（发育生物学专业论文）三氧化二砷及afp反义表达载体诱导肝癌细胞凋亡的研究.pdf

原创性声明 l u l ii1i i i ii iil l i i111l 17 9 0 912 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下， 独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论 文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本 文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标 明。本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名： 鱼羔 日 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定， 同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电 子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权山东大学可以将本学 位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用 影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：j 虹导师签名：避日 期：至竺! ! ：墨7 3 4 讨论6 9 论文总结及展望7 0 参考文献7 2 致谢8 0 攻读硕士学位期间发表的论文8 1 c o n t e n t s a b s t r a c ti nc h i n e s e l a b s t r a c ti ne n g l i s h 4 a b b r e v i a t i o n s - 8 i n t r o d u c t i o n 9 c h a p t e r1 ：s t u d i e so na r s e n i ct r i o x i d ei n d u c e dd i f f e r e n tc e h sa p o p t o s i s 2 3 m a t e r i a l s 2 3 m e t h o d s 2 7 r e s u l t s - 0 0 00 0 3 0 d i s c u s s i o n 3 8 c h a p t e r 2 ：s t u d i e so nt r a n s f e c t i o n p e g f p a n t i - a f p v e c t o ri n t o h e p a t o c a r c i n o m ac e l l s 4 0 m a t e r i a l s 4 0 m e t h o d s 4 6 r e s u l t s 5 4 d i s c u s s i o n 6 2 c h a p t e r3 ：s t u d i e so nc o m b i n a t i o no fp e g f p a n t i - a f pv e c t o ra n da r s e n i c t r i o x i d ei ni n d u c i n gt h ea p o p t o s i so f d i f f e r e n tc e l l s 6 4 m a t e r i a l s 6 4 m e t h o d s 6 5 r e s u i t s 6 6 d i s c u s s i o n 0 0 00 00 6 9 s u m m a r y a n df u t u r ep l a n s 。7 0 r e f e r e n c e s 7 2 a c k n o w l e d g e m e n t s ”8 0 p u b l i c a t i o n s 8 1 山东大学 三氧化二砷及a f p 反义表达载体诱导肝癌细胞凋亡的研究 中文摘要 背景和目的 肝癌是目前全球最常见的癌症之一，作为一种发病率高、恶性程度高、死亡 率高且高转移的癌症，目前尚无切实有效的治疗方法。近年来随着分子生物学技 术、免疫学技术及细胞间信号转导研究的进展，越来越多的生物学治疗方法被用 于肝癌的治疗，诱导肿瘤细胞凋亡就是其中之一。 三氧化二砷在治疗急性早幼粒细胞性白血病( a c u t ep r o m y e l o c y t i cl e u k e m i a , a p e ) 方面已取得很好的临床疗效，现在发现其在肝癌等实体瘤的实验治疗中也 有较好的作用效果。但目前对不同肝癌细胞细胞株的作用效果有何差异，很少有 人进行横向研究比较。 甲胎蛋白( 0 【一f e t o p r o t e i n ，a f p ) 被认为是人类发现的第一个真正有价值的肿 瘤标记物。a f p 作为一种免疫抑制性蛋白质，可抑制免疫攻击，促进肝癌细胞生 长。基于a f p 在肝癌发生发展中的特殊作用，以a f p 为靶点的基因治疗一直是相 关研究中的热点之一。 本课题以a f p 阳性肝癌细胞系h e p g 2 和h e p 3 b ，a f p 阴性肝癌细胞系 s m m c 7 7 2 1 及正常肝细胞c h a n g l i v e r 四株不同的肝癌细胞为研究对象，分别观 察a t o 对它们的作用效果。同时，构建a f p 反义表达载体转染肿瘤细胞系，抑 制该基因表达活性，再结合a s 2 0 3 ，观察其协同诱导肝癌细胞凋亡的变化。本研 究将化学药物与基因治疗相结合，立足探寻一种新的肝癌治疗方法，并取得了显 著效果，此为临床医学实践提供了科学依据。 研究方法 1 、三氧化二砷抗肿瘤活性的研究 1 ) m t t 法检测细胞存活率； 2 ) g i e m s a 染色检测细胞核的变化； 3 ) h o c h e s t3 3 3 2 4 染色检测细胞核的皱缩； 4 ) 流式细胞术检测细胞周期与凋亡； 5 ) 免疫细胞化学检测n f - r d 3 的变化； 2 、a f p 反向载体转染肝癌细胞的研究 1 ) a f p 表达载体的构建； 2 ) 脂质体法转染a f p 表达载体； 3 ) r t - p c r 检测转染前后细胞内a f pm r n a 的表达： 4 ) w e s t e r nb l o t 检测转染前后细胞中a f p 的表达； 5 ) m t t 法检测转染前后细胞的存活率； 6 ) 流式细胞术检测转染前后细胞周期与凋亡； 3 、三氧化二砷联合a f p 反义表达载体诱导细胞凋亡的研究 1 ) m t t 法测定反义载体和a t o 联合作用及a t o 单独作用时细胞存活率 的变化； 2 ) 流式细胞术检测反义载体转染后a t o 作用2 4 小时与p e g f p 空载体 转染后a t o 作用2 4 小时h e p g 2 细胞周期与凋亡率的变化。 研究结果 1 、a t o 对a f p 阳性肝癌细胞h e p g 2 和h e p 3 b 的生长有明显的抑制作用，而对 a f p 阴性肝癌细胞s m m c - 7 7 2 1 及正常肝细胞c h a n g l i v e r 的作用效果不明显。 2 、a t o 作用于h e p g 2 和h e p 3 b 后，出现明显的凋亡特征。而s m m c 7 7 2 1 仅 有个别细胞出现凋亡特征，c h a n g l i v e r 没有明显的凋亡特征。 3 、a t o 作用于h e p g 2 和h e p 3 b 后，g o g l 期细胞和凋亡细胞大量增加。 s m m c 7 7 2 1 只有g 2 m 期的细胞比例有所升高，其它各期和凋亡率变化都不 大。c h a n g l i v e r 则是各个时期变化均不大。 4 、a t o 作用于h e p g 2 和h e p 3 b 后，凋亡早期n f r d 3 的表达量增加。 5 、反义载体转染h e p g 2 和h e p 3 b 后，a f p m r n a 的量明显降低，a f p 蛋白的 表达量减少。 6 、反义载体转染h e p g 2 和h e p 3 b 后，细胞存活率降低。反义载体转染h e p g 2 后，各时期细胞变化不大，但细胞凋亡率增加。 7 、反义载体和a t o 联合作用于h e p g 2 和h e p 3 b 与只用a t o 处理相比，细胞存 活率减少，而对于s m m c 7 7 21 和c h a n g l i v e r ，细胞存活率变化不大。 2 山东大学 8 、对于h e p g 2 ，与转染空载体后用a t o 处理相比，转染a f p 反义载体后再用 a t o 处理时，细胞被大量阻滞在g 0 g 1 期和g 2 m 期，细胞凋亡率明显增加。 结论 l 、研究发现a f p 阳性的肝癌细胞h e p g 2 和h e p 3 b 对a t o 的敏感性比a f p 阴 性肝癌细胞s m m c - 7 7 2 1 以及正常肝细胞c h a n g l i v e r 要强。 2 、a t o 能够诱导a f p 阳性肝癌细胞h e p g 2 和h e p 3 b 发生凋亡，使其细胞周期 大部分阻滞在g o g l 期。 3 、在三氧化二砷诱导h e p g 2 和h e p 3 b 细胞凋亡的早期伴随着n f r , b 的活化。 4 、a f p 反义表达载体转染a f p 阳性细胞后，细胞存活率降低，凋亡细胞增加。 5 、对于a f p 阳性细胞h e p g 2 和h e p 3 b 来说，反义a f p 载体与a t o 联合作用， 比某一个单独作用的效果要好。 6 、反义a f p 载体与a t o 联合作用于舡p 阳性细胞h e p g 2 后，细胞大量阻滞在 g 0 g 1 期和g 2 m 期，且凋亡率明显增加。 关键词 三氧化二砷( a r o ) ；甲胎蛋白( a f p ) ；反义表达载体；细胞凋亡 3 a p o p t o s i so fh e p a t o c a r c i n o m ac e l l si n d u c e db y p e g f p - a n t i - a f pv e c t o ra s s o c i a t e dw i t ha r s e n i ct r i o x i d e b a c k g r o u n da n do b j e c t i v e a b s t r a c t h e p a t o c e l l u l a rc a r c i n o m a ( h c c ) i so n eo ft h em o s tc o m m o nm a l i g n a n c i e si nt h e w o r l d t h es i g n i f i c a n tf e a t u r e so fh e p a t o c e l l u l a rc a r c i n o m aa r eh i g l lc a n c e ri n c i d e n c e ， m a l i g n a n c yd e g r e e ，m o r t a l i t ya n dm e t a s t a s i s t h e r ei s s t i l ln oe f f e c t i v em e t h o d sf o r 仃e m m e m w i t ht h ed e v e l o p m e n to fm o l e c u l a rb i o l o g yt e c h n o l o g y , i m m u n o l o g i c a l t e c h n o l o g ya n dc e l l u l a rs i g n a l i n gt r a n s d u c t i o nt e c h n o l o g y , m o r ea n dm o r eb i o l o g i c a l m e t h o d sa r eu s e di nt r e a t m e n to fc a n c e r o n em e t h o di si n d u c i n gt u m o rc e l la p o p t o s i s i nt h e1 7 0 0 s ，a r s e n i ct r i o x i d ew a sf o u n dt ob eav a l u a b l et h e r a p e u t i ct o o lf o rp a t i e n t sw i t h a c u t ep r o m y e l o c y t i cl e u k e m i a n o wa r s e n i ct r i o x i d ei su s e da sa l lm e d i c i n a la g e n tf o rm a n y m a l i 印_ a n c i e s b u tf e wr e s e a r c h sf o c u so nc o m p a r i n ge f f e c t so fa r s e n i ct r i o x i d eo n h e p a t o c e l l u l a rc a r c i n o m ac e l ll i n e 谢t 1 1d i f f e r e n tc h a r a c t e r s a - f e t o p r o t e i n ( a f p ) i ss e r v e sa sad i a g n o s t i ct u m o r - s p e c i f i cm a r k c ri nm a j o r i t yo f h e p a t o c e l l u l a rc a r c i n o m ac a s e s a sa l li m l n u n es u p p r e s s i v ep r o t e i n , a f pc a ni n h i b i tt h e i m m u n er e a c t i o na n de n h a n c e t h et u m o rg r o w t h a f ph a sc r u c i a lf u n c t i o no nt h e d e v e l o p m e n to fh e p a t o c e l l u l a rc a r c i n o m a ，s og e n et h e r a p yt a r g e t i n go na f e t o p r o t e i n i sah o tp o i n ti i la s s o c i a t e dr e s e a r c h t h i ss t u d yu s e da f p p o s i t i v ec e l ll i n e sh e p g 2a n dh e p 3 b ，a f pn e g a t i v ec e l ll i n e s m m c 7 7 21a n dn o r m a lc e l ll i n ec h a n g l i v e ra sr e s e a r c ho b j e c t s ，o b s e r v e da n d c o m p a r e de f f e c t so fa r s e n i ct r i d d eo l lt h e s ec e l l s w ec o n s t r u c t e dr e c o m b i n ea n t i s e n s e - a f p g e n ev e c t o r w h e nt r a n s f e e t e d t h ev e c t o ri n t od i f f e r e n tc e l l s , w ed e t e c t e dt h er e d u c eo fa f p g e n e t h e nw et r e a t e dc e l l sc o m b i n e dw i t ha r s e n i ct r i o x i d ea n da n t i s e n s e - a f pg e n ev e c t o ra n d o b s e r v e dt h ea p o p t o s i s t h i ss t u d yt r i e dt of i n dan e ws t r a t e g yf o rc a n c e rt r e a t m e n tb y c o m b i n a t i o no fc h e m i c a ld r u ga n dg e n et h e r a p y 4 山东大学 m e t h o d s 1 s t u d i e so na r s e n i ct r i o x i d ei n d u c e dd i f f e r e n tc e l l sa p o p t o s i s 1 ) c e l lv i a b i l i t yw a sd e t e c t e db ym t ta s s a y ； 2 ) n u c l e a rc h a n g ew a sd e t e c t e db yg i e m s as t a i n i n g ； 3 ) n u c l e a rc o n d e n s a t i o nw a sd e t e c t e db yh o c h e s t3 3 3 4 2s t a i n i n g ； 4 ) c e l lc y c l ec h a n g ea n da p o p t o s i sw a sa n a l y z e db yf a c s c a l i b u r , 5 ) t h ee x p r e s s i o no f n f r d 3w e r ed e t e c t e db yi m m u n o c y t o c h e m i s t r y ； 2 s t u d i e so nt r a n s f e c t i o np e g f p - a n t i - a f pv e c t o ri n t oh e p a t o c a r c i n o m ac e l l s 1 ) t h ec o n s t r u c t i o no f p e g f p - a n t i - a f pv e c t o r ； 2 ) p e g f p a n t i - a f pv e c t o rw a st r a n s f e c t e di n t od i f f e r e n tc e l l su s m gl i p o f e c t a m i n e t m 2 0 0 0 ； 3 ) t h ee x p r e s s i o no fi n t r a c e l l u l a ra f pm r n a w a sd e t e c t e db yr t - p c r ； 4 ) me x p r e s s i o no f a f pp r o t e i n w a sd e t e c t e db yi m m u n o c y t o c h e m i s t r y ； 5 ) c e l lv i a b i l i t yw a sd e t e c t e db ym t t a s s a y ； 6 ) c e l lc y c l ec h a n g ea n da p o p t o s i sw a sa n a l y z e db yf a c s c a l i b u r , 3 s t u d i e so nc o m b i n a t i o no fp e g f p - a n t i - a f pv e c t o ra n da r s e n i ct r i o x i d ei n i n d u c i n ga p o p t o s i so f d i f f e r e n tc e l l s 1 ) c e l lv i a b i l i t yw a sd e t e c t e db ym t ra s s a y ； 2 ) c e l lc y c l ec h a n g ea n da p o p t o s i sw a sa n a l y z e db yf a c s c a l i b u r , r e s u l t s 1 、a t oh a so b v i o u si n h i b i t i o ne f f e c t so nh e p g 2a n dh e p 3 ba f pp o s i t i v e h e p a t o c a r c i n o m ac e l l s ，b u tn o t0 1 3 s m m c 一7 7 2 1a f pn e g a t i v eh e p a t o c a r c i n o m a c e l l sa n dc h a n g l i v e rn o r m a ll i v e rc e l l s 2 、a f t e rh e p g 2a n dh e p 3 bc e l l sw e r et r e a t e dw i t ha t o ，t h ec e l l se x h i b i t e ds p e c i a l m o r p h o l o g i e so fa p o p t o s i s ，s u c ha sc e l ls h r i n k a g e ，s m a l l e rc e l ls i z e ，c o n c e n t r a t i o n o fv e s i c l e so nc e l ls u r f a c e ，a n da p p e a r a n c eo fa p o p t o t i cb o d i e s g i e m s aa n d h o c h e s t 3 3 3 2 4s t a i n i n gi n d i c a t e dt h a tt h en u c l e u sc o n d e n s e da n dt h ec h r o m a t i n c l e a v e d 3 、a f t e rt r e a t e dw i t ha t o ，t h ep e r c e n t a g eo fh e p g 2a n dh e p 3 bc e l l so b v i o u s l y 5 i n c r e a s e di ng 0 g1 p h a s e ，w h i l et h ep e r c e n t a g eo fs 脚c 一7 7 21c e l l ss l i g h t l y i n c r e a s e di ng 2 mp h a s e h o w e v e r , t h ep e r c e n t a g eo fc h a n g l i v e rc e l l si nd i f f e r e n t p h a s e sh a sl i r l ec h a n g e d 4 、a f t e rt r e a t e d 谢t l la t o ，n f - r , bp r o t e i ne x p r e s s i o nw a si n c r e a s e d 5 、r t - p c rr e s u l t ss h o w e dt h el e v e lo f a f pm r n ai n c r e a s e di na t o - t r e a t e dh e p g 2 a n dh e p 3 bc e l l s i m m u n o c y t o c h e m i s t r yr e s u l t ss h o w e dt h el e v e lo fa lp i n c r e a s e di na t o t r e a t e dh e p g 2a n dh e p 3 bc e l l s 6 、p e g f p a n t i - a f pv e c t o rh a so b v i o u si n h i b i t i o ne f f e c t so nh e p g 2a n dh e p 3 ba l p p o s i t i v eh e p a t o c a r c i n o m ac e l l s w h e np e g f p - a n t i - a f pv e c t o rt r e a t e do nh e p g 2 c e l l s ，t h eq u a n t i t yo fa p o p t o s i sc e l l sw a si n c r e a s e d 7 、w h e nc o m b i n a t i o no fp e g f p a n t i - a l pv e c t o ra n da r s e n i c t r i o x i d et r e a t e do n h e p g 2a n dh e p 3 ba f pp o s i t i v eh e p a t o c a r c i n o m ac e l l s ，t h eq u a n t i t yo fa _ p o p t o s i s c e l l sw a si n c r e a s e d ，b u tn o to i ls m m c 一7 7 21a f pn e g a t i v eh e p a t o c a r c i n o m ac e l l s a n dc h a n g l i v e rn o r m a ll i v e rc e l l s 8 、a f t e rt r e a t e dw i t hp e g f p - a n t i - a f pv e c t o ra n da t o ，t h ep e r c e n t a g eo fh e p g 2c e l l s o b v i o u s l yi n c r e a s e di ng 0 g 1p h a s ea n dg 2 mp h a s e c o n c l u s i o n 。 1 a t oh a so b v i o u s l yi n h i b i t i o ne f f e c t so l lh e p g 2a n dh e p 3 ba f pp o s i t i v e h e p a t o c a r c i n o m ac e l l s ，b u tn o to ns m m c 一7 7 2 1a f pn e g a t i v eh e p a t o c a r c i n o m a c e l l sa n dc h a n g l i v e rn o r m a ll i v e rc e l l s 2 a f t e rt r e a t e d 谢t ha t o ，t h ep e r c e n t a g eo fh e p g 2a n dh e p 3 bc e l l so b v i o u s l y i n c r e a s e di ng 0 g 1p h a s e ，w h i l et h ep e r c e n t a g eo fs m m c 一7 7 2 1c e l l ss l i 曲f l y i n c r e a s e di ng d m p h a s e h o w e v e r , t h ep e r c e n t a g eo fc h a n g l i v e rc e l l si nd i f f e r e n t p h a s e sl i t t l ec h a n g e d 3 a f t e rt r e a t e dw i t ha t o ，n f r , bp r o t e i ne x p r e s s i o nw a si n c r e a s e d 4 a n f i s e n s e - a f pg e n ev e c t o rh a so b v i o u s l yi n h i b i t i o ne f f e c t so i la f pp o s i t i v e h e p a t o c a r c i n o m ac e l l s 5 w h e nc o m b i n a t i o no fp e g f p a n t i - a f pv e c t o ra n da r s e n i ct r i o x i d e t r e a t e do n 6 k e y w o r d a r s e n i ct r i o x i d e ；a l p h a f e t o p r o t e i n ；p e g f p - a n t i - - a f pv e c t o r ；c e l la p o p t o s i s 7 符号说明 英文缩写英文名称中文名称 h c c h e p a t o c e l l u l a rc a r c m o m a 肝细胞癌 a f p a l p h a - f e t o p r o t e i n 甲胎蛋白 姆oa r s e n i ct r i o x i d e 三氧化二砷 p c d p r o g r a m m e dc e l ld e a t h程序化细胞死亡 d dd e a t hd o m a m 死亡受体结构域 f a s l f a sl i g a n df a s 配体 f b s f e t a lb o v i n es e r u m胎牛血清 t n f t u m o rn e c r o s i sf a c t o r肿瘤坏死因子 t n f rt u m o rn e c r o s i sf a c t o rr e c e p t o r肿瘤坏死因子受体 m t t 3 - ( 4 ，5 - d i r n e t h y l t h i a z o l - 2 - y 1 ) - 2 ，5 - d i p h e n y t t e t r a z o l i u m 四甲基偶氮唑盐 d m s o d i m e t h y ls u l f o x i d e二甲基亚砜 p b s p h o s p h a t e - b u f f e r e ds o l u t i o n 磷酸盐缓冲液 陋 a l k a l i n ep h o s p h a t a s e碱性磷酸酶 p i p r o p i d i u mi o d i d e 碘化丙啶 f c mf l o wc ”o m e t r y 流式细胞术 d e p c d i e t h y p y r o c a r b o n a t e 焦碳酸二乙酯 e be t l l i d i u mb r o m i d e溴化乙啶 h r p h o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e辣根过氧化物酶 e d t a e t h y l e n ed i a m i n et e t r a c e t i ca c i d 乙二胺四乙酸钠 8 山东大学 - 上- _ j 一 刖置 ( 研究背景文献综述) lh c c 原发性肝细胞癌( h e p a t o c e l l u l a rc a i c i n o m a ，h c c ) 是世界上常见的恶性程度 最高的肿瘤之一，其发病率在恶性肿瘤中居第五位，死亡率居第三位【l 】。在我 国，肝癌是最常见的恶性肿瘤之一，全世界每年新发肝癌患者中4 2 在我国大陆， 我国每年死于肝癌的病人超过1 l 万，已占我国肿瘤死因的第二位，而肝癌中9 0 以上是肝细胞癌 2 】。在我国，肝癌的地理分布特点是东南地区比西北、华北和 西南地区高，沿海比内陆高。总的来说，气候温暖、潮湿、多雨的长江三角洲、 珠江三角洲及东南沿海地区是该病的高发区。研究表明，肝癌多见于男性，通常 男女比例在2 ：1 4 ：1 之间。肝癌的发病年龄一般在3 0 - - 6 0 岁之间，国外报道肝 癌发病高峰一般在6 0 岁，但近几年研究发现肝病的发病率和死亡率有年轻化的 趋势 3 】。 h c c 治疗手段的选择取决于肿瘤位置、病变范围、是否转移及肝功能等多 个因素。目前，肝切除仍是h c c 治疗的首先选择，然而国际上多数肝癌治疗中 心指出：h c c 首次可切除率仅为2 0 3 0 ，且h c c 切除术的5 年生存率只有 2 5 5 0 4 】。由于h c c 恶性程度高，且起病隐匿，多数患者就诊时已错过手术 时机，即使根治切除后，复发率也很高。近几十年来，全世界肝癌发病率和死亡 率均呈上升趋势，严重威胁着人们的生命和健康，h c c 已成为全球性的重大公 共卫生问题。 大量的事实表明，环境是影响肿瘤发生的主要因素，人类8 0 9 0 的肿瘤 为环境因素所致，由于遗传因素所产生的肿瘤不超过5 。环境致癌因素一般分 为化学、物理以及生物三类。其中化学因素是最主要的因素，7 0 以上的人类肿 瘤是由它引起的，其主要包括烷化剂、多环芳烃、芳香胺、偶氮染料、亚硝基化 合物、生物毒素等。物理因素包括各种电离辐射、紫外线、热辐射、强电磁场、 机械刺激、石棉及石棉纤维等。生物因素包括细菌、真菌、病毒以及寄生虫。由 人体以外的生活环境所引起的致癌物为外源性致癌物，机体内形成的致癌物为内 源性致癌物。这些因素有着量效积累性，最终作用于正常细胞的遗传物质，使 9 d n a 或基因发生改变，导致正常细胞发生癌变。 2 细胞凋亡 近年来，关于癌症生物学和遗传学方面的基础研究取得了巨大的进步。其中 最重要的进步是发现凋亡及控制凋亡的相关基因对肿瘤的恶性表型有很大的影 响。如，发现一些致癌性的突变可以扰乱凋亡，导致肿瘤发生、发展和转移。相 反，在多阶段致癌过程中，另外一些致癌性的改变可以促进凋亡，藉以产生选择 性的压力导致凋亡无效，最终多数细胞毒性抗癌因子作用于凋亡过程，致使凋亡 程序出现缺陷，导致治疗失败。在肿瘤发展过程中相同的突变可以抑制凋亡，降 低治疗的敏感性，凋亡为我们提供了一个概念框架，将癌症遗传学和癌症治疗连 接起来。 2 1 细胞凋亡概述 细胞有两种基本死亡形式：一种是被动性死亡，又称为坏死( n e c r o s i s ) ， 它是由物理、化学或生物性损伤因子等造成的细胞急速死亡。另一种为主动性死 亡，称为程序化细胞死亡( p r o g r a m m e dc e l ld e 砒，p c d ) 。它是细胞在一定的 生理和病理条件下，遵循自身程序，由基因控制的细胞自主性死亡方式，是一个 主动的、高度有序的过程 5 】。在过去的研究中，一直认为p c d 即凋亡。实际上 两者在概念上是有区别的，凋亡是形态学上的概念，而程序化细胞死亡则是功能 学上的概念。最近研究表明，凋亡并非程序化细胞死亡的唯一形式，还存在着其 它非凋亡性程序化细胞死亡，如自体吞噬的程序性细胞死亡 6 】。不过，凋亡仍 是机体最常见且被研究的最多的程序化细胞死亡形式。 细胞凋亡理论在1 9 7 1 年被提出，k e r r 在博士论文研究期间发现了一种与 细胞坏死明显不同的细胞死亡，并将之命名为“皱缩坏死 ( s h r i n k a g en e c r o s i s ) 7 】。1 9 7 2 年，k e r r 等在电镜下再次观察到与坏死细胞不同的细胞死亡现象，他 们发现有些细胞死亡时只是出现细胞核浓缩、细胞自身d n a 断裂等现象而没有 细胞膨胀和崩溃等典型的细胞坏死症状。k e r r 等认为这些细胞的死亡与细胞坏 死不同，可能是由于自身基因程序启动引起的主动性自身破坏过程，他们将细胞 的这种死亡命名为“细胞凋亡 ，首次将细胞凋亡的概念引入到生物界【8 】。 细胞凋亡与细胞增殖的动态平衡是维系生长发育、内环境稳定和免疫调节所 1 0 山东大学 必须的最基本过程。随着对其不断的研究，发现它与免疫系统疾病、心脑血管疾 病以及肿瘤的发生和发展关系密切。因此，深入研究凋亡的相关机制，对多种疾 病的发生、发展、预防及治疗有重要的意义。 2 2 细胞凋亡的特征 细胞凋亡的主要形态学特征有：凋亡细胞收缩变圆，体积缩小，胞质浓缩， 胞器明显聚集，但浓缩的胞质与聚集的细胞器大部分保持完整，只是密度增高； 细胞核体积明显减小，部分核孔消失。染色质凝集为大颗粒状或团块，继而细胞 呈现特征性变化，呈新月形帽( c r e s c e n t i c c a p ) ，染色质继续凝缩，核边界发生 异常卷曲、凹陷，出现核碎片，其中部分核碎片被细胞膜包围。核仁变大，分散 分布于细胞中 9 ，l o 。凋亡晚期，细胞表面不规则突起更加明显：内质网、线 粒体等细胞器发生肿胀；细胞表面突起与质膜发生分离，形成圆球形或椭圆形的 凋亡小体，最终，凋亡小体被周围具有吞噬功能的细胞如巨噬细胞、上皮细胞等 吞噬。超微结构下观察，尽管细胞裂解为多个凋亡小体，但均有膜包绕，且溶酶 体、线粒体等细胞膜结构完好，维持着内外渗透压的平衡，因此，不存在内容物 的外溢，也不引起组织的炎症反应。 随着一系列的形态学改变，凋亡细胞在生化代谢方面也会发生一些变化：内 源性c a 2 + 、m ：醇+ 依赖性核酸内切酶被活化，并将染色质d n a 在核小体单位之 间降解，产生若干大小不一的寡聚核苷酸片段，这些片段的大小一般为1 8 0 - 2 0 0 b p 的整数倍，在琼脂糖凝胶电泳中呈现为梯状图谱( d n al a d d e r ) 1 1 ；此外， 细胞凋亡的过程中往往还有新基因的表达及某些生物大分子的合成 1 2 。 2 3 细胞凋亡的检测方法 2 3 1 形态学观察法 形态学观察主要是应用显微镜对凋亡细胞的形态特征进行观察( 包括光学显 微镜、荧光显微镜及电子显微镜等) 。光学显微镜下观察未染色的细胞，可以发 现凋亡细胞的体积变小，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小 体。常用吉姆萨或瑞氏染色后观察凋亡细胞，可以看到染色质浓缩、边缘化，核 膜裂解、染色质分割成块状等典型的凋亡形态。荧光显微