（食品科学专业论文）橙色红曲菌中基于pyrG标记的同源转化系统的建立.pdf

目录 缩略语i 摘要i i i a b s t r a c t i v 本文创新之处v i 第一章文献综述1 1 1 丝状真菌的转化系统：。1 1 2未知基因的克隆策略7 1 3研究的内容和意义1 3 第二章红曲菌p y r g 基因片段的克隆1 4 2 1 材料一1 4 2 2 方法1 6 2 3 结果2 3 2 4 讨论一2 7 本章小结。3 0 第三章红曲菌p y r g 基因全长的获得及序列分析3 1 3 1 材料3l 3 2 方法3 3 3 3 结果4 1 3 4 讨论5 3 本章小结5 5 第四章红曲菌p y r g 缺陷株u m 2 8 的筛选及鉴定5 6 4 1 材料5 6 4 2 方法5 9 4 3 结果一6 6 4 4 讨 仑一7 4 本章小结7 7 第五章红曲菌同源转化系统的建立及g f p 蛋白的表达7 8 5 1 材料7 8 5 2 方法81 5 3 结果8 7 5 4 讨论9 l 本章小结9 4 结论与展望9 5 参考文献9 6 j l l 【谢1 0 2 攻读学位期间的研究成果j 1 0 3 缩略语 缩略语 p y r g 5 f o a 5 f u m p u v c o d e h o p g f p g p d o b 6 b p k b d n a d n t p i p t g x g a l e s t n c b i 英文名 缩略语 a b b r e v i a t i o n s 中文名 o r o t i d i n e 一5 。一p h o s p h a t ed e c a r b o x y l a s eg e n e 乳清苷5 磷酸脱羧酶基因 5 f l u o r o o r o t i ca c i d5 氟乳清酸 5 f l u o r o u r i d i n em o n o p h o s p h a t e5 一氟乳清苷酸 u l t r av i l e t c o n s e n s u s d e g e n e r a t eh y b r i d o l i g o n u c l e o t i d ep r i m e r g r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i n g l y c e r a l d e h y d e 3 p h o s p h a t ed e h y d r o g e n a s e d e g r e eb a u m e b a s ep a i r k i l o b a s ep a i r s d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d 紫外线 共有序列简并序列组合引物 绿色荧光蛋白 甘油醛3 磷酸脱氢酶 波美度 碱基对 千碱基对 脱氧核糖核酸 d e o x y n u c l e o s i d et r i p h o s p h a t e脱氧核苷三磷酸 i s o p r o p h l t h i o b e t a g a l a c t o s i d e异丙基硫代一p - d 一半乳糖苷 5 - b r o m o - 4 c h l o r o - - 3 - - i n d o l y b e t a - d - - g a l a c t o s i d e e x p r e s ss e q u e n c et a g n a t i o n a lc e n t e rf o rb i o n t e c h n o l o g y 5 溴4 氯3 吲哚d 一半乳糖苷 表达序列标签 美国国家生物技术信息中心 缩略语 e d t a c d l b m e s p b s p c r i n f o r m a t i o n e t h y l e n ed i a m i n et e t r a a c e t i ea c i d乙二胺四乙酸 c z a p e kd o xm e d i u m基础培养基 l u r i ab e r t a n im e d i u m m a l te x t r a c ts u c r o s em e d i u m p h o s p h a t eb u f f e r e ds a l i n e p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n p e g 4 0 0 0 p o l y e t h y l e n eg l y c o l4 0 0 0 s d s a m p t a q t b e 而s o d p t c s t c t b 3 s o d i u md o d e c y ls u l f a t e a m p i c i l l i n t h e r m o sa q u a t i c u s 掰s b o r i ca c i d e d 崩b u f f e r t r i s ( h y d r o x y m e t h y l ) a m i n o m e t h a n e o p t i c a ld e n s i t y p o l y e t h y l e n eg l y c o l - t r i s - c a l c i u mc h l o r i d e s o r b i t 0 1 t r i s c a l c i u mc h l o r i d e t e f i eb r o t hm e d i u m l b 培养基 麦芽汁培养基 磷酸盐缓冲液 聚合酶链式反应 聚乙二醇4 0 0 0 十二烷基磺酸钠 氨苄青霉素 嗜热菌 i r i s 一硼酸缓冲液 三羟甲基氨基甲烷 光密度 聚乙二醇t r i s 氯化钙溶液 山梨醇t r i s 氯化钙溶液 丰富肉汤培养基 摘要 摘要 本文采用c o d e h o p 策略设计简并引物，从橙色红曲菌( m o n a s c u s a u r a n t i a c u s ) 的基因组d n a 中克隆得到p y r g 基因片段，然后运用p c r 法筛 选红曲茵f o s m i d 文库，获得了p y r g 基因全长。以橙色红曲菌a s 3 4 3 8 4 为 出发菌株，经紫外诱变获得尿嘧啶依赖型的5 - f o a 抗性菌株，经测序和基因转 化试验鉴定出u m 2 8 为p y r g 缺陷株。对p e g 介导的转化方法优化后建立了 以p y r g 为筛选标记的红曲菌同源转化系统，并构建了含有g f p 蛋白的表达载 体p g f p - p y r g ，通过基因转化试验，在红曲菌中以p y r g 为筛选标记进行了 g f p - 蛋白的表达。主要研究内容如下： 1 根据已报道的真菌乳清苷5 磷酸脱羧酶基因( p y r g ) 的氨基酸序列，采 用c o d e h o p 策略设计简并引物，从橙色红曲菌的基因组d n a 中克隆得到 p y r g 基因片段。然后运用p c r 法筛选红曲菌f o s m i d 文库，获得了p y r g 基 因全长( g e n b a n k 登录号：g u 7 2 3 5 0 6 ) 。经过b l a s t x 比较发现，红曲菌p y r g 基 因与a s p e r g i l l u s l l a v u sn r r l 3 3 5 7 的氨基酸序列同源性最高，达到8 1 。该基 因能够作为筛选标记应用于红曲菌同源转化系统； 2 以橙色红曲菌a s 3 4 3 8 4 为出发菌株，经紫外诱变得到一株尿嘧啶依赖 型的5 - f o a 抗性菌株u m 2 8 。扩增其p y r g 基因并进行测序，发现u m 2 8 的 p y r g 基因在核苷酸序列+ 2 2 0b p 的位置发生了突变，进而导致氨基酸水平上 p r o s e r 的突变，造成了乳清苷5 磷酸脱羧酶的失活。u m 2 8 通过基因转化能 够接受含有米曲霉p y r g 基因的互补质粒恢复野生表型，且回复突变率低于 1 0 ，能够用于红曲菌同源转化系统的构建； 3 对u m 2 8 菌株的原生质体制备、再生和转化方法进行了优化，采用原 生质体p e g 介导转化将互补质粒p a o p 和p m a p 分别转入u m 2 8 中，能够 使其恢复野生表型。建立了以p y r g 为筛选标记的红曲菌同源转化系统； 4 通过d n a 重组技术构建了表达载体p g f p - p y r g ，载体中含有p y r g 筛 选标记和g f p 蛋白表达单元。通过基因转化试验，在红曲菌中以p y r g 为筛选 标记进行了g f p 蛋白的表达。 关键词：橙色红曲菌，p y r g 基因，p y r g 缺陷株，同源转化系统 i i i 摘要 a b s t r a e t i nt h i s p a p e r ，p y r gg e n ef r a g m e n tw a sc l o n e df r o mm o n a s c u sa u r a n t i a c u s g e n o m i cd n au s i n gd e g e n e r a t ep r i m e r sd e s i g n e dw i t hc o d e h o ps t r a t e g y a n di t s c o m p l e t es e q u e n c ew a so b t a i n e db yap c r - b a s e dm e t h o df o rs c r e e n i n gf o s m i dl i b r a r y u r i d i n ea u x o t r o p h ys t r a i n sf r o mma u r a n t i a c u sa s 3 4 38 4w e r ei s o l a t e db yr e s i s t a n c e t o5 - f o aa f t e ru v m u t a g e n e s i s o n ep o s i t i v ec o l o n yw a s o b t a i n e da n dn a m e du m 2 8 ， i tw a sf u r t h e rc o n f i r m e db y s e q u e n c i n ga n dt r a n s f o r m a t i o n t h ef o r m a t i o no f p r o t o p l a s tc o n d i t i o na n dt h er e g e n e r a t i o no fp r o t o p l a s tc o n d i t i o no fu m 2 8s t r a i nw e r e o p t i m i z e d ，a n dah o m o l o g o u st r a n s f o r m a t i o ns y s t e mu s i n gp y r ga sas e l e c t i o nm a r k e r o fu m 2 8i se s t a b l i s h e d a p l a s m i dp g f p - p y r gc o n t a i n i n gt h eg f pe x p r e s s i o n c a s s e r ew a sc o n s t r u c t e da n dt r a n s f o r m e di n t ou m 2 8p r o t o p l a s t ，e x p r e s s i o no f t r a n s f o r m e dg e n ew a se v a l u a t e du s i n gt h eg f pg e n e t h em a j o rf i n d i n g sw e r e e x p o u n d e da sf o l l o w s ： 1 a c c o r d i n g t ot h ek n o w no r o t i d i n e - 5 p h o s p h a t e d e c a r b o x y l a s e ，p y r gg e n e f r a g m e n tw a sc l o n e df r o mm o n a s c u sa u r a n t i a c u sg e n o m i cd n au s i n gd e g e n e r a t e p r i m e r sd e s i g n e dw i t hc o d e h o ps t r a t e g y a n di t sc o m p l e t es e q u e n c ew a so b t a i n e d b yap c r b a s e dm e t h o df o rs c r e e n i n gf o s m i dl i b r a r y ( a c c e s s i o nn o g u 7 2 3 5 0 6 ) a f t e rt h eb l a s t xc o m p a r i s o n ，t h ec l o n e dg e n ew a sc o n f i r m e dt h a ti tw a sm o n a s c u s p y r gg e n ew i t h8 1 s e q u e n c ei d e n t i t yt ot h a to f a s p e r g i l l u s f l a v u sn r r l 3 3 5 7 i tc a n b eu s e da sas e l e c t i v em a r k e rf o rm o n a s c u sh o m o l o g u st r a n s f o r m a t i o ns y s t e m ； 2 a p y r gm u t a n ts t r a i nf r o m 肱a u r a n t i a c u sa s 3 4 3 8 4 ，n a m e du m 2 8 ，w a si s o l a t e d b yr e s i s t a n c et o5 - f o a a f t e ru v m u t a g e n e s i s s e q u e n c ea n a l y s i so ft h i sm u t a t e dg e n e r e v e a l e dt h a ti tc o n t a i n e dap o i n tm u t a t i o na tn u c l e o t i d e p o s i t i o n + 2 2 0 ，c a u s e d s u b s t i t u t i o no fp r o s e r , w i t hi n a c t i v a t i o no fo m p d e c a s ef u n c t i o n c o m p l e m e n t a t i o n o f 彪a u r a n t i a c u sp y r gm u t a n tw a sp e r f o r m e db yt r a n s f o r m i n ga s p e r g i l l u so r y z a e p y r gg e n ei n t ou m 2 8 ，a n di tt r a n s f o r m e du m 2 8i n t ou r i d i n ep r o t o t r o p h y u m 2 8w a s au r i d i n ea u x o t r o p hw i maf r e q u e n c yo fr e v e r s em u t a t i o no fl e s st h a n10 一，a n di t c o u l db eu s e di nt h em o n a s c u sh o m o l o g o u st r a n s f o r m a t i o ns y s t e m ； 3 t h ef o r m a t i o no fp r o t o p l a s tc o n d i t i o na n dt h er e g e n e r a t i o no f p r o t o p l a s tc o n d i t i o n o fu m 2 8s t r a i nw e r eo p t i m i z e d t w oc o m p l e m e n t a t i o np l a s m i d s ，p a o pa n dp m a p , w e r er e s p e c t i v e l yt r a n s f o r m e di n t op r o t o p l a s to fu m 2 8a n dt h e yt r a n s f o r m e du m 2 8 t ou r i d i n ep r o t o t r o p h y h o m o l o g o u st r a n s f o r m a t i o ns y s t e mu s i n gp y r ga sas e l e c t i o n 摘要 m a r k e ro fu m 2 8i se s t a b l i s h e d , 4 t h ep l a s m i dp g f p - p y r g ，c o n t a i n i n gt h em a - p y r gg e n ea n dag f pe x p r e s s i o n c a s s e t t e ，w a sc o n s t r u c t e db yt h ed n ar e c o m b i n a n tt e c h n i q u e t h e nt r a n s f o r m p g f p - p y r gi n t ou m 2 8p r o t o p l a s tu s i n gp y r ga sas e l e c t i o nm a r k e r ，e x p r e s s i o no f t r a n s f o r m e dg e n ew a se v a l u a t e du s i n gt h eg f p g e n e k e y w o r d s ：m o n a s c u sa u r a n t i a c u s ，p y r gg e n e ，p y r gm u t a n t ，h o m o l o g o u s t r a n s f o r m a t i o ns y s t e m v 本文创新之处 本文创新之处 1 、本研究采用c o d e h o pp c r 结合p c r 筛选红曲菌f o s m i d 文库的方法克 隆了橙色红曲菌p y r g 基因全长( g e n b a n k 登录号：g u 7 2 3 5 0 6 ) ，该基因全长 的获得为红曲菌同源转化系统的构建奠定了基础。结果表明该方法能有效快速地 克隆未知基因，为红曲菌及其它真菌新基因的克隆提供了一个有效的途径。 2 、本研究采用表型分析、测序结果比对和基因转化试验相结合的三步筛选鉴定 方法获得了红曲菌p y r g 基因缺陷株，结果稳定可靠。为红曲菌营养筛选标记转 化系统提供了相对应的受体菌。 3 、本研究建立了红曲菌以p y r g 基因为营养缺陷标记的转化系统，并运用该系 统进行了g f p 绿色荧光蛋白的表达。该转化系统的建立可解决以抗生素为选择 标记和选择压力时造成的抗性基因向环境和其它微生物转移等问题。针对红曲菌 自身营养基因( 如p y r g 基因) 的营养互补筛选系统的研究未见报道。( 科技查新 报告编号：2 0 0 9 3 6 l 2 5 0 0 0 0 3 ) v i 第一章文献综述 1 1 丝状真菌的转化系统 第一章文献综述 红曲茵的转化系统是在其它真菌的基础上逐步发展起来的。1 9 7 3 年，m i s h r a 和t a t u m 第一次报道了用粗糙脉孢菌野生型菌株的d n a 与一株肌醇缺陷型 菌株共孵育，结果获得了肌醇原养型菌落l l 】；c a s e 等于1 9 7 9 年首次报道了粗糙 脉孢菌的基因转化1 2 1 ；之后丝状真菌遗传转化系统迅速发展。c u l l e nd 等人首次 应用细菌潮霉素b 磷酸转移酶( h p h ) 基因与构巢曲霉却c 基因启动子融合构 建了质粒p d h 2 5 ，转化构巢曲霉，获得了具有潮霉素抗性的转化子1 3 j 。此后， 潮霉素抗性基因作为丝状真菌选择标记得到了广泛应用。如今至少已对1 0 0 多 种丝状真菌成功地进行了转化试验1 4 j 。期间，也建立了红曲菌的转化系统并逐渐 发展，红曲菌转化系统的建立为应用分子遗传方法研究红曲菌打下了基础。 1 1 1 选择性标记 丝状真菌的转化载体一般都是以细菌来源的质粒为基础构建的。由于这些载 体要在原核细胞和真核细胞中扩增或表达目的基因，为便于基因操作，常把一些 选择性标记基因构建在载体上。常见的选择性标记【4 】主要有三类：第一类为营养 缺陷型标记基因，通过转入的标记基因与相应的营养缺陷型受体菌基因功能互 补，能够使受体菌恢复野生型表型；第二类为药物抗性标记基因，药物抗性基因 的转入可以使受体细胞在一定的药物浓度下生长，表现出药物抗性；第三类标记 基因为具有与受体细胞染色体同源的序列，可以插入受体菌染色体上的特定位 点，从而破坏该位点附近基因的表达而产生突变型表型。 1 1 1 1 营养缺陷型标记 1 9 7 7 年v a p n e k 等首次克隆了粗糙脉孢菌的g 口一2 基因，并把它应用于g 口2 基因缺陷的粗糙脉孢菌的转化试验1 5 j 。随后又有许多已知功能的丝状真菌基因被 克隆，并被应用于丝状真菌的转化试验中。 常被用作丝状真菌转化的选择性标记基因有编码乳清酸核苷5 磷酸脱羧酶 的p y r 4 基因，编码色氨酸生物合成酶的t r p l 基因，编码乙酰胺酶的a m d s 基 因，类似于t r p l 基因的即c 基因，编码鸟氨酸氨甲酰基转移酶的a r g b 基因， 类似于p y r 4 基因的p y r g 基因和编码硝酸盐还原酶的n i a d 基因等。具体信息 第一章文献综述 见表1 1 1 6 1 。 表1 1 丝状真菌转化常用的营养缺陷型标记 1 1 1 2 药物抗性标记 营养缺陷型标记的使用需要有相应的营养缺陷型受体菌，因而限制了这一选 择性标记的应用范围。药物抗性标记不要求受体菌具有营养缺陷型，应用较为方 便。 丝状真菌转化常用的药物抗性标记有来自粗糙脉孢菌的编码b e n o m y l 抗性 的b m l 基因，来自黑曲霉的编码寡霉素抗性的o l i c 基因，来自细菌的潮霉素 抗性基因( h y g ) ，博来霉素抗性基因即g 4 1 8 抗性基因( n e o 。) ，腐草霉素抗性 基因等。具体信息见表1 2 【6 1 。 2 第一章文献综述 表1 2 丝状真菌转化常用的药物抗性标记 1 1 1 3 致突型或具有特殊表型的标记 携带有受体菌基因片段的打靶载体可以通过同源重组整合到受体菌的染色 体上，造成染色体上部分基因功能的缺失，从而产生突变。以此作为选择性标记 已经成功应用于丝状真菌的转化试验中。 1 9 9 4 年，g o u k a 等人构建了两个与泡盛曲霉( a a w a m o r i ) p y r g 基因同 源但是部分位点发生了突变的质粒p a w 4 1 0 和p a w 4 2 0 ，并且将它们对烟曲 霉进行转化，造成乳清酸核苷5 一磷酸脱羧酶功能的缺失，因此转化子可以通过 5 氟乳清酸( 5 - f l u o r o o r o t i ca c i d ，5 - f o a ) 抗性进行筛选【7 j 。 l a k r o d 等人于2 0 0 3 年通过紫外诱变获得了一株紫色红曲菌( m o n a s c u s p u r p u r e u s ) 的白色突变株k b 2 0 m 1 ，然后把野生型红曲菌m p u r p u r e u s a t c c l 6 3 6 5 的基因组d n a 转化k b 2 0 m 1 菌株原生质体，转化子通过肉眼观察 是否产色素进行选择，获得了8 株能够产色素的转化子【引。 第章文献综述 1 1 1转化载体 丝状真菌的转化载体一般可分为自主复制型载体和整合型载体。自主复制型 载体在受体菌的染色体之外独立存在，不需要与宿主染色体发生整合。由于载体 上带有真核系统的复制起点，因此可以在受体菌中形成多拷贝。但是这种载体不 稳定，在没有选择压力的条件下容易丢失。整合型载体在宿主菌内不能单独存在， 它必须与宿主染色体整合，随着细胞分裂而平均分配到子代细胞中。因此，整合 型载体比自主复制型载体更稳定【9 j 。 1 1 2 1 自主复制型载体 自主复制型载体多见于细菌和酵母中，在丝状真菌中发现的不多。只在少数 真菌菌株中报道有自主复制型真菌转化载体。 1 9 9 6 年f i e r r o 曾报道利用a m a l ( a u t o n o m o u sm a i n t e n a n c ei na s p e r g i l l u s ) 序列在产黄青霉中得到了自主复制质粒，极大地提高了外源基因转化产黄青霉的 效率【l0 1 。在红曲菌中，s h i m i z u 等人构建了含有a m a l 序列及金担子素a ( a u r e o b a s i d i n a ) 筛选标记的自主复制型转化载体p a u r 3 1 6 ，并证明了a m a l 序列在紫色红曲菌( m p u r p u r e u s ) 中能够自主复制j 。 1 1 2 2 整合型载体 丝状真菌的转化大多为整合型转化，整合型载体主要通过同源重组和非同源 重组两种方式整合到染色体上。同源重组又可能产生两种类型的转化子，一种是 打靶载体与染色体d n a 发生单交换，导致目的基因与染色体基因的连锁排列； 另一种是打靶载体与染色体d n a 发生双交换，致使染色体基因被目的基因所 取代。非同源重组常导致目的基因在染色体上多位点多拷贝的整合，形成不连锁 的重复。目前，大多数红曲菌外源基因转化研究所采用的载体系统大都是整合于 染色体上的整合型载体。 2 0 0 3 年，s o n i ac a m p o y 等人首次报道了红曲菌的转化系统。他们同时尝试 了将博来霉素( p h l e o m y c i n ) 、绿色荧光蛋白( g r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i n ，g f p ) 和 潮霉素抗性基因( h y g ) 应用于红曲菌的转化系统【l 2 。 与此同时，k i m 等人于2 0 0 3 年报道了以潮霉素为显性筛选标记建立的紫色 红曲菌( m p u r p u r e u s ) 转化系统。他们将构巢曲霉( a s p e r g i l l u sn i d u l a n s ) 的t r p c 启动子或者紫色红曲菌( m p u r p u r e u s ) 的g p d l 启动子，与潮霉素磷酸转移酶( 幼办) 基因的开放阅读框( o i 讧) 连接成重组质粒，成功地转化了紫色红曲刮1 3 】。之后， 许多对红曲菌的外源基因的转化研究多采用了这种转化系统 1 4 , 1 5 , 1 6 】。 4 第一章文献综述 1 1 2转化方法 自1 9 7 3 年m i s h r a 和t a t u m 报道粗糙脉孢菌的转化以来，丝状真菌遗传 转化方法的研究迅速发展，建立了p e g c a c l 2 介导的转化法、农杆菌介导的转化 法、电击转化法、限制性内切酶介导的转化法、基因枪转化法等多种转化方法。 1 1 3 1p e g c a c l 2 介导的转化法 丝状真菌转化研究中最常用的方法是聚乙二醇( p o l y e t h y l e n e g l y c o l ，p e g ) 介导的d n a 的转化。p e g c a c l 2 介导的转化方法分为三个操作步骤：制备 原生质体；p e g 处理，诱导原生质体发生融合，引入外源d n a ；原生质 体的再生。p e g 是一种能够促进原生质体吸收外源d n a 的化学诱导剂，在高 p h 环境下，p e g 通过电荷间相互作用与外源d n a 形成紧密的复合物，受体细 胞通过内吞作用吸收这些复合物到细胞内，随后进入细胞核并整合到受体基因组 中【17 1 。 原生质体的制备与再生是p e g c a c l 2 介导的转化方法的基础，丝状真菌的原 生质体制备通常采用酶法消化细胞壁获得，目前常用的细胞裂解酶有c e l l u l o s e 、 s n a i l a s e 、l y s i n ge n z y m e 等。影响原生质体制备和再生的因素很多，包括液体培 养基的成分、酶的种类、酶解温度和时间、菌丝体的菌龄和渗透压稳定剂等。周 礼红等发现在培养基中加入一定量的甘氨酸可提高原生质体制备效率，这可能是 由甘氨酸代替d 丙氨酸合成细胞壁从而降低了细胞壁之间的交连引起的i l 引。此 外，p e g 的分子量和浓度、c a c l 2 溶液的浓度和p h 值都会对转化效率产生影 响。 1 1 3 2 农杆菌介导的转化法 根癌农杆菌( a g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n s ) 是一种革兰氏阴性的土壤杆菌，能 够侵染双子叶植物的受伤部位并形成冠瘿瘤。在冠瘿瘤的形成过程中，农杆菌环 状质粒t i 上的t - d n a 能够随机插入到植物的基因组中。农杆菌介导的遗传转 化系统是一种天然有效的遗传工程系统，已广泛应用于植物遗传转化的研究上。 1 9 9 8 年，g r o o t 等报道农杆菌也可以高效率地将其t i 质粒的t - d n a 转入 丝状真菌。他们首先研究了a a w a m o r i 中由t i 质粒介导的转化现象，发现 t - d n a 随机地整合在染色体上，而且转化效率比常规转化法高6 0 0 倍。g r o o t 等还研究了其它丝状真菌中由t i 质粒介导的转化现象，包括a n i g e r ，f u s a r i u m v e n e n a t u m ，zr e e s e i ，c o l l e t o t r i c h u mg l o e o s p o r i o i d e s ，n e u r o s p o r ac r o s s c i 以及 a g a r i c u sb i s p o r l l s 。结果表明t i 质粒可以有效地介导丝状真菌的转化【l 9 1 。 气 第一章文献综述 2 0 0 5 年f l o r 利用农杆菌介导成功地进行了红曲菌种属间的转化研究【2 0 1 ， 2 0 0 6 年丁月娣报道利用农杆菌介导法实现了红曲菌t d n a 的插入转化【2 1 1 。 1 1 3 3 电击转化法 电击转化法是利用电击穿孔使外源d n a 进入受体菌的转化。在高压脉冲 作用下，原生质体质膜上能够形成可逆的瞬间通道，从而使外源d n a 进入细 胞内，并且原生质体质膜在一定时间内可自动修复，使细胞恢复至正常的生理状 态。具体操作方法如下：将待转化原生质体和外源d n a 片段混匀置于电解液 中，然后用电脉冲在原生质体膜上电击形成小孔，d n a 片段由此进入细胞内， 最终整合到基因组中。电击转化方法中的溶液介质、原生质体浓度、外源d n a 纯度、电场强度和脉冲时间都是制约转化率的重要因素。一 2 0 0 3 年k i m 运用电击转化法对紫色红曲菌( m p u r p u r e u s ) d s m l 3 7 9 进行 转化，最高转化效率达到了4 0 0 个转化子腭d n a 1 2 j 。 1 1 3 4 限制性内切酶介导的转化法 限制性内切酶介导的转化法( r e s t r i c t i o ne n z y m e m e d i a t e di n t e g r a t i o n ，r e m i ) 是在限制性内切酶的介导下，将外源d n a 片段插入到宿主菌的染色体中。由 于限制性内切酶的酶切位点在染色体上分布广泛，所以在染色体d n a 上会引 起很多外源d n a 片段插入，可以获得许多不同插入位点的突变体。1 9 9 1 年， s c h i e s t l 等第一次在酿酒酵母菌( s c c r e v i s i a c ) 上使用了r e m i 技术【2 2 1 。 采用r e m i 技术构建突变库非常方便，而且插入位点多，可以筛选到许多 不同基因的突变体。但该方法需要制备原生质体，且内切酶的选择随意性大，内 切酶的酶切位点在染色体d n a 上的分布也并不完全随机，基因组上某些基因 未能覆盖到。用此方法建立突变库进行筛选，某些相关基因的筛选可能会发生遗 漏。 1 1 3 5 基因枪转化法 基因枪转化法又称微弹轰击法( m i c r o p r o j e c t i l eb o m b a r d m e m ) ，它是k l e i n 等在1 9 7 8 年建立起来的一种技术。其主要原理是将外源d n a 包裹在金粉或钨 粉表面，然后将微粒高速射入受体细胞或组织。微粒上的外源d n a 也随之带 入细胞内并整合到染色体上，从而实现基因的转化。 影响基因枪转化法的主要因素【2 3 】是微弹颗粒的大小，与微弹结合的d n a 的 量及结合程度，受体细胞的生理状态等。使用基因枪转化法往往获得嵌合转化体， 6 第一章文献综述 须反复进行筛选。 2 0 0 3 年k a m o l n a nl a k r o d 等【2 4 n f f 基因枪转化法将带有潮霉素b 抗性基因 的p m o c o s x 质粒成功导入红曲菌菌体内。 1 2 未知基因的克隆策略 克隆基因可以用来发展生命科学，改良农作物、畜禽品种等，还可用于对遗 传性疾病进行基因治疗，研究疾病的分子机制和生物发育调控规律等。由于基因 组计划需要耗费大量入力、物力、财力，因此并非每一种生物都可以进行基因组 测序，而模式生物的基因有时不能直接用于其它生物，因而克隆一些其它物种对 人类有益的基因也变得日益重要。 最初人们常以基因产物出发来分离克隆基因，由于基因产物的结构、功能已 知，可通过分析氨基酸序列反推其核菅酸序列，设计探针或引物从基因组d n a 文库或c d n a 文库中筛选克隆目的基因，也可以制备基因产物抗体，从表达载 体构建的c d n a 文库中筛选相应克隆。近年来，反向遗传学( r e v e r s eg e n e t i c s ) 的建立与发展，为分离未知产物的基因提供了越来越多的策略和思路1 2 引。 目前，新基因克隆策略主要有五种：同源序列法、图位克隆法、转座子标签 法、表达序列标签法及差异表达基因的分离方法。i 1 2 1 同源序列法 随着对基因认识的不断积累和深入，人们发现几乎所有的基因与其它物种的 基因都有一定的联系。人们将功能相似的基因归为一个家族，基因家族成员之间 通过生物信息学分析能够找到高度同源区域。根据这一特点发展起了基于保守氨 基酸序列的基因克隆法。其基本思路为：根据基因家族各成员间保守氨基酸序列 设计简并引物，用简并引物对含有目的基因的模板进行简并p c r 扩增，再对 p c r 扩增产物进行克隆、测序和鉴定。 该方法使用方便、应用广泛，但有些问题【2 6 】需要注意：由于密码子的简 并性和氨基酸保守程度的差异，简并引物的设计要注意特异性。由于同源序列 为基因家族共有，因而扩增产物不一定是特定基因家族成员。克隆所得基因片 段是否为目的基因需进一步验证。 应用简并p c r 方法成功与否的关键在于简并引物的设计。 第一章文献综述 1 2 1 1 传统简并引物的设计 简并p c r 与常规p c r 之间的主要区别是用简并引物代替特异序列的 p c r 引物。简并引物的出现是由于根据氨基酸的保守序列反推到d n a 水平设 计引物时所用的三联密码子具有简并性，这样设计出来的引物是可能编码一个给 定氨基酸序列的核苷酸的混合物，称之为简并引物【27 1 。 简并引物的简并度是通过每一个位置可能的核苷酸数相乘得到。例如，“a l a a s ni l el y sm e t ”的引物库简并度为4 2 3 2 1 = 4 8 ( 编码简并度：a l a = 4 ， a s n = 2 ，i l e = 3 ，l y s = 2 ，m e t = 1 ) 。简并引物缩写详见表1 3 。 表1 - 3 简并引物缩写表 r = a gy = c t m = a c k = g ts = c gw = k r h = a | c rb = c | q 氏v = m c | g d = a | g rn = a | c | q r 简并引物的设计应遵循以下几个原则2 8 , 2 9 1 ： 考虑所选靶扩增区的进化保守性和简并p c r 的扩增特异性，选择同源性 高且简并性低的氨基酸区域，如蛋氨酸和色氨酸均只有一个密码子，最好 不选择具有4 或6 个密码子的氨基酸肽段，简并程度最好不超过5 1 6 倍。 根据生物使用密码子的偏好性，选择使用率最高的密码子，进一步限定引 物的简并度。 引物的3 端不应存在简并，引物单碱基错配会阻碍简并p c r 的延伸。 在一些多义未知使用能与多种成分配合的脱氧次黄苷以降低简并度。也可 以使用能与嘌呤或嘧啶配对的稀有碱基。 引物的长度可短到对应4 6 个氨基酸的长度，一般为1 5 2 0 个核苷酸。 现在p c r 引物设计都通过计算机软件进行。具有引物设计功能的软件有 很多，通常使用p r i m e rp r e m i e r5 0 可以满足设计简并引物的要求。 1 2 1 2c o d e h o p 策略设计简并引物 传统方法设计的简并引物通常简并度过高，导致有效引物利用率过低，p c r 产物的非特异性增高。缩短简并引物长度可相应减少简并度，但如果引物t m 值 8 ) ) ) ) ) 1 2 3 4 5l，kl，k 第一章文献综述 过低，p c r 产物的假阳性率也会提高，有时不得不设计第三条引物对p c r 产 物进行第二次扩增，即巢式p c r l 刈。 与传统方法设计的简并引物不同，利用c o d e h o p ( c o n s e n s u s d e g e n e r a t e h y b r i do l i g o n u c l e o t i d ep r i m e r s ) 策略设计的引物由两部分组成，如图1 1 所示。 引物3 端为根据4 个保守氨基酸设计的核心简并区( 3 c o r er e g i o n ) ，长度只 有1 1 1 2 个碱基。引物5 端为特异性夹板结构( 5 c o n s e n s