（发酵工程专业论文）压力对酵母菌及其产海藻糖的影响.pdf

天津科技大学硕士论文 摘要 高压条件下，酵母菌细胞受到刺激后发生应激性反应。海藻糖是很多生 物体受环境胁迫所产生的重要的应激性代谢产物之一，它是由两个葡萄糖分 子结合组成的非还原性双糖，由于它对生物大分子具有非特异性保护作用， 从而在食品、医药、生物化学等领域得到了广泛的应用。本文研究主要内容 为压力条件下酵母菌积累海藻糖最佳条件的确立、不同酵母菌积累胞内海藻 糖随处理时间的变化和相应合成酶系活力的研究、不同酵母菌种及其他条件 下细胞的变化等。 首先本文以面包酵母为研究菌株，初步研究了压力条件下不同压力值、 处理时间、反应温度、p h 值、升降压速率、处理前培养时间、培养基等因素 对菌体积累海藻糖所产生的影响。确定了压力为0 5 l0 m p a ，反应处理时间 为3 h ，反应温度为3 4 。c ，发酵液p h 值调整为6 0 ，升降压速率为0 0 5 o 1 0 m p a m i n ，选用复合培养基为酵母菌积累胞内海藻糖的最适条件。 其次研究了六种不同酵母菌在l _ 0 m p a 的压力条件下，菌体积累海藻糖( 可 能还有其他低分子量的应激性代谢产物) 与高压处理时间的关系，说明不同 酵母菌种对压力具有不同的敏感性；它们之间的不同说明海藻糖的合成途径 可能有多种方式，即便是同一种生物中，也有可能存在一种以上的合成途径。 同时确立了一种测定海藻糖合成酶系活力的方法，以2 甲苯和0 2 e d t a 溶液作为细胞渗透剂处理酵母细胞，以1 0 的葡萄糖溶液作为酶促反应的底 物，采用生物传感仪一硫酸蒽酮显色法测定了相应的海藻糖合成酶系的活力。 最后以扫描式电子显微镜拍摄图像，说明经过高压处理后酵母菌体细胞 发生变形，胞质和内含物聚集两端，里现纺锤形，细胞表面有收缩褶皱和塌 陷。同时还有活细胞数减少、存活率的降低、营体量减小以及p s 值略微升高 等各种现象，均与海藻糖含量高低有关系。还分别以c 0 2 和n 2 作为加压气源， 以面包酵母w r - - 5 作为研究菌株，以溶液电导率值的变化来表示细胞的渗透 性，分别研究了不同压力、升降压速率、处理时间和处理温度对细胞渗透性 变化的影响。 关键词：压力，酵母菌，胞内海藻糖含量 a b s h 乙c t a b s t r a c t u n d e rt h ec o n d i t i o no fh i g hp r e s s u r e ，t h ei r r i t a t i v er e a c t i o no c c u r r e da f t e r b e i n gs t i m u l a t e df o rt h ey e a s tc e l l s t r e h a l o s ei so n eo ft h ei m p o r t a n ti r r i t a t i v e m e t a b o l i cp r o d u c t i o n so f p l e n t yo fm i c r o o r g a n i s m ，d u r i n gt h e yw e r ei n t i m i d a t e d b yt h ee n v i r o n m e n t ，i ti s an o n r e d u c i n gd i s a c c h a r i d ew i t ht w o g l u c o s er e s i d u e s b e c a u s et r e h a l o s ee x h i b i tp r o t e c t i v ea c t i o n a g a i n s td a m a g eo fh i g h m o l e c u l a r s u b s t a n c e s ，i ta c h i e v ew i d e s p r e a da p p l i c a t i o ni nav a r i e t yo ff i e l d si n c l u d i n g f o o d s 、p h a r m a c e u t i c sa n db i o c h e m i s t r y e t c i nt h i s p a p e r , t h em a i n r e s e a r c h c o n t e n t si n c l u d ee s t a b l i s h i n gt h eo p t i m u mc o n d i t i o n so f y e a s tt h a l l ia c c u m u l a t i n g t r e h a l o s ei nt h eh i g hp r e s s u r ec i r c u m s t a n c e ，i n t r a c e l l u l a rt r e h a l o s ea c c u m u l a t e db y d i f f e r e n ts o r t so fy e a s t sv a r y i n gf r o mt h e p r e c e s s i n gt i m ea n dc o r r e s p o n d i n g t r e h a l o s es y n t h a s es y s t e m a c t i v i t y , t h ec h a n g eo f s o m ep a r a m e t e r o f d i f f e r e n ty e a s t c e l i su n d e ro t h e rc o n d i t i o n s a tf i r s t ，b yu s i n gb a k e r sy e a s t ( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) a si n i t i a ln r a i n ， t h ef a c t o r sa f f e c t i n gt h ei n t r a c e c e l l u l a rt r e h a l o s ep r o d u c t i o nw e r es t u d i e di nt h i s p a p e r c o n t a i n i n gd i f f e r e n tp r e s s u r ev a l u e , p r o c e s s i n gt i m e ，r e a c t i o nt e m p e r a t u r e ， p hv a l u e ，p r e s s i n g a n dd e c o m p r e s s i n gr a t e s ，c u l t u r et i m eb e f o r e p r o c e s s i n g ， c u l t u r em e d i u ma n d m a n y f a c t o r s ，t h e o p t i m u mc o n d i t i o n s o fy e a s tt h a l l i a c c u m u l a t i n gt r e h a l o s ei nt h eh i g hp r e s s u r ec i r c u m s t a n c ew a se s t a b l i s h e d ，a st h e y a r e ，p r e s s u r ev a l u e 05 l0 m p a , p r o c e s s i n g t i m e3 h ，r e a c t i o nt e m p e r a t u r e3 4 。c ， p h 6 0 ，p r e s s i n g a n dd e p r e s s i n gr a t e s o 0 5 o1 0 m p a m i n ，s e l e c t i n g c o m p o s i t e c u l t u r em e d i u m s e c o n d l y , t h r e es o r t so fs a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ，s i xs t r a i n s ( b e e ry e a s t g z h a n d u s a 、b a k e ry e a s t s a f a n d w r 一5 、a l c o h o ly e a s t a y 一3a n d a y 一1 1 、 w r es e l e c t e d8 s 0 1 1 1 1 - s t u d yo b j e c t s u n d e rt h ec o n d i t i o no f1 0 m p a ，t h a l l i a c c u m u l a t i n gi n t r a c e c e l l u l a rt r e h a l o s ev a r y i n gf r o mp r o c e s s i n gt i m ew f es t u d i e d t h er e s u l t ss h o w e dd i f f e r e n ts o r t so fy e a s t sh a dv a r i o u ss e n s i t i v e i t yf o rt h eh i g h p r e s s u r e ，a n df u r t h e re x p l a i n e dt h es y n t h e s i sp a t ho fi n t r a c e c e u u l a rt r e h a l o s eh a d p o s s i b l ym a n yk i n d s ，a si ft h es a m es o r th a da l s op r o b a b l y l o r et h a no n ep a t h s s i m u l t a n e o u s l yt h en e w m e t h o do f d e t e r m i n i n g t r e h a l o s es y n t h a s es y s t e ma c t i v i t y w a se s t a b l i s h e dy e a s tc e l l sw r ep e n e t r a t e db y2 t o l u e n ea n do 2 e d t a s o l u t i o na si n f i l t r a t i o nr e a g e n t 10 g l u c o s es o l u t i o nw a su s e de n z y m ec a t a l y s i s s u b s t r a t e s c o r r e s p o n d i n gt r e h a l o s es y n t h a s es y s t e ma c t i v i t y w a sd e t e r m i n e db y 天津科技丈学硕士论文 u s i n gb i o s e n s o ri n s t r u m e n t s u l f a t ea n t h r o n ec o l o r i m e t r i c f i n a l l yt h e c e l le l e c t r o n m i c r o g r a p h w e r et a k e n b yu s i n g s c a ne l e c t r o n m i c r o s c o p e t h e r e s u l t ss h o w e dy e a s tc e i l s d i s t o r t i o na f t e r h i g hp r e s s u r e p r o c e s s i n g ，t h e r ew e r em a n ys h r i n k a g e ，d r a p e s ，p l e a t sa n dd e n t s o nt h ec e l l s u r f a c e s ，p r e s e n t e ds p i n d l es h a p e s i m u l t a n e o u s l y c o n c o m i t a n tc h a r a c t e r sw e r et h e a c t i v ec e l l q u a n t i t y a n ds u r v i v a lr a t e d e c e a s i n g ，b i o m a s sr e d u c i n g a n dp h a p p r e c i a b l yr i s i n ge t c a l lo ft h e mh a d ar e l a t i o nw i t ht h ei n t r a c e c e l l u l a rt r e h a l o s e c o n t e n t i na d d i t i o n ，c 0 2a n dn 2w r eu s e da sp r e s s i n gg a sa n db a k e r sy e a s tw r 一5 w a ss e l e c t e dr e s e a r c hs t r a i n ，t h ec e l lp e n e t r a b i l i t yw a sd e n o t e d b yt h ec o n d u c t a n c e v a l u ev a r i e t yo ft h es o l u t i o n t h ef a c t o r sa f f e c t i n gt h ec e l lp e n e t r a b i l i t yi n c l u d i n g d i f f e r e n t p r e s s u r ev a l u e ，p r e s s i n g a n d d e c o m p r e s s i n gr a t e s ，p r o c e s s i n g t i m e ， r e a c t i o n t e m p e r a t u r ew r e s t u d i e di nt h i sp a p e r k e y w o r d s ： p r e s s u r e ；y e a s t ( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) ；i n t r a c e l l u l a rt r e h a l o s ec o n t e n t ； 1 1 1 天津科技大学硕士学位论文 1 前言 1 1 引言 生物物种多样性是目前生物学研究领域最为活跃的问题之一。随着人类 对地球本身乃至整个宇宙的探索，在以前被认为是生命禁区的极端环境里， 人们发现了许多微生物以其独特的生理机制及生命活动繁衍生息着【“2 1 。最近 几年的研究发现，在地下找到大量令人惊讶的微生物种类，这些微生物多数 完全不需要太阳能，它们会利用地球内部的热能来合成它们所需的有机物【3 】。 科学家在南极一个冰湖半融化的冰层和紧贴水面的水中，取回的核心样品中 含有冷冻状态的细菌和水藻。它们在实验室中恢复了生命【羽。这种生活芳式 推翻了以往人们所认为的生物圈，扩大了其范围。 压力是一个重要的环境参数。有超过7 0 的地球表面是被海洋所覆盖( 平 均静水压为0 4 k b a r ，1 b a r = 1 0 5p a ) ，深海生物适应了其所处的环境，即高压 和低温( 1 3 ) 。多数微生物通常在常压下进行正常的新陈代谢活动，所以 压力通常不被作为影响微生物生理特点、物化特性以及代谢产物变化的因素 加以考虑。加压条件下的高压环境，对常压下生存的微生物来说，也是一种 具有模拟极端环境的刺激条件。 1 2 高压环境对微生物的影响 1 2 1 高压生物技术起源 高压生物技术是指利用现代科学技术手段来研究高压环境对适压生物的 形态结构、生理特点、物化特性、代谢机制、遗传物质和机体防御机制等方 面的影响，以及对相应的应激性代谢产物进行研究，努力挖掘和提高生物活 性物质的开发能力，为将来产生巨大的经济效益和社会效益而进行的尚处于 初始阶段的技术研究。高压生物技术的研究始于1 9 1 4 年，美国物理学家 b r i a g m u ne w 首先发现，高压会产生蛋白质的变性凝固( 压力增大时，蛋白 质甚至会产生凝胶的现象) 和酶的失活，还能杀死生物及微生物【5 l o 后来陆 续也有一些报道，但大多数研究只是在单纯培养基上进行。约2 0 年前，美国 一货船沉入1 5 0 0 m 的深海底，一年后打捞上来，在船长室里的苹果、三明治 和肉汁都没有腐败变质( 苹果被压得象条乳黄瓜婶】1 a 对此现象进行研究，发现 在海底的约1 5 0 个大气压和约2 c 的环境中，微生物虽可以生存，但不能增殖， 最后会因环境恶劣渐渐死亡。所以在海洋深处达1 万米的海底，其环境相当 于1 0 0 0 个大气压，能生长的耐压微生物是极少的。高压生物技术的应用最早 出现于9 0 年代早期的日本，1 9 8 7 年在东京大学林力丸的倡导下，日本学者了 解到高压可以使许多压力敏感微生物失活和压力可对大分子系统产生剧烈影 响，开始研究用高压( 静水压) 杀死食品中微生物的方法【w ，将这一技术用于 食品的贮藏和加工悼”1 。 前言 1 2 2 高压环境中的微生物 1 2 2 。l 微生物的分类及特性 地球上存在着诸如深海、油井等高压环境，这些环境都发现有微生物。 如在3 ，5 0 0 米以下的油井中存在一种硫酸盐还原菌，它可在约4 0 0 个大气压 下生长；另外一种生活在深海的假单胞菌可在l ，0 0 0 个大气压下生长1 2 】。这 类微生物称之为适压微生物饵a r 0a d a p t e dm i c r o o r g a n i s m ) ，又可分为嗜压型 ( b a r o p h i l e s ) 和耐压型( b a r o t o l e r a n t ) 1 1 。嗜压型生存于极端压力下，分布于自然 界的深海海底，深海动物及深海热液排放口、石油及硫的深井。前者为嗜压 嗜冷菌( 平均3 8 0 大气压，o 一4 ) ；后者为嗜压嗜热菌( 可达4 0 0 大气压，1 0 0 以上) 。它们必须生活在高静水压环境中，能耐普通微生物不能忍耐的高压， 而不能在常压下生长，在高于常压的环境中才能生长更好【1 “，深海中的微生 物利用碳氢化合物的能力所知甚少。耐压型f b a r o t o l e r a n t ) 指一类能耐受一定高 压，但也可在低压环境中正常生长的微生物。主要应用于高压生物反应器以 及耐压酶的研制。 1 i2 2 2 微生物的生存及应用 多数适压微生物生长在0 7 o 8 m p a 环境中，商的可达1 0 4 m p a 以上， 低于0 4 0 5 m p a 则不能生长。目前报道的最耐压的是美国海洋学家发现的 一些种，能够生长在1 3 1 4 m p a 环境中。日本科学家也在3 0 0 6 0 0 米深的 深海鱼类肠道内发现了极端嗜压菌f 】2 j 。在海洋内，压力随深度直线增加，大 约每1 0 米深增加一个大气压。在大洋深达6 淫处的压力( 1 涅= 1 8 6 2 米) 是 水面压力的1 0 0 0 倍。在这里生活着专性嗜压菌，如分离到的一种嗜压假单胞 菌( p s e u d o m o n a sb a t h y c e t e s ) 。这些专性嗜压菌的生长是极缓慢的。将 p s e u d o m o n a sb a t h y c e t e s 放入1 0 0 0 大气压3 c 培养，发现延迟期大约为4 个月， 增代时间为3 3 天，一年后达到静止期。在深油井或硫泉内，压力是以每1 0 米一个大气压的平均比例随深度增加，温度以约每米0 0 1 4 1 。c 的平均数而增 加，在深约4 0 0 0 米，压力约为4 0 0 大气压、温度为6 0 1 0 5 的油井和硫 泉内，分离出耐热性硫酸盐还原菌l l ”。 据报道，曰b o r b o r o k o i t e s ，m a g u 如i v i u s 、p s p e r f e c t t o m a r i n u s ，v i b r i o p h y t o p l a n k t i s 在6 0 0 大气压生长良好；p s b a t h y c e t e s 在1 0 0 0 大气压3 c 生长良 好；自石油深井分离的株硫酸盐还原菌在4 0 0 大气压1 0 5 生长良好；自深 海热液排放口分离的菌株有硫小孢菌( t h i o m i c r o s p o r a ) ，类热发菌 f c a l o t h r i x 1 i k e ) ，生丝微菌( h y p h o m i c r o b i u m ) ，生丝单胞菌( h y p h o m o n a s ) ，甲 烷球菌( m t 妇 o c o c c 骶) 以及氧化锰的细菌。嗜压菌代谢缓慢( 附着于深海动 物的菌除外1 。已有将嗜压菌应用于阐明海底次生铁矿锰矿形成的报道，以及 对海底嗜压菌的应用进行初步研究的报道 1 4 】。日本发现的深海鱼类肠道内的 嗜压古细菌，8 0 以上细菌株可以生产e p a 和d h a ，最高产量可达3 6 和 2 天津科技大学硕士学位论文 2 4 。已经有人通过基因重组，使这些细菌有效生产d h a 。另外，嗜压菌还 可以用于高压生物反应器【1 2 1 。 1 2 2 3 微生物的耐压机理及前景 嗜压机理是其d n a 中有一组能调节压力影响的基因。这组基因能在 0 3 m p a 下表达，并通过它减少某些蛋白质的产出率，从而在压力增加的条件 下，可以减少膜的通道，达到阻止体内的糖和其它营养成分扩散到体外 1 5 1 6 j 。 利用基因工程技术将极端微生物特异功能基因片段转入一般微生物体内 或将一般微生物特异基因片段导入极端微生物中，从而改造受体的生理功能， 甚至创造新的物种。总之，采用基因工程技术对极端微生物形状、功能进行 有益改良，进而为人类服务是一条崭新的道路l 】j 。 1 2 3 高压条件对微生物细胞的影响 1 2 3 1 高压对微生物的致死 高压生物技术最初的发现是其应用于杀死生物及微生物，逐步应用于灭 菌技术。对于一些耐热的微生物，如芽胞杆菌，梭状芽胞杆菌，如果高压与 其它方法结合如加热、超声波、电磁场、高压脉冲等会更有效地杀死微生物1 1 ”。 而m a g g i 1 8 】等报道间歇加压是一种有效的杀死芽胞的方法。这是因为超高压 处理对芽胞具有活化作用，促使芽胞发芽，发芽的芽胞对压力更为敏感，因 此压力处理一段时间后，重复压力处理具有明显的杀灭芽胞的作用。 病毒对l 3k b a r 之间的中等程度的压力处理非常敏感【1 。许多病毒在高 压条件下失活已经成功的实现，例如疱疹病毒。当压力与低温或尿素配合 使用时，可以使病毒更易分解。这一技术可能的应用有：生物复合物中病毒 的失活，生物材料、血液、工具的灭菌。目前已经有人提出利用体外高压处 理病毒感染者血液中的病毒如a i d s 的建议。 1 2 3 2 高压对微生物细胞结构的破坏 细胞壁和细胞膜是微生物细胞的主要结构，如果细胞壁和细胞膜的结构发 生变化，其功能势必也随着改变，并最终导致细胞的死亡【2 ”。实验结果表明， 高压可以引起细胞形状、细胞膜和细胞壁的结构和功能发生变化。q s u m i 2 2 1 等 利用t e m 和s e m 研究了在0 4 0 0 m p a 的压力下双形热带念珠菌的细胞结构及骨架 变化，他们发现在2 0 0 m p a 的压力下，细胞壁遭到破坏，细胞的亚显微结构也发 生变化，线粒体的嵴受到不同程度的损伤，核膜孔张开且被破坏。 p a u l ( 23 】等也通过实验证实细菌受到压力后细胞膜破裂，他们用可与d n a 结 合的荧光染料溴乙锭处理受压的细胞，在荧光显微镜下观察到：受压时f 可短的 细胞内有荧光物质，说明细胞膜破裂，溴乙锭进入细胞内与d n a 结合，但是在受 压时间长的细胞内却没有观察到上述现象，这是出于高压使d n a 断裂，不能与溴 化乙锭结合。因此细胞内物质的丢失被认为是细胞死亡的原因之一。另外通常 情况下，胆盐是不能进入细胞外膜的，n a c i 也不能渗透到细胞内膜。但是细胞 受到压力后，胆盐和n a d 都可以进入细胞内引起细胞损伤。正常细胞对盐不敏 感，但经高压处理后的细胞对盐非常敏感，压力越大，对盐的敏感性越大。 l _ 2 3 3 高压对微生物细胞核内物质的影响 高压对细胞核物质也有一定的影响。利用电子显微镜观察到高压对大肠杆 菌的d n a 有显著的影响1 2 。正常情况下，遗传物质和核糖体均匀地分布在整个 细胞。但是受压后，遗传物质凝集成块，胞浆r n a 漏出，胞浆内部分区域没有核 糖体，而且出现了密度斑：这是由于核糖体亚单位或胞浆蛋白质聚集而成，这 些明显的变化发生在细胞静止期和对数生长中期。用凝胶电泳测得细胞中d n a 并h r n a 断裂，而且p a u l 等还首次证实在压力达到1 0 0 0 m p a ，2 4 小时对体p b d n a 完全 无影响。对d n a 突变体的进一步研究表明，在核酸内切酶a 缺乏的突变体中的d n a 受压不发生链的断裂，因此可以认为高压致死细胞是使原本分开的遗传物质和 核酸内切酶结合在一起，因此核酸的破坏是高压致死细胞的另一个原因。高压 对质粒d n a 的影响不显著。 1 2 3 4 高压对微生物细胞活性的影响 h a a s ，g j 【2 4 】等人所做实验数据表明增加c 0 2 压力和处理时间会减少微 生物细胞数。l i n ，h 一m 等人研究压力下不同微生物发现它们对c 0 2 抑制作用 具有不同的抗性。这种敏感性的不同与细胞膜和c 0 2 渗透性有关，压力越大 和处理时间越长会增加c 0 2 的溶解性，这样会进一步增加菌体悬浮液的酸度 陋2 剐。w e i ，c i 【2 7 】等人认为这些微生物的影响不仅与实验条件有关，而且与 所用的加压气体的特性有关，用n 2 和0 2 ( 8 0 2 0 ) 的混合气体加压8 5 m p a 处理时间为4 h ，则没有杀菌效果，微生物细胞数没有减少。 e d e b s l o u k a 等人1 2 8 l 实验从4 0 m p a 的压力以0 4 s 、1 5 m i n 、5 0 m i n 三种 降压时间至常压，结论认为降压速率对菌体细胞没有太大的影响。处理后微 生物的细胞数没有明显的不同。但是f r a s e r d 和l i n ，h 一m 等人【聊0 , 3 1 1 坚持认 为快速降压是提升灭菌处理效果的一个重要参数。这些解释是作者采用c 0 2 加压，c 0 2 很容易穿透进入细胞，快速降压由于c 0 2 膨胀促进细胞破裂。这 些假设还需要进一步的研究。 高压通过对膜的影响、关键酶的失活和抑制蛋白质的生物合成使微生物 失活【3 2 】。尽管有些细菌可以耐受高达8k b a r 的高压f 3 3 】，但高压与适度温度的 组合可以用于热敏物质、脂质体、化妆品甚至小型手术和内窥镜工具的灭菌 消毒。细菌芽孢对压力具有较高的抗性。不过可以将压力与加热或化学处理 配合使用，则可使细菌芽孢失活i l 。 1 3 高压环境对微生物产生影响的作用机理 1 3 1 压力对化学键的影响机理 在压力生物工艺所采用的压力范围内，压力通常对化合物中的共价键没 有影响。因此，在室温下经高压处理，许多天然化合物如香味、风味物质； 4 天津科技大学硕士学位论文 染料和药理活性分子等物质都不会被破坏。有些维生素原和维生素( b 一胡 萝h 素、硫胺素v b l 、核黄素、叶酸、抗坏血酸、维生素a 、维生素e ) 已经 被证明对6 0 0 8 0 0 m p a 压力具有抗性。环加成反应，例如狄而斯一阿尔德反 应，伴随着体积的收缩，在压力作用下反应会加速。从而表明在提高压力 ( 6 5 0 m p a ) 和温度( 7 0 。c 1 的条件下，这些反应会促进维生素k 和辅酶q 的破坏。 由于可对非共价键发挥作用，而使压力可对细胞膜结构、生物多聚物和大分 子聚合体产生破坏作用。疏水键是与蛋白质、胶束和脂质的稳定性有关的最 重要的弱键，这些键之间的相互作用在压力的影响下会发生不同的改变。氢 键在压力作用下会被加强并伴随有体积收缩，离子键在压力作用下会断裂。 酸、碱、盐的电离和水的自身电离作用在压力影响下会加强。核酸和多糖都 具有压力抗性，这是因为这些物质的二级结构主要是由对压力影响不敏感的 氢键构成i j 4 。1 。 1 3 2 压力对酶活的的影响机理 高压条件或超临界c 0 2 条件下的酶促反应是酶工程研究领域一个崭新的 充满生机的方面”。压力低于3 0 0 m p a 时，可以使酶失活但不会引起蛋白 质结构中大范围的构象变化。此外，有证据表明，在某些情况下，适度的压 力会诱导构象向“熔球态”转换，即成为局部质密的展开状态。经高压作用 后酶会不可逆地失活，酶的失活也是细胞死亡的主要原因之一。当大肠杆菌 受压后，参与呼吸作用的柠檬酸脱氢酶的活性明显降低，在4 0 0 m p a ，5 分钟 后其活性完全丧失。高压对h i v 的灭活除了包膜、d n a 损伤外，逆转录酶的灭 活也是其死亡的主要原因之一。相同的压力对不同毒株h i v 的逆转录酶灭活 程度是不同的：4 0 0 m p a 时h t l v - - i i i b 的逆转录酶完全灭活，而k k 一1 、k k 一2 和重组h i v - i 的逆转录酶保持了部分活性；5 0 0 m p a 时，k k - 2 保持了5 7 的活 性，5 5 0 m p a 只保持了2 0 1 3 8 1 。 但是p a t r i c km a s s o n 等人1 3 9 】认为压力可以稳定酶并且可以调节酶的活性 及其专一性。在温和条件的酶催化合成药物被研究证实是可行的。尤其是酯 类物质的异构体选择性合成，如利用脂肪酶合成酯化布洛芬、利用嗜热菌蛋 白酶生产药物多肽【帅】，及多元醇和甜味剂等。这些反应都是在具有一定压力 的生物反应器中下进行的，通常使用压力低于2k b a r ，因为此压力不会改变 酶的稳定性和功能。通过对稳定的助溶剂或有机质介质进行高压处理，可以 提高工业用酶的热力学稳定性1 4 ”。压力可以促进植物细胞中天然存在酶所催 化的反应。例如，高压会促进十字花科植物g l u c o s y n o l a t e s 的水解。从而产生 具有生物活性的异硫氰酸盐( i s o t h i o c y n a t e s ) 。从花椰菜汁液中得到的葡萄糖 萝h 子素可以转化为萝h 硫素，该物质具有抗肿瘤活性和杀线虫的特性。【4 。 这些反应可用于食品的功能化和制造“n u t r a c e u t i c a l s ”以治疗o m p l e m e n t a r y 。 利用高压处理技术可使蔬菜中一些酶失活，而对其色泽、香味影响较小， 前言 随着处理压力加大、处理温度升高，酶失活速度加快，过氧化酶的含量与处理 时间的对数值呈直线减小。在高压处理酶时，必须注意压力和温度的协同作用。 1 3 3 压力对蛋白质的影响机理 高压处理过程还会引起蛋白质的变性。压力下蛋白质变性是一个复杂的多 级过程，受压力范围、压缩速度和处理时间的影响。通过对蛋白质变性的温度 压力之间相关性研究发现，两者呈椭圆型关系【”j 。蛋白质的高压变性起因于 加压后溶液体积减少。天然蛋白质并不以一级构造的形式存在，而是星球状或一 四转椭圆球状( 称为蛋白质的三级构造) 存在但细看三级构造的一部分却有螺 旋构造( h e li x 构造) 或折叠构造( s * o 造) 或不规则构造，这些构造称为二级构 造形成三级构造的力量并不是共有结合而是离子结合，氢结合成疏水结合等 较弱的非共有结合。蛋白质的变性是指三级构造的破坏。这种立体构造的破坏 是由模拟试验证实的，经加压后疏水结合及离子结合会因体积的缩小而被切断， 于是立体构造崩溃而导致蛋白质变性。蛋自质在t 0 0 0 、2 0 0 0 a t m 下变性后，一旦 释压则会恢复未变性状态，如果使之变得不可逆，就需要更高的压力，而且依 蛋白质的种类而不同1 4 3 l 。在高压下还可做到蛋白质和多糖的酶改性。尤其是， 压力可以调节酶的活性如蛋白酶的专一性。 蛋白质是对压力作用最敏感的生物分子【3 5 , 4 4 】。压力低于3k b a r 时，可以 使酶失活，但不会引起蛋白质结构中大范围的构象变化。压力下蛋白质变性 过程极为复杂，除了受压力范围大小的影响，压力条件下的其他因素如升降 压速率的快慢和加压处理时间的长短，对蛋白质变形也有较大的影响。此外， 有证据表明，在某些情况下，适度的压力会诱导构象向“熔球态”转换，即 成为局部质密的展开状态。 1 4 采用c 0 2 加压对高压环境中微生物的影响 1 4 。1 加压过程中c 0 2 的影响 o h l s o n s 等【4 6 】分析了低压条件下( 非超临界相态) c 0 2 对菌体的作用，这 些作用形式包括：( 1 ) c 0 2 作为细胞的一种“麻醉剂”吸收进入细胞膜，导致 细胞膜磷脂双分子层中的疏水端区域结构改变、临界宽度变宽。另外，高浓度 的c 0 2 和酶蛋白中的氨基反应产生的氨基甲酸酯能导致酶蛋白内部的静电吸引 或排斥而使其结构改变；c 0 2 与蛋白质的氨基基团反应，使得r n h 3 * 阳离子变 为r n h c o o 一阴离子，这种变化改变了细胞膜的表面电位差，使阴离子易于透过 细胞膜而抑制了阳离子在膜上的运输作用。( 2 ) c 0 2 通过膜的渗透作用进入细 胞质，导致细胞质的p h 值的变化，同时c 0 2 与细胞质内的酶蛋白结合也会使酶 的催化活性降低。( 3 ) 高浓度c 0 2 改变菌体内酶的催化反应速率，导致某种代 谢终产物或代谢中间产物的大量积累。 l - 4 2 加压过程中部分c 0 2 溶解对p i t 值的影响 采用c 0 2 加压处理微生物的过程中，c 0 2 在水中的浓度会明显的影响溶液中 天津科技大学硕士学位论文 的p h 值和其它因子。c 0 2 在水中的形态为1 4 5 】： c 0 2 + h 2 01 - _ + h 2 c 0 3 i _ + h c 0 3 + h + 1 + c 0 3 2 + 2 h + 当p h 值小于8 时，c 0 3 。浓度可以忽略不记，上式可变为： c 0 2 + h 2 0 + h 2 c 0 3 + h c 0 3 。+ h + 在升压和保持压力的过程中，部分c o ：在溶液中的大量溶解，由上述平 衡式可知，第一步先形成碳酸溶液，又因为其饱和溶解度相对较小，促使平 衡式进一步分解，得到游离的h + ，使细胞内外的p h 值降低，导致细胞内的 某些酶的催化活性降低，菌体的代谢发生紊乱。 1 4 3 升降压速率的影响 研究方向集中在提高细胞破碎效果方面。l i n 等人【”2 6 】认为在高压条件 下，二氧化碳穿透进入细胞内，当突然降压时，二氧化碳膨胀致使细胞破碎： 反复升降压力可以改善细胞的破碎速度。f r a s e r l 2 9 】也在1 9 5 1 年提出了这一问 题，他认为二氧化碳的压力尽快地下降可以获得最优的杀菌破碎结果。d e b s l o u k a 等人【2 8 】研究了降压速度对菌体存活率的影响。他们用4 m p a 的二氧化碳 对样本处理1 9 5 m i n 然后用不同的时间( 分别为0 4 s 、1 5 m i n 、5 0 m i n ) 降至大 气压，研究结果显示降压速度对菌体的失活速度没有显著的影响。但是许多 研究者认为快速的降压是导致菌体失活的一个重要的参数。两者的差异可能 是由于在此条件下二氧化碳更加易于穿透细胞膜进入细胞内部，压力的迅速 下降使细胞内部的二氧化碳膨胀，导致细胞的破碎。 1 4 4 采用c 0 2 加压与金属离子的作用 u n ，h 一m 等人f 2 l 】认为，碳酸氢根离子转变为碳酸根离子时，碳酸根离子 可与细胞内或细胞膜上的c a 2 + 、m 9 2 + 等离子结合形成沉淀，对细胞的生物体 系产生致命的破坏，发生破坏的位置主要集中于细胞膜的结构，蛋白质的生 物功能或者酶活性的平衡。钙基蛋白是调节细胞内生命活动最重要的一类蛋 白质。此类金属及蛋白质与碳酸根离子结合沉淀的难易程度由金属离子的结 合位置与蛋白质的化学结构决定。 1 5 高压条件下微生物的应激性反应 几乎所有生物，当受到各种应激因子( 生物、生理、物理、化学等) 刺激 时，激活一些基因的表达，其细胞和生物体会本能的合成一套保护性的物质， 从而保护生物免受应激胁迫的损害，这一系列的代谢变化，就是生物的应激 反应( s t r e s sr e s p o n s e ) ，它是生物在长期的进化过程中保留下来的自我保护 机制【4 “。在正常情况下，微生物体内的新陈代谢活动处于稳定状态，此时合 成代谢与分解代谢之间存在着平衡当机体受到外界刺激( 如高温、干燥或逆 境胁迫) 时，会产生各种应激反应，原有的平衡被破坏”。如动物体中白细胞 7 前言 岛。画。扩。飞。 前言 岛。画。扩。飞。 前言 岛。画。扩。飞。 天津科技大学硕士学位论文 通常，海藻糖受特异性酶海藻糖酶的分解，海藻糖酶是一种自然界广泛 存在的酶，它的存在范围比海藻糖存在范围还要广【5 8 】。也曾有人报导，一旦 大量摄取海藻糖，缺乏海藻糖酶的人就象缺乏乳糖酶而摄取乳糖一样。也会 有不适的症状【5 9 】。其水溶液性质稳定，无色无嗅，口感略带甜味，它不会焦 糖化| 鲫j 。海藻糖的理化性质十分稳定，不能使斐林试剂还原，也不能被a 一 糖苷酶水解，但在强酸条件下能被水解为两个葡萄糖分子。海藻糖的基本理 化性质如下【6 1 】： 表一海藻糖的基本性质 ( 1 ) 熔点二水结晶9 7 ：无水结晶2 5 1 5 ( 2 ) 熔解热二水结晶5 7 8 kj m o l ：无水结晶5 3 4 j m o l ( 3 ) 甜度为蔗糖的4 5 ( 4 ) 吸湿性含水结晶r h 9 0 以下没吸湿性 无水结晶r h 3 n 以上具吸湿性( 与含水结晶转换) ( 5 ) 消化性经口摄取后可消化吸收 6 溶解度( 在l o o g 水中含海藻糖的重量g ) 温度 l o2 03 04 05 06 07 08 09 0 溶解度 g l o o g 5 5 3 6 6 98 6 31 0 9 11 4 0 11 8 4 12 5 1 43 6 596 0 2 9 饱和浓度 3 5 6 4 0 84 6 35 2 25 8 36 4 87 1 57 8 58 5 8 ( 7 ) 渗透压 浓度 51 02 03 0 渗透压 m o s m k g 1 9 32 9 85 9 01 2 2 9 ( 8 ) 稳定性 水溶液对p h 稳定性( p h3 5 1 0 ，1 0 0 。c ，2 4 h r )9 9 以上残留 水溶液对热稳定性( 1 2 0 。c ，9 0 m i n )不褐变 水溶液对热稳定性( 在含有氨基酸或蛋白质的沸水中，9 0m i n )不褐变 水溶液长期保存稳定性 3 70 c ，1 2 月不分解，不褐变 海藻糖最初是从生活在沙漠中的一种甲虫蛹中分离得到，后来发现它存 在于低等维管植物、藻类、细菌、真菌、酵母、昆虫及无脊椎动物中。近年 来还发现人体的肾脏也存在海藻糖，其中磨菇中海藻糖比较丰富，占其干重 的1 l 1 7 ，所以海藻糖又称作蘑菇糖【6 2 】。 1 6 2 海藻糖的生物学特性 海藻糖对生物分子有特殊的保护作用，它能使许多生物在异常条件下，如 高温、脱水和冷冻时仍保持原活性，所以海藻糖对脱水干燥的生命物质有明 显的保护作用。 1 - 6 2 1 海藻糖对生物膜的保护作用 9 前言 生物膜表面结合水的存在对膜的稳定及保持完整有着重要作用。正常的 情况下，膜表面都存在大量的结合水，例如p c 脂质体、通常每一磷脂头部 都结合1 0 1 5 个水分子。结合水的存在使膜表面能降低，且使膜与膜间的 紧密接触即膜融合的第一步不能实现。但一旦失去结合水，膜结构将发生 系列变化，出现诸如磷脂相变温度升高【6 3 】，磷脂侧向相分离 6 4 】，膜脂的缺陷 及形成非双层相雌j 等等，从而使膜通透性增高乃至产生膜融合。海藻糖或其 它糖类( 甘露糖，葡萄糖等) 由于拥有许多羟基，则能够替代水和磷脂头部发 生氢键结合，从而取代失去的结合水，维持着生物膜表面“水化”状态。如 c r o w e 等从兔肌肉分离得到的肌浆网，在不存在海藻糖条件下进行干燥时， 其形态发生改变，再水化时，其转运钙的功能明显丧失，然而，当存在一定 浓度的海藻糖时( 相当于无水生活体内的浓度) ，在干燥过程中，形态几乎不 受损害，再水化时，转运钙的能力可恢复到原有水平( 。用其它生物膜作实 验也得到类似的结果。曾科等人研究发现海藻糖对聚乙二醇诱导的脂质体融 合具有抑制作用【6 ”。童济等人发现存在海藻糖时，包载抗肿瘤药物的阿糖胞 苷和阿霉素的脂质体，在经干燥，再水化后，其原有的内含物8 0 以上被保 留下来，比无海藻糖存在时增加4 倍以上【6 8 1 。海藻糖能稳定脂质体的结构， 在干燥状态下亦保持其结构的完整性，这便于脂质体的贮存，包装和运输， 有利于脂质体在制药工业上的应用