（食品科学专业论文）液态发酵豆粕制备大豆肽发酵条件的优化.pdf

0 i 一 0 ， 户 吩 f 龟 at h e s i ss u b m i t t e df o rt h e a p p l i c a t i o no f t h em a s t e r sd e g r e eo f e n g i n e e r i n g o p t i m u mc o n d i t i o n sf o rp r e p a r a t i o no f s o y b e a np e p t i d e sb yl i q u i ds t a t e f e r men t a t i o n c a n d i d a t e ： y a n gc a i y a n s p e c i a l t y ： f o o ds c i e n c e s u p e r v i s o r ：p r o f e s s o rs o n gj u n m e i s h a n d o n gi n s t i t u t eo fl i g h ti n d u s t r y , j i n a n ，c h i n a j u n e ，2 0 1 0 r t ， 学位论文独创性声明 本人声明，所呈交的学位论文系在导师指导下本人独立完成的研究成果。文 中引用他人的成果，均已做出明确标注或得到许可。论文内容未包含法律意义上 已属于他人的任何形式的研究成果，也不包含本人已用于其他学位申请的论文或 成果，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说 明并表示谢意。 论文作者签名： 学位论文知识产权权属声明 本人在导师指导下所完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属山东轻工 业学院。山东轻工业学院享有以任何方式发表、复制、公开阅览、借阅以及申请 专利等权利，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子 版，本人离校后发表或使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时， 署名单位仍然为山东轻工业学院。 论文作者签名： 栖杉夥 导师签名：重遮盘 日期：碰年白望日 日期：婴虚年角丛日 f ， f 矿 山东轻工业学院硕：卜学位论文 目录 摘要i a b s t r a c t i i i 第1 章绪论1 1 1 引言1 1 2 大豆肽的研究现状。l 1 2 1 大豆肽的特性1 1 2 2 大豆肽的应用2 1 2 3 大豆肽的生产2 1 3 立题依据及研究内容3 1 3 1 立题依据3 1 3 2 研究内容4 第2 章高转化率条件下大豆肽分子量分布的测定5 2 1 引言5 2 2 材料和方法5 2 2 1 实验材料5 2 2 2 实验方法6 2 3 结果与讨论8 2 3 1 标准物质图谱分析8 2 3 2 高转化率条件下分子量分布的测定1 0 2 3 3 动态发酵过程中的凝胶过滤图谱1 3 2 3 4 发酵过程中肽转化率随时间的变化趋势2 0 2 4 小结2 4 第3 章大豆肽分子量分布与酶系分布关系的研究2 5 3 1 引言2 5 3 2 材料和方法2 5 3 2 1 实验材料2 5 3 2 2 实验方法2 5 3 3 结果与讨论2 6 3 3 1 酪氨酸标准曲线的绘制2 6 3 3 2 发酵过程中蛋白酶酶活和低分子量肽的比率2 7 3 4 小结3 4 目录 第4 章大豆肽分子量分布与水解度( d h ) 关系的研究3 5 4 1 引言3 5 4 2 材料和方法3 5 4 2 1 实验材料3 5 4 2 2 实验方法3 5 4 3 结果与讨论3 6 4 4 小结4 3 第5 章大豆肽的苦味评定4 5 5 1 引言4 5 5 2 材料和方法4 5 5 2 1 实验材料4 5 5 2 2 实验方法4 5 5 3 结果与讨论4 6 5 3 1 各菌种发酵液的苦味评定4 6 5 3 2 枯草芽孢杆菌和黑曲霉混合发酵液的苦味评定4 7 5 4 小结4 8 结论4 9 展望5 1 参考文献5 3 致谢5 7 在读硕士期间发表的论文5 9 2 山东轻工业学院硕士学位论文 摘要 本实验室人员前期研究表明，采用液态发酵法利用枯草芽孢杆菌1 3 8 9 ，黑曲 霉a s 3 3 5 0 ，米曲霉a 9 0 0 5 发酵豆粕，通过这些微生物所分泌的各种蛋白酶对豆 粕中的蛋白质合适位点的切割，对某些肽基团和疏水性氨基酸末端进行修饰和重 排，最终可制得高转化率条件下的大豆肽产品，其中大豆肽转化率高达8 9 。由 于人体对低分子量肽( 分子量低于1 0 0 0 d a 的大豆肽) 的吸收率可达9 0 ，优质 的大豆肽分子量分布以低于1 0 0 0 d a 为主，同时低分子量肽能加快蛋白质合成， 提高矿物元素的吸收利用率，提高动物机体免疫力，阻碍脂肪的吸收，并能促进 脂质代谢，因此对所得大豆肽产品的分子量分布的测定具有很高的必要性，并且 通过对发酵条件的进一步优化有望得到分子量分布合理，低分子量肽含量较高的 大豆肽产品。本课题主要进行了以下研究：枯草芽孢杆菌1 3 8 9 、黑曲霉a s 3 3 5 0 、 米曲霉a 9 0 0 5 、枯草芽孢杆菌1 3 8 9 和黑曲霉3 3 5 0 混合、枯草芽孢杆菌1 3 8 9 和 米曲霉a 9 0 0 5 混合发酵豆粕制备大豆肽的动态发酵过程中大豆肽的低分子量肽 的比率、肽转化率、酶系分布、水解度的测定。并根据动态发酵过程中各指标的 变化规律分析各指标之间的相关性，然后确定最佳的发酵条件，并对大豆肽的苦 味进行评定。 研究结果如下： ( 1 ) 通过对本实验室前期所得的高转化率条件下的大豆肽中低分子量肽转化 率的测定可以得出，利用混合菌种发酵豆粕制各低分子量肽优于单菌种发酵。其 中枯草芽孢杆菌与米曲霉混合发酵4 8 h 时低分子量肽的转化率为5 6 ，大豆肽的 转化率为6 1 5 4 ；枯草芽孢杆菌与黑曲霉混合发酵4 8 h 时低分子量肽的转化率为 5 1 3 ，此时的大豆肽转化率为7 7 5 9 。 ( 2 ) 通过对发酵过程中肽转化率随时间的变化趋势分析可以看出，枯草芽孢杆 菌与黑曲霉的混合发酵制备大豆肽，所得的低分子量肽的转化率最高，为5 5 9 ， 相比其他菌种发酵而言，枯草芽孢杆菌与黑曲霉的混合发酵最先达到最大值。 ( 3 ) 在自然p h 条件下，改变不同菌种的发酵时间考察分子量分布与酶系分布 的相关性，通过研究发现，混合菌种发酵所得产品中，低分子量肽的比率较高， 各种蛋白酶的活性也较大。其中枯草芽孢杆菌1 3 8 9 和米曲霉a 9 0 0 5 混合发酵产 生的蛋白酶的酶活在4 8 h 达到最大值，低分子量肽的比率最大值为9 1 9 。枯草 芽孢杆菌1 3 8 9 和黑曲霉3 3 5 0 混合发酵所产生的酸性蛋自酶的酶活在3 6 h 的时候 达到最大值，低分子量肽的比率变化较小，且始终在5 5 以上，并且在3 6 h 最先 达到最大值。与单菌种发酵条件相比，混合菌种发酵过程中产生的蛋白酶种类最 摘要 多，切割位点较多，因此，大豆肽的分子量分布与酶系分布具有一定的相关性。 4 ) 在自然p h 条件下，改变不同菌种的发酵时间考察分子量分布与水解度的 相关性，通过研究发现，大豆肽的分子量分布与水解度的相关性不明显。因此不 能通过控制发酵过程中蛋白质的水解度间接地控制发酵液中低分子量肽的比率。 ( 5 ) 通过对大豆肽的感官评定可以看出，混合菌种发酵液的感官评定较理想， 苦味和臭味不太明显。伺时分子质量大于6 0 0 0 d a 的大豆肽，苦味不能被感觉。分 子质量为5 0 0 - 1 0 0 0 d a m ，大豆肽苦味最强。 r 山东轻1 = 业学院硕e 学位论文 a b s t r a c t t h ep r e l i m i n a r ys t u d ys h o w st h a t ，u s i n gb a c i l l u ss u b t i l i s1 3 8 9 , a s p e r g i l l u sn i g e r a s 3 3 5 0 , a s p e r g i l l u so r y z a e 彳一9 0 0 5t o f e r m e n ts o y b e a nm e a lc a no b t a i n e dl a r g e p e p t i d ep r o d u c t s ，b e c a u s ev a r i o u sp r o t e a s e sc a l lc u tt h ea p p r o p r i a t es i t e so fs o y b e a n m e a lp r o t e i nt h e nm o d i f ya n dr e a r r a n g es o m ep e p t i d e sa n dh y d r o p h o b i ca m i n oa c i d g r o u p s t h ec o n v e r s i o nr a t eo fs o yp e p t i d e sc a nu pt o8 9 t h ea b s o r p t i o nr a t eo fl o w m o l e c u l a rw e i g h tp e p t i d e s ( m o l e c u l a rw e i g h tl e s st h a n10 0 0 d a ) c a nu pt o9 0 o n h u m a nb o d y l o wm o l e c u l a rw e i g h tp e p t i d e sc a na c c e l e r a t ep r o t e i ns y n t h e s i s ，e n h a n c e t h ea b s o r p t i o no fm i n e r a le l e m e n t su t i l i z a t i o n , i m p r o v ea n i m a li m m u n i t y , a l s ot h e yc a n h i n d e rt h ea b s o r p t i o no ff a t ，a n dp r o m o t el i p i dm e t a b o l i s m ，t h e r e f o r e , i ti sn e c e s s a r yt o s u r v e yt h ed i s t r i b u t i o no fs o y b e a np e p t i d e sm o l e c u l a rw e i g h t b yt h eo p t i m i z a t i o no f f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sw ec a no b t a i nm u c hs o y b e a np e p t i d e p r o d u c t so fl o w m o l e c u l a rw e i g h t t h i st h e s i sf o c u s e do nt h ef o l l o w i n ga s p e c t ：m e n s u r a t i n gm o l e c u l a r w e i g h t d i s t r i b u t i o no fs o y b e a n p e p t i d e s ，c o n v e r s i o n r a t eo f p e p t i d e s a n dt h e d i s t r i b u t i o no ft h ee n z y m es y s t e m so ff e r m e n t a t i o np r o c e s so nf i v ed i f f e r e n tc o n d i t i o n s ： f e r m e n t e db yb a c i l l u ss u b t i l i s1 3 8 9 ，a s p e r g i l l u sn i g e ra s 3 3 5 0 , a s p e r g i l l u so r y z a e a 一9 0 0 5 ，a n db a c i l l u ss u b t i l i s1 3 8 9r r d x e dw i t ha s p e r g i l l u sn i g e ra s 3 3 5 0a n d a s p e r g i l l u so r y z a ea 一9 0 0 5 a n a l y z i n gt h e c o r r e l a t i o no fe a c hi n d e xa n dt h e nt o d e t e r m i n et h eo p t i m a lp r o c e s sc o n d i t i o n sb yt h ei n d i c a t o ro fs o y b e a np e p t i d e s c o n v e r s i o n , a n de v a l u a t e dt h eb i t t e m e s so fs o y b e a np e p t i d e s t h er e s u l t sw e r ea s f o l l o w s ： ( 1 ) t h r o u g ht h er e s e a r c hw ek n o w nt h a tu s i n gb a c i l l u ss u b t i l i s1 3 8 9m i x e dw i t h a s p e r g i l l u sn i g e ra s 3 3 5 0a n da s p e r g i l l u so r y z a ea 一9 0 0 5t of e r m e n t e ds o y b e a r lc a ng e t m o r el o wm o l e c u l a rw e i g h tp e p t i d et h a nu s i n gb a c i l l u ss u b t i l i s1 3 8 9 ，a s p e r g i l l u sn i g e r a s 3 3 5 0a n da s p e r g i l l u so r y z a ea 一9 0 0 5 u s i n gb a c i l l u ss u b 打l i s1 3 8 9m i x e dw i t h a s p e r g i l l u so r y z a ea 一9 0 0 5t of e r m e n t e ds o y b e a r l ，t h ec o n v e r s i o nr a t eo f l o wm o l e c u l a r w e i g h tp e p t i d ec a l lu pt o5 6 ，a n dt h ec o n v e r s i o nr a t eo fp e p t i d ec a l lu pt o61 5 4 o n 4 8 h ，w h i l et h ec o n v e r s i o nr a t eo fl o wm o l e c u l a rw e i g h tp e p t i d ec a nu pt o51 3 ，a n dt h e c o n v e r s i o nr a t eo fp e p t i d ec a l lu pt o7 7 5 9 u s i n gb a c i l l u ss u b t i l i s1 3 8 9m i x e dw i t h a s p e r g i l l u sn i g e r a s 3 3 5 0 ( 2 ) b yt h er e s e a r c ho fc h a n g e so fc o n v e r s i o ni nf e r m e n t a t i o nl i q u i dw i t ht i m e ，w e c a i lk n o w nt h a tt h ec o n v e r s i o no fl o wm o l e c u l a rw e i g h tp e p t i d e su s i n gb a c i l l u ss u b t i l i s i i i a b s t r a c t 1 3 8 9m i x e dw i t ha s p e r g i l l u s n i g e ra s 3 3 5 0 t of e r m e n t e ds o y b e a rw a sh i g h e s t ( 5 5 9 ) ，a n di tr e a c h e dt h em a x i m u ma tf i r s t ( 3 ) b yr e s e a r c h i n gt h ec o r r e l a t i o nb e t w e e nt h ed i s t r i b u t i o no fm o l e c u l a rw e i g h t a n de n z y m ei nd i f f e r e n tt i m ea n dn a t u r a lp h ，w ef o u n dt h a tt h er a t eo fl o wm o l e c u l a r w e i g h tp e p t i d e sa n dp r o t e a s ea c t i v i t yw e r eh i g h e ru s i n gb a c i l l u ss u b 疗l i s1 3 8 9m i x e d w i ma s p e v g i l l u sn i g e ra s 3 3 5 0a n da s p e r g i l l u so r y z a ea 一9 0 0 5t of e r m e n t e ds o y b e a n t h ep r o t e a s ea c t i v i t yr e a c h e dm a x a t4 8 ha n dt h er a t eo fl o wm o l e c u l a rw e i g h t p e p t i d e sr e a c h e d91 9 u s i n gb a c i l l u ss u b “l i s1 3 8 9m i x e dw i t ha s p e r g i l l u so r y z a e a 一9 0 0 5 t h ep r o t e a s ea c t i v i t yr e a c h e dm a x a t3 6 ha n dt h er a t i oo fl o wm o l e c u l a r w e i g h tp e p t i d e sc h a n g e dl i t t l eu s i n gb a c i l l u ss u b t i l i s1 3 8 9m i x e dw i t ha s p e r g i l l u s n i g e ra s 3 3 5 0 b e c a u s et h et y p e so fp r o t e a s ew a sm u c hi nm i x e dm i c r o b i a l f e r m e n t a t i o np r o c e s sa n dt h es i t e so fc l e a v a g ew a sa l s om u c h ，t h e r ew a ss o m e c o r r e l a t i o nb e t w e e nt h ed i s t r i b u t i o no fm o l e c u l a rw e i g h ta n d e n z y l l l e ( 4 ) b yr e s e a r c h i n gt h ec o r r e l a t i o nb e t w e e nt h ed i s t r i b u t i o no fm o l e c u l a rw e i g h t a n dd hi nd i f f e r e n tt i m ea n dn a t u r a lp h ，w ef o u n dt h a tt h e r ew a sn oc o r r e l a t i o n b e t w e e nt h ed i s t r i b u t i o no fm o l e c u l a rw e i g h ta n dd h s oi tw a sn o td o a b l et oc o n t r o l t h er a t eo fl o wm o l e c u l a rw e i g h tp e p t i d e sb yc o n t r o l i n gt h ed e g r e eo fh y d r o l y s i so f p r o t e i n s ( 5 ) t h ef e r m e n t a t i o nl i q u i d sb i t t e m e s sa n do d o rw a sn o to b v i o u su s i n gb a c i l l u s s u b 疗l i s1 3 8 9m i x e dw i ma s p e r g i l l u sn i g e ra s 3 3 5 0a n da s p e r g i l l u so r y z a ea 一9 0 0 5t o f e r m e n t e ds o y b e a r l s o y b e a np e p t i d ew h i c hm o l e c u l a rw e i g h tw a sm o r et h a n6 0 0 0 d a c a nn o tb ef e e l i n gb i t t e r w h e nt h em o l e c u l a rw e i g h to fs o y b e a r lp e p t i d ew a s5 0 0 d a - 10 0 0 d at h eb i t t e r n e s sw a ss e r i o u s k e yw o r d s ：s o y b e a nm e a l ；f e r m e n t a t i o n ；p e p t i d e so fl o wm o l e c u l a rw e i g h t ；d i s t r i b u t i o n o fe n z y m e ；d e g r e eo fh y d r o l y s i s ；c o n v e r s i o nr a t e i v 山东轻丁业学院硕士学位论文 1 1 引言 第1 章绪论 大豆肽是大豆蛋白经蛋白酶水解后产生的分子链不等的各级肽类的混合物【l 】， 研究表明由3 - - 6 个氨基酸组成的大豆肽具有良好的生物活性，能够更好的被人体 吸收。表1 1 为大豆肽的营养成分f 2 1 。 表1 1 大豆肽的营养成分( ) 【3 】 t a b l e1 it h ec o n t e n t so fs o y b e a np e p t i d e s 豆粕是油脂加工的副产品，豆粕中粗蛋白质含量高达4 5 o ，是丰富的植物性 蛋白资源。目前，豆粕主要用作动物饲料的原料，其中大部分优质大豆蛋白没有 得到充分利用，造成大量植物蛋白蛋白资源的浪费【4 1 。因此，对豆粕进行深加工利 用尤为重要。 1 2 大豆肽的研究现状 1 2 1 大豆肽的特性 ( 1 ) 大豆肽的物理化学特性【习 低渗透压是大豆肽的一个重要特性，大豆肽溶液渗透压处于大豆蛋白质和氨 基酸之间【6 1 ，由于大豆肽的渗透压比氨基酸渗透压低，可作为1 3 服营养液的蛋白 源供人体更好的吸收利用；大豆肽具有较高的溶解性，在p h 4 2 4 5 ( 大豆蛋白 等电点) 条件下大豆肽能显示出良好的溶解性【_ 7 1 ，同时，大豆肽具有抑制蛋白质 凝胶形成，调整蛋白食品硬度和改善口感的作用【8 】，因此，在食品和饮料中添加 大豆肽既不会减弱蛋白质营养价值，还能获得良好功能特性；大豆肽具有较强的 吸水性，蛋白质的分子结构在水解中被破坏，大量的亲水基团裸露出来，因此大 豆肽比大豆蛋白具有更强的吸水性，同时大豆肽的保湿性能也优于大豆蛋白【9 】； 大豆肽的粘度较低【l o 】，因此，大豆肽添加于食品中不会出现腻1 2 1 的不良感觉。 ( 2 ) 大豆肽的功能特性 低抗原性是大豆肽重要的功能特性，因此，食用大豆肽后产生过敏反应的可 能性小于大豆蛋白；大豆肽在肠道内的吸收率最好，人体对蛋白质的吸收大部分 以多肽形式直接吸收【1 1 】，表1 2 是对小自鼠进行强制喂食各种蛋白源l h 后消化道内 第1 章绪论 残留量的试验结果。结果表明，小白鼠对大豆肽的吸收率最高；大豆肽比蛋白质 具有更大的促进能量代谢的作用。因此，摄入少量的大豆肽就可以产生较多的能 量，促进大量脂肪的代谢：大豆蛋白中存在的植酸、草酸、纤维、单宁及其他多 酚类物质，显著地抑制了人体对各种矿物质的生物利用率，在蛋白质酶解过程中， 这些矿物质金属离子游离出来，并与大豆肽形成螫合物保持了矿物质的溶解状态， 因此，食用大豆肽能够促进金属离子在体内的转运，增加了人体对矿物质的吸收 利用率h 2 - l3 1 。 表1 2 小自鼠对各种蛋白原的吸收率 t a b l e1 2m i c e0 1 1t h ea b s o r p t i v i t yo fv a r i o u sf i b r i n o g e n 注：无括号项为对役食量的五分比；括号项为人豆肽的胃肠转移率，或以吸收率为1 0 0 时各样品的相对值；氨 基酸混合物的组成与大豆肤相同。 1 2 2 大豆肽的应用 ( 1 ) 大豆肽在食品中的应用 由于大豆肽具有优良的物理化学及功能特性，大豆肽在食品中具有广泛的应 用前景。用大豆肽可生产出更容易消化的豆制品：生产赔烤食品时添加一定量的 大豆肽可以增加食品的香气；利用大豆肽的高溶解性，在饮料中添加一定量的大 豆肽，可以使饮料更澄清透明；大豆肽能被肠道直接吸收，因此添加大豆肽的 营养剂适用于胃功能失调人群、消化功能衰退的老年人及消化功能未成熟的婴幼 儿【1 5 1 6 1 ；在运动过程中，人体蛋白质合成受到抑制体内蛋白质的利用增加【1 7 1 ，由 于大豆肽吸收速度快，在运动员食品中添加大豆肽，可起到迅速补充运动员的体 力的作用。 ( 2 ) 大豆肽在发酵工业中的应用 大豆肽可以促进乳酸菌、双歧杆菌、酵母及其它菌类的增殖，同时能促进微 生物有益代谢物的分泌，还能促进面包酵母的产气 1 7 1 。大豆肽已经被广泛的应用 于发酵工业。 1 2 3 大豆肽的生产 ( 1 ) 直接酶解法生产大豆肽 随着酶学的迅猛发展，美国、日本等发达国家对大豆蛋白酶解工艺的研究取 2 山东轻- 丁业学院硕卜学位论文 得了较大的进展【i 引。当前认为，酶解法生产大豆肽是最有效的大豆肽制备工艺【i 绷。 直接酶解法生产大豆肽一般采用单酶水解、法【2 0 1 ，采用单酶水解法生产的大豆 肽的疏水性氨基酸残基暴露出来，得到的大豆肽产品往往带有明显的苦味【2 1 1 。与 单酶水解法相比，多酶复合水解工艺中除考虑水解时间、初始p h 、水解温度等因 素外，还要考虑各种蛋白酶的配比和加酶方式【2 2 】，因此多酶复合水解法比单酶水 解法制备大豆肽复杂。但是多酶复合水解法制备大豆肽过程中蛋白质水解度( d h ) 比单酶水解蛋白质的水解度高【2 3 1 ，同时所得的大豆肽产品苦味较低，并且酶解时 间也会大大缩短。因此，多酶复合水解法制备大豆肽将成为今后研究的热点，并 逐步取代单酶水解法制备大豆肽 2 4 1 。 ( 2 ) 微生物发酵法生产大豆肽 豆粕中存在多种抗营养因子【2 5 1 ，发酵过程中，通过微生物产生的酶对大豆蛋 白的酶解作用，豆粕中的苦昧肽基团会进行重新组合与修饰【2 6 1 ，因此微生物发酵 法制备的大豆肽溶液的苦味较低【27 1 ，同时由于微生物发酵法生产大豆肽反应条件 温和【2 酊，这种制各大豆肽的方法受到研究人员极大的关注【2 9 1 。 近期的报道显示，邵伟采用枯草芽孢杆菌发酵豆粕制备高产量的大豆肽【3 0 l ； 万琦通过实验筛选到一株枯草芽孢杆菌，此菌株产生的羧肽酶可将短肽末端的疏 水性氨基酸切除，发酵豆粕制备大豆肽过程中可同时实现大豆蛋白的酶解和大豆 肽的脱苦【3 1 1 。张雁平认为采用发酵法生产大豆肽，大豆肽的得率比酶解法制备大 豆肽得率有所提高，而生产成本比酶解法制备大豆肽的成本低【3 2 1 。因此，微生物 发酵法制备大豆肽有良好的应用前景和经济性。 1 3 立题依据及研究内容 1 3 1 立题依据 人体对低分子量肽( 分子量低于1 0 0 0 d a 的大豆肽) 的吸收率可达9 0 ，优 质的大豆肽分子量分布以低于1 0 0 0 d a 为主，由于低分子量肽能加快蛋白质合成， 提高矿物元素的吸收利用率，提高动物机体免疫力，同时能阻碍脂肪的吸收，并 能促进脂质代谢，近年来对大豆肽分子量的测定也取得了一定的进展。 2 0 0 0 年，k i m 等从大豆蛋白水解物中可分离并纯化得到一种抗癌活性肽( 9 肽，11 5 7 d a ) 3 3 1 。2 0 0 3 年，李里和潘进权等通过液体发酵法制备风味良好的大 豆多肽，指出水解度达到2 5 - - , 3 0 时多肽得率为7 5 ，经质谱分析发酵液中大 豆肽的分子量分子质量主要集中在4 0 0 0 d a 3 4 】。2 0 0 5 年，经研究发现发酵3 6 h 所 得的多肽的分子量主要分布在2 0 0 0 d a 3 5 0 0 d a 范围内。2 0 0 6 年，邹存娟等采用 凝胶过滤法分离纯化大豆蛋白肽，收集分子量在1 2 0 0 d a 以下的小肽。同年，程 天德采用s e p h a d e x g 2 5 凝胶过滤层析法对大豆蛋白酶解产物中的低聚肽的进行 3 第1 章绪论 分离纯化，可以分离分子量为1 0 0 d a - 5 0 0 0 d a 的大豆肽，2 0 0 7 年，王梦芝等综 述了大豆小肽的生理功能特性及在奶牛生产中的应用，指出了大豆小肽的生理功 能t 3 5 1 。同年，余勃，陆兆新对发酵豆粕生产大豆肽进行了研究指出，2 4 h 发酵所 得主要为3 0 0 d a - 1 0 0 0 d a 具有潜在生物活性的短链肽【圳。近几年对大豆肽分子量 的测定及研究为本课题提供了一定的理论支持和可行性依据。 本实验室人员的前期研究表明，采用液态发酵法发酵豆粕制备大豆肽，并对 发酵条件进行优化，最终可制得高转化率条件下的大豆肽产品，其中大豆肽转化 率高达8 9 。由于低分子量肽具有各种生理活性，并且以往的报道中没有对分子 量低于1 0 0 0 d a 的大豆肽含量进行测定。因此对所得大豆肽产品的分子量分布的 测定具有很高的必要性，并且通过对发酵条件的进一步优化有望得到分子量分布 合理，低分子量肽含量较高的大豆肽产品。 1 3 2 研究内容 ( 1 ) 采用s e p h a d e x g 1 5 凝胶过滤层析法对本实验室前期发酵所得的高转化率 条件下大豆肽的分子量分布进行测定，结合低分子量肽的转化率分析出低分子量 大豆肽转化率的变化规律。主要包括：枯草芽孢杆菌1 3 8 9 、黑曲霉a s 3 3 5 0 、米 曲霉a - 9 0 0 5 分别单独发酵豆粕制备的高转化率条件下的大豆肽以及枯草芽孢杆 菌1 3 8 9 和黑曲霉a s 3 3 5 0 、米曲霉a 9 0 0 5 分别混合发酵豆粕制备的高转化率条 件下的大豆肽的分子分布的测定；各菌种发酵过程中不同发酵时间低分子量肽转 化率的测定。 ( 2 ) 根据低分子量肽比率的变化规律，分析分子量分布与酶系分布的关系，找 出分子量分布与酶系分布的相关性，从而通过改变酶系分布控制低分子量肽的比 率。研究内容主要包括：在前期发酵条件的基础上改变发酵时间得到不同酶系分 布的大豆肽发酵液，分别测定其分子量分布，考察蛋白酶系分布对分子量分布的 影响。主要测定指标为各发酵阶段酸性蛋白酶酶活、中性蛋白酶酶活、碱性蛋白 酶酶活、分子量分布。 ( 3 ) 根据低分子量肽比率的变化规律，分析分子量分布与水解度的关系，找出 分子量分布与水解度的相关性，从而通过改变水解度控制低分子量肽的比率。研 究内容主要包括：在前期发酵条件的基础上改变发酵时间得到不同水解度的大豆 肽发酵液，分别测定其分子量分布，考察水解度与分子量分布的关系。主要测定 指标为各发酵阶段的水解度和分子量分布。 ( 4 ) 通过感官评定确定不同发酵液的苦味和臭味值，以期得到口味较好的大豆 肽产品。 4 山东轻工业学院硕士学位论文 第2 章高转化率条件下大豆肽分子量分布的测定 2 1 引言 本实验室人员的前期研究表明，采用液态发酵法发酵豆粕制备大豆肽，并对 发酵条件进行优化，最终可制得高转化率条件下的大豆肽产品，其中大豆肽转化 率高达8 9 。由于低分子量肽具有各种生理活性，并且以往的报道中没有对分子 量低于1 0 0 0 d a 的大豆肽含量进行测定。因此对所得大豆肽产品的分子量分布的 测定具有很高的必要性，并且通过对发酵条件的进一步优化有望得到分子量分布 合理，低分子量肽转化率较高的大豆肽产品。 本课题主要从以下方面进行研究：测定大豆肽分子量所需标准物质的选取： 不同菌种发酵豆粕制备的高转化率发酵条件下大豆肽分子量分布的测定；不同发 酵时间低分子量肽转化率的测定及分析。 2 2 材料和方法 2 2 1 实验材料 ( 1 ) 原料：豆粕，购自山东万得福集团。 ( 2 ) 菌种：枯草芽孢杆菌1 3 8 9 ，购自中国科学院微生物研究所；黑曲霉a s 3 3 5 0 ， 购自山东大学微生物实验室；米曲霉a 9 0 0 5 ，本实验室保存。 ( 3 ) 培养基 培养基的配制如下【3 7 】： 发酵培养基采用不同浓度、不同p h 条件下的豆粕溶液，装量5 0 m l 2 5 0 m l ， 1 2 1 ，2 0 m i n 灭菌，待用。 枯草芽孢杆菌使用营养肉汁琼脂培养基；米曲霉、黑曲霉均使用查氏培养基。 ( 4 ) 试剂 s e p h a d e x g 1 5 ，色氨酸，维生素b 1 2 ，磷酸氢二钠，磷酸二氢钠，三氯乙酸， 硼酸，溴甲酚绿，甲基红，浓硫酸，双氧水，硫酸钾，硫酸铜，硒粉，氢氧化钠， 盐酸，硝酸钠，磷酸氢二钾，氯化钾，硫酸镁，硫酸亚铁，蔗糖，蛋白胨，牛肉 提取物，琼脂。 以上试剂均为分析纯。 ( 5 ) 仪器设备 d z k w c 型电子恒温水浴锅黄马市卸甲综合电器厂 s 第2 章高转化率条件下大豆肽分子量分布的测定 k j e l t e c 2 3 0 0 全自动凯氏定氮仪 a l 2 0 4 电子天平 x w t s 小型台式记录仪 h d 1 核酸蛋白检测仪 s p e c t r u m l a b 2 2 p c 可见光分光光度计 g h x 一9 0 8 0 b 1 隔水式恒温培养箱 2 2 2 实验方法 福斯分析仪器公司 梅特勒托利多仪器有限公司 上海自动化仪表三厂 上海沪西分析仪器厂有限公司 上海棱光技术有限公司 上海福玛实验设备有限公司 ( 1 ) 发酵液的制备 活化菌种 将枯草芽孢杆菌1 3 8 9 的斜面保藏菌种转接到液体培养基中，3 0 c ，2 0 0 r m i n 振荡培养2 4 h 后用于发酵【3 3 。3 9 1 。 将黑曲霉a s 3 3 5 0 和米曲霉a 一9 0 0 5 的斜面保藏菌种分别转接到液体培养基 中，3 0 ，2 0 0 r m i n 振荡培养3 6 h 后用于发酵【3 8 3 9 】。 转接菌种 将活化好的不同菌种分别转接入液体发酵培养基中，在适宜条件下振荡培养。 发酵液的处理 发酵结束后对不同菌种的豆粕发酵液进行离心，所得上清液为待测发酵液。 ( 2 ) 大豆肽转化率的测定 c ) t c a 酸溶蛋白的制备 用量筒量取3 0 m l 豆粕发酵液，倒入容量瓶定容至1 0 0 m l 。混合均匀后用移 液管吸取1 0 m l 放入带塞比色管中，随后加入1 0 m l l 5 = _ 氯乙酸( t c a ) 溶液， 混合均匀后静置5 分钟，将比色管中的溶液倒入离心管，在4 0 0 0 r m i n 的转速下 离心2 0 m i n ，最后取离心后的上清液倒入贮液瓶中，放入冰箱保存，备用。 肽转化率的计算 肽转化率( ) = 酸溶蛋白中可溶性氮的含量豆粕中总氮的含量 丝 1 8 坠尘 = 垃刖盟_ 百u l o o ( 2 21 一) 4 6 ” () a 一 a 8 0 6 式中k ：酸溶蛋白的凯氏定氮数值( m g l o o m l ) a ：发酵液豆粕质量( 酚 1 8 ：酸溶蛋白液的平均体积( m l ) 4 5 ：发酵液的平均体积( m l ) 6 山东轻工业学院硕上学位论文 8 0 6 ：豆粕氮含量的质量分数 ( 3 ) 分子量分布的测定 采用s e p h a d e x g 1 5 凝胶过滤法测定发酵液中大豆肽的分子量分布【4 0 。4 1 1 。 柱参数 柱径：4 c r n填料高度：8 0 c m 检测波长：2 5 4 n r n洗脱液：p h 7 2 的磷酸盐缓冲液 流速：3 m l m i n温度：室温 加样量：5 m l 标准样的选取及配制 采用维生素b 1 2 ( 分子量1 3 5 5 d a ) 和色氨酸( 分子量2 0 4 d a ) 作为标准物质。 称取标准样品0 2 9 ，用蒸馏水溶解，定容到1 0 0 m l ，配制成2 m g m l 的标准 溶液，待测。 标准样洗脱体积的测定 打开柱上的塞子，吸出层析柱中多余液体直至与胶面相切，用移液枪取0 2 m l 标准溶液，沿管壁小心加到凝胶床面上，待标准溶液流至与胶面相切时，将洗脱 液沿管壁流下，同时收集流出液。凝胶层析柱的出水口与核酸蛋白质检测仪相连， 记录其达到峰值时流出液的体积，即标准样的洗脱体积。维生素b 1 2 的洗脱体积 记为v l ，色氨酸的洗脱体积记为v 2 。 大豆肽分子量分布的测定 取2 0 m l 酸溶蛋白溶液，1 0 0 * c 浓缩至l m l 备用。加样量为0 5 m l ，核酸蛋 白检测仪和小型台式记录仪相连，可以记录层析曲线，在曲线上标明洗脱体积达 到v l 和v 2 时的点分别记为s l ，s 2 ，则体积介于v l 和v 2 之间的洗脱液中含有所 需分子量的大豆肽即低分子量大豆肽( 分子量分布为2 0 4 d a 至1 3 5 5 d a ) 。 大豆肽比率的计算 计算洗脱曲线上洗脱开始到点s l 的层析曲线下的面积，记为s l ；