（蔬菜学专业论文）根癌农杆菌介导芜菁花叶病毒的HcPro基因对茎用芥菜的遗传转化研究.pdf

摘要 本研究以茎瘤芥( b r a s s i c a j u n c e ac o s s v a t t u m i d at s e ne tl e e ) 作为试验材 料，分别以子叶和子叶诱导的愈伤组织为外植体，建立了农杆菌介导的芜菁花叶 病毒h e p r o 基因的转化体系，得到了茎瘤芥转基因植株。本研究不仅为利用现 代病毒分子生物学和植物基因工程育种获得抗病毒农作物提供理论和技术依据， 也为芥菜以及其他十字花科作物转基因技术提供技术平台。 主要结果归纳如下： 1 以子叶为外植体的基因转化体系的建立 茎瘤芥子叶可以在含有3m 叽b a 和0 5m e g ln a a 的培养基上得到9 5 以 上的不定芽再生率。本论文研究了预培养时间( 2 d ，3 d ，4 d ) 、共培养时间( 2 d ， 3 d ，4 d ) 和共培养温度( 2 0 c ，2 4 c ，2 8 。c ) 对子叶转化效率的影响；还对农杆 菌、抗生素对子叶分化的影响进行了研究。结果表明，预培养3 d 的外植体在2 8 4 c 共培养3 d 的条件下获得了最高的分化频率。经p c r 鉴定，最高转化频率达 1 6 3 4 。高浓度的农杆菌可以抑制子时的分化，随着侵染子叶的农杆菌浓度 ( o d 6 ) 从0 1 上升到0 3 ，子叶的分化频率下降了4 3 个百分点。研究还发现， 羧卞青霉素与头孢酶索都在一定程度上抑制了子叶不定芽的分化。 2 以愈伤组织为外植体的基因转化体系的建立 子叶切块可在含有o 。2 5m 班n a a ，o 。2 5m g l2 , 4 - d 和0 5m 班b a 的m s 培养基上被诱导成愈伤组织。本论文研究了外植体状态( 不同继代次数) 、共培 养温度( 2 0 。c ，2 4 c ，2 8 。c ) 和共培养时问( 1 d ，2 d ，3 d ) 对愈伤组织转化效率 的影响；还对抗生素对愈伤组织分化的影响以及转化植株的遗传多样性进行了研 究。结果表明，经2 次继代的愈伤组织在2 4 。c 共培养2 d 的条件下获得了最好的 转化频率，为3 9 5 。同时发现，羧卞青霉素与头孢霉索均对愈伤组织的分化有 促进作用。r a p d 分析表明转化植株存在遗传多样性。 3 转化植株的分子及抗病性鉴定 经p c r 及s o u t h e r nb l o t 检测，目的基因及筛选标记基因已经插入了茎瘤芥 染色体基因组中。经病毒接种鉴定及e l i s a 分析，转化植株较对照株获得了较 好的抗性，虽然没有完全抗病，但可以在一定程度l 延迟发病。 v 关键词：茎瘤芥：子叶；愈伤组织；芜菁花叶病毒；h c p r o ；基因转化 v a b s t r a c t at r a n s f o r m a t i o n s y s t e m o fh c p r o g e n em e d i a t e db ya g r o b a c t e r i u mw a s e s t a b l i s h e di nt h ep r e s e n ts t u d y t u b e rm u s t a r d ( b r a s s i c a j u n c e ac o s s v a t “l m i d 口 r s e ne t l e e ) w a su s e d a st h em a t e r i a l c o t y l e d o na n di t s i n d u c e dc a l l u so ft u b e r m u s t a r dw e r es e r v e da st h e e x p t a n t s ，a n d t r a n s f o r m e d p l a n t s w e r es u c c e s s f u l l y o b t a i n e d t h i s s t u d yp r o v i d e d t h e o r e t i c a la n dt e c h n i c a l b a s i sf o r o b t a i n i n g v i r u s - r e s i s t a n tp l a n t sb ym o d e r nm o l e c u l a r b i o l o g ya n dp l a n tg e n e t i ce n g i n e e r i n g ，a n d t e c h n i c a lp l a t f o r mf o rg e n et r a n s f o r m a t i o ni nm u s t a r da n dc r u c i f e r a ea sw e l l t h em d i nr e s u l t sw e r el i s t e da sf o l l o w s ： 1 e s t a b l i s ho ft r a n s f o r m a t i o n s y s t e mu s i n gc o t y l e d o na se x p l a n t a d v e n t i t i o u sb u d sc o u l db ee f f i c i e n t l yi n d u c e do nm sm e d i u ms u p p l e m e n t e d w i t h3m # lb aa n d0 5 m 班n a a t h e e f f e c to f p r e - c u l t u r ef i m e ( 2 d ，3 d ，4 d ) ， c 0 c u l t u r e t i m e ( 2 d ，3 d ，4 d ) a n dc o c u l t u r et e m p e r a t u r e ( 2 0 * ( 2 ，2 4 。c ，2 8 c ) o n t r a n s f o r m a t i o n e f f i c i e n c y o fc o t y l e d o nw a s i n v e s t i g a t e d i nt h e p r e s e n ts t u d y ， m e a n w h i l e ，t h ee f f e c to f a g r o b a c t e r i u ma n da n t i b i o t i c so n r e g e n e r a t i o no fc o t y l e d o n s w a ss t u d i e d t h eb e s tt r a n s f o r m a t i o n f r e q u e n c yw a sf o u n di n3 - d a yp r e - c u l t u r e d e x p l a n t sa f t e r3 - d a yg o c u l t u r ea t2 8 。c ，i tr e a c h e d1 6 3 4 h i g h e rc o n c e n t r a t i o no f a g r o b a c t e r i u mh a da r lo b v i o u se f f e c to nr e g e n e r a t i o no f c o t y l e d o n s ，a n di ts h o w e da d e c l i n a t i o ns t e pb ys t e pw i t ht h ec o n c e n t r a t i o ni m p r o v e m e n to f a g r o b a c t e r i u m w e a l s of o u n dt h a tc a r b e n i c i l l i na n dc e f o t a x i m eh a da d v e r s ee f f e c to nr e g e n e r a t i o no f c o t y l e d o n s 2 e s t a b l i s ho ft r a n s f o r m a t i o ns y s t e mu s i n gc a l l u s8 s e x p l a n t c a l l u sc o u l db ei n d u c e do nm sm e d i u ms u p p l e m e n t e dw i t h0 2 5m g l n a a ， o 2 5 m g 几2 ，牟da n d0 5m 班b a t h ee f f e c to fs u b c u l t u r et i m e ( o ，1 ，2 ，3 ) ， c o c u l t u r e t e m p e r a t u r e ( 2 0 c ，2 4 c ，2 8 * ( 2 ) a n d c o c u l t u r e t i m e ( 1 d ，2 d ，3 d ) o n t r a n s f o r m a t i o ne f f i c i e n c yo fc a l l u sw a sr e s e a r c h e di nt h ep r e s e n ts t u d y m e a n w h i l e ， t h ei n f l u e n c eo fa n t i b i o t i c so n r e g e n e r a t i o n o fc a l l u sa n d g e n e t i cd i v e r s i t y o f t r a n s f o r m e dp l a n t sw e r ei n v e s t i g a t e d t h er e s u l ts h o w e dt h a ta f t e rb e i n gc o c u l t u r e d f o r2d a y sa t2 4 c ，2 - s u b c u l t u r e de x p l a n t sg o tt h eb e s tt r a n s f o r m a t i o nf r e q u e n c y , i t v l j w a s3 9 5 a tt h es a m et i m e c a r b e n i c i l l i na n dc e f o t a x i m es h o w e d p o s i t i v ee f f e c to n r e g e n e r a t i o no fc a l l u s a f t e rr a p da n a l y s i so ft r a n s f o r m e ds h o o t s ，g e n e t i cd i v e r s i t y w a sf o u n d 3 m o l e e u l a ra n dv i r u $ - r e s i s t a n ti d e n t i f i c a f i o no ft r a n s f o r m e ds h o o t s b yp c r a n ds o u t h e r nb l o ta n a l y s i s ，w ef o u n dt h a th c p r og e n ea n db a rg e n e h a v ei n s e r t e di n t ot h et u b e rm u s t a r dg e n o r n e e l i s aa s s a ys h o w e dt h a tl o w e rd e n s i t y o ft 1 】m vw a sf o u n di nt r a n s f o r m e ds h o o t st h a nn o n t r a n s f o r m e d o n e d e l a y e d s y m p t o m s o f t u m vw e r ef o u n di nt r a n s f o r m e d p l a n t s k e y w o r d s ：t u b e rm u s t a r d ；c o t y l e d o n ；c a l l u s ；t u b e rm o s a i cv i r u s ；h c - p r o ； g e n e t r a n s f o r m a t i o n v 【i 分类号： udc ： 密级： 单位代码： 编码： 学号： y 7 3 2 9 五6 1 0 3 3 9 2 0 2 16 0 4 6 根癌农杆菌介导芜菁花叶病毒的h c p r o 基因 对茎用芥菜的遗传转化研究 论文答辩日期： 2 0 0 5 年6 月1 5 日 答辩委员会主席： 扬丝俭硒究虽逝塑省壅型瞳 答辩委员会成员：置啮虚数援逝婆太堂 装明基副夔攫逝堑盔堂 逛舾良副熬援逝江太堂 睦型莲副熬攫! 逝迤太堂 论文评阅人：周雪芏麴攫! 逝江太堂 喧量拯熬攫( 逝堑太堂2 筮查塞亟巍虽逝塑省奎型瞳2 致谢 本论文在导师陈利萍副教授的悉心指导r 完成的。二年来，导师在生活、学习和科研 上给予了很大的关心和帮助。从论文选题、研究过程到论文写作和修改，导师都倾注了人茸 的心血，在此衷心感谢导师对我的精心指导和孜孜不倦的教诲。导师严谨的治学态度、高瞻 远瞩的学术眼光、认真负责的t 作态度以及严谨执着的治学作风将永远是我生活和工作上学 习的榜样。这一切也将永远激励我奋发前进，让我终生受益。 在求学和完成论文中，也感谢本实验室张明方教授、汗炳良副教授在各方面对我的指导 和教育：感谢浙江大学生物技术研究所周雪平教授提供基因并在试验思路方面给予指导；感 谢喻景权教授、曹家树教授、朱祝军教授等对我学习、科研和生活上的关心和帮助；感谢卢 钢副教授在生活和思想上给予的关心和教育；感谢向坷老师、钱琼秋老师在实验过程中提供 的帮助。 感谢浙江大学生物技术研究所陶小荣博士、施曼玲博士等在基因序列提供及e l i s a 试验 、 方面的指导。感谢中国水稻研究所庄杰云研究员、樊r 杨老师、应杰政老师以及陈忱硕士等 对我试验的帮助。 在进行毕业课题和论文撰写过程中，感谢师兄杨景华博士在我试验过程中的指导和生活 上的关心；感谢向庆宁、李志凌、于天祥、张全美、徐春霞、付杰、闫静、葛亚明、王艳菊、 杨国志、齐晓华、朱雪芸、张硕、许智颖、缑艳霞等在实验及生活等方面给予的帮助；感谢 曹建新博士在我求学和生活上给予的关心和帮助；感谢张玉艳硕士在学习、科研以及生活上 给予的鼓励和帮助。 特别感谢我的父母、家人及朋友，在我的求学过程中给予的理解、支持和鼓励，是你们 的无私奉献支持我在求学路上不断前进。 晟后，再次向所有关心、支持和帮助过我的老师、家人、同学和朋友表示最诚挚的感谢! 李春顺 零零五年六月于华家池 a b b r e v i a t l o n s b a b e n z y l a n i n o p r u i n e苄基氨基嘌呤 2 , 4 一d 2 ，4 一d i c h l o r o p h e n o x y a c e t i c a c i d 一氯苯氧乙酸 b p b a s e p a i r碱基对 b tb a c i l l u st h u r i n g i c r i s i s 苏云菌芽孢杆菌 c p c a p s i dp r o t e i n外壳蛋白 c t a b c e t y l t r i me t h y l a m m o n i u mb r o m i d e十六烷基三甲基溴化铵 d d a y天 d n a d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d脱氧核糖核酸 d n t p d e o x y r i b o n u c l e o s i d et r i p o s p h a t c脱氧核糖核苷三磷酸 e be t l l i d u mb r o m i d e溴化乙锭 hh o u r小时 h e - p r oh e l p e rc o m p o n e n t - p r o t e i n a s e 辅助组成蛋白酶 m l nm i n u t e分钟 n a a 1 - n a p h t l a l e n ea c e t i ca c i d 1 一萘乙酸 o d o p t i c a ld e n s i t y 光密度 p c r p o l y m e r a s e c h a i nr e a c t i o n聚合酶链式反应 r p m r o t a t i o n p e r m i n u t e每分钟转速 s d ss o d i u m d o d e c y ls u l f a t e 十二烷基磺酸钠 t r i s t r i s ( h y d r o x y m e t h y l ) a m i n o m e t h a n e 三( 羟甲基) 氨基甲烷 t u m v t u r n i p m o s a i cv i r u s芜菁花叶病毒 p b s t p h o s p h a t e b u f f e r e ds a l i n ea n dt w e e n一种磷酸缓冲液 1 v 剐昂 茎用芥菜含笋予芥、抱子芥和茎瘤芥( b r a s s i c aj u n c e ac o s s v a r t u m i d at s e ne t l e e ) - 个变种，在浙江、四川等地广泛栽培( 刘佩瑛，1 9 9 4 ) 。其中茎瘤芥，俗 称榨菜，是世界三大名腌菜之一，也是我国的一类重要加工出口蔬菜。 病毒病是茎瘤芥生产中的主要问题之一。据统计，病毒病可对产量造成4 0 以上的影响，严重时可导致完全失收。因此病毒病的有效防治是保证茎瘤芥稳产、 高产的重要环节。茎瘤芥病毒病的症状主要有花叶型和缩叶型二大类型。一般从 苗期到生长后期均可发生，而以苗期及食用茎膨大前期为盛发期。 据报道，茎瘤芥病毒病是由芜菁花叶病毒和黄瓜花叶病毒所引起，其中芜菁 花叶病毒是最为突出的问题之一( 李新予等，】9 8 8 ) 。芜菁花时病毒( t u m v ) 是属马铃薯y 病毒属的一类r n a 病毒，是一类在世界范围内对蔬菜作物危害最 大的五孝中病毒之- - ( t o m l i n s o n e ta 1 ，1 9 8 7 ) 。与马铃薯y 病毒属的其它病毒相比， 它具有侵染寄主范围小的特点。t u m v 分布极其广泛，是一个世界性的病原，主 要分布在包括非洲、亚洲、欧洲、大洋洲和南北美洲( p r o v v i d e n t i ，1 9 9 6 ) 在内的 温带和热带地区。芜菁花叶病毒可以通过非持久性传播的途径被至少8 9 种蚜虫 传毒( m a i ae ta 1 ，1 9 9 6 ) ，但不能经种子和土壤传染。目前，在生产上一般采用改 进育苗技术、避蚜防蚜、化学防治等方法来防治病毒病。虽然这些防治措施在一 定程度上控制了病毒病的发生，但没有从根本上解决问题，而化学防治的方法在 一定程度上对环境造成了污染。因此，培育抗病品种是防治茎瘤芥病毒病的最佳 途径。目前，抗病品种的选育主要有抗病性的转育，突变育种等。然而，对茎瘤 芥来说，陈竹君等经过多年的研究至今未能找到有效的抗芜菁花叶病毒的种质资 源，通过体细胞杂交等方法来获得抗病毒病的材料与应用尚有一段距离( c h e ne t a 1 2 0 0 5 ) 。丽利用农杆菌介导来转化编码病毒蛋白的基因可以在很大程度上弥补 种质资源缺乏等问题，而且可以高效地获得抗病材料。这在有些作物上已经取得 了成功( p a n g e ta 1 ，19 9 3 ；t u u l ae ta 1 ，2 0 0 0 ) 。自从19 8 6 年p o w e l l 等( p o w e l le ta l ， 1 9 8 6 ) 将烟草花叶病毒( t m v ) 的外壳蛋i 刍( c o a tp r o t e i n ，c p ) 基因导入烟草并得到 延迟发病的转基因烟草以来，全世界许多科学家开展了转化编码病毒蛋白的正义 或反义d n a 序列以获得抗病毒病的转基因材料的研究( z h e n g e ta 1 ，1 9 9 7 ；f a n ge t a t ，1 9 9 4 ：b a u l c o m b e e ta 1 1 9 9 6 ：w a l s he ta 1 ，1 9 9 9 ；n e v e se ta 1 ，2 0 0 1 ) 。同时， 人们对芜菁花叶病毒所属的马铃薯y 病毒属的研究也取得了一定的进展( j a ne t a 1 ，1 9 9 9 ；t u u l a e ta 1 ，2 0 0 0 ) 。h c p r o ( h e l p e rc o m p o n e n t - p r o t e i n a s e ) 是个在马 铃薯y 病毒侵染循环中起作用的多功能蛋白( m a i a e ta 1 ，1 9 9 6 ) 。 目前，国内外已有利用农杆菌对茎瘤芥进行遗传转化的报道( h u a n ge t a 1 ， 1 9 9 4 ；p r a s a de ta 1 ，2 0 0 0 ；k a n r a re ta 1 ，2 0 0 2 ；杨朝辉等，2 0 0 4 ) ，但以获得抗病毒病 材料为目的的基因转化还没有报道；而且其报道的外植体是下胚轴( h u a n ge ta 1 ， 1 9 9 4 ；杨朝辉等，2 0 0 4 ) 、予叶( 杨朝辉等，2 0 0 4 ) 、叶柄( p r a s a d e ta 1 ，2 0 0 0 ) 等。 本研究通过根癌农杆菌介导的方法，将芜菁花叶病毒的h c p r o 基因导入了茎瘤 芥子叶以及子叶诱导的愈伤组织，并得到了抗芜菁花叶病毒的转基因植株。这不 仅丰富了茎瘤芥抗病毒病的种质资源，也为茎瘤芥乃至十字花科其他作物的基因 转化提供了理论基础和技术支持。 第一章文献综述 第一节十字花科作物转基凶研究进展 十字花科植物包括许多重要的蔬菜、花卉、油料和饲料等作物，在人民生活 及农业生产中有着重要的作用。培育十字花科作物的优良品种，满足社会生产和 生活等各方面的需要，具有重大的理论和实践意义。迄今为止，利用常规育种技 术来改良十字花科作物品种虽然取得了一定的成功( 张鲁刚等，2 0 0 1 ) ，但同时 还存在着选育年限过长、远缘杂交不亲和以及有用亲本材料缺乏等问题。从而导 致理想品种选育困难。植物转基因技术的兴起，为十字花科作物品种的改良和培 育提供了一条新途径。它作为当代高效的育种辅助手段，解决了一些常规育种难 以解决的问题，并取得了一定的成效。自1 9 8 5 年o o m s ( o o m s e ta 1 ，1 9 8 5 ) 获得了 第一例十字花科转基因作物甘蓝型油菜以来，十字花科植物转基因的研究引 起了世界上包括中国在内的很多国家的科学家的关注。目前，利用十字花科植物 的不同转化受体，通过直接转化或间接转化等不同方式，已经得到了拟南芥、甘 蓝型油菜、花椰菜、大白菜、甘蓝、羽衣甘蓝、芜菁等转基因植物。同时，在转 化受体、转化方法、不同外源基因的导人以及转基因植物获得等方法研究上也取 得了重大进展。本文将从以下几个方面进行综述。 1 转化受体 良好的植物受体系统的建立是成功实现基因转化的首要条件之一。良好的受 体必须具有高效稳定的再生能力、较高的遗传稳定性和稳定的外植体来源，并且 要具各对选择性抗生素敏感、对农杆菌或其它转化方式敏感等特性。十字花科植 物的转化受体主要是直接取自植物的组织块，包括无菌的下胚轴( x i a n g e t a 1 ，2 0 0 0 ；d i n ge ta l ；r o g e r e ta 1 ，2 0 0 0 ；徐淑平等，2 0 0 2 ；c h oe ta 1 ，2 0 0 1 ；w a n ge t a 1 ，2 0 0 2 ) 、子叶柄( c a o e ta 1 ，1 9 9 9 ；朱常香等，2 0 0 1 ) 、子叶( z h a n ge ta 1 ，2 0 0 0 ； d a g m a re ta 1 ，1 9 9 8 ) 、根( j e l e n s k a e ta 1 ，2 0 0 0 ；l e c l e r ee ta 1 ，2 0 0 1 ；l e g u ee t a 1 ，1 9 9 4 ) 、叶( c o g a n e ta 1 ，2 0 0 1 ) 等；也有人以花辜：( r o g e r e t a l ，2 0 0 0 ) 、花药( c o g a n e ta 1 2 0 0 1 ) 、小孢子( f u k u o k ae ta 1 ，1 9 9 8 ；e l i z a b e t he ta 1 ，1 9 9 5 ；c h e ne ta 1 ，1 9 9 4 ) 、花 梗( t i m o t h y e ta l ，1 9 9 5 ) 等花器官组织作为转化受体。下胚轴、子叶柄、子叶、叶、 根等具有再生能力强、取材方便、转化简便、快捷等优点，曾被广泛利用a 然而， 由于这些外植体是多细胞结构，容易得到嵌合植株。因此，人们开始采用原生质 体进行基因转化。原生质体为单细胞结构，作为基因转化的受体具有独特的优点 ( k r e ne ta 1 ，1 9 8 2 ) 。现已从拟南芥( a l l a ne ta 1 ，1 9 9 7 ) 、甘蓝( d a g r n a re ta 1 ，1 9 9 8 ； a r u n d h a t ie ta 1 ，1 9 9 1 ) 、花椰菜( v o l o d y m y re ta 1 ，2 0 0 2 ；l e c l e r ee ta 1 ，2 0 0 1 ) 、青花 菜( 余建明等，2 0 0 0 ) 、芜菁( r o u a n e ta 1 ，1 9 9 1 ) 、甘蓝型油菜( r o u a ne ta 1 ，1 9 9 1 ) 等的 原生质体获得转基因植株。但是，由于原生质体再生体系的建立比较困难，再生 频率较低，它的应用也因此而受到了一定的限制。为了避免组织、器官再生体系 建立的困难，人们提出了用种子、完整植株等作为转化受体。实验结果表明，种 子或完整植株也可以作为转化受体而获得转基因植株，但转化频率非常低，并且 需要大量的种子或完整植株。但是，该方法具有获得转基因植株时间短、方法简 单、成本低等优点。然而不管是利用植物的组织、器官和细胞，还是利用种子或 完整植株进行基因转化，得到的皆为二倍体植株，后代会发生分离。而利用单倍 体的小孢子为外植体进行基因转化，就可以获得纯合后代。现已从大白菜、甘蓝 型油菜( f u k u o k a e ta 1 ，1 9 9 8 ；e l i z a b e t he la 1 ，1 9 9 5 ) 、芜菁( c h e ne ta 1 ，1 9 9 4 ) 等的小 孢子获得转化植株或愈伤组织。 2 转化方法 基因导入植株的方法有载体介导基因转化法、d n a 直接导入法、种质系统 介导基因转化法等。 2 1 载体介导转化法 载体介导转化又称间接转化法，该方法主要是利用农杆菌( 根癌农杆菌和发 根农杆菌) 作为介体进行转化。由于十字花科植物是农杆菌良好的宿主，所以， 利用农杆菌作为十字花科转化载体具有内在的优势。载体介导基因转化法作为最 常用的基因转化方法，其转化受体广泛，转化技术较成熟，尤其在十字花科植物 上已取得很大成功。例如，1 9 9 7 年c h r i s t e y 等以甘蓝、花椰菜等的子叶、叶柄 为外植体，通过与根癌农杆菌共培养进行乙烯形成酶反义基因的转化，最高转化 频率可达】5 。c a o 等( 2 0 0 0 ) p a u 花的小白菜完整植株为外植体，利用根癌农杆 菌真空渗透法进行b a r 基因的转化，也得到了转化株，虽然转化率很低，但转化 周期短，成本低。 4 利用农杆菌进行基因转化，在十字花科不同的作物间的转化效果是有很大的 差异的，如p u d d e p h a t ( 2 0 0 1 ) 希 用发根农杆菌转化系统对青花菜和花椰菜进行遗 传转化，结果发现花椰菜和青花菜的转化能力有明显差异，花椰菜的转化频率达 2 7 ，而青花菜只有2 2 。此实验中，他们在悬浮培养发根农杆菌的培养基中 加入2 ，4 一d 来提高毛根的出现水平，并利用毛根为选择标记进行转化植株的筛 选，取代了标记基因的应用。这是一种较新的方法。但它的广泛应用还有待于进 一步研究。 现通过载体介导转化得到的十字花科蔬菜主要有：拟南芥( o o m s e ta 1 ，1 9 8 5 ； j e l e n s k ae ta 1 ，2 0 0 0l e c l e r ee ta 1 ，2 0 0 1 ；a l l a ne la 1 ，1 9 9 7 ) 、菜塞( x i a n ge l a 1 ， 2 0 0 0 ) 、芥菜( r o g e r e la 1 ，2 0 0 0 ) 、甘蓝( r o g e re la 1 ，2 0 0 0 ；c o g a ne la 1 ，2 0 0 1 ) 、 大白菜( c h o e la 1 ，2 0 0 1 ；w a n ge ta 1 ，2 0 0 2 ；z h a n g e t a l ，2 0 0 0 ；c h r i s t e ye ta 1 ，1 9 9 7 ) 、 青花菜( c o g a n e ta 1 ，2 0 0 1 ；c a oe la 】， 9 9 9 ) 、甘蓝型油菜( d a g m a re ta 1 ，19 9 8 ；c h e n e la 1 ，1 9 9 4 ) 、花椰菜( c o g a ne la 1 ，2 0 0 1 ；c h r i s t e yc ta 1 ，1 9 9 7 ) 、羽衣甘蓝c o g a ne la l 。， 2 0 0 1 ) 、芜菁甘蓝( l i e la 】，1 9 9 5 ) 等。从这些研究结果来看，农杆菌侵染外植体后， 会大大降低外植体的分化能力，从而影响了转化频率。因此，人们又希望通过直 接转化的方法来获得转基因植株。 2 2 d n a 直接导入转化 d n a 直接导八转化就是不依赖农杆菌载体和其它生物媒体，将特殊处理的 裸露d n a 直接导入植物体或离体组织、细胞，实现基因转化的技术，也被称为 无载体介导d n a 转化。常用的d n a 直接转化的方法，根据其原理可分为化学 法和物理法两大类。主要包括显微注射法( e l i z a b e t h c ta 1 ，1 9 9 5 ) 、基因枪法( c h e ne t a 1 ，1 9 9 4 ；p u d d e p h a t e ta 1 ，1 9 9 9 ) 、p e g ( 聚7 , - - 醇法) ( a l l a ne ta 1 ，1 9 9 7 ；a r u n d h a t ie t a 1 ，19 9 1 ；l ie ta 1 ，1 9 9 5 ) 、激光穿刺法( 张海燕等，1 9 9 9 ) 、电击法( r o u a ne ta 1 ， 1 9 9 1 ) 、脂质体法( h a l f l i i l le ta 1 ，2 0 0 1 ) 等。如：1 9 9 8 年，f u k u o k a 等利用基因枪技 术对甘蓝型油菜小孢予进行基因转化，当基因枪粒子重1 5 卸昏穿透距离6 e m ， 轰击压力为9 0 0 一1 3 0 0 p s i 时，取得了较好的转化效果。但在其他作物上利用基 因枪法进行基因转化，总的来说转化率不高，遗传稳定性差。1 9 9 1 年，a r u n d h a t i 等利用p e g 介导法，以甘蓝下胚轴原生质体为外植体直接吸收含有目的基因的 5 质粒d n a 获得转化株，结果原生质体分化频率达8 0 ，转化频率达3 3 。e l i z a b e t h 等利用微注射法把含有目的基因的d n a 导入了旨蓝型油菜的小孢子，发现虽然 拷贝数较低( 1 - 2 0 ) 但仍得到了转化株。c h e r t 等综合利用了基因枪和d n a 直接 吸收的方法，先用基因枪向外植体中打入d n a ，再将外植体放入d n a 溶液中进 行直接吸收，向油菜小孢子发育的胚胎的下胚轴导入外源d n a 。结果该方法大 大提高了转化频率，并获得了纯合的转化株。r o u a n 等利用电击法以芜菁、油菜 的叶肉、下胚轴以及子叶为外植体，也得到了转化株。此外，还有一些十字花科 作物也通过直接转化法获得转化株( 朱常香等，2 0 0 1 ；v o l o d y m y r e ta 1 ，2 0 0 2 ：r o u a n e ta 1 ，1 9 9 1 ) 。 与载体介导转化相比，本方法具有技术要求简单、时间短、易得到转化体等 多方面的优点。目前，上述几种d n a 直接导入的方法在十字花科植物上都有成功 的报道，但也存在转化率不高、后代遗传稳定性差的问题。 2 3 种质系统介导转化法 种质系统介导基因转化是借助生物体自身的种质细胞为媒体，特别是植物的 生殖系统的细胞( 花粉、卵细胞、予房、幼胚等) 以及细胞的结构来实现转化之 目的。本方法主要是通过向子房、幼穗及种胚注射外源d n a 以获得转基因植株。 种质系统介导基因转化的d n a 可以是裸露的，也可以是重组在质粒上的。该方法 不需建立离体培养体系，更简便易行。在十字花科作物上，该方法也有过成功的 报道。1 9 9 5 年，l i 等以甘蓝型油菜小孢子为外植体，通过基因枪法进行基因转 化，得到了转化株。但是，此方法也同样存在转化效率不高、遗传稳定性差等问 题，而且对d n a 如何通过多层细胞壁的阻碍而到达分生细胞尚缺乏有力的证据。 此方法目前仍处于研究阶段。 3目的基因 随着转基因技术的日益完善和国际市场上转基因产品的逐步商品化，转化的 目的基因越来越受到人们的关注。近十年来，基因转化的目的主要有：对受体植 物进行遗传改良，选育抗病、抗虫、高产、优质等符合育种目标的品种为生产实 践服务；研究植物基因调控机理，以及功能基因，充分发展植物分子遗传学基础 理论；研究无标记转基因技术系统，降低转基因安全隐患，进一步促进转基因产 6 品的商品化进程。 从以上的目的出发，迄今为止向植物中导入的目的基凶主要有以下两类： ( 1 ) 改良植物遗传特异性的基因 在十字花科基因转化中应用的改良植物遗传特异性的基凶主要有：抗虫基因 b t ( x i a n ge ta 1 ，2 0 0 0 ；c h oe ta 1 ，2 0 0 1 ：c a o e ta 1 ，1 9 9 9 ；t i m o t h ye ta 1 ，1 9 9 5 ) 、 c p t l ( 豇豆胰蛋白酶抑制剂) 基因( 徐淑平等，2 0 0 2 ) ：抗病基因：c p ( 外壳蛋白) 基因( s e i ie ta 1 ，1 9 9 5 ) 、抗菌肽基因( w a n ge ta l ，2 0 0 2 ) ；抗非生物胁迫基因： b 川耐除草剂) ( l e c l e r e e t a 1 ，2 0 0 1 ；a r u n d h a t i e t a 1 ，19 9 1 ；c a oe ta 1 ，2 0 0 0 ) 、 a h p r o t i ( 脯氨酸转运蛋白基因) ( s h e i l e ta 1 ，2 0 0 2 ) ；改善品质基因：a c c 反义合成 酶基因( c a oe ta 1 ，2 0 0 0 ) 、乙烯形成酶反义基因( l ie ta 1 ，1 9 9 5 ) 。另外，还有改变 种子内储存物质成分及含量的基因( r o g e r e ta 1 ，2 0 0 0 ；d a g m a re ta 1 ，1 9 9 8 ；c o g a n e t a 1 ，2 0 0 1 ) 。以上这些改良植物遗传特异性的基因都成功地在十字花科作物进 行了转化。例如：2 0 0 1 年，c h o 等对大白菜下胚轴进行b t 基因转化，在对六个 转化株系进行抗虫实验时发现，其中有四个株系抗虫性可达1 0 0 。朱常香等 ( 2 0 0 1 ) r 句甘蓝型油菜转t u m v c p 基因，结果对照接种2 0 天后感病，3 0 天后花叶 严重皱缩畸形，而转化株4 5 天后才略有花叶，并且症状不随植株发育而加重。 ( 2 ) 选择标记基因 在十字花科基因转化中应用的选择标记基因主要有：新霉素磷酸转移酶 ( n p t i i ) 基因( 能使受体细胞获得对卡那霉素的抗性) ( z h a n g e ta 1 ，2 0 0 0 ；l e c l e r e e ta 1 ，2 0 0 1 ；c h e r te la 1 ，1 9 9 4 ；l ie ta 1 ，1 9 9 5 ) 、潮霉素磷酸转移酶( h p 0 基因，( 能 使受体获得对潮霉索的抗性) ( m i c h a e le ta 1 ，1 9 9 5 ) 、g u s ( b - 葡萄糖苷酸酶) ( a r u n d h a t ie ta 1 ，1 9 9 1 ：h e n z ie ta 1 ，2 0 0 0 ) 基因以及能使受体具有对双丙氨膦产生 抗性的b a r 基因( l e c l e r e e ta 1 ，2 0 0 1 ：a n m d h a t ie ta 1 ，1 9 9 1 ；c a oe ta 1 ，2 0 0 0 ) 。这 些选择标记基鼠的存在对转基因植株的安全性问题的影响也有待于进一步研究。 4 最佳转化系统及最高转化频率 转化频率是评价各种作物转化技术成熟程度的主要标志之一。而转化频率的 高低又依靠于转化体系。高效的再生体系，是转基因成功的前提之一。由于不同 作物的转化受体不同，转化频率也差异很大，结果重复性差。因此，在转基因前， 人们往往投入大量的时间来研究作物的高效再生体系。2 0 0 0 年p l u s 经过研究建 7 立了甘蓝以子叶为外植体的高效转化体系，最高分化频率达3 2 ，处于报道中的中 间水平。a r u n d h a t i 等( 1 9 9 1 ) 建立了甘蓝下胚轴原生质体的高效再生体系，利用6 天苗龄的无菌苗下胚轴原生质体进行培养分化，发现最高分化率达8 0 。也有人 通过向培养基中加入其他利于分化的物质提高分化频率。如：2 0 0 0 年，h e n z i 等 向共培养的培养基中加入了乙酰丁香酮和旨露碱，转化频率明显提高，并发现加 入5 0 u m 乙酰丁香酮和1 0 m 甘露碱时分化效果最好。同时，作者还对精氨酸对 转化频率的影响进行了研究，结果发现适当的精氨酸浓度可以提高转化频率 3 0 5 0 倍。徐淑平等( 2 0 0 2 ) 通过研究不同的激素配比、硝酸银浓度、卡那霉素、 头孢霉素、羧卞青霉素处理和感染农杆菌的浓度以及感染时间对青菜芽分化频率 的影响，建立了最佳的青菜再生体系，青菜无菌苗下胚轴切段的芽分化频率达 6 5 ，子叶切块的芽分化率为5 2 。但也有人报道乙酰丁香酮对分化的频率的作 用不明显，甚至有反作用。如今，有些十字花科植物的最高分化频率己达1 0 0 ， 般都在8 0 0 以上。但是，仍有一些十字花科作物由于再生体系建立的困难，很 少有人进行转基因方面的研究，如萝b 等。 5 无选择标记基因转化 随着转基因植物环境释放种类增多，规模增大，转基因植物释放后可能引起 的种种问题成为人们关注的热点。转基因植物释放后，可以通过花粉或种子将导 入的基因从基因修饰植物向非目标植物或杂草扩散。转基因植物食品的安全性问 题主要包括有无毒性物质及有无过敏性蛋白。 食品安全性中的另一个重要问题是标记基因的安全性评价。选择标记基因 ( 报告基因) 的表达产物易检测，便于研究基因的表达过程，利于筛选转化细胞、 组织乃至植株，并对植物本身无特殊影响。但是，有些标记基因( 如抗生素抗性 基因、抗除草剂基因等) 的安全问题也引起了广泛重视。近几年来，科学工作者 对无标记转基因技术进行了研究，并在一些植物上取得了成功( b l o c k e ta 1 1 9 9 1 ： d e n e v ee ta 1 ，1 9 9 7 ) 。同时在十字花科植物也取得了一定的研究进展。如：1 9 9 1 年， b l o c k 等利用两个不同的农杆菌菌系( 同时分别含有b a r 基因和n p t l l ，h p t 标记基 因) 一起与甘蓝型油菜下胚轴外植体共培养，进行基因转化，转化效率比两农杆 菌菌系各自侵染明显提高。但该结果是否与所用的抗性标记有关有待于进一步研 究。s o u t h e r nb l o t t i n g 和遗传分析表明有7 8 的转化株的两个不同t - d n a 整合到 了同一个位点上。1 9 9 7 年，d e n e v e 等利用农杆菌c 5 8 菌系( 双重载体，一个含 自n p t l l ， 个含有h p t 基因) 与拟南芥叶盘和根进行共转化。结果7 2 的转化株 中两个t - d n a 以同向或不问向连锁。表明不同细菌的t d n a 通常整合在同一 个位点。 在十字花科植物中，无选择标记基因转化系统的研究仍处于初级阶段，须进 一步研究和应用。 6 转基因存在的问题 目前，基因转化存在主要存在转化效率低、遗传稳定性差等问题；同时也存 在转基因过程中还无法预测基因的插入位点或达到基因的定点整合。外源基因可 插入植物基因组的非编码区、结构基因区或调控区，易引起插入突变等问题，这 也是很多科学家一直要探索和研究的重要课题之一。近年来，许多研究者发现， 转基因表达水平不稳定。原因主要是外源基因插入容易导致基因沉