（发育生物学专业论文）fstl1在小鼠中枢神经系统的表达谱分析及其功能初探.pdf

中文摘要 f s t l l 在小鼠中枢神经系统的表达谱分析 及其功能初探 研究生姓名：杨洋导师姓名：赵春杰( 教授) 东南大学疾病与发育教育部重点实验室 中文摘要 风们( f o l l i s t a t i n l i k e1 ) 最早从小鼠的成骨细胞系中克隆获得，因为转录生长因 子t g f ( t r a n s f o r m i n gg r o w t hf a c t o r ) 1 31 可以诱导其表达上调，所以又被称为t s c 3 6 ( t g f b s t i m u l a t e dc l o n e3 6 ) 。f s t l l 是一种分泌性细胞外糖蛋白，在鸡胚中的实验 证明f l i k ( f s t l l 在鸡中的同源物) 可能通过调节b m p 或t g f p 家族的一些相关配 体在中胚层背部化和神经诱导中发挥作用，并随后维持s h h 信号的表达。故此推测 f s t l l 基因在小鼠中可能也参与神经系统的发育。为了研究胁川在小鼠中枢神经系统 ( c n s ) 发育过程中的功能，我们利用原位杂交技术检测了f s t l l 基因在小鼠c n s 发 育过程中的表达谱，便于探讨f s a l 与小鼠c n s 发育的关系。结果显示f s a l 在中枢 神经系统的多个区域均有较强的表达。在端脑，出生之前风们在脑室区和脑室下区 表达较强，尤其在顶板和底板处表达强烈，出生后在大脑皮质的第一躯体感觉区，视 皮质区，听皮质区的i i 、i 层表达适中；在海马整个发育阶段直至成年，f s t l l 持续 强烈表达两力j 在胚胎期的丘脑发育信号中心强烈表达，另在间脑和后脑的多个核 团如缰核、背内侧核、面神经核、蜗神经核等可以检测到f s t l lm r n a ；并且在嗅皮 质和边缘系统中的多个部位如梨形皮质、嗅皮质、嗅结节、隔区等也有f s t l l 表达； 胚胎期的脊髓底板和出生后脊髓前角处可检测到而f ，jm r n a 阳性信号；从胚胎1 4 5 天开始，背根神经结中f s t l l 的信号持续强烈表达。综上所述，f s t l l 在整个c n s 中 表达广泛，从胚胎持续表达至成年，由此推测，f s t l l 可能对中枢神经系统的发育及 功能维持亦有重要调控作用。故此我们进一步利用f s a l 条件性基因敲除小鼠研究其 在端脑中的功能。 关键词： f o l l i s t a t i n 1 i k e1 ；发育；中枢神经系统；小鼠；原位杂交 英文摘要 e x p r e s s i o np a t t e r no ff s t l li nt h ed e v e l o p i n g c n si nm i c ea n di t sp r i m a r i l yf u n c t i o n a l s t u d y g r a d u a t es t u d e n t ：y 锄gy a n g s u p e r v i s o r ：z h a oc h u nj i e k e yl a b o r a t o r yo fd e v e l o p m e n t a lg e n e sa n dh u m a nd i s e a s e ， m i n i s t r yo f e d u c a t i o ns o u t h e a s tu n i v e r s i t y a b s t r a c t f o l l i s t a t i nl i k e1 ( f s t l l ) a l s on a m e dt s c - 3 6 ( t g f p s t i m u l a t e dc l o n e3 6 ) ，w a sf i r s t c l o n e df r o mt h em o u $ eo s t e o b l a s t i cm c 3 t 3 - elc e l ll i n e ，a n dc a l lb eu p - r e g u l a t e db y t g f b i te n c o d e sas e c r e t e de x t r a c e l l u l a rg l y c o p r o t e i n f l i k ，t h ef s t l1h o m o l o g u ei n c h i c kw a sr e p o r t e dt op l a yar o l ei nn e u r a li n d u c t i o na n ds u b s e q u e n tm a i n t e n a n c eo f m i d l i n es h hs i g n a l i n g i tm o d u l a t e st h ea c t i v i t i e so fb m po rt g f pr e l a t e dl i g a n d sa sa l l i n h i b i t o ro ft g f ds u p e r f a m i l yi nas i m i l a rw a yt of o l l i s t a t i n p r e v i o u ss t u d ys u g g e s t e d f s t l lm a y p l a ya ni m p o r t a n tr o l ei nc n sd e v e l o p m e n to fm o u s e t os t u d yt h ef u n c t i o n s o ff s t l ld u r i n gt h ed e v e l o p m e n ti nm o n s ec n s ，w ef r i s te x a m i n e dt h ee x p r e s s i o np a t t e r n o ff s t l li nt h ed e v e l o p i n gc n si nt h em o u s eb yi ns i t uh y b r i d i z a t i o n f s t l lw a ss t r o n g l y e x p r e s s e di nm u l t i p l er e g i o n si nc n s o u rr e s u l t ss h o w e df s t l lp o s i t i v ec e l l sw e r e m a i n l yl o c a t e di nv za n ds v z ，a n dt h eh y b r i d i z a t i o ns i g n a lw a sd e c r e a s e di nc o r t e xa f t e r b i r t h f s t l lw a se x p r e s s e di nh i p p o c a m p a lp l a t es t r o n g l ya n dm a i n t a i n e dt oa d u l t h o o d s t r o n gf s t l ls i g n a l sw e r ea l s oo b s e r v e di nm a n yn u c l e ii nd i e n c e p h a l o na n dh i n d b r a i n ， i n c l u d i n gm e d i a lh a b e n u l a rn u c l e u s ( m h b ) ，m e d i a ld o r s a ln u c l e u s ( m d ) ，c o c h l e a rn u c l e i a n ds oo n i na d d i t i o n ，s t r o n ge x p r e s s i o no ff s t l lw a sd e t e c t e di nt h a l a m e n c e p h a l i c s i g n a lc e n t e ra sw e l la so l f a c t o r yc o r t e xa te l4 5 - p 0 i nt h es e p t a la r e aa n dc i n g u l a t e g y r u so ft h el i m b i cs y s t e m ，f s t l lw a sd e t e c t e da tp o s t n a t a ls t a g e s h i g hl e v e le x p r e s s i o n w a sa l s oa p p a r e n t l yo b s e r v e di nv e n t r a lh o r no fs p i n a lc o r d t h e s er e s u l t si n d i c a t e dt h a t f s t l lm a y p l a ya ni m p o r t a n tr o l ei nc n sd e v e l o p m e n t 、d i f f e r e n t i a t i o na n dp l a s t i c i t yi nt h e m o u s e w ew i l lu s ef s t l lf l o x e dm u t a n tm i c e ( f s t lll o x p ) t os t u d yi t sf u n c t i o n sf u r t h e r k e yw o r d s ：f o l l i s t a t i n - l i k e l ；d e v e l o p m e n t ；c n s ；m o u s e ；i ns i t uh y b r i d i z a t i o n i l 主要缩略诃表 主要缩略词表 缩写词 a o a t n b p c d s c g c g c n s c s d d e p c d h 2 0 d r g f r p f s t l l 烈 g i h h l g e m d m e 5 m 舶 m m m 0 5 p l r i 玎 s si t a e t g f t s c 3 6 英文 中文 a n t e r i o ro l f a c t o r yn u c l e u s 前唉核( 嗅皮质) a n t e r i o rt h a l a m i cn u c l e i 前核复合体( 间脑) b a s ep a i r碱基对 c o d i n gs c q u c n c 圮编码序列 c i n g u l a t ec o r t e x扣带皮质 c i n g u l a t e扣带回 c e i l t r a ln e i v o u 【ss y s t e m 中枢神经系统 c o r t i c o s t r i a t a lj u n c t i o n 皮质纹状体接合部 d o r s a lt h a l a m u s 背侧丘脑 d i e t h y lp y r o c a r b o n a焦碳酸二乙酯 d e i o n i z e dw a t e r 去离子水 d o r s a lr o o t g a n g l i a 背根神经节 f o l l i s t a t i n r e l a t e dp r o t e i n f o l l i s t a t i n 相关蛋白 f o l l i s t a t i nl i k e1 f o l l i s t a t i n 相似因子1 f a c i a ln e r v en u c l e u s 面神经核( 脑桥) g i g a n t o c e l l u l a rr e t i c u l a rn u c l e u s巨细胞网状核( 脑桥) h i p p o c a m p u s海马 h o u r 小时 l a t e r a lg a n g l i o n i ce m i n e n c e 外侧隆起 m e d i a ld o r s a ln u c l e u s 内侧背核( 丘脑) m e s e n c e p h a l i cn u c l e u so f t h e5 t hn e r v e 三叉神经中脑核( 脑桥) m e d i a lh a b e n u l a rn u c l e u s 缰内侧核( 上丘脑) m i n u t e 分钟 t r i g e m i n a lm o t o rn u c l e u s三叉神经运动核( 脑桥) p i r i f o r mc o r t e x 梨形皮质 r e v e r s et r a n s c r i p t i 逆转录 s e c o n d 秒 p r i m a r ys o m a t o s e n s o r yc o r t e xa r e a 第一躯体感觉皮质 t r i sg l a c i a la c e t i ca n de d t ab u f e 乙酸、e d t a 缓冲液 t r a n s f o r m i n gg r o w t hf a c t o r 转化生长因子 t g f p s t i m u l a t e dc l o n e3 6 t g f d 诱导克隆3 6 i i i 东南大学硕士学位论文 t u vi v l p l v m v p o l f a c t o r yt u b e r c l e p r i m a r yv i s u a lc o r t e x v e n t r a ll a t e r a ln u e l 哪 m i c r o l i t e v e n t r a lm e d i a ln u c l e u s v e n t r a lp o s t e r i o rn u c l e u s 嗅结节( 嗅皮质) 初级视皮质 腹外侧核( 丘脑) 微升 腹内侧核( 丘脑) 腹后核( 丘脑) i v 东南大学学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得东南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过 的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并 表示了谢意。 研究生签名：j 虚l 日 期：卫丛争 东南大学学位论文使用授权声明 东南大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆有权保留本人所送交学位论文的 复印件和电子文档，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。本人电子文档的内 容和纸质论文的内容相一致。除在保密期内的保密论文外，允许论文被查阅和借阅，可 以公布( 包括刊登) 论文的全部或部分内容。论文的公布( 包括刊登) 授权东南大学研 究生院办理。 研究生虢牛导师繇榉日期：攀p 前言 1 1 刖舌 中枢神经系统的发育是一个复杂而又精密的过程，各种基因在目前尚不完全清楚的 机制诱导下按照一定的时序表达，它们的产物又有序地调控神经细胞的迁移、增殖、生 长、分化与消亡。 风订，( f o l l i s t a t i n 1 i k e1 ) 最早是从小鼠的成骨细胞系m c 3 t 3 e 1 中克隆获得，因为 转录生长因子t g f ( t r a n s f o r m i n gg r o w t hf a c t o r ) bl 可以诱导其表达上调，所以又被 称为t s c 3 6 ( t g f d s t i m u l a t e dc l o n e3 6 ) 【j j 。f s t l l 是一个属于b m 一4 0 s p a r c o s t e o n e c t i n 家族的分泌性细胞外糖蛋白，含有一个高度保守的f o l l i s t a t i n 区( f s 区) 【l 2 】， 又被称为f r p ( f o l l i s t a t i n r e l a t e dp r o t e i n ) 。 f o l l i s t a t i n 可以抑制a c t i v i n s 活性【 引，同时还 可以与转录生长因子t g f d 家族的许多蛋白如b m p 、m y o s t a t i n ( m s t n ) 等结合睁。丌，参 与胚胎发育。有文献指出f s t l l 最早从胚胎6 5 天开始在小鼠的原条和头褶开始表达【8 】， 原条是脊椎动物原肠胚形成的组织中心，它可以确定未来胚胎的中线位置以及引导细胞 迁移至胚层一j 。在鸡胚中的实验证明f k ( 风“j 在鸡中的同源物) 可能是通过调节b m p 或t g f p 家族的其他一些相关配体在中胚层背部化和神经诱导中行使作用，并在随后维 持s h h 信号的表达【1 0 j 。2 0 0 6 年，j i n l i nz h o u 在扁虱中发现f s t l l 的重组蛋白可以结合并 活化a c t i v i n a 和b m p 2 】。之前有文献指出b m p 4 在大鼠c n s 有广泛表达，主要表 达在海马和皮质【l2 | ，这提示小鼠中风“j 可能通过调节b m p 信号通路参与了海马和皮质 的发育。目前对f s t l l 基因在哺乳动物中枢神经系统中的分布及作用研究较少，表达谱 研究还局限在胚胎发育早期e 1 2 5 以前【l 引。为此，本研究采用原位杂交技术详细研究了 f s t l i 在小鼠c n s 发育中的表达情况，为今后研究f s t l l 基因的功能提供更为详实的资 料。根据表达谱提供的信息，我们结合f s t l l 条件性敲除小鼠来深入研究f s t l l 在端脑中 的功能。 东南大学硕士学位论文 f s t l l 的研究现状 文献综述 一、概述 f s t l l ( f o l l i s t a t i n l i k ej ，) 最早从小鼠的成骨细胞系m c 3 t 3 e 1 中克隆获得，因为转 录生长因子t g f ( t r a n s f o r m i n gg r o w t hf a c t o r ) p1 可以诱导其表达上调，所以又被称为 t s c 3 6 ( t g f p s t i m u l a t e dc l o n e3 6 ) 【1 1 。 f s t l lc d n a 含有一个可编码3 5 k d a 蛋白的开放阅读框，c 端糖基化后蛋白分子量 为3 8 k d a 【l j 。f s t l l 是一个属于b m 4 0 s p a r c o s t e o n e c t i n 家族的分泌性细胞外糖蛋白。 该家族蛋白都有一个细胞外钙结合( e x c e l l u l a rc a l c i u m b i n d i n g ，e c ) 区和一个f o l l i s t a t i n 1 i k e ( f s ) 区 。这个家族成员还包括糖蛋白( b m 4 0 s p a r c o s t e o n e c t i n ，s c l h e v i n ，q r l ， s m o c 1 ，s m o c 2 ) 以及蛋白多糖t e s t i c a n 1 ，一2 ，3 等。虽然f s t l l 属于b m 4 0 s p a r c o s t e o n e c t i n 家族，但该家族中保守的结构域e c 区在f s t l l 是没有功能的，这也 许因为f s t l l 在进化中拥有了与家族不同的其它功能【2 】。f s t l l 另一个结构域f s 区在 各种模式动物中具有高度保守性，f s 区大约有近7 0 个氨基酸，包含1 0 个保守的半胱 氨酸残基，f o l l i s t a t i n 中的这个区域被认为可以与生长因子结合【1 4 0 卯，目前还没有文献 报道该区域在f s t l l 中是否也起同样的作用。其他含有f s 区的因子还有f o l l i s t a t i n ， f o l l i s t a t i n - l i k e3 ( f s t l 3 ) ，s p a r c ，s c 1 h e v i n ，t e s t i c a n ，q r l 等，它们与f o l l i s t a t i n 1 i k e 1 ( f s t l l ) 同属于f o l l i s t a t i n 家族【l6 】( 图1 ) 。 二、 眙“j 在各类模式动物中的表达 1 非洲爪蟾( 脚) 1 9 9 9 年，人们在非洲爪蟾中克隆出乃玎j 的同源c d n a ，称为x f r p 。x f r p 和小鼠， 人以及鸡的f s t l l 相比，分别有7 0 ，7 1 ，6 8 的相似性。在f s 区则具有高达9 5 的同源性，但是爪蟾中x f r p 只有一个糖基化位点，人和鸡中则分别有四个和两个。 x f r pm r n a 最早在爪蟾的1 0 体节时开始表达，首先在s p e m a n n 中心，之后表达在脊 索、神经管的f l o o rp l a t e 、h y p o c h o r d a l ( 底索) 和体节。这些表达和f o l l i s t a t i nm r n a 的 表达非常相似，人们推测脚可能在爪蟾的神经发生中发挥作用【1 4 】。 2 文献综述 f o l l i s t a t i n n h 2 【= j e 妻 ( 3 1 l a 4 4 ) f r p t s c - 3 6 f s t l l 毗虹曼= = = = ( 3 0 e ) j _ f l ，f s t l 3 s p a r c n h 20 0 3 ) f i g u r el 。s c h e m a t i cr e p r e s e n t a t i o no ff o l l i s t a t i n a n dr e l a t e df s d o m a i n 粕a r i n gp r o t e i n s f o l l i s t a t i na n df o l l i s t a t i n - r e l a t e dg e n ep r o - t e i n ( f l r g ) f o i l i s t a t i n - l i k e3 ( f 譬n 3 ) h a v em o r et h a n2f sd o m a i n s i nt h ec o o ht e r m i n u s ，f o l l i s h a t i n r e l a t e dp r o t e i nf f r p ) 糟s c 3 弱w 1c o n t a i n sas i n g l ef o l l i s t a t i nd o m a i ni nt h en h ，t e r m i n u s n u m b e r si np a r e n t h e 辩sr e p r e s e n ta m i n oa c i dr e s i d u e si nt h eh u m a n p r o t e i n s s i g n a lp e p t i d e sa r cs h o w ni nt h es o l i dp o r t i o n so ft h eb a r s 图1f o l l i s t a t i n 家族1 1 7 i 2 鸡( f l i k ) 在鸡中，风盯j 的同源基因f l i k 与小鼠有9 3 的相似性。励忌在鸡发育中的表达比 f o l l i s t a t i n 早，只km r n a 表达在中线原条和神经胚芽期，并且在中线的表达向周围组 织呈梯度递减。因为f o l l i s t a t i n 和f l i k 都特异性标记在组织者( 亨氏结和中胚叶前体) 以及早期神经板，人们认为这两个基因可能参与中胚层背部化和神经诱导【l 引。以前的研 究表明尽管这两个基因表达相似，但是在发育过程中，它们被其他信号诱导表达的机制 并不相同，脊索可以抑制f o l l i s t a t i n 表达，但对f l i k 表达没有影响，f l i k 由神经管发出 的信号诱导表达，而非脊索诱导【l9 】。 3 短尾猿( o c c l ) o c c l 是f s t l l 在短尾猿中的同源基因，它与人f s t l l 的同源性高达9 9 ，而与小鼠， 大鼠和鸡也分别有8 9 、8 9 和7 9 的同源性【2 0 1 。在短尾猿的海马的c a 2 的锥体细胞 层发现了o c c l 的表达，在始层和c a 3 还有散在的细胞表达傀c 严1 1 。原位杂交结果显 示o c c lm r n a 特异且大量表达在第一视皮质( v 1 ) 的丘脑投射层，并且成年短尾猿单 眼剥夺之后，o c c lm r n a 表达明显下调f 2 2 1 。在短尾猿的发育中研究显示o c c lm r n a 在出生后表达增强【2 1 1 。这些结果证明o c c lm r n a 的表达是以一种活性依赖性方式表达， 由丘脑传入视皮质的活性调节。并且在新皮质谷氨酸兴奋性神经元及g a b a 氨能抑制 性中问神经元都表达o c c lm r n a ，但只有v 1 的兴奋性神经元是活性依赖性表达的【2 0 j 。 t o r u t a k a h a t a 在之后实验得出在单眼剥夺后短尾猿v l 区o c c lm r n a 的表达大幅减少， 而在小鼠中则没有这个现象，作者认为这个结果说明在小鼠中f s t 1 的表达与感觉传入 无关【2 3 1 。 4 人 通过n o r t h e r nb l o t t i n g 检测，f s t l l 除了在外周血白细胞之外，在人体组织中普遍存 在，尤其在心脏、前列腺、卵巢、胎盘及小肠中f s t l l 表达最耐2 4 1 。 3 东南人学硕士学位论文 5 小鼠 到目前为止，f s t l l 在小鼠中的表达谱研究还局限在胚胎发育早期e 1 2 5 以前。f s t l l 从胚胎7 5 天开始表达于原条( p r i m i t i v es t r e a k ) 以及中胚层临近的头褶( h e a d f o l d ) ，在 胚胎8 5 天时小鼠的神经板、体节、脊索、前肠、心脏、前脑和后脑检测到f s t l l 的表 达，到胚胎9 5 天肾小管也开始表达毋订，】。2 0 0 7 年，d e r e ka d a m s 的实验结果显示f s t l l 在小鼠胚胎期呈广谱性表达，大多数组织的间叶细胞都有表达。d e r e ka d a m s 发现在中 枢神经系统发育中，胚胎9 5 天f s a l 特异性表达在神经管的底板，前脑的顶板和底板 分别有微弱的表达，但背侧部无表达；到胚胎1 2 5 天f s t l l 广泛表达于底板，背部的脉 络丛也可检测到f s t l l 表达；在感觉器官中，f s t l l 在眼睛周围的色素上皮和视茎以及内 耳的间叶细胞都有较强表达，嗅上皮周围的间叶细胞也可检测到而以j 表达；在外周神 经系统中，f s t l l 在d r g ( d o r s a lr o o tg a n g l i a ) 没有表达，但是高表达在d r g 周围的 间叶细胞【l3 1 。在和短尾猿比较中，t o r ut a k a h a t a 发现成年小鼠皮质中f s t l l 表达较弱， 在大脑皮质的b 层，f s t l l 有中度表达，在耳蜗神经核和背外侧膝状体核也检测到f s t l l 表达【2 3 1 。 三、风川的功能 1 与t g f b 家族的关系。 t g f p 家族成员包括t g f d 、抑制素( i n h i b i n s ) 、活化素( a c t i v i n s ) 、d p p 和b m p s 等。 t g f p 超家族结构上的共同点为每个家族成员c 末端的2 5 氨基酸序列是相同的，其中 7 个c y s 非常保守。已有的研究证明t g f 1 3 超家族在机体的发生发育过程中起着重要的 作用。t g f bl 是小鼠成骨细胞系m c 3 t 3 e 1 细胞的生长抑制剂【2 5 1 。在t g f p1 作用4 小时后，f s t l l 的表达增长了近十倍。但是在v k j r a s ( 一种癌基因) 转化的m c 3 t 3 细 胞或者n i h3 t 3 细胞( d t ) 中，f s t l l 出现大幅度表达下调【lj 。之后有研究发现在v - m y c 转化的成纤维细胞中也出现f s t l l 大幅表达下调，但在其他癌基因如：v s r c ，v a b l ，或v - r a f 转化的细胞中f s t l l 的表达则无太大变化【2 6 】。同年，o h a s h i 在雌激素受体阳性的成骨细 胞系c d 0 7 f 中检测到一个由雌激素诱导表达上调的基因，后证明该基因就是f s d l ，且 其还可以由莫西芬诱导上调。这些结果显示f s t l l 在成骨细胞中可能是作为一个雌激素 调节剂存在1 27 1 。虽然也有实验认为t g f bl 在一些成骨细胞中可以由雌激素诱导表 达【2 戤列j ，o h a s h i 等人n o r t h e r nb l o t 的实验数据显示在雌激素阳性的细胞中f s t l l 和t g f b1 是同时表达的，但是在成骨细胞系c d 0 7 f 中，t g f pl 的表达却不受雌激素和它莫 西芬的作用影响。所以人们认为在雌激素受体阳性的成骨细胞系c d 0 7 f 中，雌激素和 它莫西芬上调f s d l 表达是不依赖于t g f bl 的。 2 与f o l l i s t a t i n 家族成员的关系 f s t l l 又被称为f r p ( f o l l i s t a t i n r e l a t e dp r o t e i n ) ，在结构上属于f o l l i s t a t i n 家族，其作 用机制可能与f o l l i s t a t i n 相似。f o l l i s t a t i n 3 j 是一个分泌蛋白，具有三个高度保守的f s 区。 f o l l i s t a t i n 可以与t g f d 家族中的a c t i v i n s 高亲和力地结合，从而阻止a c t i v i n s 与其受体 结合，达到抑制a c t i v i n s 活性的作用【4 5 】，而且f o l l i s t a t i n 还可以与t g f p 家族的其它蛋 白如b m p 、m y o s t a t i n ( m s t n ) 等结合1 6 7 叫j 。小鼠中f o l l i s t a t i n 最早在原条( p r i m i t i v es t r e a k ) 表达，之后表达在后脑的2 、4 和6 菱脑节，然后到胚胎9 5 天中脑，间脑及体节也开始 表达瞵 3 1 】。在f o l l i s t a t i n 缺失的小鼠中，没有看到明显的神经系统结构异常，突变鼠生长 缓慢，横膈膜消失，肋间肌减少，胡须和牙齿异常等，因为无法呼吸，出生后数小时后 死亡【32 。在a c t i v i n s 突变的小鼠也表现出同样的表型。人们认为f o l l i s t a t i n 可能通过参与 调节t g f d 家族的几个因子来起到作用1 3 引。在非洲爪蟾中，f o l l i s t a t i n 的表达与f s t l l 很 4 文献综述 相似1 1 4 j ，在鸡中的实验也证明f s t l l 的作用方式可能是和f o l l i s t a t i n 相似，都是通过抑制 b m p 或t g f b 家族的其他一些相关配体来行使其功能的【1 0 ，3 4 。 f s t l 3 具有两个f s 区，被称为f s r e l a t e dp r o t e i n ( f s r p ) 或f s - r e l a t e dg e n e ( f l r g ) 。 f s t l 3 和f o l l i s t a t i n 一样都具有a c t i v i n 结合活性并可以抑制a c t i v i n 相关基因的转录物的 功能。在扁虱中，f s t l l 也被证明有相似作用3 5 1 。f s t l 3 还可以与b m p 以及 m y o s t a t i n ( m s t n ) 结合【7 ，3 6 】，与f o l l i s t a t i n 相似。在小鼠中，f s t l 3m r n a 大量表达于心脏、 肺、肾和睾丸【”j 。还有文章认为f s t l 3 和m s t n 以及f o l l i s t a t i n 、a c t i v i n 共同参与了心 脏的发割5 ，3 7 j 。虽然f s t l 3 被称为f s r p ( f s r e l a t e dp r o t e i n ) ，与f r p ( f o l l i s t a t i n r e l a t e d p r o t e i n ) 的名称相似，也都同属于f o l l i s t a t i n 家族，但暂时还没有实验证明两者有直接的 关系。 3 在胚胎发育中的作用 研究表明f s t l l 可能参与了b m p 信号通路，从而调节胚胎发育过程。 b m p 信号已被证明在胚胎发育中起着重要的作用。骨形成蛋仨l ( b o n em o r p h o g e n t i c p r o t e i n s ，b m p s ) 是机体的多肤生长因子之一，除b m p l 外，其他均属于t g f d 超家族 成员【3 8 1 。b m p 家族已确认的至少有二十多个成员，构成t g f b 超家族中最大和增加最 快的一个蛋白家族【3 9 1 ，其结构的c 端有1 4 的氨基酸序列是相同的，尤其是其中7 个半 胱氨酸序列绝对保守，并形成保守的半胱氨酸小结片段，这与其功能高度相关【3 9 枷】。生 物体内除存在众多种类的b m p s 外，尚存在多种b m p s 的生理拮抗剂，主要包括n o g g i n 、 c h o r d i n 、f o l l i s t a t i n 、s o g 和d a n 家族的成员1 4 卜43 1 。这些拮抗剂广泛地存在于发育中的 胚胎脑区和成体脑区，与b m p s 一起组成一个网络调控c n s 的发育。 近来研究表明b m p s 在神经系统的发育中有多种作用，从神经板的诱导到神经系统 发育成熟的不同时期、不同脑区，b m p s 均起着重要作用【39 ，他4 5 1 。在神经发育的不同时 期b m p 的表达部位也都各不相同。在神经发育的初始阶段，b m p s ( 如b m p 4 、b m p 7 ) 就表达于外胚层中，抑制神经组织的发型4 “47 | 。此后b m p s 及相关分子( 包括t g f p 超家族成员) 继续表达于外胚层中，诱导背侧神经细胞类型的分化，如b m p 4 、b m p 7 表达于外胚层，诱导背侧细胞的产生。当神经板产生神经管时，b m p 4 仍高表达于神经 褶和神经管的中线区域，直到神经管闭合时。在神经管闭合和成熟的过程中，b m p 4 表 达于头侧背正中线区域，b m p 6 表达于整个轴索，b m p 5 和b m p 7 则重叠地表达于背正 中线区域【钓 4 8 o 在神经发育的中晚期，b m p s 表达于哺乳类动物的大部分脑区，但表达 强度有所差掣崛4 引。b m p 2 、4 高表达于e 1 2 1 6 小鼠室管膜层( v e n t r i e u l a r z o n e ，v z ) 细胞。在p 1 周大鼠，额叶皮层、枕叶皮层与海马的前下托可见较强的阳性信号。生后 1 个月，海马与皮层b m p 4 的表达达到生后的峰值，b m p 4 在颞叶皮层与杏仁周皮质 呈强阳性表达。生后3 个月，b m p 4 在大鼠c n s 有广泛表达，其中在海马、颞叶皮 层、杏仁周皮质、丘脑侧核与下丘脑的室旁核均可见强阳性信号【1 2 1 ，其中在海马和皮质 f s t l l 都有表达。 b m p s 的拮抗剂n o g g i n 、c h o r d i n 和f o l l i s t a t i n 表达于s p e m a n n 中心( s p e m a n n o r g a n i z e r ) ，他们与b m p s 结合而阻断b m p s 的作用，诱导神经外胚层的形成【4 3 ，4 7 4 圳。在 吻侧区域神经化过程中，b m p f o l l i s t a t i n 信号起着决定性作用。在背侧神经管的分化中， b m p 也起到非常重要的作用，b m p 在此处可以诱导神经嵴细胞和背部中间神经元的发 生，b m p 与腹侧诱导信号s h h 相互抑制，共同对背腹轴形成起到作用【4 7 。 b m p 的家族成员按结构可分为不同的类型，b m p 2 、4 、7 是研究得最多的成员， b m p 2 、4 、7 在胚胎发育( 如神经系统、心脏、肾脏、肢体、头颅、肋骨、眼等器官的 形态发生) 中起重要作用。尤其是b m p 2 、4 ，二者的氨基酸有8 3 的同源性，b m p 2 b m p 4 在胚胎发育过程中，神经管背腹轴模式的形成及细胞命运的选择过程中起重要作用【5 们。 东南大学硕士学位论文 其中b m p 4 已被证实对神经组织的生长、发育和分化有重要的调节作用，同时还参与细 胞凋亡和细胞信号传导的调节【4 8 1 。 s 1 1 l l 由脊索和神经管底板诱导产型孔s 引，其信号通路参与调控脊髓背腹轴模式建 立p 5 4 1 ，且对胚胎发育过程中的细胞分化和增殖起重要作用【5 引。在神经系统的发育中， s h h 缺失的人和小鼠均出现前脑无裂畸形和独眼畸形【5 9 1 ，证明s h h 在前脑发育中起到 重要作用，并且s h h 对于m g e ( m e d i a lg a n g l i o n i ce m i n e n c e s ) 和l g e ( 1 a t e r a lg a n g l i o n i c e m i n e n c e s ) 中细胞的产生是必需的【6 u 】；中脑和后脑的多巴胺能神经元和血清素激活神 经元的产生也需要s h h 信号【6 卜6 2 j ；在小脑中，颗粒状细胞前体细胞的增殖同样需要s h h 信号【6 3 j 。s h h 信号可能还调控包括s v z 区、海马和嗅球等脑的其它部位祖细胞的自我 更新【5 5 , 6 4 】。 用f l i k 的反义寡聚脱氧核糖核酸处理原肠胚的鸡胚后，出现轴发育和前脑发育异常， 胚胎发育早期抗b m p 信号的减弱，原本背部不表达b m p 一4 的区域在处理之后出现阳性 信号，但b m p 4 的配体c h o r d i n 表达并没有改变，之后s l l h 信号也随之减弱。也许正是 因为背部化和神经诱导信号变弱，难以维持之后脊索中胚层和神经系统中线的信号，因 而无法调节中胚层形成。f l i k 可能是通过调节b m p 或t g f b 家族的其他一些相关配体 在中胚层背部化和神经诱导中行使作用，以及在随后维持s h h 信号的活性【l o j 。2 0 0 6 年， 人们在扁虱中发现风玎的重组蛋白可以结合并活化a c t i v i n a 和b m p 2 【l 。在南京大学 未发表的数据显示在f s t l l 基因敲除的纯合子小鼠中存在呼吸系统异常，脊椎骨及肢骨 异常，神经管背腹分化异常。s h h 在中轴的表达量与正常小鼠相比有所下降，推测可能 由于f s t l l 抑制b m p 信号从而导致s h h 信号的降低，但还缺乏直接的证据。有文献指出 b m p 4 在大鼠c n s 有广泛表达，主要表达在海马和皮质【12 1 。而本实验中结果显示风f ，j 在此处也有表达，这提示小鼠中f s t l l 可能也是通过b m p 信号通路调节了海马和皮质的 发育。由此可见，f s t l l 对中枢神经系统的发育可能起重要作用。目前对f s t l l 基因在哺 乳动物中枢神经系统中的分布及作用研究较少，表达谱研究还局限在胚胎发育早期 e 1 2 5 以前【l3 | 。为此，本研究采用原位杂交技术法详细研究f s t l l 在小鼠c n s 发育中的 表达情况，为进一步研究f s t l l 基因的功能提供更为详实的资料。 4 其他 f s t l l 与风湿性关节炎( r a ) 关系密切，它是风湿性关节炎自身抗体的靶抗原之一 睇4 ，作为一个联合防御因子在其中起作用【6 5 1 。人们认为f s t l l 是治疗关节炎的一个关 键因子【1 7 】。 f s t l l 可能还和细胞增殖和迁移有关。在胚胎期的小鼠中，f s t l l 表达主要在肺的气 道上皮【1 3 】。成年小鼠的各器官中，r t - p c r 的结果显示f s t l lm r n a 在肺中表达最强， 并且原位杂交的结果显示f s t l l 在肺泡上皮表达但支气管上皮不表达，人们推测f s t l l 也 许可以作为人类肿瘤的一个指