（遗传学专业论文）重组猪生长激素在毕赤酵母中的表达及其生物活性研究.pdf

， 图片目录 图1p c r 结果电泳图谱( 1 2 琼脂糖凝胶) 2 1 图2 重组p p i c 3 5 k 质粒的曲落p c r 电冰图( 1 - 2 9 6 琼脂糖凝胶) 2 2 图3p c 3 5p g l l 屁d i e c o r l ，庇棚i + j ，舾i 酶切电泳图谱( 1 2 琼脂糖凝胶) 2 2 图4 重组质粒p c 3 5 k p g h 酶切位点图2 3 图5 基因组p c r 电泳图谱( 1 0 琼脂凝胶) 2 3 图6p p i c 3 5 k - p g h 重组酵母菌的表达产物s d s p a g e ( 1 2 5 ) ( 第一次转化) 2 4 图7p p i c 3 5 k - p c 汛重组酵母菌的表达产物s d s p a g e ( 1 2 5 ) ( 再次转化) 2 5 图8p c 3 5 l ( p g h 重组酵母菌的w e s t e r nb l o t t i n g 结果3 2 图9p g h 蛋白及p g h 重组酵母作用小鼠增重情况3 3 重组p g h 在毕赤酵母中的 表达及其生物活性研究 遗传学专业 研究生：付若彬指导教师：刘世责教授 摘要 本研究首先将克隆到的猪生长激素( p g n ) 基因e d n a 编码区片断定向插入 p m d t 质粒，转化大肠杆菌j m l 0 9 ，用菌落p c r 和质粒p c r 方法筛选阳性克 隆；以b a m hi 和e 幻r j 酶切鉴定重组质粒。将得到质粒用b a m hi 和e 幻刚酶 切，胶回收后定向插入p p i c 3 5 k 质粒，重组质粒命名为p p i c 3 5 k p g h 。 p p i c 3 5 k - p g h 。质粒用s a l 酶切线性化处理后，经电击转化g s l l 5 酵母，用m d 和m 培养基，筛选重组子，破碎细胞，提取基因组，用p c r 的方法进一步鉴 定，并用g 4 1 8 抗生素进行拷贝数筛选，以甲醇诱导目标蛋白表达，产物经 s d s p a g e 和w e s t e r n - - b l o t 分析，得到高效表达p g h 的重组酵母，命名为 p p i c 3 5 k - p g h g s l l 5 ，s d s p a g e 和w e s t e r n - - b l o t 分析证明诱导重组酵母表达 了p g s 蛋白，分子量接近2 5 k d a ，与预期的2 4 4 k d a 的猪生长激素基因编码蛋 白质构成的融合蛋白大小一致。 p p i c 3 5 k - p g h g s l l 5 酵母经甲醇诱导表达，分别在4 8 ，7 2 ，9 6 ，1 2 0 小时 取样分析，得出最佳的表达条件和时日】。从聚丙烯酰胺制备凝胶中回收正确表达 的融合蛋白，对小自鼠用纯化p g h 蛋白灌胃) ( b 组) ；同时收集表达酵母菌体， 采用灌胃( c 组) 和自由采食方式( d 组) ，第7 d ，1 4 d ，2 1 d ，2 8 d 称霉，试验c 组在第三周与对照组之间差异显著( p o 0 5 ) 。表明p g h 重组酵母对办白鼠具有促 生长活性。 关键词：猪生长激素，p v i c 3 5 k 质粒真核表达，小白鼠，促生长活性 e u k a r y o ne x p r e s s i o no ft h er e c o m b i n a n tp g hi n p i c h i a p a s t o r i sa n di t sb i o a c t i v i t ys t u d y g r a d u a t es t u d e n t ：f ur u o b i nt u t o r l i ns h _ i g u i a b s t r a c t ：f i r s t l yi nm yr e s e a r c h , p o r c i n eg r o w t hh o r m o n e ( p g r og e n ew a sc o r r e c t l y i n s e r t e di n t op m d - tp l a s m i di no r d e rt oc o n s t r u c tt h ee x p r e s s i o np l a s m i d p p i c 3 5 k - p g h 1 h er e c o m b i n a n tp l a s m i dp m d - tw a st r a n s f o r m e d i n t oe c o l i j m l 0 9 c o m p e t e n tc e l l s n 砖p o s i t i v ec l o n ew a ss e l e c t e do u tb yc o l o n y p c ra n d p l a s m i dp c r w eu s e db a m hi a n de c o r id i g e s t i o nt oi d e n t i f yt h er e c o m b i n a n t p l a s m i d t h e n , w eo b t a i np g hg e n ef r a g m e n tb yb a m h ia n de c o r id i g e s t i o n , u s eg e l t o h a r v e s t , a n d d i r e c t l y i n s e r t i n t o p p i c 3 5 k p l 锄n i d t o p r o d u c e a r e c o m b i n a n t p l a s m i d , w h i c hw a sn a m e dp p i c 3 5 k - p g h a f t e rl i n e a r l yc l e a v a g e ，t h ep p i c 3 5 k - p g hp l a s m i d w a su s e dt ot r a l 砌o l t i lg s i l 5y e a s tb yl i g h m i n gs t r o k e , t h e niu s e dm da n dm m m e d i u m st os c t g e nt h er e c o m b i n a n t s ，c r a c k e dt h ec e l l sa n de x t r a c t e dt h eg e n o m e d n a , d o i n gf i l r t h a i d e n t i f i c a t i o nb yp c & a p p l i e dg 4 1 8a n t i b i o t i ct oc o p yn u m b e r s c r e e n i n g ，e m p l o y e dm e t h a n o lt oi n d u c ep r o t e i ne x p r e s s i o n , t h ep r o t e i ni ”e d u c tw a s a 1 1 a l y 2 尉b ys d s p a g ea n dw e s t e r n - - m o t , t h u sih a v eg o tap c hh i g he x p r e s s i o n r e c o m b i n a n ty e a s t , w h i c hw a sd e n o m i n a t e da s p p i c 3 5 k - p g h - g s i l 5 s d s p a g e a n dw a s t e r n - - b l o ta s s a y e sh a v ep r o v e dt h er e c o m b i n a n ty e a s t sh a v eb e e ni n d u c e dt o e x p r e s st h ep o hp r o t e i n , w h o s em o l e c u l a rw e i g h tw a sd o s et o2 5 k d a , w h i c hi si n a c c o r d a n c ew i t he x p e c t e d2 4 4 k d ap e nf u s i o np r o t e i n a t t e rp p i c 3 5 k p g n g s l1 5 y e a s t sw a si n d u c e db ym c t h e n o us a m p l e dt h ef e m e n t a f i o nb r o t hi n4 8 h , 7 2 h , 9 6 h a n d 1 2 0 hr e s p 鳅i v e l yi no r d e rt of i n do u tt h eb e s tc o n d i t i o na n dt i m eo fe x p r e s s i o n i h a v e s t e dt h ec o r r e c t l ye x p r e s s e df u s i o np r o t e i nf r o mt h rp o l y a c r y l a m i d eg e l ，t h e n 8 i n j e c t e x lp g 村i nm u sm u s c u l u sa l b u sa b d o m i n a lc a v i t y ( ag r o u p ) ；f o rt h es a m et i m ei c o l l e c t e d t h e p g h p r o t e i n a n d a d o p t e d ( b g r o u p ) a d o p t e d l a v a g e w a y ( c g r o u p ) a n d f r e e l yf o r a g i n gw a y ( dg r o u p ) , w e i g h e d i n7 正1 4 d 2 1 d , 2 8 d , t h e r el i e s s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e s ( p 0 0 5 ) b e t w e e ncg r o u pa n dc o n t r o lg r o u p si nt h et h i r dw e e k , w h i c h s u g g e s t e dt h a tp g hh a v eg r o w t hp r o m o t i o na c t i v i t yo nm u sm u s c u l u sa l b u s k e yw o r d s ：p 6 h , p p i c 3 5 kp l a s m i d , e u k a r y o f i ce x p r e s s i o n , m mm u s c u l u sa l b u s , g r o w t hp r o m o t i o na c t i v i t y 9 引言 我国养猪历史悠久，我国养猪业历史悠久，猪是原始先民最早驯化的动物之 一，从先秦时期就有了“六畜“的说法，”六畜”中猪为其一。养猪业在畜牧业中历 来占有重要地位，近年来，猪肉一直占肉类总产的7 0 左右，对于改善人民的生 活，增加农民收入，保证社会稳定起到了重要的作用。我国是世界养猪生产和消 费第一大国，年产生猪五亿头以上，猪存栏、出栏总量世界第一，猪肉产量世界 第一，占世界猪肉总产量的4 6 7 。随着现代人口数量的增加，土地的减少，水 环境的污染，粗放型自然牧养和圈养已不能满足人类的需求。尤其随着我国经济 体制的改革，农民商品意识逐步增强，养猪业正由传统家庭副业向专业化、规模 化、集约化、工厂化方向迅速发展。这就要求更合理、更有效的食料，旨在促进 猪的生长，缩短养殖周期，减低养殖成本。 猪的良种选育和促生长剂的研发是人们长期以来致力解决该问题的两种思 路。 传统的猪的良种选育是引种和杂交育种，起到过一定的积极作用。但杂交育 种存在着周期长，成本高等问题，现在比较热门的转基因育种是一个比较直观高 效的方式，美国伊利诺斯大学研究出一种带牛生长激素的转基因猪，这种猪生长 快、体大、饲料利用率高，可给养猪业带来丰厚的经济效益。澳大利亚研究人员 培育的转猪生长激素基因猪，生长速度比对照组提高了一倍。我国在“七五”，“八 五”期间，获生长激素转基因猪比非转基因猪生长水平提高2 0 ，但转基因动物 不同程度具有死胎和畸型率较高，患关节病、胃溃疡、肾病和不育症等现象，同 时外源基因转入的方法都存在转化率低、整合率低的缺点；外源基因在转基因猪 体内的表达调控也有待进一步研究：另外转基因的快速检测筛选系统的建立也需 加强。 促生长剂主要有化学促长剂和外源生长激素类促长剂。 铜是畜禽生长所必需的微量元素，有研究证明在饲料中添加铜离子可以明显 加快猪的生长，但猪肉的品质和铜的残留是限制其使用的严重问题。而促长抗病 剂的研究和使用作为一种使用简便，不同养殖规模部可以受益的方法一直受到关 注。以前对猪的促生长制剂开发主要包括化学合成激素类、抗菌药物等。其结果 是：首先，常因化学合成激素残留人体组织不能彻底分解、抗生素超标等问题引 1 0 发中国猪肉制品出口受阻；欧洲共同体明文规定：肉品生产不得使用激素制品。 其次抗生素过多过滥的使用也在一定程度上加剧了耐药菌甚至耐多药菌的产生， 破坏生态环境：还有，由于在动物体内的蓄积和残留严重或胁人类健康。随着激 素、类激素在饲料添加剂中的使用受到限制和禁止。寻求抗生素，化学激素的替 代制品已经成为目前的重要研究课题之一。 生长激素( g r o w t hh o r m o n e ) 是动物脑垂体远侧部腺垂体合成并分泌的一 种具有种属特异性的单链蛋白质类激素，由1 8 6 1 9 1 个氨基酸组成，分子量约 2 1 0 0 0 2 2 0 0 0 d a ，其与催乳素( p r o l a c t i np r l ) 和胎盘催乳素同属一个基因家族， 广泛存在于各种脊椎动物中。g h 作用机理复杂，影响动物机体蛋白质、脂肪和 糖的代谢，与其生长发育、繁殖等密切相关。因此，g h 是近些年在提高动物生 长速度、生长性能等方面研究的热点之一。猪生长激素是由1 9 1 个氨基酸残基组 成，分子量约2 2 2 4 k d a 。 人类对动物生长激素的认识起始于3 0 年代，目前近百种动物的生长激素己 陆续被分离提纯，其生理、生化机理方面的研究越来越深入。猪生长激素( p o r c i n e s o m a t o t r o p i n 简称p s i 或p o r c i n eg r o w t hh o r m o n e ，p g h ) 是由垂体前叶分泌的 含1 9 0 个氨基酸的单链多肽激素，p g h 几乎对所有组织的生长都有刺激作用。 其促进生长的生理生化机制在于调节动物的蛋白质、脂肪和糖代谢。大量研究工 作表明，外源猪生长激素( p g h ) 能够提高动物生长速度和饲料转化率，体内脂 肪减少( 可达5 5 ) 、提高每日体重增加量( 1 5 - 2 5 ) 和饲料转化率( 1 7 ) 。外 源生长激素也是现在研究的热点，猪生长激素可促进蛋白质合成和脂肪动用显著 提高猪的生长速度、饲料报酬和瘦肉率，具有明显的经济效益和社会效益。k i n d t j 等报道，给平均体重为5 9 k g + 1 4 k g 的猪每天颈肌注射重组猪生长激素，连用4 2 天，试验猪只的采食量降低增重和饲料报酬明显改善。4 0 - - 5 0 年代国外一些实验 室开始进行从垂体胄4 备动物生长激素的研究。7 0 年代末，基因工程技术成了制备 功能蛋白的新技术途径。1 9 8 1 年，美国率先克隆了牛生长激素基因( c d n a ) ，并 很快在大肠杆菌中表达了n 端多出一个甲硫氮酸的重组牛生长激素即基因工程 牛生长激素( r b s 0 。生长激素在大肠杆菌，酵母，蚕体中的表达研究也相继开展 起来，通过腺病毒携带生长激素转染动物，生长激素通过脂质体包被使用促进动 物生长的报道也相继出现。 因生长激素混入饲料后，进入消化道易被消化酶破坏而失效，故目前主要用 注射法，此法费工费时，生产者接受很困难。而埋植法的有效性和安全性有待更 多的验证，生长激素口服制剂研制成功后，将在提高养猪业的生产效率上发挥重 要作用。脂质体皿i l ) o s o m e s ) 是具有类似生物膜结构的双分子小囊，最早是英国学 者b a n g h a m 等对磷脂研究中发现的磷脂分散在水中后会自然形成多层囊泡，每 层均为脂质双分子层；囊泡中央和各层之间被水相隔开，双分子层的厚度约4 n m 由于脂质体能在动物体内降解，无毒性和免疫原性，作为药物载体可以提高药物 的治疗指数，降解药物的毒性。近年来，脂质体作为药物载体的研究倍受重视， 发展迅速。p g h 通过脂质体包裹后不仅可以保护p g h 免受消化酶的破坏，促进 吸收，而且可使p g h 缓释长效，提高p g h 的生物利用度和促生长效果试验结果 表明，p g h 及p g h 脂质体对雌性和雄性大白鼠均具有促生长活性，试验组与对 照组间差异显著口 l o ) 可实 现外源基因的高效表达。多拷贝单元可以通过整合时的重复发生得以实现，发生 频率通常为5 一l o ，为了筛选出高拷贝数转化子，可采用菌落杂交，或者增加 抗生素的浓度，以及用d n a 连环或专门构建的多拷贝载体如p a 0 8 1 5 和p a 0 8 5 6 ， 在体外构建好多拷贝表达载体后再转化毕赤巴斯德酵母等方法。本研究采用重复 转化，增加g 4 1 8 ( 四环素) 的浓度对高拷贝数重组菌进行筛选，获得了含高拷贝数 外源基因的酵母工程菌，实现了猪生长激素的高效表达。 第二章重组p g h 蛋白纯化及活性研究 摘要：本研究采用超声波细胞破碎和机械研磨的方法收集细胞表达产物，低 速离心去除细胞碎片，用丙酮沉淀蛋白，用g d 8 0 0 凝胶图像分析系统分析s d s p 蜘e 胶测定其回收的重组p g h 含量达3 7 8 m g l 用回收的蛋白进行 s d s p a g e 和w e s t e r n - b l o t 分析；同时用回收的蛋白样品进行小鼠径口饲喂和酵 母细胞进行小鼠经口饲喂和的方法研究小鼠促长实验。实验结果表明回收的重组 p g h 能特异地与猪肝膜g h 受体蛋白结合，具有免疫活性和生物活性：进一步 的小鼠促长试验研究发现重组p c ；h 蛋白灌胃处理组小鼠增重率和对照组无显著 区别。c 组小鼠在用p g h 重组菌体灌喂处理后，在第三周增重幅度达到显著( p o 0 5 ) ，b ，d 两组和对照组没有显著差异。 关键词促长纯化 w e s t e r n - - b l o t生物活性 1 引言 。 猪生长激素( p o r c i n eg r o w t hh o r m o n e ，p g h ) 是由猪脑垂体前叶合成分泌的一 种蛋白类激素，具有促进动物机体碳水化合物和葡萄糖吸收，促进脂肪分解和核 酸、蛋白质合成的作用。畜牧学效应表现为促进家畜生长和饲料转化，减低动物 胴体脂肪含量。因此p g h 研制开发具有极大的商业价值。目前国内外均有研制 成功基因工程重组p g i q 的报道。但基因工程重组p g h 的实际应用还存在许多困 难( 如缓释技术问题等) 。国外研究机构曾进行了p g h 缓释技术的积极探索，如美 国和韩国已申请了专利保护，但这些专利和技术至今没有得到广泛应用。我国对 此虽亦有研究，但与实际应用尚有较大距离 在进行g h 分离纯化中，很重要的一点就是鉴定所获得的g h 制品是否具有 生物活性， 2 材料方法 2 1 实验材料 2 1 1 质粒和宿主菌 p p 3 5 p g h g s l l 5 酵母由本实验室构建并保存。见第一章 2 1 2 主要试剂 丙烯酰胺、n ，n 亚甲双丙烯酰胺，购自b o r h r i n g e rm a n n h e i m 公司 n ，n ，n ，n 一四甲基乙二胺( t e m e d ) ，购自t a k a r a 公司 3 3 5 5 一四甲基联苯胺( n 佃；) ：购自华美生物工程有限公司 y n b ( y e a s t n i t r o g e n b a s e w o a m i n o a c i d e ) 购自a m r e s c o 公司 s p a 心：购自华美生物工程有限公司 其他药品均为分析纯 2 1 3 培养基 y e p d ：胰蛋白胨2 0 9 l ，酵母抽提物1 0 9 几，葡萄糖2 0 9 l ，琼脂糖1 8 9 l 。 b m g y ：胰蛋白胨2 0 9 l ，酵母抽提物1 0 9 l ，y n b1 3 4 9 l ，生物素4xl o - 4 9 l ， 甘油t o g l 。 b m m y ：胰蛋白胨2 0 9 l ，酵母抽提物1 0 9 l ，y n b1 3 4 9 l ，生物素4 1 0 - - 4 9 l ， 甲醇5 9 l 。 2 1 4 仪器设备 超声破碎器，高速低温离心机 2 1 5 表达纯化所需溶液 洗涤缓冲液 。 l m o f lt r i s - h c i ( p h 7 9 1 5 0 m m o l l 0 5 m o f le d t a0 5 m m o 儿 5m o 儿n a c l 5 0 m m o l l 2 1 6s d s - p a g e 所需试剂 十二烷基硫酸钠( s d s ) ( 1 0 w v 水溶液) ：将1 0 9 s d s 溶于h 2 0 ，然后用i - 1 2 0 调 体积至1 0 0 m l 。 s d s 样品缓冲液( 2 ) ：将1 2 9 s d s 溶于5 0 m l 的4 x 上槽t r i s 溶液中。加2 0 m l 2 毓基乙醇，用1 0 0 甘油调体积至1 0 0m l 。再加痕量的溴酚蓝作为标记染料。 2 1 7w e s t e r n 印迹试剂 p b s ：n a 2 h p 0 4 1 2 h 2 02 9 9 ，k h 2 p 0 4o 2 9 ，8 0 9 n a c i ，k c lo 2 9 再 加水至1 0 0 0 m l ，p h 7 0 包被液：0 0 2 m o l l 碳酸缓冲液( c b s ) ，p h 9 6 洗液：含o 1 t w e e n - 2 0 的o 1 m o l l p b s 缓冲液，p h 7 2 稀释液：含0 1 b s a 的0 1 m o l l p b s 缓冲液，p h 7 2 封闭液：含0 1 b s a 的o 1 m o f l p b s 缓冲液，p h 7 2 底物液：含o 1 m g m l 3 3 5 5 一四甲基联苯胺( n 但) 的磷酸盐柠檬酸缓 冲液( p h 5 们，用前加5 l 】l 3 0 h 2 0 9 l o m l 3 方法 3 1 重组基因工程酵母的诱导表达 将筛选到的阳性菌株接种于1 0 0 0 m l l 3 m g y 中，2 8 。c 剧烈振荡培养至 o d 啪= l o _ 2 0 ，离心收集菌体，加入1 0 0 0 m l 诱导培养基洲y ，2 8 。c 下继续诱导培 养3 5 d 。 3 2 表达蛋白的收集 将重组基因工程酵母诱导培养4 d ，取上述培养液2 0 0 m l ，1 0 0 0 0 r p m 离心 3 m i n ，用p b s b u f f e r 清洗菌体，1 0 0 0 0 r p m 离心3 m i n ，加入4 0 m l p b s b u f f c r ，用超 声波破碎和机械研磨的方法破碎细胞，4 0 0 0 r p m 离心3 m i n ，收集上清液。用4 0 0 m l 丙酮沉淀l 一2 h ，4 1 2 0 0 0 r p m 离心1 5 m i n ，取沉淀加入8 n l l d d h 2 0 ，得到纯化 粗产物。 3 3 表达产物的w e s t e r n 印迹分析 3 3 1 表达产物的s d s - p a g e 参照a u s u b e l 方法制备1 2 5 丙烯酰胺凝胶溶液【3 0 丙烯酰臌o 8 亚甲双 丙烯酰胺溶液6 m l ，4 x t r i s h c v s d s 溶液( p h 8 8 ) 3 7 5m l ，d d h 2 0 5 2 5m l ，1 0 过硫酸铵5 0u l ，t e m e d1 0 u l ，3 7 条件下聚合后，灌制3 浓缩胶l 3 0 丙烯 酰胺0 8 亚甲双丙烯酰胺溶液o 6 5m l ，4 x t r i s - h c i s d s 溶液佃h 6 8 ) 1 2 5m l ， 1 0 过硫酸铵1 0 u l ，t e m e d2 u l ，待凝胶聚合后，在电泳槽中加入t r i s - 甘氨酸 电泳缓冲液( 2 5m m o l lt r i s ，2 5 0m m o l l 甘氨酸，o i s d s ，p h 8 3 ) 。 取2 0 u l 纯化后的产物与2 0 u l 上样缓冲液 4 x t r i s h c l s d s ( p h 6 8 ) 2 5m l ， 2 m l 甘油，1gs d s ，o 5 m l 巯基乙醇，0 2 5n a g 溴酚蓝，加水至1 0 m l 等量混 合，煮沸3 分钟后备用。制备好样品后，用微量进样器上样于凝胶梳孔中，起始 电流1 0m a ，观察溴酚蓝带进入分离胶后，电流凋为1 5m a ，电泳完毕后，以考 马斯亮蓝r 2 5 0 染色液( 5 0 甲醇，o 0 5 考马斯亮蓝r 2 5 0 ，1 0 冰醋酸，4 0 d d h 2 0 ) 染色4 小时，以脱色液( 5 甲醇，7 冰醋酸，8 8 d d h 2 0 ) 脱色至背景完 全脱去，凝胶置7 冰醋酸中保存。 3 3 2 表达产物的w e s t e r n 印迹分析 在s d s p a g e 电泳结束后，将凝胶，6 张滤纸和一张硝酸纤维膜( n c 膜) 3 0 共浸于转移缓冲液中o 5 h 。制备夹心抗体：阴极夹板一海绵一二层滤纸一凝胶一 硝酸纤维膜一滤纸一海绵一阳极夹板。置夹心抗体于电泳槽中，硝酸纤维膜对阳 极，凝胶置阴极。4 ，9 0 v ，电泳4 6 l l ，对硝酸纤维膜上的样品进行免疫测定。 丽春红s 染色，将硝酸纤维膜放入小平皿中，根据滤膜面积以o 1 - - 0 2 m i j c m 2 的量加入p b s t 封闭液，于室温作用2 h 。弃封闭液，按0 1 - - 0 2 m l c m 2 的量加 入p b s t 封闭液和第一抗体( 第一章制备) ，在室温孵育5 0 m i n 用p b s 清洗滤 膜2 3 次，每次5 - - 1 0 r a i n 。将硝酸纤维膜转移到t b s 液托盘中，室温洗涤1 0 m i n 。 将滤膜置于小平皿中，按o i - - 0 2 n d j c r n 2 的量加入t b s t 封闭液和酶标二抗( 1 ： 4 0 0 ) ，室温反应1 h ，然后用t b s 洗涤2 3 次，每次5 - - 1 0 r a i n 。加入显色液， 3 7c 作用1 5 r a i n 。待蛋白质条带显色后，则取出硝酸纤维膜并用缓冲液洗涤， 拍摄n c 膜。 3 4 小鼠促长试验 3 屯1 试验样品制备 纯化蛋白制备见3 2 酵母细胞制备，取表达菌液2 0 0 m l ，4 0 0 0 r p m 离，t l , 3 m i n ，2 0 0 m l 去离子水 洗涤，4 0 0 0 r p m 离心3 m i n ，加入8 m l d d h 2 0 。 3 4 2 试验小鼠分组 昆明种小鼠2 4 只，随机分成四组，重量1 7 1 9 a 组：正常饲养 b 组：0 2 m l 纯化p g h 蛋白，即1 8 9 m g 灌胃，每三天一次 c 组：0 2 m l p g h 重组酵母悬浊液灌胃，。即1 8 9 m g 即每三天一次 d 组：0 2 m l p g h 重组酵母1 0 9 饲料，约1 8 9 m g ，加入少许白糖，正常饲喂， 3 。4 3 小鼠体重检测， 小鼠饲喂的0 ，l ，2 ，3 ，4 周，称量体重，记录数据。 4 试验结果 4 1 表达产物的w e s t e r n 印迹 w e s t e r n - - b l o t 印迹结果显示重组基因工程酵母所分泌表达的蛋白能很好的 与制备的一抗特异结合。说明分泌出的蛋白具有很好的特异性，确证了p g h 在 毕赤巴斯德酵母中获得了高效分泌表达。 图8p c 3 5 k p g h 重组酵母菌的w e s t e r nb l o t t i n g 结果 f i g 8w e s t e r n - b l o tr e s u l t so fp p i c 3 5 k - i t c hp o s i t i v et r a n s f o r m a n t s l a n e l - 4 ：e x p r e s s i o np r o d u c t so fp p i c 3 5 嘣li ny e a s ti n d u c e db ym e t h a n o l 4 2 小鼠增重 由下图数据分析可得，c 组小鼠在用p o n 重组菌体灌喂处理后，在第三周 增重幅度高于对照组( p 0 0 5 ) ，经统计学分析，其他时间没有显著差异。b ， d 两组和对照组没有显著差异。四组小鼠体重数据如下表 0 周 组 b 组 c 组 d 组 第一周 组 b 组 c 组 d 组 第- r 组 b 组 c 组 d 组 第三周 组 b 组 c 组 d 组 第四周 组 b 组 c 组 d 组 1 7 3 1 6 4 1 8 3 1 6 3 2 1 3 1 9 3 2 2 1 9 8 2 6 8 2 1 7 2 4 3 2 9 2 2 8 7 2 9 2 3 0 4 2 2 2 3 6 2 2 5 4 3 8 7 3 6 8 1 5 6 1 6 6 1 6 2 1 6 5 2 0 4 2 0 7 2 0 4 2 1 2 2 5 8 2 4 1 2 1 _ 8 2 0 9 2 3 8 2 8 1 2 7 4 2 2 3 2 2 2 2 2 2 8 1 2 4 8 重量 s 6 6 8 4 6 6 7 2 2 1 5 2 1 5 2 1 1 2 1 4 2 6 2 2 5 7 2 4 8 2 5 9 2 8 5 2 0 3 2 8 4 3 4 5 2 0 2 2 9 2 2 7 4 3 0 1 6 6 5 8 7 2 6 2 1 8 7 2 1 2 1 9 9 1 9 5 2 0 9 2 5 9 2 6 4 2 5 8 2 6 8 2 8 2 8 5 2 7 8 6 5 7 4 6 6 7 6 1 7 8 2 1 9 2 1 4 2 0 8 1 9 8 2 6 4 2 8 5 2 1 8 3 2 3 2 9 4 3 0 9 2 52 7 3 3 2 6 平均重量增重增重率 1 8 11 6 7 8 3 3 3 i 7 61 7 0 3 3 3 3 1 8 21 7 1 8 3 3 3 1 8 21 7 1 8 51 9 7 1 6 5 7 1 9 42 0 6 6 6 6 7 2 1 22 1 1 9 32 0 3 3 3 3 3 1 3 62 3 0 1 6 6 7 2 2 42 4 3 6 6 6 7 2 52 5 1 3 3 3 3 1 9 42 3 8 3 3 3 3 2 6 9 5 2 7 5 8 3 2 92 9 5 2 7 4 8 2 9 3 3 3 3 30 1 7 4 7 7 7 3 6 3 3 3 3 30 2 1 3 3 0 7 3 8 1 6 6 6 7 0 2 2 2 1 1 4 3 3 3 3 3 3 30 1 9 6 0 7 8 6 2 3 3 3 3 30 3 7 1 4 7 3 3 3 3 3 3 0 4 3 0 5 2 8 r 9 50 4 6 2 6 5 8 6 8 3 3 3 3 3 0 4 0 1 9 6 1 1 0 1 6 6 6 70 6 0 5 7 6 1 0 5 4 6 6 7 0 6 1 9 1 7 8 1 2 3 1 6 6 7 0 7 1 6 7 8 1 0 4 80 5 1 6 4 7 1 2 9 5 3 3 3 31 2 7 50 7 5 9 6 8 2 2 5 68 5 6 6 6 6 70 5 0 2 9 3 5 2 9 31 2 1 1 6 6 70 7 0 5 1 4 1 3 1 0 7 51 4 0 7 50 8 2 7 9 4 1 图9p g i 蛋白及p g h 重组酵母作用小鼠增重情况 5 讨论 1 将p g h 基因克隆到穿梭载体p p i c 3 5 k 中，构建了重组穿梭质粒，命名为 p p i c 3 5 k - p o r t 。经s a i 线性化处理后电击转化毕赤酵母g s i l 5 ，重组酵母经甲醇 诱导，表达产物的s d s p a g e 分析，结果表明：p p i c 3 5 - p g h g s l l 5 酵母表达的 融合蛋白p g h 分子量约为2 4 4 k d a ，与预期的蛋白分子量一致，说明重组p g i a 得到了正确表达。 2经过w e s t e r n - b l o t 印迹分析，结果证实制备的抗血清对猪生长激素具免疫特 异性。 3 进一步对小鼠的促长实验表明，回收的重组p g h 蛋白对小白鼠灌胃，没有明 显的促生长活性。而重组酵母和对照组比较，有一定的促生长活性，但只在第三 周达到显著水平。根据已报道的情况认为重组p g h 经1 3 饲喂，因为胃肠蛋白酶 的消化，没有明显的促长效果的，我们的试验和这一说法一致，以重组p g h 酵 母灌胃组，增重明显，可能足酵母细胞壁能经受胃蛋白酶的消化，进入动物体内 表现一定的促长活性，更确切的结果还有待于进一步的研究。 一。_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ - _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ 。_ _ _ - 。_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ 。- 。_ _ _ - _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ - 。_ _ _ _ 。- 。一 参考文献： lc h e ney ，l i a nyc ，s m i t l ldh ，矗a t , t h eh u m a ng r o w t hh o l - i n o p * l o c u s n u c l e o t i d e s e q u e n c e ，b i o l o g ya n de v o l u t i o nj ( 3 t y f l o m i c $ ，1 9 8 9 4 ：4 7 9 - 4 9 7 2p e l e rd ，j u l i a nre i s o i m i o na n dc i l 扰吼嘣刎o f lo ft h ep o r c i n e 删h o r m o n eg e n e p c e n e , 1 9 8 7 ，5 5 ：1 2 9 3 k l i n & ，j ，b u o n o m o f c ，y e n j t , e t a , p o r c i n es o - - i n b y d a i l y i n j e c t i o n ：g r o w t h e n d o c r i n e r e s p o n s e s i n g e n e t i c a l l y ，l e a n a n d o b e s e b a f f o w 5 a n d 西l 饵【j 】a n i t a s e i ，1 9 9 5 , 7 3 ：3 2 9 4 3 3 0 3 4c h e nh c h u a n gc f , m o ud ge ta t , h i g h - d e n s i t ye s e h e r i c h i ae o l ic u l t i v a t i o np r o c e s sf o r h y p e r e x p r e s s i o n o fr e c o m b i n a n t p o r c i n e g r o w t h h o r m o n e j 】e n z y m e m i c r o b t e c h n o l1 9 9 2 a p t , 1 4 ( 4 ) ：3 2 1 - 3 2 6 5e l e z - m a r t i n e z 只e s c o l a - h e r n a n d e zj s o l i v a - f o r a m yr c , e ta t , i n a c l i v e a f i o no fs a c c h a r o m v c e s c c r e v i s i a es u s p e n d e di n0 r 姆j u i c eu s i n gh i g h - i n t e n s i t yp u l s e de l e c t r i cf i e l d s j f o o dp r o t 2 0 0 4 。 6 7 ( 1n ：2 5 9 6 - 2 6 0 2 6s i rmf ，v e r r i e rj m i n t e s t e s t i n a l a b s o r p t i o n o f p r o t e i n i nt e l e o s t f i s n j c o m p b i o e h e m p h y s i o l , 1 9 9 2 ( 1 0 3 a ) ：7 7 1 7 8 1 7c o xd s ，r a j es ，g a nh ，e ta e n h a n c e dp e b i l 时o f m o l e c u l a rw e i g h tm m k e 6a n dp o o d y 。 b i o a v a i l a b l ec o m p o u n d sa g r u s $ c a c o - 2c e l lm o n o l a y e r su s i n gt h ea b s o r p t i o na m 慨z o n u l a o e e l u d e n s t o x i n j 】p h a r m r e s ，2 0 0 2 , 1 9 ( 1 1 ) ：1 6 8 0 - 1 6 8 8 8k a r y e k a rcs ，f a s a n oa ，叫es ，e ta 1 z o n u l ao u c l u d e n st o x i ni n c r e a s e st h ep e r m e a b i l i t yo f m o l e c u l a rw e i g h tr t 砒e r 5a n dc h e m o t h e r a p e u t i ca g e n t sa c r o s st h eb o v i n eb r a i nm i c r o v e s s e l e n d o t h e l i a lc e l l s 【j 】p h a r m s e i ，2 0 0 2 ，9 2 ( 2 ) ：4 1 4 - 4 2 3 9b e m k o p - s c h n u r e ha t h eu s eo fi n h i b i t o r ya g e n t st oo v e r c o m et i l ee n z y m a t i cb a r r i e rt o p e r o r a l l ya d m i n i s t e r e dt h e r a p e u t i cp e p t i d e sa n dp r o t e i n s j 】c o n u o l l e dr e l e a s e , 1 9 9 8 ，5 2 ( 1 - 2 ) ：1 1 6 l os l t z ( 苏悌之) ，o x e n d e r d l ，r i - c , e w e l e v m ee t a l c d n ar e c o m b i n a n t o f p o r c i n e g