（食品科学专业论文）癞葡萄皂苷及其降血糖功能研究.pdf

摘要摘要癞葡萄( m o m o r d i c ac h a r a n t i al v a r a b b r e v i a t es e r ) 为葫芦科( c u c u r b i t a c e a e ) 苦瓜属植物苦瓜的一个变种。癞葡萄具有明显的降血糖功效，经研究，癞葡萄皂苷是其主要的降血糖活性成分之一。本文旨在研究癞葡萄皂苷的提纯工艺，为工业化生产提供借鉴。在此基础上，研究了癞葡萄皂苷的结构组成，探索了癞葡萄皂苷元的水解方法，得到了初步的苷元组成，对比了皂苷元与皂苷的降血糖活性。对癞葡萄皂苷单体进行了分离纯化和结构鉴定。首先，对癞葡萄皂苷的提纯工艺进行了系统研究，通过静态吸附、动态吸附以及动态洗脱实验，确定了大孔吸附树脂a b 8 分离纯化癞葡萄皂苷的最佳工艺条件为：上样液浓度为5 5 5 m g m l ，上样液p h 值为5 ，上样液盐浓度( k c l ) 为9 m g m l ，上样液流速为2 b v h 1 ，用乙醇进行梯度沈脱，收集不同梯度下乙醇的沈脱液，可得到初步分离的癞葡萄皂苷组分。直接用9 5 的乙醇洗脱，洗脱液流速为2 b y h ，收集4 个柱体积，可得到纯化的癞葡萄总皂苷，得率可达9 0 1 ，皂苷纯度为7 7 8 。采用c 1 8 填料进一步分离纯化，得到了一种癞葡萄皂苷单体，经核磁共振谱图分析，推测其为葫芦烷5 烯3 ，2 2 ，2 3 ，2 4 ，2 5 四羟基3 d 。3 p d 吡哺葡萄糖( 1 _ 6 ) d 吡哺葡萄糖苷。为了进一步得到癞葡萄皂苷的结构组成，本文对癞葡萄皂苷元进行了初步研究。确定了癞葡萄皂苷元的检测方法，比较了皂苷元不同的水解方法，采用直接酸水解法可得到纯度较高( 苷元百分含量为7 5 6 ) 的癞葡萄皂苷元。通过液相色谱串联质谱分析( l c m s ) ，检测出六种主要的皂苷元组成，其中三种皂苷元的分子量与已报道的苦瓜皂苷元峨齐墩果酸以及p ，7 p ，2 3 t r i h y d r o x y c u c u r b i t a 5 ，( 2 3 e ) - d i e n - 19 - a l 的分子量相同，一种皂苷壳与后续分离纯化得到的皂苷单体的苷元分子量相同。t l c 法快速检测癞葡萄皂苷元结果显示，癞葡萄皂苷元的最佳展开剂条件为：氯仿：石油醚在1 5 ：8 5 2 5 ：7 5 之间，：得到了比较清晰的六条苷元条带，与l c m s 分析结果一致。癞葡萄皂苷及皂苷元的降血糖活性实验比较发现，以2 0 0 m g k g 体重的癞葡萄皂苷水溶液灌胃糖尿病小鼠，可以在4 h 内使小鼠血糖值下降2 6 8 ，连续灌胃5 d 后，使小鼠血糖值下降5 8 4 ，而同样条件下，癞葡萄皂苷元却并未表现出降血糖活性，表明苷元不存在降血糖活性。关键词：癞葡萄皂苷皂苷元a b 8 降血糖a b s t r a c tm o m o r d i c ac h a r a n t i al v a r a b b r e v i a t es e r ( m c v ) i sak i n do fm u t a t i o no fm o m o r d i c a c h a r a n t i al ( m c ) w h i c hb e l o n g st oc u c u r b i t a c e a e i ti sr e p o r t e dt h a tm c vh a sb e e nu s e df o rt h et r e a t m e n to fh y p o g l y c e m i a s a p o n i ni so n eo ft h em a i na c t i v ei n g r e d i e n t si nm c v i nt h i sw o r k ，t h ee x p e r i m e n t sw e r ec a r r i e do u to nt h ep u r i f i c a t i o no fs a p o n i n sf r o mm c v i no r d e rt op r o v i d et h er e f e r e n c ef o rt h ei n d u s t r yp r o d u c t i o n t h er e s e a r c ho ft h ec o n s i s to ft h es a p o n i n s ，t h em e t h o do ft h eh y d r o l y z a t i o n ，t h ec o m p a r i s o no ft h eh y p o g l y c e m i ab e t w e e ns a p o n i n sa n ds a p o g e n i n sw e r ea l s oc a r r i e do u ti nt h i sw o r k w eg o tt h eo p t i m u mc o n d i t i o n sf o rp u r i f i c a t i o no fa b - 8t h o u g hs t a t i ca n dd y n a m i ca d s o r b e n te x p e r i m e n t sa n dd y n a m i ce l u t ee x p e r i m e n t sa sf o l l o w i n g ：t h ee l u t es o l v e n tw a se t h a n o l ，t h ec o n c e n t r a t i o no fs a m p l ew a s5 - 5 5 m g m l 。1 ；t h ep ho fs a m p l ei s5 ；t h es a l t yc o n c e n t r a t i o n ( k c l ) o fs a m p l ew a s9 m g m l 一，t h ef l o w i n gs p e e do fs a m p l ew a s2 b v h d i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o no fe t h a n o le l u t es o l v e n t sw e r ec o l l e c t e df o rt h es a k eo ft h eb r i e fp u r i f i c a t i o n 4t i m e sv o l u m er e s i n so f9 5 e t h a n o lw a su s e dt oe l u t et h em a c r o p o r o u sr e s i n sf o rt h es a k eo fg e t t i n gt h ec r u d es a p o n i n s t h er e s u l ts h o w e dt h a tt h ep u r i t yo fs a p o n i n sw a s7 7 8 a n dt h er e c o v e r yw a s9 0 1 am o n o m e rw a sp u r i f i e df r o mt h ee t h a n o le x t r a c t i o no ncl8c o l u m na n di t sm o l e c u l a rs t r u c t u r ew a sc o n c l u d e dt ob ec u c u r b i t a n e 5e n3 伊2 2 ，2 3 ，2 4 ，2 5 - t e t r a h y d r o x y l 3o3 1 3dg l u c o p y r a n o s e ( 1 _ 6 ) - d g l u c o p y r a n o s i d eb yn m r t h e s t u d i e so ns a p o g e n i n sf r o mm c v w e r ec a r r i e do u tt os t u d yt h ec o m p o n e n t so fs a p o n i n s t h em e t h o do fd e t e c t i o no ft h es a p o g e n i n sw a sc o n f i r m e di nt h i sw o r k i tw a sf o u n dt h a tw ec o u l dg e th i g h e rp u r i t ya s7 5 6 w h e ns t r a i g h t l yh y d r o l y z et h es a p o n i n s l c m sa n a l y s i ss h o w e dt h a tt h r e eo ft h ec o m p o u n d ss a p o g e n i n sh a v et h es a m em o l e c u l a rw e i g h t ( m w ) o fc 3 0 h 4 8 0 3 ，o l e a n a n e s ，p ，7 p ，2 3 - t r i h y d r o x y c u c u r b i t a 5 ，( 2 3 e ) d i e n 19 - a lw h i c hh a db e e nr e p o r t e di nm c w eg o ta n o t h e rs a p o g e n i nw h i c hh a st h es a m em wo ft h es a p o g e n i nf r a c t i o no ft h es a p o n i n si nl a t e re x p e r i m e n t t h er a p i dd e t e c t i o no fs a p o g e n i n sb yt l cs h o w e dt h a tt h ee f f e c t i v ed e v e l o ps o l v e n t sw e r ec h l o r o f o r m ：p e t r o l e u me t h e rw a s2 ：8 ，i nw h i c hc o n d i t i o nw eg o ts i xb a n d so fs a p o g e n i n st h a tm a t c h e dt ot h er e s u l to fl c m s t h eh y p o g l y c e m i ao fs a p o n i n sa n ds a p o g e n i n sf r o mm c vw a ss t u d i e di nt h i sa r t i c l e i tw a sf o u n dt h a ts a p o n i n sc o u l de v i d e n t l yr e d u c et h eb l o o ds u g a ro fd i a b e t i cr a t s t h eb l o o ds u g a ro fd i a b e t i cr a t sr e d u c e d2 6 8 a f t e rl a v a g ew i t ht h ed o s a g eo f2 0 0 m g m ga v o i r d u p o i si n4 ha n dr e d u c e d58 4 i n5 d t h es a p o g e n i n sw e r en o tf o u n dt h ef u n c t i o no fh y p o g l y c e m i ai nt h es a m ee x p e r i m e n tc o n d i t i o n s k e y w o r d s ：m c v s a p o n i ns a p o g e n i na b - 8h y p o g l y c e m i a独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。签名：么! 堡尘日期：勉缸! 丝! 笪关于论文使用授权的说明本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定：江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。保密的学位论文在解密后也遵守此规定。签名：趁绥毫墨导师签名：一芝参堕日期：炒6 2第章绪论第一章绪论1 1 癞葡萄与苦瓜的概迷癞葡萄( m o m o r d i c ac h a r a n t i alv a r a b b r e v i a t es e l ，m c v ) 属于葫芦科( c u c u r b i t a c e a e ) 苦瓜属，是苦瓜的一个变种。癞葡萄原产于印度东部，江苏省优质产品开发服务中心曾对其进行驯化改良，后无锡富仁生物技术有限公司对其进行大面积栽培获得成功。癞葡萄果实呈纺锤状有瘤状突起，果长约为4 1 0 c m ，宽约为3 - 6 e m ，果重2 5 3 5 9 ，未成熟的果实外表为青绿色，内部瓤为白色，成熟后外表呈盒黄色，内部瓤为红色，味甜。癞葡萄作为苦瓜的变种，与苦瓜存在着一定的差异性，由于苦瓜的种植面积及应用范围远大于癞葡萄，大量的研究工作及文献报道多以苦瓜为主。癞葡萄与苦瓜的对比见，如图l 一1 、1 1 、1 3 所示。图1 - 1 未成熟癞葡萄f i g1 1i m m a t u r em c v图1 - 2 成熟痛葡萄f i g1 2m a t u r em c v图1 3 苦瓜f i 9 13 m c苦瓜为葫芦科苦瓜属一年生攀援草本植物苦瓜( m o m o r d i c a c h a r a n t i a l ，m c ) 的果实，原产于印度，1 7 世纪传入欧洲，多做观赏植物栽培，大约在明初传入我国f 1 】。苦瓜叶互生，掌状5 7 深裂，花小，单性，雌雄同株，黄色，果实呈纺锤形，有瘤状凸起，成熟时为橙黄色，味苦，瓤为鲜红色，味甜，中国各地均有栽培。苦瓜不仅具有良好的食用价值还具有明显的药用功能。苦瓜富含蛋白质、糖类、微量元素( 如磷、钙、铁、钾等) 、胡萝 索、维生素( 如v 孙vb 2 、v 阶v c 、v e )等营养成分，属于上等瓜类蔬菜”3 1 。苦瓜的药用价值，世界各地均有记载。我国医学认为：苦瓜，苦、寒，归脾、胃、心、肝。有清热祛心火，解毒，明目，补气益精，止渴消暑，治痈的功效。明代以前医书没有记载苦瓜，明代救荒本草、本草纲目始列入，疑为三宝太监下西洋时，从南洋群岛移植过来。清代王孟英的随息居饮食谱说：“苦瓜清则苦寒；涤热，明目，清心。可酱可腌。中寒者勿食。熟则色赤，味甘性平，养血滋肝，润脾补肾。”：明代兰茂撰滇南本草中称苦瓜“治丹火堵起，疗恶疮结毒，泻六经实火、清暑、益气、止渴。”：李时珍在本草纲目中记载其“气味苦、寒、无毒，具有除邪恶、解劳乏，清心明目，益气壮阳之功效”。近代中药大辞典中记载其根、茎、花、叶、果、籽均可入药。江南人学硕十学位论文1 2 苦瓜主要研究进展1 2 1 苦瓜中主要活性成分的研究进展苦瓜富含多种活性成分，其根、茎、叶、花、种子都可供药用。f 体类，尤其是其中四环三萜类是苦瓜中所含有的最主要、研究最多的化合物【4 】，朱照静从干燥的果实中提取分离得到了p 谷简醇p d 葡萄糖苷和5 ，2 5 豆彬二烯醇3 d 葡萄糖苷等分子的混合物【8 】；肖志艳等利用多种层析技术从苦瓜果实的醇提物中分离得到了苦瓜亭( 胡萝卜苷与5 , 2 5 一豆甾二烯醇葡萄糖苷的混合物) 【9 1 ；李树贵等从苦瓜种子中分出结构为2 4 b 乙基5 a 胆甾7 反式2 2 e ，2 5 ( 2 7 ) 三烯一3 r 羟基3 o - s - d 吡喃葡萄糖苷的化合物，从果实的乙醇提取物中分离出胡萝卜甾醇( d a u c o s t e r 0 1 ) ，其结构为d 谷涵醇3 - 0 p d 吡喃葡萄苷。从果实中提取的活植物胰岛素、植物蛋白质( 由1 7 种氨基酸组成) 等具有抗菌、抗生育等作用【5 , 6 1 。程霜等从苦瓜中提取的苦瓜水溶性多糖是由鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖等组成的杂多糖，该多糖含有p d 吡喃糖苷键，可能是活性多糖【l 。苦瓜中还含有许多有机酸、生物碱以及微量元素等化学成分【l0 1 。1 2 2 苦瓜的药用价值作为苦瓜的一个分支，已报道的癞葡萄的药用价值并不多，而对于苦瓜药用价值的研究国内外均有很多报道。1 2 2 1 降血糖作用降血糖作用是苦瓜最重要的药理作用，一直受到人们的普遍关注，相关报道很多，其果汁、水提取物及醇提取物均有降血糖作用。2 0 m l k g 苦瓜汁( 相当于生苦瓜约3 0 9 k g ) 灌胃糖尿病小鼠即能显著降低采用链脲佐菌素( s t z ) 诱导的仅有血糖升高而无典型症状的无症状期糖尿病模型小鼠的空腹血糖和餐后2 h 血糖【12 1 。鲜苦瓜汁冻干粉4 0 9 k g 、2 0 9 k g 对四氧嘧啶尾静脉注射诱发的糖尿病小鼠有良好的降糖作用l l 引。苦瓜新鲜未熟果实的水提物冻干粉2 0 m g k g 可使糖尿病大鼠的空腹血糖降低4 8 ，作用类似二甲双胍【l 钔。苦瓜的5 0 甲醇提取液( 3 0 m g k g )口服给药3 h 后，s t z 高血糖大鼠血糖水平下降2 5 。苦瓜果实的甲醇提取液喂饲3 0 天可改善糖尿病大鼠糖耐量i l 引。1 9 6 5 年，s u c r o w 从苦瓜的干燥果实中提取分离出苦瓜苷c h a r a n t i n ，并证明它是b 谷f 醇d d 葡萄糖苷和5 , 2 5 豆甾二烯醇一3 一p d 葡萄糖苷等分子混合物【1 6 1 ；1 9 6 6 年，l o t l i k a r 等也从苦瓜中分离得到苦瓜苷c h a r a n t i n ，并经动物实验证实其有降血糖作用。1 9 6 6 年，r a o 对苦瓜果实提取物的降血糖作用进行了研究，发现静脉注射提取物5 m g k g体重4 h 后可引起血糖水平降低，并认为这种物质是降血糖的有效成分，其降糖活性强于1 丁基3 对甲苯磺酰脲【1 7 1 1 9 7 5 年，o l a n i y i 通过实验证明苦瓜苷比甲德宁具有更强的降糖作用。1 9 7 7 年，m a r q u i s 等人发现苦瓜苷对空腹大鼠的降糖作用与胰岛素相当，但对四氧嘧啶型大鼠的效果不佳，他将这一现象解释为苦瓜降糖需要苦瓜苷与苦瓜中的其他成分的协同作用l l 引。1 9 9 2 年，张萍萍等人通过实验证明，用自制的苦瓜皂苷对家2第一章绪论兔动物模型的降糖作用明显。实验动物为同本大耳兔，以2 5 m l k g 体重苦瓜皂苷提取液灌胃给药，对照组药物优降糖的使用剂量为o 1 5 m g k g 体重。结果表明，苦瓜皂苷降血糖作用较优降糖效果缓慢而持久【1 9 】。王峰等人用苦瓜皂苷进行临床验证，治疗i i 型糖尿病人4 6 例，总有效率达7 8 3 ，连续用药3 个月，患者血糖得到控制，无毒副作用。另报道，姜毅用苦瓜皂苷治疗i i 型糖尿病患者1 0 0 例，总有效率为8 2 【2 0 1 。1 9 9 3 年，l i a q u a ta l i 等人研究证实苦瓜的降糖作用主要存在其果实中，苦瓜种子对大鼠和糖尿病大鼠的血糖均无作用，并且对饥饿状态和进餐后的大鼠有引起高血糖的趋势【2 1 1 。王先远等人报道，苦瓜皂苷具有降血糖、降血脂的功能，并对苦瓜皂苷的降血糖机理进行了探索，表明苦瓜皂苷可能是通过调节糖皮质激素水平，刺激糖原合成，调节酶活力( 抑制糖异生的关键酶即葡萄糖6 磷酸酶和果糖1 ，6 二磷酸酶；激活旁路途径的基本酶即葡萄糖6 磷酸脱氢酶以加强葡萄糖氧化) 来降低血糖的【1 1 。从苦瓜中提取的一些多肽、粗多糖阿以及一些其它物质也被报道具有降血糖活性。1 2 2 3 苦瓜的其它生理作用研究表明，苦瓜除了具有良好的降血糖活性，还具有抗病毒和抗艾滋病 2 5 - 2 7 1 、抗肿瘤2 引、抗菌2 9 , 3 0 1 、抗氧化【3 1 】、抗生育【3 2 , 3 3 】、免疫调节【3 4 】、降血脂、驱虫、止痛等功能3 5 - 3 7 1 。1 3 癞葡萄研究进展虽然对于苦瓜，目前研究报道很多，但是对于它的变种癞葡萄，止前研究的并不多。本实验室近年来开始对癞葡萄进行研究，目前主要取得以下研究。1 3 1 癞葡萄的化学成分组成2 0 0 5 年，赵海雯测定了癞葡萄干片的化学成分组成，测得癞葡萄干片中含有水分1 0 9 6 、灰分5 9 3 、粗蛋白1 4 0 8 、粗脂肪0 9 3 、总糖1 7 7 9 、总皂苷3 1 嘣4 6 。2 0 0 7 年，袁晓晴对癞葡萄鲜果的化学成分组成进行了测定，测下癞葡萄鲜果中共含水分9 2 2 8 、灰分o 4 8 、粗蛋白1 4 2 、粗脂肪o 9 3 、还原糖1 4 8 、多糖1 5 5 、粗纤维o 7 8 1 6 引。1 3 2 癞葡萄水提物及多肽的研究袁晓晴通过四氧嘧啶型糖尿病小鼠研究了癞葡萄水提物的降血糖作用。结果表明不同剂量( 2 5 0 、5 0 0 和7 5 0 m g k g ) 的癞葡萄水提物可显著降低糖尿病小鼠的血糖浓度，水提物的降血糖作用在灌胃后2 小时就已经开始，并在4 小时后达到最大。此外，水提物还可显著改善糖尿病小鼠的糖耐量。以5 0 0 m g k g 剂量连续治疗糖尿病小鼠1 5 d 可使小鼠血糖浓度下降5 9 8 8 。通过超滤将癞葡萄水提物分成浓缩液m c l 和透过液m c 2 ，其中m c 2 对糖尿病小鼠的血糖浓度有显著影响，在灌胃2 h 和4 h 后可使小鼠血糖浓度降低4 6 1 5 和5 2 5 9 。s e p h a d e xg 2 5 凝胶色谱将m c 2 分成六个组分，动物实验表明m c 2 一l 在以2 0 m g k g 体重的剂量灌胃时即可显著降低四氧嘧啶型糖尿病小鼠的血糖浓度，用半制备i 冲h p l c 柱从m c 2 1 中筛选出的m c 2 1 1 和m c 2 1 5 在以2 m g k g 体重3江南人学硕十学位论文的剂量灌胃时即可显著降低四氧嘧啶糖尿病小鼠的血糖浓度。其中m c 2 1 5 的分子量为3 4 0 5 5 1 7 4 ，蛋白测序仪测得n 端前1 0 个氨基酸排列顺序为g h p y y s i k k s 【6 6 。6 7 】。1 3 3 癞葡萄皂苷的研究1 3 3 1 癞葡萄皂苷的提取工艺研究2 0 0 5 年，赵海雯确立了超声波法提取癞葡萄皂苷的工艺条件【6 8 1 ，该工艺条件已经比较完善，因此，在癞葡萄粗皂苷的提取方面，本文将直接采用该方法。1 3 3 2 癞葡萄皂苷的大孔树脂纯化工艺赵海雯研究了上样液浓度对树脂吸附皂苷的影响、a b 8 吸附癞葡萄皂苷的穿透曲线和沈脱曲线，并对洗脱样品进行了纯度测定。结果表明，采用a b 8 型大孔吸附树脂，用6 0 的乙醇为洗脱剂时洗脱量最大，皂苷浓度达到8 6 0 0 t 4 6 1 。1 3 2 3 癞葡萄皂苷的降糖活性皂苷是癞葡萄中含量较丰富的活性成分之一，癞葡萄皂苷具有良好的降血糖活性。2 0 0 5 年，赵海雯以血糖值为评价指标，昆明种小鼠为动物模型对癞葡萄皂苷的降血糖活性进行了研究。结果表明，粗皂苷对正常小鼠没有不良影响，对四氧嘧啶糖尿病小鼠的降血糖作用非常显著；通过不同剂量癞葡萄皂苷对小鼠降血糖效果的影响可知，低、中剂量组( 剂量分别为1 0 0 m g k g 、2 0 0 m g k g ) 具有更好的降糖效果。通过糖耐量试验可知，癞葡萄皂苷对四氧嘧啶糖尿病小鼠的糖耐量具有显著的增强作用。1 4 皂苷及皂苷元概述1 4 1 皂苷及皂元的结构皂苷( s a p o n i n ) ，又称皂素，是广泛存在于植物界的一类特殊的苷类，它的水溶液振摇后可产生持久的肥皂样的泡沫，因而得名。皂苷通常是由糖或糖的衍生物等与另一非糖物质通过其端基碳原子联接而成的一类比较复杂的苷类化合物。组成皂苷的糖常见的有葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖及葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸等，常与皂苷元c 3 位的一o h 连接成苷。根据皂苷水解后生成皂苷元的结构，可分为三萜类皂苷( t r i t e r p e n o i d a ls a p o n i n s ) 与箔体类皂苷( s t e r o i d a ls a p o n i n s ) 两大类。三萜类皂苷的皂苷元为三萜类衍生物，具3 0 个碳原子。大多数在苷元上带有羧基，故又称酸性皂苷。在酸性溶液中形成较稳定的泡沫，能被醋酸铅试剂沉淀。此类皂苷在植物界分布较广，尤以石竹科、桔梗科、五加科、豆科等为多。桔梗、南沙参、党参、人参、三七、瞿麦、甘草、远志、紫菀、地榆等许多中草药都含有此类皂苷。五环三萜与四环三萜二种。其中四环三萜类皂苷元主要可以分为以下几种：( 1 ) 达玛烷型；( 2 )羊毛脂甾烷型；( 3 ) 甘燧烷型；( 4 ) 环阿炖烷型；( 5 ) 葫芦烷型；( 6 ) 楝烷型，其结构如图1 4 所示：4第一章绪论m e l i a 屺a n e s图1 - 4 四环三萜类皂苷元依次为达玛烷型、羊毛脂甾烷型，甘燧烷型、环阿炖烷型、葫芦烷型、楝烷型f i g 1 4t e t r a c y c l i c t r i t e r p e n o i d a ls a p o g e n i n sd a m m a r a n e s ，l a n o s t a n e s ，t i r u c a l l a n e s ，c y c l o a r t a n e s ，c o c u r b i t a n e s ，m e l i a c a n e s五环三萜类皂苷元主要有以下四类：( 1 ) 齐墩果烷型；( 2 ) 乌苏烷型；( 3 ) 羽扇豆烷型；( 4 ) 木栓烷型，结构如图1 5 所示：ss图1 5 五环三萜类皂苷元依次为齐墩果烷型、乌苏烷型、羽扇豆烷型、木栓烷型f i g 1 5p e n t a c y c l i c t r i t e r p e n o i d a ls a p o g e n i n so l e a n a n e s ，u r s a n e s ，l u p s n e s ，f r i e d e l a n e s5l a n e s江南人学硕十学位论文甾体类皂菅的皂苷元为甾体衍生物，具2 7 个碳原子，不具羧基，故又称中性皂苷，在碱性溶液中形成较稳定的泡沫，能被碱式醋酸铅试剂沉淀。此类皂苷主要存在于薯蓣科、百合科植物中，如各种薯蓣、七叶一枝花、土茯苓、知母、麦冬等。甾体类皂苷因可作为合成甾体激素的原料而有重要意义。其苷元基本骨架为螺旋f 烷( s p i r o s t a n e ) 。f 体类皂苷元不要可以分为以下几类：( 1 ) 螺旋甾烷类；( 2 ) 异螺甾烷类：( 3 ) 异螺甾烷醇类；( 4 ) 呋甾烷醇类；( 5 ) 变形甾烷醇类；其结构如图1 6 所示：图l _ 6 甾体类皂苷元依次为螺旋甾烷类、异螺甾烷类、异螺甾烷醇类、呋甾烷醇类、变形甾烷醇类f i g 1 6s t e r o i d a ls a p o n i n ss p i r o s t a n e s ，s p i r o s t a n o l s ，i s o s p p i r o s t a n o l s ，f u r o s t a n o l s ，p s e u d o - s p r i s r a n o l s1 4 2 苦瓜皂苷研究进展概述苦瓜中含有很多种皂苷，近年来，已先后在苦瓜中发现皂苷达4 1 种之多，见表1 1 。苦瓜中的皂苷主要为四环三萜类的葫芦烷型及五环三萜类的齐墩果酸型及乌苏烷型等三萜类皂苷；同时，苦瓜皂苷中还含有若干种的 体类皂苷。1 9 8 0 年日本学者o k a b e 等用甲醇渗滤苦瓜种子，浓缩后以丁醇提取，再以硅胶柱层析，分得2 种五羟葫芦烷三萜糖苷，即苦瓜皂苷a 、b ( m o m o r d i c o s i d e s a a n db ) ，见表1 1 中的1 、2 1 3 引。次年y u m i 等人从苦瓜种子正丁醇提取部分中得到三个新的三萜葡萄糖苷，命名为苦瓜皂苷c 、d 和e ( m o m o r d i c o s i d e sc 、da n de ) ，见表1 1 中的3 、4 、5 ；并继续在1 9 8 2 年报道从未成熟果实的甲醇提取液中分离得到无苦味的苦瓜皂苷g 、f 1 、f 2 和i ( m o m o r d i c o s i d e sg 、f i 、f 2a n di ) 以及有苦味的苦瓜皂苷k 和l ( m o m o r d i c o s i d e ska n dl ) ，见表1 1 中的6 1 2 1 3 5 1 。m a y u m i 等用甲醇提取苦瓜茎、叶、用氯仿和水分配甲醇浸膏，氯仿层经硅胶柱层析得m o m o r d i c o s i d ei ，用丁醇萃取得m o m o r d i e o s i d ei i和i i i ，见表1 1 中的1 3 、1 4 、1 5 。1 9 9 0 年，朱照静等用硅胶柱层析得到苦瓜子苷a 和b ( m o m o r c h a r a s i d eaa n db ) ，均为葫芦烷型三萜类化合物1 4 0 1 。2 0 0 1 年，日本学者6第一苹绪论m u r a k a m it 等采用甲醇对苦瓜鲜品( 包括种子) 进行了回流提取，经硅胶柱层析分别得到g o y a g l y c o s i d ea 、b 、c 、d 、e 、f 、g 、h ，见表l 一1 中的1 9 - 2 6 。r 本学者m u r a k a m i 还用o d s 柱分得g o y s a p o n i ni 、i i 、i i i 等齐墩果烷型皂苷，2 0 0 5 年赵余庆采用乙醇提取，并用树脂纯化处理，从苦瓜干燥未成熟果实中分离得到日耳曼醇乙酸脂( g e m m a n i c y la c e t a t e ) ，见表1 1 中的2 9 3 2 1 4 2 1 。1 9 9 7 年巴基斯坦学者b e g u ns 等用甲醇提取鲜苦瓜，其提取液浓缩、干燥后用乙酸乙脂萃取，乙酸乙脂层经碳酸钠中和，再经过清洗、干燥、脱色后，取其汽油不溶物，以氯仿一甲醇梯度洗脱，硅胶柱层析得到三个乌苏烷型三萜类化合物，分别为m o m o r d i c i n 、m o m o r d i c i n i n 、m o m o r d i c i l i n ，见表1 1 中的3 3 3 5 4 2 。表1 - 1 苦瓜中已发现皂苷m o m o r d i c o s i d eb 【3 8 1m o m o r d i c o s i d ecm o m o r d i c o s i d edm o m o r d i c o s i d eem o m o r d i c o s i d ef i 3 5 1m o m o r d i c o s i d ef 2 t 3 5 jm o m o r d i c o s i d eg 【3 5 1m o m o r d i c o s i d el t s s 苦瓜皂苷元i 3 5 1m o m o r d i c o s i d ek 【3 5 1m o m o r d i c o s i d el 【3 5 1m o m o r d i c o s i d ei1 4 0 m o m o r d i c o s i d ei i 【4 0 1m o m o r d i c o s i d ei i i t 4 0 】3 p ，7 p ，2 3 - t r i h y d r o x y c u c u r b i t a - 5 ，2 4- d i e n 7op d - g l u c o s i d e3 p ，7 p ，2 3 - t r i h y d r o x y c u c u r b i t a - 5 ，( 23 e ) - - d i e n - 19 - a l3 p ，7 p ，2 3 一t r i h y d r o x y - 2 5 - m e t h o x y cu c u r b i t a - 5 ，( 2 3 e ) 一d i e n 一1 9 一a lg o y a g l y c o s i d eag o y a g l y c o s i d ebg o y a g l y c o s i d ecg o y a g l y c o s i d edg o y a g l y c o s i d eeg o y a g l y c o s i d efg o y a g l y e o s i d egg o y a g l y c o s i d ehm o m o r c h a r a s i d eac 4 7 h s 0 0 1 9c 4 2 h 7 2 0 1 4c 4 2 h 7 0 0 1 3c 3 7 h 6 0 0 1 2c 3 7 h 6 0 0 8c 3 6 h 5 8 0 8c 3 7 h 6 0 0 8c 3 6 h 5 8 0 8c 3 0 h 4 8 0 3c 3 7 h 6 0 0 9c 3 6 h 5 8 0 9c 3 0 h 4 8 0 4c 3 6 h 5 8 0 9c 3 6 h 5 6 0 1 0c 3 6 h 6 0 0 8c 3 0 h 4 8 0 4c 3 1 h 5 0 0 4c 3 7 h 6 0 0 9c 3 7 h 6 0 0 9c 3 8 h 6 2 0 9c 3 8 h 6 2 0 9c 4 2 h 6 8 0 1 3c 4 2 h 6 8 0 1 3c 4 3 h 7 0 0 1 4c 4 2 h 7 2 0 1 5c 4 2 h 7 0 0 15苦瓜子苦瓜子苦瓜子苦瓜子未成熟果实未成熟果实未成熟果实未成熟果实干燥未成熟果实未成熟果实朱成熟果实干燥茎、叶干燥茎、叶干燥茎、叶干燥叶干燥叶干燥叶新鲜果实新鲜果实新鲜果实新鲜果实新鲜果实新鲜果实新鲜果实新鲜果实苦瓜子葫芦素烷型葫芦素烷型葫芦素烷型葫芦素烷型葫芦素烷型葫芦素烷型葫芦素烷型葫芦素烷型葫芦素烷型葫芦素烷型葫芦素烷型葫芦素烷型葫芦素烷型葫芦素烷型葫芦素烷型葫芦素烷型葫芦素烷型葫芦素烷型葫芦素烷型葫芦素烷型葫芦素烷型葫芦素烷型葫芦素烷型葫芦素烷型葫芦素烷型葫芦素烷型723456789m 屹bh ：2插墙侈加扒勉乃抖筋弱江南人学硕十学何论文苦瓜中还有少量甾体类皂苷。1 9 6 5 年s u c r o w 从苦瓜的干燥果实中提取分离出箔体类苦瓜苷c h a r a n t i n 4 3 1 ；1 9 6 6 年l o t l i k am m 从苦瓜果实中获得具有显著降糖活性的植物甾酣删。1 9 9 0 年朱照静分离出化合物2 4 1 3 乙基5 a - 胆甾7 ，反式2 2 e ，2 5 ( 2 7 ) 一三烯3 p 羟基3 o p d 吡喃葡萄糖苷【8 】；1 9 9 5 年常风岗从苦瓜果实中首次分离出胡萝卜甾醇，国外学者还分离出更多的简体类化合物m 5 1 。1 5 立题依据和主要研究内容1 5 1 立题依据和意义糖尿病是一种代谢性、终身性疾病，其并发症严重威胁着人类的健康。目前的糖尿病治疗药物均有不同程度的副作用，且无法根本阻止胰岛细胞的进一步坏死，往往导致对药品的依赖。苦瓜是我国传统医学中糖尿病的食疗药物，为糖尿病的防治提供了一种新颖、安全、可靠的途径。其来源丰富，疗效确切、无任何副作用、且药食兼用，因而受到医药工作者的广泛关注。癞葡萄作为苦瓜的一个变种，与苦瓜有着一定的相似性，但同时也必然与苦瓜有着一定的差别性。目前有关苦瓜皂苷，无论是其种类的确定、结构的鉴定还是生理功能的研究，国内外都已有很多报道，但对于癞葡萄，目前研究还不是很多，因此，对癞葡萄的生理功能及其有效成分的分离、纯化和鉴定就有着很重要的意义，同时还应积极开展已知有效成分的功效和量效关系的研究工作。皂苷是癞葡萄中的重要活性成分之一，目前对于苦瓜皂苷的报道虽已汗牛充栋，然而，有关癞葡萄的皂苷的报道却还鲜著报端，因此，有必要对癞葡萄皂苷作一个较为系统、全面的研究，并与苦瓜皂苷在结构和功能上作一个比较，这无论对于苦瓜皂苷还是8第一苹绪论癞葡萄皂苷的研究来说，都是一个突破。皂苷元是皂苷分子的组成部分，皂苷元与不同的糖或糖类衍生物分子键合，可以产生很多不同种类的的皂苷，往往一种植物中皂苷的种类很多，而皂苷元的种类却有限。现在苦瓜和癞葡萄中的皂苷都已有人研究，虽然有关苦瓜皂苷元已有发现和报道，但始终未见有对苦瓜和癞葡萄皂苷元的系统的全面的研究报道，因此，对癞葡萄中的皂苷元作一个较为全面的研究，包括对其分离纯化条件的探索、结构的鉴定以及生理功能的研究也是很有必要的。癞葡萄皂苷的大孔树脂纯化过程是工业化生产中的一个重要步骤，目前有关其工业化生产的参数确定还很不全面，所以本文还将对癞葡萄皂苷的大孔树脂工艺进行优化，并确定其工艺参数，以提高癞葡萄皂苷的得率。1 5 2 主要研究内容1 癞葡萄皂苷的大孔树脂纯化工艺参数的确定；2 癞葡萄皂苷元的基本性质研究；3 癞葡萄皂苷元的检测方法的研究；4 癞葡萄皂苷的分离纯化及结构鉴定；5 癞葡萄皂苷及皂苷元降血糖功能研究与比较。9江南人学硕十学位论文第二章癞葡萄皂苷的大孔树脂纯化工艺研究2 1 引言大孔树脂纯化是癞葡萄皂苷纯化过程中的一个重要过程，通过这个过程，能够去除癞葡萄皂苷粗提物中的大部分糖类、鞣质、色素以及无机盐等杂质，从而为进一步分离纯化打下基础。同时，经过大孔树脂纯化过程，能够得到纯度较高的总皂苷混合物，这种总皂苷的混合物具有较好的降血糖活性，并能直接用于保健品原料。大孔吸附树脂为具有立体结构的多孔性海绵状聚合物，外观为白色或微黄色球形颗粒，粒度多为2 0 一6 0 目。大孔吸附树脂的吸附作用由于范德华引力或与样品分子产生氢键的结果，分子筛性是由其本身多孔性结构的性质所决定。大孔吸附树脂以范德华力从很低浓度的溶液中吸附有机物，其吸附特性主要取决于吸附剂的表面性质，根据树脂的表面性质，可分为非极性( 苯乙烯型) 、中极性( 含酯基) 和极性( 含酰胺基、腈基、酚羟基等) 。大孔树脂为吸附性和筛分性相结合的分离材料，根据有机化合物吸附力的不同及分子量的大小，在大孔树脂上选取不同的溶剂洗脱而分开。目前国内常用的大孔吸附树脂按其极性大小可分为：非极性树脂( d 3 5 2 0 、d 4 0 0 6 、d 4 0 2 0 、h 1 0 3 、h 1 0 7 、x 5 等) ；弱极性树脂( a b 8 等) ；极性树脂( n k a i i 、n k a 9 、s - 8 等) 。大孔吸附树脂在中草药有效成分的提取和富集领域中得到广泛应用。应用大孔吸附树脂可以提取和分离天然产物中的有效成分，如黄酮、皂苷、生物碱以及其他苷类。大孔吸附树脂之所以能得到广泛应用，主要是它能解决其他常用吸附剂难以解决的问题，具有吸附容量大、吸附速度快、易解吸、易再生；物理与化学稳定性高，不溶于酸、碱及有机溶剂；对有机物选择性好，不受无机盐类及其他强离子、低分子存在的影响，树脂品种多，不同品种可吸附多种有机化合物；流体阻力较小；脱色能力高等优点。大孔树脂目前主要应用于极性和弱极性物质的提取和富集。如陆志科等研究了6 种大孔树脂吸附分离竹叶黄酮的特征，对吸附性能及吸附动力学过程进行比较，发现a b 。8 型树脂较宜于竹叶黄酮的提纯，经a b 8 型树脂吸附分离后，提取物中黄酮含量提高1 倍以上h 7 】；吕茂平等首次用a b 8 、d 3 0 1 r 、d 2 9 6 和、d 3 9 6 等4 种型号树脂分离栀子苷，试验结果表明，d 3 0 1 r 型树脂分离效果好，栀子苷全部集中在醇洗脱液中。本章主要筛选出一种最适合于分离纯化癞葡萄皂苷的大孔树脂，并对其分离纯化工艺进行研究，最终确定癞葡萄皂苷的大孔树脂分离纯化的最佳工艺条件。2 2 实验材料与仪器2 2 1 实验材料与试剂大孔树脂( d 3 5 2 0 ，a b 8 ，d 4 5 2 0 ，s 8 ，n k a )南开大学化工厂大孔树脂( d a 2 0 1 一b ，a 2 0 1 一d )苏青水处理工程集团有限公司癞葡萄皂苷粗品实验室制备其他试剂均为分析纯1 0第二章癞葡萄皂前的人孔树脂纯化：i ：艺研究2 2 2 仪器与设备a b 2 0 4 s a 分析天平w f j 可见光分光光度计s h z 2 2 水浴恒温振荡器z f q 8 5 a 旋转蒸发仪h h 2 恒温水浴锅2 3 实验方法梅托勒一托利多仪器( 上海) 有限公司尤尼柯仪器有限公司太仓市医疗器械厂江苏省医疗器械厂金坛市新航仪器厂2 3 1 癞葡萄皂苷的测定方法采用2 0 0 5 年，赵海雯在癞葡萄总皂甙提取新工艺中的方法【6 吼。2 3 2 癞葡萄粗皂苷的提取与制备癞葡萄干粉经索氏抽提去脂后，用7 5 的工业乙醇于5 0 。c 、料液比为1 ：1 2 5 的条件下用声波提取约l h 即得癞葡萄皂苷的乙醇粗提物。2 0 0 5 年，赵海雯以此方法对癞葡萄干粉进行了提取，其得率可达成到2 4 5 。将乙醇提取液用旋转蒸发仪浓缩至无醇味，然后用正丁醇进行萃取，将正丁醇萃取液浓缩成浸膏，即成癞葡萄粗皂苷。2 3 3 癞葡萄皂苷供试液的制备一定量癞葡萄粗皂苷浸膏，加适量去离子水，用超声波加速其溶解，溶液待用。2 3 4 大孔树脂的预处理按照醇洗一水洗一酸洗一水洗一碱洗水洗的步骤处理大孔树脂。大孔树脂用乙醇浸泡3 h ，然后用去离子水洗至无白色浑浊；再用5 h c l 浸泡3 h 并用去离子水洗至中性；最后再5 n a o h 浸泡3 h ，用并去离子水洗至中性。2 3 5 树脂的选择不同的树脂有着不同的物理及化学特性，因此，其对皂苷的吸附率及解析率也不同。以大孔树脂