（食品科学专业论文）富硒菜籽蛋白肽的制备工艺研究.pdf

湖北工业大学硕士学位论文 摘要 油菜籽是我国重要的油料作物，也是重要的植物蛋白质资源。菜籽蛋白是一种 营养价值较高的蛋白质，为完全蛋白质，几乎不存在限制性氨基酸。由天然蛋白 质制备具有营养性和生理活性的功能肽，尤其是富含活性微量元素硒的营养保健 产品将是2 1 世纪最重要的营养课题之，具有良好的经济效益及深远的意义。 本课题首先对富硒菜籽分离蛋白的提取工艺进行了研究。在单因素实验的基础 上，通过正交实验优化制备条件：确定富硒菜籽脱皮脱脂粕脱除植酸和硫代葡萄 糖甙( 简称硫甙) 的条件为：在p h = 4 0 的条件下，固液比1 ：1 0 ，温度4 5 ，每 次浸洗6 0 m i n ，浸洗3 次。制各富硒菜籽分离蛋白优化的工艺条件为：用p h = 1 2 0 的n a o h 溶液浸提3 次，每次浸提3 5 m i n ，固液l k = l ：1 2 ，浸提温度5 0 。 然后对富硒菜籽分离蛋白酶水解的工艺进行了探讨，选用碱性蛋白酶进行酶解 制备富硒菜籽蛋白肽，在单因素实验的基础上，通过正交实验优化制备条件为： p h = 8 0 ，时间7 小时，温度5 0 ，底物浓度为3 ，加酶量1 8 1 0 4 u g ；在最佳工 艺条件下，水解度( d h ) 达3 2 5 1 ，氮收率达9 1 2 8 。 对粗产品进行了精制，经活性炭脱色、脱苦和脱盐处理后，浓缩干燥得富硒菜 籽蛋白肽产品。对产品进行分子量分析并且对其功能性如：溶解度、粘度、吸湿 与保湿及热变性等做了探讨。结果表明，富硒菜籽蛋白肽产品的平均分子量在 1 5 0 0 d 以下；富硒菜籽蛋白肽溶解度好，不受p h 值变化的影响；粘度低，浓度3 0 以上的肽液流动性好：吸湿与保湿性强，受热不易变性。 关键词：富硒菜籽分离蛋白，植酸，酶解，富硒菜籽蛋白肽，功能性 湖北工业大学硕士学位论文 a b s t r a c t r a p e s e e di si m p o n a n to i lp l a n ta n dp l a n t p r o t e i nr e s o u r c ei no u rc o u n t y r a p e s e e d p r o t e i ni sak i n do f h j g l ln u m t i o n a lv a l u ep r o t e i na n di ta l m o s td o e s n th a v el i m i t e d a m i n oa c i d e s s oi ti sh i g h l yp r o f i t a b l ea n dp r o f o u n d l yr e m a r k a b l et o p r e p a r et h e n u t r i t i o u sa n db i o l o g i c a la c t i v i t yp e p t i d e sf r o mn a t u r a lp r o t e i n t h er e s e a r c ha n d d e v e l o p m e n to ft h eh e a l t h ye s p e c i a l l ys e l e n i u m e n r i c h e de a t a b l ew i l lb eo n eo ft h e m o s ti m p o r t a n ts u b i e c t si n2 1 “c e n t u r y r e s e a r c hh a sb e e nc a r r i e do u to nt h et e c h n o l o g yo fe x t r a c t i n gs e l e n i u m e n r i c h e d r a p e s e e dp r o t e i ni s o l a t r p i ) b a s e do nt h es i n g l ef a c t o re x p e r i m e n t ，t h ee x t r a c t i o n c o n d i t i o n sh a db e e no p t i m i z e db yo r t h o g o n a la n a l y s i s 1 1 l eo p t i m u me x t r a c t i o np h y t i c a c i da n dg l u c o s i n o l a t ef r o ms e l e n i u m e n r i c h e dd e f a t t e dr a p e s e e dm e a lc o n d i t i o nj s ：p h 4 0 t h er a t eo fs o l i dt os o l u t i o ni s l ：1 0 ，t h ee x t r a c t i n gt e m p e r a t u r ei s4 5 3t i m e sa n d6 0 m i no n c e t h eo p t i m u me x t r a c t i o ns e l e n i u m e n r i c h e dr a p e s e e dp r o t e i ni s o l a t ec o n d i t i o n i s ：p i l l 2 0 ，t h er a t eo fs o l i dt os o l u t i o ni s1 ：1 2 ，t h ee x t r a c t i n gt e m p e r a t u r ej s5 0 3 t i m e sa n d3 5m i no n c e r e s e a r c hh a sb e e n c a r d e do u to nt h e t e c h n o l o g y o f e n z y m e h y d r o l y c i s s e l e n i u m e n r i c h e dr a p e s e e dp r o t e i ni s o l a t e f i r s ta l k a l i n ep r o t e i ne n z y m e - - - a l c a l a s e h a sb e e ns e l e c t e dt o h y d r o l y z et h es e l e n i u m e n r i c h e dr a p e s e e dp r o t e i ni s o l a t e t 1 l e s i r i g l ef a c t o rt e s t sa n do r t h o g o n a le x p e r i m e n t sh a v eb e e na p p l i e dt oo p t i m i z ec o n d i t i o n o f e n z y m o l y s i sa sf o l l o w s ：p h 8 o ，s u b s t r a t ec o n c e n t r a t i o ni s3 ，t h et i m eo f e n z y m e h y d r o l y s i si s7h o u r s ，t e m p r a t u r e5 0 ，a n dt h ed o s e so fa l c a l a s ei s1 8 0 0 0 0 u g u n d e rt h eo p t i m i z e dc o n d i t i o n ，t h ed e g r e eo fh y d r o l y s i s ( d h ) i s3 2 5 1 ，t h er e c o v e r y r a t eo f n i t r o g e ni s9 1 2 8 t h e c m d ep r o d u c t i o ni sr e f i n e db yd i s c o l o r i n gw i t ha c t i v ec a r b o na n dd e s a l i n a t i o n t h e ni ti so b t a i n e db yc o n c e n t r a t i o na n dl y o p h i l i z a t i o na n dm o l e c u l a rw e i g h ti s d e t e r m i n e d s o m ef u n c t i o n a lp r o p e r t i e sw e r ed e t e r m i n e di n c l u d e ds o l u b i l i t y , v i s c o s i t y , m o i s t u r er e g a i na n dm o i s t u r er e t a i n i n gq u a l i t y , m e t a m o r p h i cb yb e i n gh e a t e d 1 1 l e r e s u l t ss h o wt h a ts e l e n i u m - e n r i c h e dr a p e s e e dp r o t e i np e p t i d eh a sl o w e r1 5 0 0 da v e r a g e m o l e c u l a r i th a st h ea d v a n t a g eo fs o l u b i l i t yo v e rr a p e s e e dp r o t e i ni s o l a t ea n dj th a sn o t s e d i m e n t a t i o ni na n yp hw a t e r i t sv i s c o s i t yi sv e r yl o w w h e nc o n c e n t r a t i o ni s3 0 i t s t i l lh a sw e l la d p a r e n tf l u i d i t y a n d i t sm o i s t u r er e g a i na n dm o i s t u r er e t a i n i n gq u a l i t yi s b e t t e ra n di th a sg o o dh e a ts t a b i l i t y k e y w o r d s ：s e l e n i u m e n r i c h e dr a p e s e e dp r o t e i ni s o l a t e ，p h y t i ca c i d ，e n z y m e h y d r o l y s i s ， s e l e n i u m e n r i c h e dr a p e s e e dp r o t e i np e p t i d e ，f u n c t i o n a lp r o p e r t y i l 佩：l 亡工繁火港 学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，独立进行研究工作所取 得的研究成果。除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经 发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均己在文中以明确方 式标明。本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：阍傻梅日期：2 年s 月；。日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授 权湖北工业大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采 用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 学位论文作者签名：固住掏 日期：h - 年5 月；。日 指导教师签名：幸t l 呔一1 1 日期：钿6 年5 月孑0 日 湖北工业大学硕士学位论文 1 1 概述 第1 章引言 1 1 1 菜籽蛋白的组成和加工状况 油菜籽是我国重要的油料作物，也是重要的植物蛋白质资源，在我国是居大豆 之后的第二大油料蛋白资源“。蛋白质是人体重要组成部分，是生命的物质基础， 对人体的生长发育和维持身体健康都是非常重要的o 。油菜籽含蛋白质约2 5 2 7 ，脱脂后的菜籽饼粕中约含3 5 4 5 的蛋白质，略低于大豆粕中蛋白质的含 量。菜籽蛋白是一种营养价值较高的蛋白，为完全蛋白质，几乎不存在限制氨基酸。 与大豆粕相比，菜籽粕中蛋氨酸、胱氨酸等含硫氨基酸含量较高，仅赖氨酸含量略 低于大豆蛋白o “3 。从蛋白质的氨基酸组成来看，菜籽蛋白的营养价值较高，与大 豆蛋白质以及联合国粮农组织( e a o ) 和世界卫生组织( w h o ) 推荐值非常接近“1 。 据研究人员预测，“菜籽蛋白将和大豆蛋白一样，可用作人造肉、肉类填料、烘烤 食品和其它加工食品的配料”，成为人类理想的优化食物结构绿色营养源而具有无 量的发展趋势“。 我国还没有食用的菜籽蛋白产品，这主要是由于大豆蛋白和花生蛋白开发利 用较多，而食用级菜籽蛋白的开发研究尚属起步阶段。而且菜籽饼粕中含有植酸、 硫甙、单宁等有害或抗营养物质，大大限制了菜籽饼粕的直接利用”“1 。 1 1 2 肽的组成和功能特性 肽是比蛋白质结构简单、分子量小，由氨基酸通过肽键相连的一类化合物。一 种肽含有的氨基酸少于1 0 个称为寡肽，超过的就称为多肽；氨基酸数为5 0 多个 以上的多肽就是人们熟悉的蛋白质。1 。多肽具有调节机体生理功能和为机体提供营 养的双重功效，它几乎影响着人体的一切代谢合成“。过去人们认为，人体吸收 蛋白质主要是以氨基酸的形式吸收的。近年来，国际科学界研究发现，蛋白 质经消化道酶促水解后，主要以小肽的形式被吸收，比完全游离氨基酸更易、 更快被机体吸收利用。这是“肽”研究理论和实践的重大突破“。从天然 蛋白质中提取具有营养性和生理活性的功能肽，并将这些功能肽应用到保健 食品和强化营养食品当中。它不但能够解决食品及食品加工中优质蛋白质的 来源和需求，还可以大大提升传统食品的科技含量。制约功能肽在食品工业 湖北工业大学硕士学位论文 中的应用除了成本的因素，还有就是技术的原因，其中最为突出的就是产品 品质的标准化和稳定性问题“”1 。 肽优于氨基酸，一是较氨基酸吸收快速；二是以完整的形式被机体吸收； 三是主动吸收( 氨基酸属被动吸收) ；四是低耗，与氨基酸比较，肽吸收具有 低耗或不需消耗能量的特点，肽通过十二指肠吸收后，直接进入血液循环， 将自身能量营养输送到人体各个部位；五是肽吸收与氨基酸相比，具有不饱 和的特点；六是氨基酸只有2 0 种，功能可数，而肽以氨基酸为底物，可合成 上百上千种。 肽优于高蛋白( 大分子蛋白质) ，两者功能大不相同。首先，肽是体现信 息的信使，以引起各种各样不同的实效的正性或异性生理活动和生化反应调 节；其次，活性高；第三，分子量小，易于改造，易于化学合成，而高蛋白 ( 大分子蛋白质) 不具备这一特点。若氨基酸为二度深度开发产品，则肽就 是高蛋白的三度深度开发产品。 肽优于低聚糖等物质。酶法多肽的功能大大优于低聚糖类物质。多糖类 物质的分子量很大，难消化；而肽类活性物质分子量小，极易消化吸收和利 用，其吸收机制、活性强度和活性多样性均优于多糖类物质。目前能够用于 食品中的功能肽大多数为天然蛋白质的分离提取物，它们大多具有良好的营 养价值，又具有一定的生物学功能，同时添加成本较低，无毒副作用“”1 。 多肽除具有高营养、易消化、易吸收的性能外，在体内与c a ”、c u ”、z n 2 + 等离子及某些化合物( 胆红素、尿酸；乙酰胆碱、组胺、甲状腺素；多种药 物) 均有较高亲和力，起到运输到组织、器官和调节功能的作用“。多项实 验证实，在人体内蛋白质大部分是以肽的形式直接吸收的，菜籽肽的适量补 充，对保证机体的蛋白质、氨基酸等营养成分的及时供应及氮平衡是极为有 利的，并且被吸收的肽在机体内可能具有调节生理功能的作用，其产品将具 有很高的应用价值和市场经济价值”2 “。 1 1 3 硒的生理功能及作用机理。”2 7 3 1 1 3 1 清除自由基功能 硒化合物有清除自由基和抑制生物膜脂质过氧化的作用。在膜脂质过氧化过程 中，脂质过氧自由基( r 0 0 ) 是自由基连锁反应扩展阶段的主要稳态形式，危害很 大。硒化合物对它有很强的清除能力，而且有机硒化合物的清除效果优于无机硒 化合物。 2 湖北工业大学硕士学位论文 1 1 3 2 提高机体的免疫力 硒能有效地提高机体的免疫水平，其作用涉及免疫和细胞免疫两个方面。缺硒 会降低机体的体液免疫反应，补硒则能消除这些影响，刺激机体产生较高水平的 免疫球蛋白m ( i g m ) 和免疫球蛋白g ( t g g ) 。 1 1 3 3 抗肿瘤作用 硒有清除自由基的作用从而保护遗传物质d n a 免遭自由基攻击产生突变而引 发肿瘤病变；硒有提高机体的免疫力的作用从而加强机体对异常细胞的防卫能力， 肿瘤的诱发与发展也就得以有效地控制。 1 1 3 4 对部分重金属元素的解毒作用 硒与金属有很强的亲和力，在体内可与金属，如汞、甲基汞、镉及铅等结合成 金属硒的蛋白质复合物而解毒，并使金属排出体外。 1 1 3 5 保护心血管、维护心肌的健康 硒对心肌纤维、小动脉及微血管的结构与功能有重要作用。在我国发现以心肌 损伤为特点的克山病，缺硒是一个重要原因。 1 1 3 6 促进生长、保护视觉器官 缺硒可以引起生长迟缓，白内障与糖尿病者补充硒后，视觉功能有所改善。此 外，硒还有降低黄曲霉素b 脏急性损伤、减轻肝中心小叶坏死的程度与死亡率的 作用。 1 2 国内外研究现状 用菜籽加工成食用蛋白产品，加拿大、瑞典、德国等国家的学者一直把它作 为重点课题进行研究，几十年来取得了较大的发展。但到目前为止，菜籽食用蛋 白的生产仍处于研制和试验阶段。在我国还没有食用的菜籽蛋白产品，这主要是 由于大豆蛋白和花生蛋白开发利用比较多，而食用级菜籽蛋白的开发研究尚属起 步阶段。”1 。其次由于油菜籽饼粕中因含有硫甙、单宁、植酸等有害或抗营养物 质，从而大大限制了菜籽饼粕的直接利用。“。 肽的一系列优点，在世界范围内引起关注，世界上万名科学家，研究了半个 多世纪，至今已成为高科产业新热点。专家认为，肽较生物体的其他物质，最大 的特点是具有极强的活性和多样性，2 1 世纪将是“肽的世纪”。无论从吸收速 度还是生物学功能上，肽都将引发营养品革命。在日本，美国和西欧，含有多肽 湖北工业大学硕士学位论文 的健康食品层出不穷，例如多肽饮料、多肽儿童午餐，多肽老人套餐，多肽保健 饼干等等。“。在中国，营养学家也在大力推进多肽在食物中的应用，特别是来源 于食物蛋白中的多肽，近几年来有许多专著和论文发表，也有一些多肽健康食品 问世”4 “1 ，可以说，多肽在健康食品中的应用具有无比巨大的商业前景。 近年来，人们对大豆蛋白水解制备氨基酸和肽营养液的研究较多，但是对菜 籽蛋白水解的研究较少。7 “。对富硒菜籽蛋白水解的研究，目前在国际上也极少 报道，在国内武汉工业学院首先对富硒菜籽蛋白的的酶水解进行了初步的研究。 最近1 0 年来，随着现代科学的发展，分析检测技术的提高，对植物硒的生化 与分子生物学的研究及硒蛋白、硒多糖、硒核酸等分离纯化技术方面的突破，一 些富硒植物药物已用于治疗疾病。我国在植物硒开发与研究方面处于起步阶段， 目前还没有分离出一种纯化的有机硒产品已经证明植物在硒的生态链中可以更 有效地将无机硒转化为有机硒，而人和动物对有机硒的吸收与利用远大于无机硒， 可见富硒植物的开发潜力巨大“。 1 3 研究的目的及意义 植物体中的硒主要来自于植物对于土壤中无机硒的吸收。油菜的生长过 程中，土壤中的无机硒将被吸收并富集与油菜籽中并与蛋白质结合，尤其与 含硫氨基酸结合成硒蛋氨酸( s e m e t ) 或硒胱氨酸( s e c v s ) “。油菜籽 即是几种油料蛋白质中含硫氨基酸含量比较高的物种，因此，富硒油菜籽成 了急待开发的富硒油料蛋白资源。富硒菜籽的开发利用，也为国家划定的我 省西部地区经济振兴和农民致富起到积极的作用。 湖北省恩施市和陕西省紫阳县是我国两个罕见的高硒地区，据统计恩施市( 包 括建始县、宜恩县) 每年种植富硒菜籽达1 4 1 7 万顷，富硒菜籽的产量达1 3 1 6 万t 。湖北恩施市( 高硒地区) 的油菜籽含硒量可达2 1 0m g k g ，最高的含硒 量甚至达到1 0 0 2 0 0m g k g “。 本课题充分利用湖北恩施的富硒油菜籽资源，将肽与有机硒结合起来，用肽 与蛋白质作为人体吸收微量元素硒的有效载体，既发挥了肽的生理功能特性同时 又补充了硒，能有效地预防相关疾病的发生，因此具有重大而深远的意义。 1 4 本课题研究的主要内容 1 4 1 低植酸、低硫甙富硒菜籽分离蛋白的制备 对经脱皮、脱脂处理后的富硒菜籽仁进行脱毒处理，即根据菜籽中的蛋白质、 湖北工业大学硕士学位论文 植酸和硫甙在不同p h 值下溶解度的不同，用一定p h 值的酸性水浸泡洗涤，在一 定温度下浸洗一定时间脱除植酸和硫甙，得到低植酸、低硫甙的富硒菜籽脱脂粕； 再用碱溶酸沉法制备富硒菜籽分离蛋白。 1 4 2 富硒菜籽蛋白肽的制备和产品的精制 对富硒菜籽分离蛋白用蛋白酶进行水解，控制一定水解度得到水解液即为富硒 菜籽蛋白肽的粗产品，对粗产品进行脱色脱苦、脱盐为精制富硒菜籽蛋白肽产品。 1 4 3 富硒菜籽蛋白肽产品的物性研究 探讨p h 值与富硒菜籽蛋白肽产品溶解度之间的关系，浓度与粘度的关系，吸 湿性与保湿性以及热行为等。 湖北5 - 业大学硕士学位论文 第2 章富硒菜籽分离蛋白的制备工艺研究 菜籽蛋白是一种营养价值较高的蛋白，属于全价蛋白，几乎不存在限制性氨基 酸“1 。与其它蛋白质相比，菜籽蛋白质优势体现在：其氨基酸组成模式比大豆蛋白 更理想，与f a o 及w h o 推荐模式很接近。含硫氨基酸蛋氨酸、胱氨酸和组氨 酸含量比大豆蛋白高。含硫氨基酸是食品中一类最重要氨基酸，在食品感观功能、 营养功能和生理调节功能方面作用重大“。它的效率比值( p e r ) 、蛋白质净利用 率( n p u ) 、蛋白质生物价( b v ) 均高于其它植物蛋白 4 s o 但是，菜籽中含有植酸、硫代葡萄糖甙等抗营养因子，以及含有多酚类化合物 和高纤维的皮壳，会使产品产生较深的色泽，限制了它的利用。植酸是一种很 强的金属螯合剂，能与钙、镁、锌等金属螯合，不易被机体所利用。硫甙本身无 毒，但硫甙与硫甙酶或黑芥子酶伴存，可被黑芥子酶所水解，其降解产物具有毒害 作用；另外，硫甙具苦昧，影响适口性。菜籽饼粕的脱毒问题，一直是关注的热 点，国内外专家对此进行了大量的研究，提出了许多物理学、化学、生物学的脱 毒工艺和方法，如水浸法、发酵法、热处理法、碱处理法、微生物发酵法等，尽 管各有特色，但仍存在工艺繁锁，生产成本高，还可能造成干物质损失和废水污 染”“”。 分离蛋白的制取是利用菜籽中蛋白质和其它物质在不同p h 值时溶解度的差异， 在蛋白的萃取和沉淀的同时和其它物质分离开。“。最常用的萃取水相是稀碱，有 报道用水、水乙醇、稀酸、n a c l 水溶液以及六偏磷酸钠溶液“”等提取菜籽蛋白。 本实验采用碱提酸沉方法制备菜籽分离蛋白。 本章将根据菜籽中的蛋白质和植酸、硫甙的溶解度情况“”，探讨用稀酸性水 浸泡洗涤脱除植酸和硫甙的最佳工艺条件，对固液比、提取时间、提取次数和温 度进行了考察；探讨脱植酸处理后的粕碱提酸沉制备富硒菜籽分离蛋白的最佳工 艺条件，对溶液的p h 值、固液比、提取次数进行了考察，在单因素实验的基础上， 通过正交实验优化提取条件。为后续水解操作提供中间产品。 2 1 材料与方法 2 1 1 原料 原料：由湖北恩施市沙地乡提供的富硒菜籽，其成分见表2 1 湖北工业大学硕士学位论文 表2 1 原料主要成分表 t a b l e 2 1m a i ni n g r e d i e n t so fs t u f f 试剂：盐酸、浓硫酸、氢氧化钠、柠檬酸、硝酸、乙醇、磷酸氢二钠、硼酸、硫 酸钾、三氯乙酸、磷酸二氢钾、高氯酸、无水乙醚、钨酸钠、偏钒酸铵、硫酸铜、 磷钼酸、钼酸铵、单宁酸、e d t a 等。以上试剂均为分析纯： 指示剂：酚酞、甲基橙、甲基红、次甲基蓝： 2 1 2 仪器： 奥立龙8 6 8 型酸度计( 美国奥立龙公司) l d 5 1 0 型离心机( 北京医用离心机厂) 8 0 一2 离心沉淀器( 江苏省金坛市医疗仪器厂) a l p h a 2 4 型冷冻干燥机( 德国c h r i s t 公司) c a r y 一5 0 型紫外分光光度计( 美国v a r i a n 仪器公司) c a r y - e c l i p s e 型荧光分光光度计( 美国v a r i a n 仪器公司) j b 9 0 - d 型强力电动搅拌机( 上海标本模型厂) h h s 型恒温水浴锅( 江苏金坛市大地自动化仪器厂) s h a c 水浴恒温振荡器( 江苏恒丰仪器厂) 小型胶辊砻谷机( 浙江省台州市粮仪厂) a r 2 1 4 0 电子天平( 奥斯豪国际贸易公司) 微量凯氏定氮仪 2 1 3 检测方法 2 1 3 1 水分测定方法 粗脂肪测定方法 7 g b1 3 1 0 1 g b5 5 1 2 1 9 9 1 ： 1 9 8 5 删： 湖北工业大学硕士学位论文 氮溶解指数测定方法 g b5 5 1 7 1 9 8 5 ”1 ； 蛋白质含量测定 g b5 5 1 1 1 9 8 5 “； 植酸测定方法三氯乙酸法( t c a 法) 。“； 单宁测定方法钼酸铵一钨酸钠( f d ) 比色法“。； 硫代葡萄糖甙测定方法硫脲紫外法”： 2 1 3 2 产品得率= 龟襄赭蛆o o 2 1 3 3 硒含量的测定方法o ” 称0 2 9 于6 0 8 0 烘干的样品，加入5 m l 硫酸，l o m l 混合酸( 硝酸：硫酸= 2 ：1 ) 浸泡，在消化炉上1 0 0 。c 1 小时，升温至1 5 0 y ：消化至冒白烟，溶液变澄清即可，冷却 后加入l o m l l o 的盐酸，继续加热1 5 0 1 7 0 。c 消化至冒一缕白烟，然后冷却须做空 白绘制硒标准曲线，按g b1 2 3 9 9 1 9 9 0 方法对处理液于激发波长3 7 6 n m ，发射 波长5 2 0 n m 处测定荧光强度。 2 1 4 实验方法 2 1 4 1 原料预处理 将富硒菜籽清理后，用小型胶辊砻谷机进行脱皮，分离皮后得到仁，然后用 索式抽提器浸出4 8 h 脱脂，将脱脂粉干燥，用小型粉碎机粉碎过8 0 目筛，即制成 富硒菜籽脱脂粕粉。 2 1 4 2 菜籽粕的预处理和分离蛋白制备工艺方案 由富硒菜籽中的蛋白质、植酸和硫甙的溶解曲线。”分析可知，富硒菜籽蛋白 质的等电点是p t l = 4 0 ，在等电点附近溶解度较低，在碱性范围( 当p t t 7 0 时) 内蛋白质的溶解度迅速增加；硒的溶解度曲线与蛋白质的溶解度曲线非常相似， 变化趋势也基本一致。为了尽可能地避免脱毒过程中蛋白质和硒的损失，应选取 在酸性范围内进行脱毒处理。而植酸在酸性范围内p h 为4 0 5 0 时有最大溶解 度，此时硫甙的溶解度也较高。因此可选取p h - - - - 4 0 的酸性水溶液来脱除植酸和 硫甙，此时植酸和硫甙大部分被浸洗出来，蛋白质和硒最大程度地保留在原料中 达到脱毒的目的。在碱性范围内，当p h 1 0 0 时，蛋白质和硒的溶解度均较高，此 时植酸在p h = 1 2 0 时溶解度有最小值，且硫甙的溶解度在碱性范围内迅速下降，在 p h = 1 2 0 1 4 0 之间降为最低。因此选取在碱性条件下提取蛋白的同时，植酸和 硫甙不被提取出来，以降低产品中的植酸和硫甙的含量。 脱植酸和脱硫甙预处理：将富硒脱皮脱脂菜籽粕在p h = 4 0 的条件用水浸洗， 湖北工业大学硕士学位论文 搅拌，离心分离除去上清液。 富硒菜籽分离蛋白的制备：将脱植酸处理后的富硒菜籽粕按一定比例加水，用 n a o h 溶液调p h 值，浸提，离心分离，得到蛋白质浸提液，调节蛋白质浸提液的 p h = 4 0 ，酸沉，离心分离，收集沉淀物。 2 1 4 3 工艺流程 乳清水 2 1 5 影响脱植酸和脱硫甙效果的单因素探讨 2 1 5 1 浸洗时间对脱除效果的影响 准确称取1 0 o g 富硒菜籽脱脂粕5 份，加入8 倍水，调节p h = 4 0 ，5 0 。c 搅拌 浸提3 次，分别每次3 0 m i n ，4 5 m i n ，6 0 m i n ，9 0 m i n ，1 2 0 m i n ，3 0 0 0 r m i n 离心l o m i n 分 离除去上清液，固相烘干检测其植酸、硫甙含量，比较时间对脱植酸效果的影响。 2 1 5 2 浸洗温度对脱除效果的影响 准确称取l o o g 富硒菜籽脱脂粕5 份，加入8 倍水，调节p h = 4 0 ，分别在3 0 ，3 5 ，4 0 ，4 5 ，5 0 搅拌浸提3 次，4 5 m i n 次，3 0 0 0 r m i n 离心l o m i n 分 离除去上清液，固相烘干检测其植酸、硫甙含量，比较温度对脱植酸效果的影响。 2 1 5 3 固液比对脱除效果的影响 准确称取1 0 0 9 富硒菜籽脱脂粕5 份，分别加入7 倍，8 倍，9 倍，1 0 倍，1 1 倍 水，调节p h = 4 0 ，4 0 搅拌浸提3 次，4 5 m i n 次，3 0 0 0 r m i n 离心l o m i n 分离除去 上清液，固相烘干检测其植酸、硫甙含量，比较固液比对脱植酸效果的影响。 2 1 5 4 浸洗次数对脱除效果的影响 准确称取1 0 o g 富硒菜籽脱脂粕5 份，加入1 0 倍水，调节p h = 4 0 ，分别在4 0 条件下搅拌浸提1 次，2 次，3 次，4 次，5 次，4 5 m i n 次，3 0 0 0 r m i n 离心l o m i n 分 离除去上清液，固相烘干检测其植酸、硫甙含量，比较次数对脱植酸效果的影响。 9 湖北工业大学硕士学位论文 2 1 6 影响富硒菜籽分离蛋白制备的单因素探讨 2 1 6 1p h 值对提取效果的影响 准确称取1 0 0 9 脱植酸处理后的富硒菜籽脱脂粕，按固液比1 ：1 0 分别加入 p h 值为8 ，9 ，1 0 ，1 1 ，1 2 的n a o h 溶液l o o m l ，5 0 c 搅拌溶解3 次，3 5 m i n 次， 3 0 0 0 r m i n 离心l o m i n 分离去渣，得到蛋白质浸提液，调节蛋白质浸提液的p h = 4 0 ， 酸沉后离心分离，收集沉淀。用微量凯氏定氮法测蛋白质含量，计算产品得率， 比较p h 值对提取效果的影响。 2 1 6 2 浸提次数对提取效果的影响 准确称取1 0 o g 脱植酸处理后的富硒菜籽脱脂粕，按固液比1 ：1 0 加入p h = 1 2 的n a o h 溶液l o o m l ，5 0 分别搅拌溶解2 次，3 次，4 次，5 次，6 次，3 5 m i n 次，3 0 0 0 r m i n 离心l o m i n 分离去渣，得到蛋白质浸提液，调节蛋白质浸提液的 p h = 4 0 ，酸沉后离心分离，收集沉淀。用微量凯氏定氮法测蛋白质含量，计算产 品得率，比较次数对提取效果的影响。 2 1 6 3 固液比对提取效果的影响 准确称取1 0 o g 脱植酸处理后的富硒菜籽脱脂粕，分别按1 ：9 ，1 ：1 0 ，+ l ： l l ，1 ：1 2 ，l ：1 3 不同固液比加入p h = 1 2 的n a o h 溶液，5 0 c 搅拌溶解3 次，3 5 m i n 次，3 0 0 0 r m i n 离心l o m i n 分离去渣，得到蛋白质浸提液，调节蛋白质浸提液的 p h = 4 0 ，酸沉后离心分离，收集沉淀。用微量凯氏定氮法测蛋白质含量，计算产 品得率，比较固液比对提取效果的影响。 2 1 7 正交实验优化提取工艺参数 2 1 7 1 以浸洗时间、浸洗温度、固液比、洗涤次数设计脱植酸和硫甙l g ( 4 3 ) 正交 实验，优化脱除条件。 2 1 7 2 以p h 值、固液比、浸提次数设计制备分离蛋白l 。( 3 3 ) 正交实验，优化制备 条件。 2 2 结果与讨论 2 2 1 各因素对脱除植酸和硫甙效果的影响 2 2 1 1 浸洗时间对脱植酸和脱硫甙效果的影响见图2 1 1 0 湖北工业大学硕士学位论文 i 盖1 5 ， 弋= 扣。“兰l ， 由图2 1 可知，随着浸洗时间的延长粕中植酸和硫甙的残留量降低。当浸洗时 间为4 5 m i n 时，处理后粕中植酸的含量最低；浸洗6 0 m i n 后，硫甙的含量降至最低。 再延长时间可能会把其它物质也提取出来而使植酸和硫甙的残留量变化不明显。故 2 5 2 g 1 5 蚓 抽l o 5 0 3 03 54 04 55 0 温度( ) 图2 2 温度对脱除效果的影响 f i g 2 2e f f e c to ft c m p e r a t u r eo ne x t r a c t i o nr e s u l t p h = 4 0 ，时间4 5 m i n ，固液比= l ：8 由图2 2 可知，随着浸洗温度的升高，粕中植酸和硫甙的残留量降低，当浸提 温度为4 0 c 时，处理后粕中硫甙的含量最低，植酸的含量也很低，再升高温度二者 残留量的变化都不太明显。故浸洗温度取为4 0 。c 。 2 2 1 3 固液比对脱植酸和脱硫甙效果的影响见图2 3 湖北工业大学硕士学位论文 2 5 2 s 1 5 梨 t 0 5 o l ：u ，1 ：0 81 ：0 9l ：1 0 i ：1 l 固渡比 图2 3 固液比对脱除效果的影响 f i g 2 3e f f e c to ft h er a t eo fs o l i dt os o l u t i o no ne x t r a c t i o nr e s u l t p h = 4 0 ，时间4 5 r a i n ，温度4 0 固液比的选择般为l ：8 l ：1 0 左右，固液比太大会使废洗水量大，造成污 水处理困难，固液比太小则浸洗不充分。本实验选择1 ：7 1 ：1 1 的因素水平做研 究。实验结果表明，随着固液比的增加，粕中植酸和硫甙的残留量降低。当浸洗固 液比为1 ：l o 时，处理后植酸的残留量最低，加大固液比植酸和硫甙的残留量变化 不明显。故浸洗固液比取1 ：1 0 较适宜。 2 2 1 4 浸洗次数对脱植酸和脱硫甙效果的影响见图2 4 奢 删 奇 次数 图2 4 次数对脱除效果的影响 f i g 2 4e f f e c to fe x t r a c t i n gt i m e so ne x t r a c t i o nr e s u l t p h = 4 0 ，时间4 5 m i n ，固液比= l ：8 ，温度4 0 由图2 4 可知，当浸洗3 次后粕中植酸和硫甙的残留量已较低，次数再增加对植 酸和硫甙的脱除效果没有显著影响。故浸洗次数取3 次较适宜。 2 2 2 各因素对富硒菜籽分离蛋白制备的影响 2 2 2 1 p h 值对提取效果的影响见图2 5 1 2 3 5 2 5 l 5 o 2 l 0 湖北_ x - 业大学硕士学位论文 8 0 6 0 拿 面4 0 奇 2 0 0 89l o1 l1 2 p h 值 图2 5p h 值对分离蛋白提取效果的影响 f i g 2 5e f f e c to f p ho ne x t r a c t i n gp r o t e i nr e s u l t 温度5 0 ，时间3 5 m i n ，固液比1 ：1 0 由图2 5 可知，随着溶液p h 值的增大，富硒菜籽分离蛋白的产率和产品的蛋 白含量随之增大，当p h 值过大时，会使产品的颜色较深且菜籽蛋白可能会发生极 端p h 值变性。而且由蛋白质和植酸、硫甙的溶解度曲线可知，在p h = 1 2 时植酸和 硫甙的溶解度都很低，p h 1 2 时植酸的溶解度较大，p h a c 。 表3 4 水解度的方差分析 t a b l e 3 4v a r i a n c ea n a l y s i so f t h ed e g r e eo f h y d r o l y s i s 由水解度的方差分析可知，影响富硒菜籽分离蛋白酶解的最显著性因素是底物 浓度。由氮收率的方差分析可知，影响富硒菜籽分离蛋白酶解的最显著性因素也是 湖北工业大学硕士学位论文 底物浓度。由以上实验结果得到制各富硒菜籽蛋白肽的最佳条件为a 。b 。c 。，即：采 用碱性蛋白酶a l c a l a s e ，底物浓度为3 ，加酶量为1 8 1 0 4 u g ，酶解时间为7 小 时，酶解温度5 0 。c ，酶解液的p h = 8 0 。在此最佳工艺参数进行的重复实验，富硒 菜籽分离蛋白的水解度d h 可达3 2 5 1 ，氮收率达9 1 2 8 。 3 3 小结 3 3 1 对4 种蛋白酶进行选择，在一定条件下，根据其水解度、氮收率和产物的 苦味，选出a l c a l a s e 酶作为富硒菜籽分离蛋白水解用酶。 3 3 2 确定酶水解富硒菜籽分离蛋白的最佳工艺条件为：底物浓度3 ，加酶量为 1 8 xi 0 4 u g ，酶解时间为7 小时，p h 8 0 。水解度d h 可达3 2 5 1 ，氮收率达9 1 2 8 。 湖北工业大学硕士学位论文 第4 章富硒菜籽蛋白肽产品的精制 4 1 材料与方法 4 1 1 材料与仪器 材料：富硒菜籽分离蛋白酶解液 活性炭粉末，7 3 1 、7 3 2 型阴阳离子交换树脂 试剂：0 1 m o l l 硝酸银标准滴定溶液，铬酸钾溶液( 5 0 9 l ) 仪器：奥立龙8 6 8 型酸度计( 美国奥立龙公司) c a r y 一5 0 型紫外分光光度计( 美国v a r i a n 仪器公司) j b 9 0 一d 型强力电动搅拌机( 上海标本模型厂) h h s 型恒温水浴锅( 江苏金坛市大地自动化仪器厂) h d 一3 紫外检测仪( 上海沪西分析仪器厂有限公司) c e 一3 1 - - c o i o o d 透析袋 a g l i e n t l l 0 0 系列液相色谱仪( 安捷伦科技中国有限公司) 4 1 2 测定方法 4 1 2 1 活性炭脱色研究”6 。 脱色率和氨基酸损失率的测定：在富硒菜籽蛋白水解液中加入一定量的活性炭 吸附剂，在一定温度和p h 值条件下吸附一定时间。过滤水解液，上清液在波长为 4 0 0 h m 处测定其吸光值，按下列公式计算脱色率；同时上清液在波长为2 8 0 n m 处测 定其吸光值，按下列公式计算氨基酸损失率： 脱色率=生! 塑! 苎丝鱼盟二生! 塑竺些鱼旦1 0 0 一4 0 0 删盛色前 氨基酸损失率：生婴趔笪止! 塑业1 0 0 。脱色前 4 1 2 2 含盐量的测定：莫尔法”1 4 1 2 3 多肽分子量分布测定方法。” 中华人民共和国轻工行业标准q b t2 6 5 3 - - 2 0 0 4 ，高效凝胶过滤色谱法。即以 多孔性填料为固定相，依据样品组分分子体积大小的差别进行分离，在肽键的紫 湖北工业大学硕士学位论文 外吸收波长2 2 0 n m 条件下检测，对色谱图及其数据进行处理，计算得到相对分子 量大小及分布范围。 高效液相色谱( h p l c ) 测定产品分子量范围：采用a g l i e n t l l 0 0 系列液相色谱 仪，色谱柱：t s k g 2 0 0 0 s w x l ，流动相：乙腈：水：三氟乙酸= 1 0 ：9 0 ：0 1 ，流速： 0 5 m l m i n ，进样量：5 ul ，检测波长：2 2 0 n m ，样品浓度：l m g m l 。标准品： 1 细胞色素c ，分子量1 2 3 8 4 d ；2 胰岛素，分子量5 7 3 3 d ；3 杆菌肽，分子量1 4 2 2 d ； 4 甘氨酸一甘氨酸一酪氨酸一精氨酸，分子量为4 5 1 5 d 。所用常溶剂乙腈为色谱 纯，三氟乙酸为分析纯。 4 1 3 影晌脱色效果的单因素探讨 4 1 3 1 脱色时间对脱色效果的影响 量取富硒菜籽蛋白水解液l o o m l ，调p h = 4 ，加入0 5 的活性炭粉末，6 0 c 分 别加热搅拌2 0 m i n ，4 0 m i n ，6 0 m i n ，8 0 m i n ，l o o m i n 。趁热过滤水解液，上清液在 波长为4 0 0 h m 处测定其吸光值，计算脱色率；波长为2 8 0 h m 处测定其吸光值，计 算氨基酸损失率。 4 1 3 2 活性炭用量对脱色效果的影响 量取富硒菜籽蛋白水解液l o o m l ，调p h = 4 ，分别加入0 2 5 、0 5 、0 7 5 、 1 、1 2 5 的活性炭粉末，6 0 加热搅拌4 0 m i n 。趁热过滤水解液，上清液在波长 为4 0 0 n m 处测定其吸光值，计算脱色率：波长为2 8 0 n m 处测定其吸光值，计算氨 基酸损失率。 4 1 3 3 脱色温度对脱色效果的影响