（农产品加工及贮藏工程专业论文）强力霉素残留的荧光检测与分子印迹固相萃取柱的制备.pdf

独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经 发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得塑皇堡盛些盘堂或其他教育机构的学 位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文 中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：1 嗨么咖 学位论文版权使用授权书 月，日 y 本学位论文作者完全了解塑皇垦壅些盘堂有关保留、使用学位论文的规定， 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借 阅。本人授权塑兰垦盎些盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行 检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：僦晟渔 签字日期：功f 年多月专日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 导师签名：侑舛 签字日期：如年厂月日 电话： 邮编： 摘要 irrl ir f l r l lijii i i ifi illl!iwh|1,r。l,ir l l i i i ii n y 18 9 7 3 0 8 兽药在动物体内的残留可经过食物链的富集进入人体，导致各种致病菌耐药性的 产生，肠道菌群的紊乱，细胞癌变，激素水平紊乱等各种危害人类健康情况的发生。 因此，对于动物性食品中的兽药残留开展有效提取和高效检测方法的研究对于保障食 品安全具有重要意义。强力霉素是四环素类抗菌素，兽医临床上常用于防治畜禽的呼 吸道、消化道、泌尿道等细菌的感染。许多国家和地区对其在动物性食品中的残留均 有限量规定，本文以此作为目标物开展了系列研究。 1 四环素类药物结构中存在c i o 。酚羟基和c 1 2 烯醇基能与镁离子按络合比2 ：1 形 成具有强荧光的不溶性螯合物。强力霉素与镁离子的络合物在溴化十六烷基三甲铵存 在的条件下，荧光可进一步增强。结合导数同步荧光技术信息量大和选择性好的特点， 可对强力霉素进行高选择性的灵敏检测，据此建立了一种测定强力霉素残留的新方 法。在最优条件下，强力霉素线性范围为0 2 1 0m g l ；相对标准偏差为0 9 - - - - 3 9 ； 检出限为1 2p g k g ；加标回收率9 0 5 1 0 7 3 。方法可用于猪肉中强力霉素残留的 测定，结果令人满意。 2 以强力霉素为模板分子、甲基丙烯酸为功能单体、四氢呋哺为溶剂、乙二醇二 甲基双丙烯酸酯为交联剂、偶氮二异丁睛为引发剂可制备出对强力霉素进行选择性识 别的分子印迹聚合物。优化的合成条件为：模板、甲基丙烯酸及乙二醇二甲基丙烯酸 酯间的摩尔配比为l ：8 ：4 0 ；反应温度5 5 ；反应时间2 4h 。通过对该分子印迹聚合物 性能的表征，证明了其对模板的吸附能力主要来自于低亲和力和高亲和力两类结合位 点；聚合物在印迹反应中形成的立体构型对特异性识别的建立起主要作用。 3 以强力霉素的分子印迹聚合物为填料，制备出对该物质进行选择性萃取的固相 萃取小柱。对小柱的萃取条件进行了优化。以纯水作为样品溶剂，2m l 乙腈作为淋 洗液，2 0m l 的甲醇：水- - - 9 ： ( v v ) 的混合溶剂作为洗脱液时，该柱对强力霉素的回收 率可达9 0 1 。将该萃取柱用于猪肉样品中强力霉素残留的提取和富集后，6 个加标 水平的平均回收率达劭8 2 a 。 关键词：强力霉素；分子印迹聚合物；传统聚合；分子印迹固相萃取；荧光光谱法 f l u o r e s c e n td e t e r m i n a t i o no fd o x y c y c l i n er e s i d u ea n dp r e p a r a t i o no fm o l e c u l a r i m p r i n t e ds o l i dp h a s ee x t r a c t i o nc o l u n m c a n d i d a t e ：c h e n 办i m i n s u p e r v i s o r ：c h e r tg u a n h u a m a j o r ：a g r i c u l t u r a lp r o d u c tp r o c e s s i n ga n ds t o r a g ee n g i n e e r i n g a b s 仃a c t r e s i d u e so fv e t e r i n a r yd r u g si na n i m a l sc a ne n t e rt h eh u m a nb o d yt h r o u g ht h e e n r i c h m e n to ff o o dc h a i n ，l e a d i n gt ot h ed r u gr e s i s t a n c eo fv a r i o u sp a t h o g e n i cb a c t e r i a , t h e d i s o r d e r so fi n t e s t i n a lf l o r a , c e l lc a n c e r a t i o n ，h o r m o n ed i s o r d e r s ，a n do t h e rh a z a r d st o h u m a nh e a l t h t h e r e f o r e ，d e v e l o p i n gt h em e t h o do fe x t r a c t i o na n dd e t e c t i o no fv e t e r i n a r y d r u gr e s i d u e si na n i m a lf o o di si m p o r t a n tf o rf o o ds a f e t y d o x y c y c l i n ei sat e t r a c y c l i n e a n t i b i o t i c s ，u s e dt op r e v e n tt h e b a c t e r i a li n f e c t i o n s i nr e s p i r a t o r y , d i g e s t i v ea n du r i n a r y t r a c ti nc l i n i cv e t e r i n a r y i nm a n yc o u n t r i e s ，d o x y c y c l i n er e s i d u e si na n i m a lf o o da r e l i m i t e d t h em e t h o d so fd e t e c t i o na n de x t r a c t i o no fd o x y c y c l i n ea r es t u d i e di nt h i sp a p e r 1 t h ec l o 。p h e n o l i ch y d r o x y lg r o u pa n dc n e n o y lg r o u po ft e t r a c y c l i n e sc a nr e a c t w i t hm + a tc o m p l e xr a t i oo f2 ：la n df o r mh y p e r t l u o r e s c e n c ec h e l a t e ，w h o s ef l u o r e s c e n c e c a nb ef u t h e ri n c r e a s e di nt h em i c e l l a rs o l u t i o no fc e t y l t r i m e t h y la m m o n i u mb r o m i d e w h e nt h e s ea r ec o m b i n e dw i n lt h ef e a t u r e so fd e r i v a t i v es y n c h r o n o u sf l u o r e s c e n c e s p e c t r o m e t r ys u c ha s l a r g ei n f o r m a t i o na n dg o o ds e l e c t i v i t y , t h es e l e c t i v ed e t e c t i o no f d o x y c y c l i n ec a nb er e a l i z e d an e wa s s a yi sd e v e l o p e dt od e t e r m i n et h ed o x y c y c l i n e r e s i d u eo nt h eb a s i so ft h i sp r i n c i p l e u n d e rt h eo p t i m u mc o n d i t i o n s ，t h el i n e a rd y n a m i c r a n g ei s 0 2 - 10m g l ；t h er e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o n sa r eb e t w e e n0 9 a n d3 9 ； d e t e c t i o nl i m i ti s12i x g k g ；r e c o v e r i e so fs p i k e ds a m p l ea r eb e t w e e n9 0 5 a n d10 7 3 t h i sm e t h o dc a nb eu s e dt od e t e r m i n ed o x y c y c l i n er e s i d u e s i np o 呔a n dt h er e s u l ti s s a t i s f a c t o r y 2 t h em o l e c u l a ri m p r i n t e dp o l y m e r sr e c o g n i z i n gd cc a ns y n t h e s i z e dw h e nd ci s u s e da st e m p l a t em o l e c u l e ，m e t h y l a c r y l i ca c i da sf u n c t i o n a lm o n o m e r s ，t e t r a h y d r o f u r a na s s o l v e n t ，e t h y l e n eg l y c o ld i m e t h y ld i a c r y l i ce s t e ra st h ec r o s s l i n k e r , a z o b i s i s o b u t y r o n i t r i l e 蠲 i n i t i a t o r o p t i m i z e ds y n t h e s i sc o n d i t i o n sa r ea sf o l l o w s ：t h em o l a rr a t i oo ft e m p l a t e ， m e t h y l a c r y l i c a c i da n de t h y l e n eg l y c o ld i m e t h y ld i a c r y l i ce s t e ri s1 ：8 ：4 0 ；r e a c t i o n t e m p e r a t u r ei s5 5 ：a n dr e a c t i o nt i m ei s 2 4h t h ea d s o r b a b i l i t yo ft h em o l e c u l a r i m p r i n t e dp o l y m e rt ot e m p l a t ep r o d u c ef r o mt w od i f f e r e n ta f f i n i t yb i n d i n gs i t e s a n d m o l e c u l a rs i z ea n ds h a p es a v ea st h em a i nf a c t o r s f o r t h es p e c i f i ca f f i n i t yo ft h e s y n t h e s i z e dp o l y m e r 3 t h ec a r t r i d g eo fd cm o l e c u l ei m p r i n t e ds o l i dp h a s ee x t r a c t i o nc a nb ep r e p a r e d t h r o u g hf i l l i n gt h em o l e c u l a ri m p r i n t e dp o l y m e ro fd c i n t oi t ，n l ee x t r a c t i o nc o n d i t i o no f t h ec a r t r i d g ei so p t i m i z e d t h er e c o v e r i e so fd cc a nb eu pt o9 0 1 w h e nd e i o m z e dw a t e r i su s e da ss a m p l es o l v e n t ，2m l a c e t o n i t r i l e 弱w a s h m gs o l v e n ta n d2 0m l m i xs o l u t i o no f m e t h a n o l ：w a t e r = 9 ：1 ( v n 0 鹤e l u t r i a n t t h ec a r t r i d g ec a r lb ea p p l i e dt oe x t r a c ta n de n r i c h d o x y c y c l i n ef r o mp o r ks a m p l e s ，a n dt h ea v e r a g er e c o v e r yo fs a m p l e ss p i k e da ts i x d i f f e r e n tl e v e l si s8 2 4 k e yw o r d s ：d o x y c y e l i n e h y d r o c h l o r i d e ；m o l e c u l a r l yi m p r i n t e dp o l y m e ；b u l k p o l y m e r i z a t i o n ；m o l e c u l a r l yi m p r i n t e ds o l i dp h a s ee x t r a c t ；f l u o r e s c e n c e s p e c t r o m e t r y 目录 l 研究综述l 1 1 食品中兽药残留的检测技术及前处理技术1 1 1 1 兽药残留检测技术一1 1 1 2 样品前处理技术2 1 2 强力霉素检测方法研究进展4 1 2 1 强力霉素简介4 1 2 2 强力霉素检测方法研究进展”4 1 3 分子印迹概述5 1 3 1 分子印迹技术概况”5 1 3 2 分子印迹技术的原理”6 1 3 3 分子印迹聚合物的聚合方法分类6 1 3 4 分子印迹聚合物的合成条件”8 1 3 5 分子印迹技术的应用研究进展及存在问题一l o 1 4 分子印迹固相萃取技术1 2 1 4 1 固相萃取技术原理1 2 1 4 2 分子印迹固相萃取技术原理1 2 1 4 3 分子印迹固相萃取技术操作模式1 3 1 5 本文研究的主要内容一1 4 2 导数同步荧光光谱法测定猪肉中残留盐酸强力霉素1 5 2 1 试验部分”l5 2 1 1 仪器与试剂”15 2 1 2 标准品及样品制各1 6 2 1 3 仪器测定条件”1 6 2 2 结果与讨论1 6 2 2 1d c 及其络合物的荧光光谱1 6 2 2 2p i - t 值对荧光强度的影响”1 7 2 2 3 金属离子的种类和浓度的影响1 8 2 2 4 表面活性剂的种类和浓度的影响一l8 2 2 5 导数一同步荧光光谱2 0 2 2 6 工作曲线、检出限、精密度”2 0 2 2 7 共存物质的干扰”2 0 2 2 8 实际样品测定结果和加标回收率“2 l 2 3 本章小结“2 1 3 盐酸强力霉素分子印迹聚合物的制备及性能研究2 2 3 1 试验部分一2 2 3 1 1 仪器与试剂”2 2 3 1 2 分子印迹聚合物( m i p s ) 和非分子印迹聚合物( n m i p s ) 的制备2 3 3 1 3 分子印迹聚合物的结合试验方法一2 3 3 2 结果与讨论2 5 3 2 1 溶剂的选择对印迹聚合物选择性的影响一2 5 3 2 2 功能单体的确定2 5 3 2 3 引发剂用量对印迹聚合物选择性的影响2 6 3 2 4 模板功能单体，交联剂的比例对印迹聚合物选择性的影响2 7 3 2 5 模板去除条件的优化2 7 3 2 6 分子印迹材料的等温吸附曲线一2 8 3 2 7 分子印迹材料吸附动力学曲线一2 9 3 2 8 分子印迹材料的选择性2 9 3 3 本章小结3 0 4 猪肉中强力霉素残留的分子印迹固相萃取3 1 4 1 试验部分3l 4 1 1 仪器与试剂3 l 4 1 2 分子印迹固相萃取小柱的制备3 l 4 1 3 样品制备一3 1 4 1 4 固相萃取方法3 2 4 2 结果与讨论一3 2 4 2 1 活化溶剂的选择3 2 4 2 2 上样溶剂的选取3 2 4 2 3 淋洗液的种类及用量的选择3 2 4 2 4 洗脱液的选择3 3 4 2 5 猪肉样品中回收率试验“3 4 4 3 本章小结3 5 5 结论3 6 参考文献3 7 在读期间发表学术论文4 5 作者简历4 6 致谢4 7 强力霉素残留的荧光检测与分子印迹同相萃取柱的制备 1 研究综述 近年来由于食品安全质量问题不断出现，人们对食品质量与安全的关注与日俱 增，食品安全问题逐步成为政府工作的重点和群众关注的焦点，而与食品安全检测方 法相关的研究成为该领域的研究热点之一。 兽药残i $ t ( v e t e r i n a r yd r u gr e s i d u e s ) 是指给动物使用兽药或饲料添加剂后，可蓄积 或储存于动物的细胞、组织、器官或可食性产品( 蛋、奶) 中的药物原型及其代谢产 物，是兽药在动物性食品中的残留，简称兽药残副。在养殖业的生产过程中，为了 预防和治疗各种疾病、促进动物生长、提高产品的投入产出比等，人们大量使用各种 兽药以及激素等化学物质。一些不法商贩更是在利益的驱动下，超量、非法使用国家 已经明令禁止的药物。这些药物在动物体内残留后，经过食物链的富集，最终进入人 体，对人类健康产生极大危害。其结果表现为：各种细菌病毒的耐药性的产生，体内 肠道菌群的紊乱，细胞癌变，人类激素水平调节出现紊乱，各种药物的急性、慢性中 毒等。在国际贸易中，食品中的兽药残留一旦被检测出来，将影响动物产品的出口贸 易，从而影响我国的国际形象。因此，对于动物性食品中的兽药残留开展有效提取和 高效检测方法的研究对于保障食品安全和维护国家利益都具有重要意义。 1 1 食品中兽药残留的检测技术及前处理技术 兽药残留检测的两个关键问题是怎样提高样品检测的灵敏度以及如何去除样品 基质的干扰。食品样品中基质极为复杂，药物残留量很低，基质对检测结果的干扰很 大。要求采用的检测方法应有一定的灵敏度和选择性【2 1 。 1 1 1 兽药残留检测技术 ( 1 ) 色谱技术 目前g c 和h p l c 为最常用的分析检测技术，广泛应用于食品安全检测中。郑举 等【3 】用h p l c 法测定饲料中的盐酸克伦特罗，在o 1 2 0g g m l 时具有良好的线性关 系，回收率达到1 0 1 2 9 7 5 。h p l c 还可以与柱前提取、纯化及荧光衍生化反应相 结合【4 】，其优点为容易实现分析过程的自动化、检测精确度高、假阳性率低；缺点为 检测过程繁琐，检测时间长，需专业分析人员，不易普及。何桂花等【5 】利用g c 法对 动物产品中二氯二甲吡啶酚兽药残留量的不确定度来源进行了研究。韩丽等【6 】利用 g c m s 法建立了动物组织中1 9 去甲睾酮的残留分析方法。田勇等【7 】采用薄层色谱法 对吡哌酸片、诺氟沙星胶囊、环丙沙星片及氧氟沙星片4 种喹诺酮类药物进行鉴别分 析，结果令人满意。 ( 2 ) 生物检测技术 常用的生物学检测方法主要包括分离培养方法、免疫学方法、分子生物学技术、 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 生物传感器技术、生物芯片技术和基因芯片技术等【8 0 0 1 。传统的微生物检测方法主要 依赖于微生物的富集培养、选择性分离和生化鉴定，操作繁琐、时间冗长、检出效率 及灵敏度低、容易出现假阴性。酶联免疫吸附法是一种把抗原和抗体的特异性免疫反 应和酶的高效催化作用有机结合起来的检测技术，具有简便、快速、灵敏、污染少、 高特异性等优点，已广泛应用于食品分析检测中。例如对尿液、血清等液体样品不需 要处理，检测限可达到0 5n g g 甚至更侧1 1 j 。但在检测动物组织等样品时，干扰源较 多，效果较差，不能同时分析多种成分，假阳性较高，严重影响结果判定【】2 1 。 ( 3 ) 光谱法 该类方法是根据待检测物质的光学特性来实现的物质检测方法，用于兽药残留分 析方面主要包括紫外可见分光光度、法【1 3 】、原子吸收光谱法【1 4 1 、荧光分析法【1 5 】等。其 中荧光分析法具有选择性好、灵敏度高及检测下限低等优点，结合同步荧光技术【蛉1 7 】 ( 恒波长同步荧光分析法是指在同时扫描过程中使激发波长和发射波长彼此间保持 固定的波长间隔，即入锄一入e x 一- - - 常数) 可以很好地对结构相似、荧光光谱重叠的混合 组分进行同时测定，且所需要的仪器价格和检测费用都比较低廉。 1 1 2 样品前处理技术 随着各种灵敏的检测方法的建立，我们对痕量存在物质的检测已经能够达到检测 的要求，于是基质( 蛋白、脂肪、有机酸、和各种生物组分) 对检测结果的影响就显 得越来越明显。所以食品安全分析的另外一个研究重点就是样品的前处理技术。 样品前处理是指样品的制备和对样品中待测组分进行富集、浓缩、净化的过程。 前处理的目的是消除基质的影响，保护检测仪器，提高检测的灵敏度、准确度和选择 性。在检测仪器一定的情况下，前处理方法对检测方法的灵敏度和重复性有重要影响。 但是在实际工作中，相对于检测分析技术的发展，样品的前处理技术相对落后。随着 高精密仪器的开发和利用，样品的前处理技术已经成为食品安全检测的瓶颈。目前食 品安全检测中常用的前处理技术有液液萃取( l l e ) 、固相萃取( s p e ) 、固相微萃取 ( s p m e ) 、基质固相分散( m s p d ) 、超声波辅助萃取( u s e ) 、免疫亲和色谱( 队c ) 、超临 界流体萃取( s f e ) 、加速溶剂萃取( a s e ) 等，这些技术的不断发展，为食品安全检测过 程中的样品提取净化提供了重要选择手段【1 8 。1 9 1 。 ( 1 ) l l e 在生物样品的前处理过程中，传统的l l e 仍普遍采用。l l e 用选定的溶剂分离 液体混合物中某种组分，溶剂必须与被萃取的混合物液体不相溶，具有选择性 的溶解能力，而且必须有好的热稳定性和化学稳定性，并有小的毒性和腐蚀性。 萃取的溶剂常用氯仿、乙醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、正己烷等。该方法的缺点 为劳动强度大，提取净化过程繁琐，耗费时间长；手工操作居多、样品容易损 失、引进误差的机会增多，工作效率低；浪费大量的试剂，易对操作人员健康 造成危害等。 ( 2 ) s p e 2 强力霉素残留的荧光检测与分子印迹同相葶取柱的制备 该方法是将不同的填料作为固定相装入微柱，当含有药物的生物样品溶液通时， 由于受到“吸附 、“分配”、“离子交换”或其它亲和力作用，药物或杂质被保留 在固定相上，用适当的溶剂洗除杂质，再用适当溶剂洗脱药物，达到分离纯化目的物 的目的。该方法既可用于复杂样品中微量或痕量目的物的提取，又可用于物质的净化、 浓缩和富集，且操作简单、省时、省力、易于自动化，是目前样品前处理的主流技术。 但由于其采用的填料为非特异性吸附剂，故萃取的选择性不强。在富集分析物的同时， 不能较好的除去基质和干扰物质，从而影响后续的分析效果。这些不利因素限制了固 相萃取技术的进一步发展，目前开发具有高选择性、高特异性的固相萃取剂成为研究 的热点。 ( 3 ) s p m e s p m e 是在s p e 的基础上发展起来的崭新的萃取分离技术。是指在微量进样器的 针头部分涂一层相当于气相色谱( g c ) 固定液的物质或键合一层固定相，直接将其浸入 液体样品或样品的顶空萃取装置，浓缩有机化合物后，随即将进样器直接插入g c 等 进样口加热，脱去有机物质，使被测物进入分析器。s p m e 是一种无溶剂萃取技术， 并具有操作时间短、样品用量少、重现性好、精密度高、检出限低等优点，已广泛应 用于实际样品处理中，但其缺点为对热不稳定性的物质不适用，影响结果的准确性。 ( 4 ) m s p d m s p d 是将涂有c 1 8 等多种聚合物的固相萃取材料与样品一起研磨得到半干 状态的混合物，并将其作为填料装柱，然后用不同的溶剂淋洗柱子，将各种待 测物洗脱下来。其优点是浓缩了传统的样品前处理中的样品匀化、组织细胞裂 解、提取、净化等过程，避免了样品的损失，是一种简单高效实际的提取净化 方法。但其缺点是自动化程度低、取样少、备选的吸附剂的种类有限。 ( 5 ) u s e u s e 是利用超声波辐射压强产生的强烈空化效应、机械振动、扰动效应、高 的加速度、乳化、扩散、击碎和搅拌等多级作用，增大物质分子运动频率和速 度，增加溶剂穿透力，从而加速目标成分进入溶剂，加速提取的进行。该方法 快速、安全、操作简便，但这种方法目前还多为手工操作，且主要用在小型实 验室。 ( 6 ) 认c i a c 是是基于免疫学技术发展起来的萃取技术，是基于抗原抗体相互作用的 专一性，从样品中选择性地提取净化目标分析物，具有高分辨、高灵敏度、低 检测限的要求，是一项颇具发展潜力的样品前处理技术，它所具有的高选择性 的净化和富集能力使得复杂繁琐的样品前处理问题变得简单化。i a c 利用的是蛋 白之间结合的特性，其选择性强，纯化效率高。但是该技术还是有很多不足之 处的，其依赖的核心填料为单克隆或多克隆抗体，其成本昂贵、制备过程繁琐、 周期长，而且还涉及动物实验。此外，不同批次抗体质量差异较大、不稳定， 需要在低温条件下保存，这些因素严重阻碍了该方法的广泛应用。 ( 7 ) s f e 3 河北农业大学硕十学位( 毕业) 论文 s f e 是近代化工分离中出现的高新技术，s f e 将传统的蒸馏和有机溶剂萃取 结合一体，利用超临界c 0 2 优良的溶剂力，将基质与萃取物有效分离、提取和纯 化。c 0 2 安全、无毒、廉价，超临界c 0 2 具有类似气体的扩散系数、液体的溶解 力，表面张力为零，能迅速渗透进固体物质之中，具有高效、不易氧化、纯天然、 无化学污染等特点。 ( 8 ) a s e a s e 是用溶剂对固体、半固体的样品进行萃取的技术。其原理是选择合适的 溶剂，通过增加温度和压力来提高萃取过程的效率。使用的萃取溶剂可以是有 机溶剂、缓冲盐水溶液、水和少量的无机酸。由于该技术非常安全而且可以控 制，美国环境保护局已经将其收录为处理固体样品的标准方法。 1 2 强力霉素检测方法研究进展 1 2 1 强力霉素简介 强力霉素( d o x y c y c l i n e ，d c ) 又称多西环素、脱氧土霉素，为半合成的四环素类抗 菌药，属于第二代四环素类抗生素。其抗菌机制与四环素相同，主要与细菌核蛋白体 的3 0 s 小亚基结合，干扰细菌蛋白质的合成，从而达到抑菌作用。d c 抗菌范围较广， 对溶血性链球菌、葡萄球菌等多杀性巴氏杆菌、沙门氏菌、革兰氏阳性菌、阴性菌均 有抑制作用，对支原体、衣原体、立克次氏体、螺旋体等也有不同程度的抑制作用【2 0 】。 吸收后体内分布广，组织渗透性良好，药物与血浆蛋白结合率高，体内维持药效时间 长，在国内兽医临床上应用的d c 制剂有盐酸强力霉素片、可溶性粉、注射液等。兽 医临床上常用于防治畜禽的呼吸道、消化道、泌尿道等细菌的感染。许多国家和地区 对d c 残留限量均有规定，欧盟规定猪肉中的残留限量为1 0 0 眺一2 ，日本为5 0 聊【善2 2 】，我国为1 0 0l 上g k g 2 3 1 。 1 2 2 强力霉素检测方法研究进展 中国药典【2 4 l 规定d c 的测定采用高效液相色谱法，除此之外，其他文献报道的方 法还有分光光度法、毛细管电泳法、化学发光法、微生物法、酶联免疫法等。江虹等 【2 5 j 利用分光光度法测定稀土元素与四环素、强力霉素、土霉素及金霉素间的络合反应， 方法用于市售药物中有关抗生素含量测定，结果满意；韦寿莲等【2 6 】运用毛细管电泳 电导检测方法对4 种四环素衍生物一土霉素( o t c ) 、金霉素( c t c ) 、强力霉素( d o c ) 和四环素( t c ) 的分离进行了研究，采用本法对实际样品强力霉素片中强力霉素和土霉 素片中土霉素进行测定，回收率分别为9 7 2 和9 6 4 ；c a s t e l l a n o s 等【2 7 1 利用毛细管 电泳法分析测定强力霉素，该方法具有良好的选择性，可重复性，线性范围和灵敏度。 可对商业样品进行定量分析；李念兵等【2 5 j 利用在n a o h 介质中强力霉素对l u m i n o l 4 强力霉素残留的荧光检测与分子印迹同相萃取柱的制备 k m n 0 4 体系发光反应具有强烈的抑制作用，建立起流动注射抑制化学发光测定痕量 强力霉素的新方法；j i a n g 等【2 9 利用铕与强力霉素反应形成的三元络合物可显着提高 特征荧光强度的特性，建立了一种检测强力霉素的荧光新方法；p i j p e r s 等3 川利用高 效液相色谱法和微生物法对猪血浆中的强力霉素、土霉素和米诺环素进行了定量分 析；s o l o m o n 掣3 1 1 利用酶联免疫法对强力霉素进行了分析。 1 3 分子印迹概述 1 3 1 分子印迹技术概况 分子印迹技术( m o l e c u l a ri m p r i n t i n gt e c h n o l o g y ，m i t ) 是指模拟自然界所存在的分 子识别作用机理，以目标分子为模板，将具有结构互补的聚合物功能单体通过共价键 或非共价方式与模板分子结合，再加入交联剂和引发剂进行聚合和交联，反应结束后 将模板分子洗脱，即形成了含有能识别模板分子空穴的高分子聚合物p 4 1 。分子印迹 技术常被形象地描绘为制造识别“底物”的“酶 或“分子钥匙”的“人工锁 技术。 分子印迹技术来源于免疫学的发展，起源于2 0 世纪4 0 年代p a u l i n g 3 5 j 首次提出 的以抗原为模板来合成抗体的大胆设想，可以说这是对分子印迹技术的最初描述。虽 然该理论被后来的“克隆选择理论”推翻，但“模板学说”却激发了人们以抗原或待 测物作为模板合成抗体模拟物的设想，这一设想为分子印迹的发展提出了研究的方 向，也成为分子印迹最初的理论描述。1 9 4 9 年，d i c k e y l 3 6 】成功地将甲基橙烙印在硅 胶表面上，首次提出了分子印迹的概念，但在很长一段时间内没有引起人们的重视。 1 9 7 2 年w u l f f 研究小组首次报道了人工合成分子印迹聚合物之后，这项技术逐渐为人 们所认识。但由于其研究主要集中在共价型模板聚合物上，动力学过程较慢，且仅限 于催化领域，在分子识别领域的应用没有展开。2 0 世纪8 0 年代后非共价型模板聚合 物的出现，特别是1 9 9 3 年瑞典科学家m o s b a c h 掣3 7 j 在( n a t u r e ) ) 上发表了有关茶碱 m i p s 的研究报道后，分子印迹技术得到了蓬勃的发展。1 9 9 7 年，国际分子印迹协会 ( s o c i e t yf o rm o l e c u l a ri m p r i n t i n g ，s m i ) 在瑞典成立，目的是推进m i t 的快速发展。 目前世界上至少有1 0 0 个以上的学术机构和企事业团体在从事m i t 的研发工作，并 主要集中在瑞典、英国、中国和美国等1 0 多个国家。 m i t 之所以发展迅速，主要是因为它有三大特点：构效预定性( p r e d e t e r m i n a t i o n ) 、 特异识别性( r e c o g n i t i o n ) 和广泛实用性( p r a c t i c a b i l i t y ) 。构效预定性决定了人们可以根 据不同的目的制备不同印迹聚合物，以满足各种不同研究的需要；特异识别性是因为 m i p s 是根据印迹分子( i m p r i n t e dm o l e c u l e ) 定做的，它具有特殊的分子结构和官能团， 能选择性地识别印迹分子。因为制备的分子印迹聚合物亲和性和选择性都很高，抗酸 碱等恶劣条件的能力强，稳定性好，使用寿命长。所以分子印迹技术的应用非常广泛， 现在m i p 被成功应用的领域包括环境污染物的处理【3 8 - 3 9 1 、手性药物的分离【州3 1 、食 品中痕量物质的分离检测【4 4 - 4 9 1 、军事中有毒物质的检测【蜘等。同时分子印迹技术对于 5 河北农业大学硕+ 学位( 毕业) 论文 研究分子识别的机理和结构也有重要的理论意义和使用价值。 1 3 2 分子印迹技术的原理 分子印迹技术是指为获得在空间和结合位点上与模板分子完全匹配的聚合物的 制备技术。如图l 所示，其原理为：在模板分子周围形成一个高度交联的刚性高分子， 除去模板分子后在聚合物的网络结构中留下了与模板分子大小和形状相匹配的立体 孔穴，同时孔穴中含有识别模板分子的结合位点，从而对模板客体分子表现出高度的 选择识别性能【5 。这些孔穴的空间结构和性质是由模板分子的结构和性质决定的，因 此m i p s 可以在众多模板分子及其结构类似物中选择性地识别模板分子，而非印迹分 子的体积大小和功能集团都不能很好的和m i p s 匹配，不具备特异性的识别作用。 m a a 蝴 今 琏 b、 幽 删 竹岣棚眦 = h =麒 图1 分子印迹技术原理示意图 f i g 1t h ep r o c e s so f m o l e c u l a ri m p r i n t i n g 1 3 3 分子印迹聚合物的聚合方法分类 1 3 3 1 按模板分子与功能单体作用方式分类 预组装法( 共价法) ：该方法形成的聚合物是模板分子与功能单体通过可逆共价 键结合形成的，然后交联聚合，聚合后再通过化学途径将共价键断裂并将印迹分子洗 脱出来，即形成了有吸附活性的印迹聚合物。这种技术的最大优点在于模板单体的复 合物稳定而且二者之间的比例严格，合成时的条件广泛【5 2 1 。但是由于共价键作用较强， 在模板分子识别过程中结合和解离的速度较慢，不适于快速识别，而且识别能力与生 物识别差别甚远p 引。 自组装法( 非共价法) ：该方法形成的聚合物是将适当比例的模板分子与功能单 体之间自组织排列，通过非共价键自发形成具有多重作用位点的单体模板分子印迹 聚合物，在交联剂的作用下形成刚性聚合物，然后采用高极性有机溶剂或各种有机溶 剂的混合物通过索氏萃取、热处理、超临界萃取或微波辅助溶剂萃取等物理方法除去 模板分子，随后的分子识别过程通过非共价作用进行【5 4 4 9 。该方法不必合成共价的单 6 薯 知 竺 一 强力霉素残留的荧光检测与分子印迹同相葶取柱的制备 体印迹加合物，可在温和的条件下将印迹分子从聚合物中除去，且有很快的速度。 但该方法也有不足之处：为了使模板和单体的特异性最大化，通常实验者要摸索很多 条件来减少非特异性作用，且不同的模板需要采用的合成细节不同，使合成变得困难； 由于在大量功能单体存在的条件下( 为使平衡有利于加成物生成) 常会出现非特征的 键合点，于是就会降低体系结合底物的选择能力等。 半共价法：是综合了共价法和非共价法的分子印迹新方法。即聚合时单体与分子 印迹间作用力是共价键，而在对分子印迹识别过程中，二者的作用是非共价的。 w h i t c o m b e 等j 综合了共价和非共价技术的优点，采用4 - 乙烯基苯基碳酸酯作为功能 单体，单体与模板分子之间通过共价键作用，洗脱时发生水解反应，放出c 0 2 ，将模 板分子胆固醇洗脱下来，产生的m i p s 具有一个非共价型的识别位点，识别位点上的 酚基可以通过氢键与模板分子相互作用完成识别。该方法结合了共价法产物的稳定性 和各成分比例的恒定与非共价法印迹的高动力学特点。 1 3 3 2 按反应方式分类 传统聚合法：将印迹分子、功能单体、交联剂和引发剂按一定比例溶于有机溶剂 中，并密封在一个真空的安培管中并封口经热、光或电引发，经一定时间的聚合制得 棒状聚合物，经洗脱、粉碎、过筛等得到所需粒状m i p s 。该方法制备的m 口具有满 意的记忆功能，对印迹分子有良好的选择性和识别特性，而且合成操作条件易于控制， 实验装置简单，是最常见和使用最多的方法【6 1 - 6 2 1 。合成的聚合物多应用于离线分子印 迹固相萃取。这种方法的最大缺点是不利于大规模生产。 原位聚合法：是一种将预聚合混合溶液注入到空的色谱柱、毛细管柱或固体表面， 直接聚合制得连续型棒状聚合物的方法。通过洗脱除去模板分子后可直接应用，制备 过程简单，具有连续性和均一性的特点。s c h w e i t z 等【6 3 】采用原位聚合法，在毛细管中 获得了针对对映体的多孔聚合物，可在两分钟内完成基线分离。张静等畔j 用此法合成 了一系列m i p s 柱，用于富集和检测体液中的士的宁。此法制作色谱柱较为简便，但 色谱柱压偏高也限制了这种方法的广泛使用。 悬浮聚合法：是先制备稳定的乳液连续相，然后把模板分子、功能单体、交联剂、 引发剂等加入到连续相中，经搅拌热引发制备具有规则的球状聚合物。该项技术通常 在水中【6 5 舶】、矿物油中【6 7 l 、四氟化碳中【硝】制得产物。得到的产物是球状，并且产物 尺寸均一。但该方法的缺点是水与大多数印