（食品科学专业论文）利福霉素SV高产菌株的选育.pdf

摘要 利福霉素s v 由地中海拟无枝酸菌a m y c o l a t o p o s i sm e d i t e r r a n e i 产生，在生物合成过 程中受芳香族氨基酸、利福霉素芳香i j i 体c ，n 的结构类似物及利福霉素s v 的反馈调节。 本文根据利福霉素s v 生物合成途径和代谢调控理论，对利福霉素s v 的产生菌进行了 推理选育。原始出发菌种a m y c o l a t o p o s i s m e d i t e r r a n e i l 7 7 经自然选育和原生质体融合分 别得到a m y c o l a t o p o s i sm e d i t e r r a n e i 4 9 和a m y c o l a t o p o s i sm e d i t e r r a n e i1 7 4 ，作为两株不同 的诱变出发菌株。 选用不同的诱变剂对诱变出发菌株进行诱变处理，分别经过5 0 # g m l 的吖啶黄诱变 处理、1 硫酸二乙酯( d e s ) 处理1 6 m i n 、1 5 w 的u v 照射6 0 s 、0 1m o l m l 的h n 0 2 诱变处理5 m i n 、0 8 m g m l 的亚硝基胍( n t g ) 处理4 0 m i n 、u v 照射4 0 s 和0 1m o l m l 的 i n 0 2 处理3 m i n 复合诱变以及u v 照射4 0 s 和1 的d e s 处理1 0 r a i n 复合诱变，再分别 采用o 1 的l 色氨酸、o 5 l 色氨酸、0 1 邻氨基苯甲酸和o 0 5 的利福霉素s v 进 行药物耐受筛选，并结合自然选育进行分离纯化，经过琼脂块初筛以及摇瓶发酵复筛， 最终获得利福霉素s v 生产菌株a m y c o l a t o p o s i sm e d i t e r r a n e i 7 3 5 ，其摇瓶发酵单位达到 6 5 1 8 # g m l ，较出发菌株a m y c o l a t o p o s i sm e d i t e r r a n e i 4 9 提高了1 8 5 。 为了充分体现高产菌株a m y c o l a t o p o s i sm e d i t e r r a n e i 7 3 5 的生产优势，激发其产利福 霉素s v 的潜力，进一步对其发酵培养基进行了调整和优化。选取鱼粉、豆饼粉和k n 0 3 三个因素进行单因素以及j 下交试验，确定其发酵培养基的最佳组合是鱼粉的添加量为 o 5 、豆饼粉的添加量为1 2 和k n 0 3 的添加量为o 6 ，此条件下利福霉素s v 生产 菌株a m y c o l a t o p o s i sm e d i t e r r a n e i 7 3 5 摇瓶发酵单位达到6 7 3 5 # g m l ，其发酵产量较发酵 培养基调整前提高了3 3 。 对利福霉素s v 高产菌株a m y c o l a t o p o s i sm e d i t e r r a n e i 7 3 5 连续5 次传代，在同一条 件下进行摇瓶发酵，分别测摇瓶发酵单位，其利福霉素s v 发酵单位稳定在6 3 0 0 # g m l 以上，说明利福霉素s v 生产菌株a m y c o l a t o p o s i sm e d i t e r r a n e i 7 3 5 具有良好的传代遗传 稳定性。 关键词：利福霉素s v ：选育；复合诱变；吖啶黄；硫酸二乙酯；亚硝基胍 a b s t r a c t r i f a m y e i ns vi sp r o d u c e db ya m y c o l a t o p o s i sm e d i t e r r a n e i t h eb i o s y n t h e s i so f r i f a m y c i ns vw a si n h i b i t e db yt h ea r o m a t i ca m i n oa c i d s ，t h ea n a l o g u e so fa r o m a t i cp r e c u r s o r c 7 na n dr i f a m y c i ns v a c c o r d i n gt ot h ep a t h w a ya n dm e t a b o l i cr e g u l a t i o no fr i f a m y c i ns v b i o s y n t h e s i s ，i m p r o v e m e n to fa m y c o l a t o p o s i sm e d i t e r r a n e i l 7 7b yr a t i o n a ls c r e e n i n gw a s p e r f o r m e dt or a i s et h ep r o d u c t i o no fr i f a m y c i ns v s t r a i n sa m y c o l a t o p o s i sm e d i t e r r a n e i 4 9 a n da m y c o l a t o p o s i sm e d i t e r r a n e i17 4w e r es e p a r a t e l yo b t a i n e da st w od i f f e r e n ts t r a i n sf o r m u t a t i o nf r o mt h eo r i g i n a ls t r a i na m y c o l a t o p o s i sm e d i t e r r a n e i1 7 7 ，w i t ht h em e t h o d so f n a t u r a ls e l e c t i o na n dp r o t o p l a s tf u s i o n m u t a n t sw e r eo b t a i n e df r o mt h et w os t r a i n sa m y c o l a t o p o s i sm e d i t e r r a n e i 4 9a n d a m y c o l a t o p o s i sm e d i t e r r a n e i1 7 4d u r i n gi n d u c e dm u t a t i o n ，s u c ha s5 0 # g m la e r i f l a v i n e h v d r o c h o r i d e ，1 d e sd e a l i n g1 6 m i n ，1 5 wu vr a d i a t i n g6 0 s ，0 1m o l m lh n 0 2d e a l i n g 5 m i n , 0 8 m g m ln t gd e a l i n g4 0 m i n c o m p o u n dm u t a t i o no fu vr a d i a t i n g4 0 sa n d0 1 m o l m lh n 0 2d e a l i n g3 m i n c o m p o u n dm u t a t i o no fu vr a d i a t i n g4 0 sa n d1 d e sd e a l i n g 1 0 m i n h i g hp r o d u c t i o nm u t a n t sw h i c hc o u l dg r o ww e l lo nt h em e d i u mw i t ht h ec o n c e n t r a t i o n o f o 1 t r p ，o 5 t 叩，o i a n aa n d0 0 5 r i f a m y c i ns vw e r es e l e c t e di no r d e rt oa l l e v i a t e t h ei n h i b i t i o nc a u s e db yt r p ，a n aa n dr i f a m y c i ns v b ya b o v em e t h o d s ，am u t a n t a m y c o l a t o p o s i s m e d i t e r r a n e i 7 3 5w a so b t a i n e d t h e r i f a m y c i n s vp r o d u c t i v i t yo f a m y c o l a t o p o s i sm e d i t e r r a n e i 7 3 5r e a c h e d6 5 1 8 # g m 1 w h i c hw a s1 8 5 h i g h e rt h a nt h e o r l l g i n a ls t r a i na m y c o l a t o p o s i sm e d n e r r n n e i 4 9 i no r d e rt oa r o u s et h ep r o d u c t i o na d v a n t a g ea n dp r o d u c t i v ep o t e n c yo fr i f a m y c i ns vo f a m y c o l a t o p o s i sm e d i t e r r a n e i 7 - 3 5 ，t h ef e r m e n t a t i o nm e d i u mw a s f u r t h e ra d j u s t e da n d o p t i m i z e d f i s hp o w d e r , b e a np o w d e ra n dk n 0 3w e r es e l e c t e df o rf a c t o r sa n do r t h o g o n a l i t y t e s t t h ec o m b i n a t i o no ff i s hp o w d e r0 5 b e a np o w d e r1 2 a n dk n 0 30 6 w e r e s e l e c t e da st h eb e s tc o m b i n a t i o no ft h ef e r m e n t a t i o nm e d i u m t h er i f a m y c i ns vp r o d u c t i v i t y o f t h es t r a i na m y c o l a t o p o s i sm e d i t e r r a n e i 7 3 5r e a c h e d6 7 3 5 # g m 1 w h i c hi s3 3 h i g h e rt h a n t h a tg r o w i n go nt h ef o r m e rf e r m e n t a t i o nm e d i u m t h es t r a i na m y c o l a t o p o s i sm e d i t e r r a n e i 7 3 5w a ss u b c u l t u r e d5g e n e r a t i o n s ，w h o s e r i f a m y c i ns vp r o d u c t i v i t yw a sd e t e r m i n e d a f t e rs h a k e f l a s kc u l t u r ed u r i n gt h es a m e i i c o n d i t i o n g o o dh e r e d i t ys t a b i l i t yo ft h es t r a i na m y c o l a t o p o s i s - m e d i t e r r a n e i 7 3 5w a s s h o w e da st h er i f a m y c i ns vp r o d u c t i v i t yw a ss t a b l yh i g h e rt h a n6 3 0 0 # g m 1 k e yw o r d s ：r i f a m y c i ns v ；s e l e c t i o n ：c o m p o u n dm u t a t i o n ：a c d f l a v i n eh v d r o c h o r i d e ；d e s n t g 1 1 1 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及 取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外， 论文中不包括其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得河 南工业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工 作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表 示了谢意。 论文作暑签名： 缝围垒日期：2 旦：! ：! ! 关于论文使用授权的说明 本人完全了解河南工业大学有关保留、使用学位论文的规定， 即：学校有权保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；本 人授权河南工业大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数 据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编 学位论文。( 保密的论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：丝睦日期：! z ：! ：! 导师签名： 有关知识产权的保证 本人所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得 的研究成果。本人在校期间的研究成果及发表的论文，知识产权归河南 工业大学所有。本人毕业后发表的、以本人在校期间研究成果为基础完 成的论文、研究报告及其它科研成果，将署名河南工业大学为作者单位。 论文作者签名：逛坠日期：圣簟：三：! ! 导师签名： 日期：孚世 | 利福霉袭s v 高产菌株的选育 1 1 本论文的研究目的和意义 第一章绪论 利福霉素是主要用于治疗结核病的一大类抗生素。众所周知，结核病曾是一种可怕 的疾病，在本世纪三、四十年代肆虐全球，严重危害人类健康，曾经夺走许多人宝贵的 生命，被称为十九世纪的巨大灾难。人们在与之作斗争的过程中，先后发现了异烟肼、 对氨基水杨酸等化学合成药物以及氨基糖苷类、肽类抗生素。特别是利福霉素类抗生素 中的利福平、利福喷汀等的研制成功，使结核病的危害得到了很大的控制，这是抗痨事 业的重大胜利“1 。 尽管如此，目前结核病仍是一大类常见病、多发病，尤其是近二十年来，由于各国 对结核病的忽视，使结核病在世界范围的流行重新加剧。全球现有结核病人2 0 0 0 万， 每年新发现8 0 0 - - 1 0 0 0 万，每年约3 0 0 万人死于结核病。1 9 9 3 年世界卫生组织宣布结核 病为全球紧急病症w h o 官员宣称结核病菌仍是传染病中的“头号杀手”，尤其是在 不发达的第三世界各国发病率较高。中国结核病人数居世界第二位，仅次于印度，有 肺结核病人6 0 0 万，其中具有传染性的病人2 0 0 万，每年死于结核病的越2 5 万多”1 。 随着结核病的卷土重来，有科学警告：“致命的抗药性结核病可能成为二十一世纪的新 灾难! ”。世界卫生组织预测今后1 0 年全球肺结核患者将由2 0 0 0 万人增加到3 0 0 0 万人 以上，国内、国际对结核病防治力度在加大以控制结核病的蔓延。 利福霉素( r i f a m y c i n ) 是具有抗分枝菌活性的安莎霉素( a n s a m y c i n s ) 类抗生素， 由地中海拟无枝酸菌“a m y c o l a t o p o s i sm e d i t e r r a n e i ”产生。1 ，广泛应用于结核病、麻风 病和与艾滋病有关的分枝菌感染的治疗“1 。在a m y c o l a t o p o s i sm e d i t e r r a n e i 发酵液中有五 种利福霉素组份( a 、b 、c 、d 、e ) ，其中利福霉素s v 最容易得到分离。第一个用于 临床的利福霉素类药物就是利福霉素s v ，因其口服后排泄太快，不易达到治疗所需的 血药浓度，从而希望通过化学结构改造，合成出口服吸收好，排泄慢，能维持血药浓度 的半合成的衍生物，利福平就是以利福霉素s v 为原料合成出来的较好的一种”1 。 利福平( r i f a m p i c i n ) 是六十年代新发展起来的一种新型的抗结核菌的利福霉素衍 生物，具有广谱的抗菌作用，对结核杆菌、麻风杆菌和革兰氏阳性球菌”1 ，特别是耐药 性会黄色葡萄球菌，有很强的抗菌作用，对革兰氏阴性菌及一些病毒也有一定的作用， 副作用低，对那些用其他药物已产生耐药性的菌株，以及对繁殖期和静止期的结核杆菌 都有效。近几年随着临床应用推广，其用途也不断扩大，除被广泛用于分枝杆菌感染的 河南t 业大学硕 ：论文 治疗，还用于治疗革兰氏阳性菌所致胆道感染和脑膜炎球菌带菌者，也可用于治疗麻风 病和沙眼5 1 。另外，利福布汀在抗药性结核菌感染及治疗结核菌与艾滋病毒复合感染、 利福昔明作为肠道用药方面起了重要作用，已在全世界范围内广泛应用于l 晒床。目前国 内外正在研制的较有希望的利福霉素新衍生物大约有十来个，而且利福霉素类抗生素的 研究仍然蓬勃发展，正向纵深推进。 利福霉素s v 是利福霉素菌种( 诺卡氏菌) 发酵次级代谢产生的分泌物，其产量、 质量和菌种性能关系较大，要想使利福霉素s v 的产量和质量有较大提高，首先就要提 高菌种的性能，要想使菌种生产能力不断提高，最根本的还得依靠菌种本身固有的遗传 特性，这就必须不断进行菌种选育、改良。目前，国内工业微生物育种工作效率低，利 福霉素s v 的发酵水平不高，平均发酵水平在5 0 0 0 # g m l 左右。若能将发酵单位提高1 0 以上，则利福霉素s v 的产量提高1 0 以上，利福霉素s v 生产企业所获得利润至少增 加l o 。因此，提高利福霉素s v 的发酵水平，既能带来可观经济效益，又能满足社会 需求。提高菌种的性能的方法有很多，可以采用交叉物理和化学的诱变方法，以及合适 的筛选方法来筛选高产菌株，也可以借助现代的高科技生物技术，改变重组菌种的d n a 分子结构，使其次级代谢更旺盛，产生更多质量更好的分泌物利福霉素s v 。 本课题就是根据地中海拟无枝酸菌的遗传机制和生化代谢机制，在工厂实际生产条 件下，利用诱变育种的理论和知识，合理地选择诱变因子对其进行一系列的诱变，并结 合代谢控制育种方法，通过一系列的筛选从诱变突变体中获得利福霉素s v 高产菌株。 这样，一方面为利福霉素s v 生产菌及其他工业微生物的育种工作提供理论依据；另一 方面，也可给利福霉素s v 生产企业带来丰厚的效益，又能满足社会需求。 1 2 国内外研究概况 1 2 1 微生物育种进展 微生物育种的目的就是要人为地使某些代谢产物过量积累，把生物合成的代谢途径 朝人们所希望的方向加以引导，或者促使细胞内发生基因的重新组合优化遗传性状，获 得所需要的高产、优质和低耗的菌种“1 。微生物育种在发酵工业中占有重要地位，是决 定该发酵产品能否具有工业化价值及发酵过程的成败与否的关键。微生物育种无论从自 然变异中还是人工诱变的选择，都是建立在遗传和变异的基础上”1 。 自从1 9 2 8 年英国的f l e m i n g 首次发现青霉素( p e n i c i l l i n ) ，1 9 4 0 年f o r e y 和c h a i n 成功应用于l 临床以来，短短几十年青霉素的研究和生产获得很大发展。依靠菌种选育和 工艺革新，青霉素的产生菌的生产能力从刚发现时的1 2 单位毫升到目前已达6 0 0 0 0 利福霉素s v 高产菌株的选育 单位毫升以上，比原始菌株的产量提高了上千倍。至于其它抗生素，通过菌种选育都 获得了很大提高”1 。 随着现代生物技术的发展，将目的基因导入宿主菌，进行克隆和表达，从而构建基 因工程菌的报道已有不少，在1 9 5 7 1 9 8 0 年期间瑞士的c i b a 公司、意大利l e p e t i t 研究 所、莫斯科全苏抗生素研究所，以及中国、韩国和日本的几个研究所己经对地中海拟无 枝酸菌进行过遗传操作，使得利福霉素s v 的产量提高或可产生活性更高的利福霉素类 及其衍生物。在1 9 8 0 年后，采用改进重组d n a 技术便于进一步对地中海拟无枝酸菌 株的操作，达到菌种改良的目的。但基因工程菌用于大规模工业生产的还为数不多，经 典的诱变育种仍是目前最重要的遗传育种手段，特别是对遗传背景不很清楚的对象，诱 变育种更是必不可少。对于抗生素生产厂家，理化因子诱变育种技术和原生质体融合技 术是为提高抗生素产量而经常采用的有效方法9 。 周建琴等“”用康乐霉素( k - c ) 产生菌的自然突变株s t - 9 1 为出发菌株，采用u v 诱 变和自然分离纯化的方法，筛选出1 株突变株u 1 0 - s 4 。发酵条件优化后，5 吨罐上k c 效价比s t - 9 1 提高4 6 0 多倍。 王筱虹“用u v 照射红霉素产生菌红色链霉菌的原生质体，得到比对照菌株效价 提高2 2 5 8 的高产菌株。 值得注意的是，白兰芳1 以紫外线、光复活处理西罗莫司产生菌，得到正变株 u v - 8 6 1 的效价较出发菌株高2 3 倍。 姚建铭“”通过n 离子注入利福霉素生产菌，最终获得的高产菌2 9 5 3 # ，较原始出 发株效价提高1 9 3 0 。 王纪“”通过离子注入诱变筛选产麦角 醇酵母高产菌，形成率较出发菌提高 5 5 巧0 。 李瑶“”用n t g 对可产生耐高温淀粉酶的高温菌进行诱变选育，得到酶活性提高 为原菌2 2 3 倍的一株突变株。 蔡晶晶等“”把产生洛伐他汀的土曲霉经n t g 诱变，选出一突变株，产生洛伐他汀 的能力较出发菌株提高6 6 。 胡永兰“”用u v 和d e s 复合处理梧宁霉素产生菌不吸水链霉菌，得到一产素较高 的突变株，产素效价比出发株提高2 9 1 7 2 。 普为民“”用u v 和5 i 氟尿嘧啶复合诱变处理5 i 腺苷酸脱氨酶产生菌，以及条件优 化后，使菌株的酶活性提高1 4 6 倍。 齐秀兰“”用l i c i 、u v 和博来霉素三重复合处理赖氨酸产生菌钝齿棒杆菌，筛到一 高产菌株的l 广赖氨酸产量较出发菌株提高1 7 7 。 河南t 业大学硕i ：论文 张怡轩汹1 应用磁场复合吖啶橙处理氨甲酰一妥布霉素产生菌黑暗链霉菌，得到高产 株的总效价、c t b 含量均提高6 4 o 。 利用定向育种技术和基因重组技术，对利福霉素产生菌进行菌种选育己取得重大成 功，不仅大幅度提高了利福霉素的生产能力，而且获得了许多新的利福霉素。金玉坤等 根据利福霉素s v 的生物合成和调节特点，利用定向育种技术，对地中海诺卡氏菌 ( n o c a r d i am e d t e r r a n e i ) 9 9 3 6 先采用超声波处理菌丝片段，经u v 诱变处理后，再经 l 色氨酸、氯化铯以及利福霉素s v 进行耐受筛选，获得了解除利福霉素s v 生物合成 的关键i ； f 体物质3 一氨基一5 一羟基苯甲酸( c ，n ) 合成中的色氨酸反馈调节、氨离子反 馈调节以及利福霉素s v 合成中解除终产物反馈调节的高产菌株，产量提高1 0 左右川。 全志华等利用u v 诱变处理n m e d i t e r r a n e ix c j 叩菌丝悬浮液后，再经芳香族氨 基酸( p h e 、t r p 、t y r ) 作耐受处理，获得了利福霉素b 的高产菌株，产量提高4 2 以 上2 ”。 张益桑等对地中海诺卡氏菌( n o c a r d i am e d i t e r r a n e i ) a s 经亚硝基弧( n t g ) 诱变， 用谷氨酞胺的拮抗物进行筛选，获得消除谷氨酰胺对谷氨酞胺合成酶的阻遏作用的变 株，从而使利福霉素的产量有较大的提高”。 s c h u p p 通过2 个地中海诺卡氏菌株( 一个产利福霉素b 、一个产利福霉素w ) 进 行种内基因重组，获得的重组体菌株r - 2 1 ，能产生许多新的利福霉素，其中以3 一羟基 利福霉素s 活性最强，它抑制革兰氏阴性菌的活性比利福霉素s 强”“。 廖福荣在研究巴比妥对地中海拟无枝酸菌的毒性与利福霉素b 生物合成的关系时， 筛选到巴比妥敏感茵株，其利福霉素的产量比亲株高一倍1 。 齐秀兰“1 以妥布霉素产生菌黑暗链霉菌a t c c l 7 9 2 0 为出发菌株，经紫外线处理， 获得一株产量较高且稳定的菌株u v - 5 9 ，其效价比原株提高9 2 3 。 颉红梅”1 用4 0 a r 4 十离子辐照庆大霉素产生菌绛红小单孢菌，出发菌株的平均效价 为1 1 5 0 u m l ，最高效价为1 3 0 4 u m l ，得到一正变株的平均效价为1 4 0 9 7 u m l ，最高效 价为3 5 8 0 u m l ，正变率为6 9 1 。 龚加顺啪1 用矿离子注入单宁酸酶产生菌黑曲霉9 7 0 1 ，获得一株产酶活力 3 4 5 0 m o l s 的高产菌株，比原始菌株酶活力提高了2 6 8 倍，且酶活性稳定。 钱玉英啪1 用6 0 c o 下射线诱变处理酸性蛋白酶产生菌黑曲霉c p u 菌株，获得一高产菌 株其酸性蛋白酶活力比出发菌株提高近4 倍。 王海彬以阿维菌素产生菌阿维链霉菌为出发菌株，进行6 0 c o 诱变处理后，筛选 到一高产突变株，其b l a 组分摇瓶发酵单位可达1 6 0 0 t g m l ，比出发菌株提高3 3 。 邱玉棠”用6 0 c o 射线辐照肌苷产生菌枯草杆菌，选育出一肌苷高产突变株的肌苷 4 利福霉素s v 高产菌株的选育 产量达2 5 1 8 l ，比出发菌株提高2 4 7 ，菌株产肌苷能力稳定。 刘连碧o ”采用链霉素抗性筛选法，用含链霉素高氏一号合成培养基筛选柔红霉素产 生菌对链霉素的抗性自发突变株，获得了产抗生素能力是原菌株的1 5 倍左右的突变株。 于秀莲对庆大霉素产生菌进行了摇瓶耐受高浓度庆大霉素试验，从耐受 8 0 0 0 u m l 庆大霉素的摇瓶中，筛选得到一高产株，其摇瓶效价较出发菌株提高2 2 8 。 王世梅1 用吖啶撞对阿扎霉素b 产生菌进行诱变处理，获一高产株的产量为 1 1 0 0 m 扎，而出发株产量为2 4 0 m g i l ，且传代稳定。 程世清3 用5 - b u 对产色素菌( 分枝杆菌t 1 7 2 3 9 ) 细胞进行诱变，生物量平均提高 2 2 5 。 王付转汹1 用离子注入诱变利福霉素生产菌结合推理筛选，使利福霉素s v 摇瓶效价 相对提高5 8 7 。 郑璞。”对产利福霉素s v 的地中海拟分枝酸菌臼m y c o l a t o p s i sm e d i t e r r a n e i ) 原生质 体进行电融合处理，利福霉素s v 发酵化学效价相对提高3 0 ，最高化学效价达 8 9 0 0 i l m l 。 陈灼湖汹1 通过对利福霉素发酵培养基配方改进及改斜面孢子进罐为菌丝瓶进罐，使 发酵效价相对提高3 2 6 。 1 2 2 利福霉素及其生物合成的研究 利福霉素属于安莎类抗生素，由地中海拟无枝酸菌产生嘲1 。该菌种首次在法国南部 的拉菲尔植物园的土壤中由意大利l e p t i t 研究室分离获得，该菌株原名为地中海链霉 菌，经t h i e m a n n 等研究该菌的细胞壁组分，发现其水解物中含内消旋二氨基庚二酸并 含阿拉伯糖，从而将它归属为地中海诺卡氏菌1 ，1 9 8 6 年经分类学家进一步研究，更 名为地中海拟无枝酸菌“。 1 9 5 9 年s e n s i 等首次从地中海拟无枝酸菌发酵液中分离得到利福霉素s ，它是第一 个用于临床治疗的利福霉素”“删。1 9 6 3 年p r e l o g 等确定了利福霉素的化学结构“，它 是由一个芳香核的两个不相邻的位置通过脂肪桥的联结，即一个发色基团( c 7 n ) 和一 条安莎链组成，并首先对这类抗生素的命名，p r e l o g 的工作有力地推动了这类抗生素的 研究和开发。1 9 6 2 年第一个半合成利福霉素药物利福霉素s v 应用于临床“。1 9 6 7 年h a r t l n a n n 等首次发现了利福霉素的作用方式特异性抑制细菌r n a 聚合酶”，同 时瑞士c i b a g e i g y 公司和意大利l e p t i t 公司经过多年合作成功地合成了新的半合成 口服利福霉素利福平( r i f a m p i c i n ) ，并广泛应用于结核病的i 临床治疗，与随后陆续 上市的利福定( r i f a n d i n ) 、利福喷汀( r i f a p m t i n ) 等品种一起成为临床上广泛使用的重 s 河南t 业大学硕l ：论文 要抗生素。1 9 8 0 年l i o 、n a g a o k a 和k i s h i 完成了安莎类抗生素的典型代表利福霉 素s 的全合成，这是8 0 年代在天然产物合成化学领域中取得的最大成就“。几个重要 的利福霉素的结构式见图1 1 “”。 啦o n f a m y c i ns v i m 哪i n o 耐a m y c i n b 图1 - 1 几个重要的利福霉素的结构式 利福霉素的生物合成是从七碳氨单位开始的由两个乙酸单位和八个丙酸单位在i 型 聚酮酶( p k s ) 的作用下的聚酮装配“，3 氨基5 。羟基苯甲酸是生物合成利福霉素芳基部 分“c 7 n ”的直接前体。8 脱氧利福霉素w ( p r o t o r i f a m y c i ni ) 是利福霉素w 的一个直 接的生物合成前体物质，利福霉素w 是第一个分离到的利福霉素s 的前体，地中海拟 无枝酸菌( a m y c o l a t o p s i sm e d i t e r r a n e i ) 合成利福霉素s 后经修饰可生成各种利福霉素( 利 福霉素a 、b 、c 、d 、e 、s v 、l 、o 、y 、g 、r 、p 、q 和v e r d e ) ”。 焦瑞身等应用非活性突变株之阳j 的生化互补关系，并制定国产利福霉素的生化互补 图，将有助于进一步研究及阐明利福霉素的生物合成途径。利福霉素生物合成先从形成 3 氨基5 羟基苯甲酸开始，然后由3 氨基一5 一羟基苯甲酸辅酶a 依顺序和丙酸盐( p ) 和乙 酸盐( a ) 单位缩合，首先形成c 7 n 一丙酸盐一乙酸赫( c 7 n p a ) 。之后c 7 n p a p 缩合形成 6 利福霉素s v 高产菌株的选育 聚酮体型键，先形成原拌环霉素b ，原利福霉素i 进一步形成利福霉素w 。由此形成 利福霉素s 和s v ，最后通过修饰利福霉素s 和s v ，从而形成不同基团的最终产物。1 ， 见图1 2 。 r l 密吼 - 、， f c 7 n p a f p i - 、r lc , n f a f f fl - ic n p a f f f p a a f a a fl i l + h 肇霉囊 l 鬣袢环霉素b - - 甄利福霉l l _ 一 利桐霉蒜o 利栅霉素s + 利椭霉藉w tl 利粕霉寮b 利桐霉豢y ti + 一 科相茸素s v t 剃橱霉豢l p 丙酸盐单似一甲桀丙酰c o aa 己疆盐单位一丙：酰c o a 图i - 23 - 氨基- 5 - 羟基苯甲酸作为前体，生物合成利福霉素的可能途径 7 嚣呐 ， 氏。各 孵 瞅 一 一卜 一阵 河南t 业大学硕t 论文 1 2 3 利福霉素的代谢调控 近年来由于应用生物化学和遗传学原理，深入研究了生物合成代谢途径以及代谢调 节控制的基础理论，人们可以通过定向选育某种特定的突变型，以达到大量积累有益产 物的目的，即所谓代谢控制育种。代谢调节控制育种通过特定突变型的选育，达到改变 代谢通路、降低支路代谢终产物的产生或切断支路代谢途径及提高细胞膜的透性，使代 谢流向目的产物积累方向进行。 利福霉素属于安莎类抗生素，其结构由安莎链和发色基团组成。3 氨基一5 羟基苯甲 酸( c ，n ) 是利福霉素生物合成七碳起始单位的直接前体，来自莽草酸途径。c ，n 的生物 合成受三种末端芳香族氨基酸( t r p ，p h c ，t y r ) 的调节，其中色氨酸的抑制作用最强，苯丙 氨酸和酪氨酸仅略有抑制作用，当三种氨基酸一起加入时，总的效应是三种单个氨基酸 抑制作用的迭加“”。 研究表明芳香族化合物的作用部位是莽草酸途径第一个酶，即d a h p 合成酶h 8 1 ； 该酶不仅在芳香族氨基酸的生物合成中，而且在利福霉素生物合成中都起着关键作用， 芳香族氨基酸抑制该酶活性，从而抑制c 7 n 和利福霉素的生物合成。 利福霉素芳香i ；i 体( c ，n ) 的结构类似物对氨基苯甲酸( p a b a ) 、对羟基苯甲酸 ( p h b a ) ，邻氨基苯甲酸( a n a ) 等对c 7 n 的生物合成有抑制作用，尤其是对羟基苯甲酸 ( p h b a ) ，邻氨基苯甲酸( a n a ) 的抑制作用更为强烈，在0 0 5 浓度下，几乎全部抑制 了利福霉素的生物合成“”。 利福霉素的生物合成过程中，利福霉素s v 对c 7 n 的生物合成有反馈抑制作用。 c 7 n 生物合成大致过程和它的反馈调节见图l 一3 “”。 f - 4 4 i4 - 礴黯七算篇；p e p ：蕾蝻肆武忑奢醵：d | 、 伊 牲鬟d 纠拉协魔抡t 7 一 量d o ，啦钮士魁麓id s 能量莽纂麓【s j 荐罩麓；( ) i 箭挂麓 图1 - 3c t n 生物合成大致过程和它的反馈调节 利福霉素s v 高产菌株的选育 1 3 本论文的主要内容 ( 一) 从原始菌株中筛选诱变出发菌株： ( 二) 确定所选取的多种诱变剂诱变的最佳诱变处理剂量： ( 三) 确定原生质体制备和融合的最佳条件； ( 四) 以最佳诱变处理剂量对诱变出发菌株进行诱变； ( 五) 对诱变后的突变菌株进行药物耐性筛选，并经过初筛和复筛确定高产菌株； ( 六) 对高产菌株进行发酵培养基配方进行调整和优化； ( 七) 对高产菌株进行传代稳定性试验，确定是否可应用于生产。 9 河南t 业大学硕b 论文 2 1 实验材料 2 1 1 原始出发菌种 第二章材料与方法 利福霉素s v 生产菌：地中海拟无枝酸菌a m y c o l a t o p o s i sm e d i t e r r a n e i l 7 7 ( 发酵单 位：5 2 8 6 # g m 1 ) ，由河南南街村药业集团制药有限公司提供。 鉴定菌：藤黄八叠球菌。 2 1 2 培养基 ( 1 ) 斜面琼脂平板培养基( ) ：蔗糖3 0 ，蛋白胨0 5 ，k c l 0 0 5 ，f e s 0 4 0 0 0 1 ， k h 2 p 0 4 0 1 ，m g s 0 4 7 i - 1 2 0 0 0 5 ，琼脂1 8 ，p h 7 0 。 ( 2 ) 液体培养基：o 5 甘氨酸，其余同斜面培养基，不含琼脂。 ( 3 ) 种子培养基( ) ：葡萄糖2 0 ，豆饼粉1 0 ，蛋白胨1 0 ，k f l 2 p 0 4 0 o l ，k n 0 3 0 0 5 。 ( 4 ) 发酵培养基( ) ：葡萄糖1 1 0 ，鱼粉o 5 ，豆饼粉1 0 ，k n 0 3 0 8 ，k h 2 p 0 4 0 0 2 ， c a c 0 3 0 5 ，氯化钴3 腭m l 。 ( 5 ) 再生培养基( ) ：蔗糖l o 3 ，葡萄稽1 0 ，聚胨0 4 ，酵母膏0 4 ，k c l 0 0 5 ， m g c l 2 6 h 2 0 0 8 1 ，c a c l 2 2 h 2 0 0 2 2 ，k i - 1 2 p 0 4 0 0 2 ，t e s 缓冲液，琼脂1 8 ，p h 7 2 。 ( 6 ) p 缓冲液m 1 2 1 3 培养条件 1 、琼脂平板培养条件 培养温度2 8 ，相对湿度3 0 - - 6 0 ，培养周期1 2 1 5 d 。 2 、斜面培养条件 培养温度2 8 c ，相对湿度3 6 - - 6 0 ，培养周期7 d 。 3 、种子瓶培养条件 培养温度2 8 c ，装量2 5 m l 2 5 0 m l ，摇床转速2 2 0 r p m ，培养时间4 8 h 。 4 、液体培养条件 同种子瓶培养条件。 0 利福霉素s v 高产菌株的选育 5 、发酵瓶培养条件 培养温度2 8 。c ，装量2 5 m l 2 5 0 m l ，摇床转速2 2 0 r p m ，接种量5 ，培养时间1 3 2 h 。 2 1 4 主要试剂 试剂名称药品纯度 赫酸 分析纯 氢氧化钠 分析纯 碳酸钠分析纯 l 一色氨酸 分析纯 邻氨基苯甲酸( a n a )分析纯 利福霉素s v 2 1 5 主要实验仪器设备 设备、仪器名称 p h s - - 2 5 型p h 计 7 5 1 分光光度计 z p 9 6 旋转摇瓶机 t d l - 4 0 b 型低速台式离心机 x h c 旋涡混合器 x s p b m 系列生物显微镜 s a r t o r i u s 电子天平 b c d - - 2 8 6 e 型低温冰箱 2 2 实验方法 2 2 1 分析方法 1 、还原糖的测定 采用菲林试剂法哪! 。 2 、氨基氮的测定 采用甲醛法1 。 3 、p h 值的测定 生产厂家 洛阳化学试剂厂 洛阳化学试剂厂 洛阳化学试剂厂 上海康达氨基酸厂 中国医药集团上海化学试剂公司 河南南街村药业集团制药有限公司 生产厂家 上海雷磁仪器厂 上海分析仪器厂 四川长征制药厂 上海安亭科学仪器厂 江苏省会坛市医疗仪器厂 上海彼爱姆光学仪器制造有限公司 北京赛多利斯天平有限公司 中国海尔集团公司 河南t 业大学硕e 论文 用p h 计测定。 4 、菌丝生长量的测定 用菌丝干重法侧。 2 2 2 利福霉素s v 生产菌发酵单位的测定 用分光光度法测定。 2 2 3 菌丝悬浮液的制备方法 取菌丝处于生长对数期的新鲜斜面，加入8 m 1 0 8 5 已灭菌的生理盐水( 如果使用 化学诱变剂诱变时需要在缓冲环境中进行，则将生理盐水换成相应的缓冲液) ，轻轻的 将菌丝刮下，连同盐水转入一灭菌的不锈钢管，内置灭菌石英砂，塞上口置于6 0 w 的 旋涡混合器上处理2 0 m i n ，将菌丝体破碎成小段，后用1 6 层无菌擦镜纸过滤，所得滤 液即为菌丝悬浮液，经血球板计数确定细胞浓度为1 0 7 1 0 8 。 2 2 4 原生质体融合 2 2 4 1 原生质体制备 挑活化斜面菌体于液体培养基中，2 8 ，2 2 0 r m i n 培养2 d ，取生长处于中后期的菌 体制成菌丝悬浮液，血球板计数。离心( 3 0 0 0 r m i n ，1 0 m i n ) ，弃上清液，用无菌水沈涤、 离心2 3 次，再用p 缓冲液洗涤1 次，加入等体积溶菌酶溶液，3 0 c 摇动处理，镜检无 丝状体或成呈球状后，离心，p 缓冲液洗涤一次。“。 2 2 4 2 原生质体形成率的计算 未经过酶解的菌丝悬浮液血球板计数，酶解完毕得到的悬浮液用无菌水稀释，使原 生质体破裂，剩下未破壁的完整细胞，适当稀释后吸取o 2 m i 均匀涂布琼脂平板，培养 长出菌落后计数。 原生质体形成率的计算公式： 原生质体形成率( ) ：丛；墨。1 0 0 公式( 2 1 ) 川 式中：n 一未经过酶解的菌丝悬浮液镜计数，个； n ，一用无菌水稀释后培养长出菌落数，个。 1 2 利福霉素s v 高产菌株的选育 原生质体形成率受到酶浓度、处理时的温度和酶处理时间等多因素的影响，通过原 生质体形成率来确定酶解所需的酶浓度、处理温度和酶处理时间等因素。 2 2 4 3 原生质体再生率的计算 经过酶解的原生质体悬浮液用p 缓冲液适当稀释后，吸取0 2 m l 均匀涂布完全培养 基，培养长出菌落后计数。 原生质体再生率的计算公式： 原生质体再生率( ) ：n z - n , 1 0 0 公式( 2 2 ) 一j 】v 1 式中：n 一同上；n 1 一同上； n 2 一用p 缓冲液稀释后培养长出菌落数，个。 原生质体再生率同样也受到原生质体制备条件的影响，通过原生质体形成率和再生 率确定原生质体制备的最佳条件。 2 2 4 4 双灭活标记 热灭活标记：吸l 2 m l 已去壁呈球状的原生质体置于4 7 , , - 5 5 恒温水浴中处理 1 1 5 h ，涂布计数。 紫外灭活标记：吸l 2 m l 已去壁呈球状的原生质体于平皿中置于紫外灯( 3 0 w ) 下，静 态照射5 - 9 0 m i n ，涂布计数”1 。 2 2 4 5 原生质体的融合与再生 将标记好的两亲本原生质体等量混合于大试管，加入适量预热的聚乙二醇( p e g ) 助融，振荡均匀后2 0 。c 静置处理1 0 - - 1 5 m i n ，立即用再生培养基稀释4 - - 一5 倍，以低速离 心( 1 0 0 0 r m i n ，5 m i n ) 除去p e g ，沉淀重新悬浮，然后分离在完全培养基上，再生细胞 壁，最终成为完整细胞”。 2 2 4 6 融合率的计算 数。 融合子在完全培养基上长成菌落后计数，即为两亲本原生质体融合得到的融合子 融合率( ) = 融合后长成菌落数融合前原生质体数1 0 0 公式( 2 3 )