（食品科学与工程专业论文）琼脂明胶协同法固定化酪氨酸酶的研究.pdf

上海海洋人学硕士学位论文 琼脂一明胶协同法固定化酪氨酸酶的研究 摘要 酪氨酸酶( t y r o s i n a s e ) 是多酚氧化酶的一种，广泛存在于植物、 动物和微生物中，该酶具有重要的生理生化特性，在食品、精细化工、 医药、环境工程等领域具有广泛的应用，如苹果汁脱除酚类，污水处理 等。近年来，国内外对该酶固定化的研究越来越多，但固定方法成本 高、效率低、稳定性比较差，开发出简便、实用的固定方法以及新型 固定载体材料成为当前研究的首要任务。而海藻酸钠、琼脂、明胶等 作为一种天然高分子载体材料，因其安全、环保以及工艺方面的优良 性已广泛应用于酶的固定化，所以利用它们来固定酪氨酸酶成为可能。 本论文研究之一是从海藻酸钠等五种载体中筛选出最佳固定载体，并 优化其固定化条件和固定化酶的反应条件，为进一步改进酶固定化的 生产工艺提供了实验依据。研究之二是将琼脂、明胶组合，协同固定 化酪氨酸酶的探究，为新型固定化载体的开发利用打下了基础。 1 最佳固定载体的选择 琼脂是五种材料中固定效果最好的载体，固定化酪氨酸酶的活力 回收率达到8 7 9 。首先利用包埋法和交联法对五种载体材料进行实验 上海海洋大学硕士学位论文 分析，得到固定化酶的活力回收率，分别为海藻酸钠：8 0 9 、卡拉胶： 5 0 2 、明胶：6 2 2 、壳聚糖：3 8 3 、琼脂：8 7 9 。结果表明：琼 脂和海藻酸钠固定化酪氨酸酶的活力回收率相对较高；接着对海藻酸 钠和琼脂固定化酪氨酸酶进行全面的比较分析，综合考虑p h 、温度、 重复使用次数和贮存稳定性等因素，研究固定化酪氨酸酶的反应工艺 参数。结果显示：酪氨酸酶经固定化后，能保留较高的酶活性，具有 较广泛的p h 值作用范围、较好的重复使用性与反应稳定性、较长的贮 存时间。但是琼脂在固定化酶的反应条件：p h 值作用范围、温度变化 范围、重复使用次数和贮存稳定性等方面更优于海藻酸钠，且在最佳 条件下海藻酸钠固定化酶的活力回收率只有7 5 o ，而琼脂固定化酶的 活力回收率达到8 7 9 。所以笔者选择琼脂作为酪氨酸酶的最佳固定化 载体。 2 琼脂一明胶协同固定酪氨酸酶的研究 为了开发出成本低、效率高、稳定性好的固定化载体，笔者将琼 脂和明胶两种天然高分子环保材料进行组合，采用包埋法协同固定酪 氨酸酶，与单独的琼脂包埋法进行比较，并对固定化酶的酶学性质进 行研究，得出较好的固定化载体和最优固定化酶的工艺条件。结果表 明：3 的琼脂、8 的明胶与酶液在4 条件下固定化2 h 得到较好的固 定化酶，同时固定化酶在在p h 为7 0 、温度为4 0 c 的条件下，前四次 1 1 上海海洋大学硕士学位论文 反应中酶活保存率均达到9 0 以上，在连续使用1 0 次后其相对酶活力 仍保留6 8 9 ，2 4 d 后该固定化酶的残余活力保留原酶活性的7 0 4 ， 酶活损失不大。琼脂一明胶协同固定法与单独的琼脂、明胶作为载体法 进行比较，它不仅具有后者体系中的诸多优点，同时该方法得到的固 定化酶比使用后者得到的固定化酶具有更好的温度敏感性、更好的反 应稳定性和更好的贮存稳定性，具有较长的使用寿命。所以该方法制 得的固定化酪氨酸酶可以广泛的应用于酶固定化的工业生产，具有较 好的工业应用前景；同时也为新型酶固定化载体的开发利用打下了基 础。 酪氨酸酶是一种多酚氧化酶，和我们的日常生活密切相关，同时固 定化酶是二十世纪六十年代后期迅速发展起来的一项新技术，近几年 受到广泛的关注，笔者首次研究用琼脂一明胶协同固定法处理酪氨酸 酶，取得了较好的结果，并使固定化的酪氨酸酶有望应用于酶固定化 的工业生产，为进一步改进酶固定化的生产工艺提供了实验依据。同 时，随着近年来酶生物传感器的研究发展，本实验也为酶在电极上的 固定打下了基础，对传统固定化酶制剂在多种领域中应用的拓展与开 发新型酶固定化载体的研究，是一种有益的尝试。 关键词：酪氨酸酶，琼脂，明胶，包埋法，固定化 i i i 上海海洋大学硕十学位论文 i m m o b i l i z a t i o no ft y r o s i n a s ei na g a r - g e l a t i n a b s t r a c t t y r o s i n a s ei sat y p eo fp o l y p h e n o lo x i d a s e ，a n di sw i d e l yf o u n di n p l a n t s ，a n i m a l sa n dm i c r o o r g a n i s m s t h ee n z y m e h a sa n i m p o r t a n t p h y s i o l o g i c a la n db i o c h e m i c a lc h a r a c t e r i s t i c s ，w h i c ha c c o u n t sf o ri t sw i d e a p p l i c a t i o n s i nt h ef o o d ，f i n ec h e m i c a l s ，m e d i c i n e ，e n v i r o n m e n t a l e n g i n e e r i n ga n do t h e rf i e l d s ，s u c h a sr e m o v a lo fp h e n o l i ca p p l ej u i c e ， s e w a g et r e a t m e n ta n ds oo n i nr e c e n ty e a r s ，w o r l d w i d er e s e a r c h e so nt h e e n z y m ei m m o b i l i z a t i o nh a v eb e e ni n c r e a s i n g ，b u tm a n yp r o b l e m s s t i l l r e m a i nt ob er e s o l v e d ，l i k eh i g hc o s t so fi m m o b i l i z a t i o n ，l o we f f i c i e n c y ， p o o rs t a b i l i t y t od e v e l o pas i m p l e ，p r a c t i c a lm e t h o da n dt or i s en e w i m m o b i l i z a t i o nm a t e r i a l sh a v eb e c o m et h e p r i m a r y f o c u so fc u r r e n t r e s e a r c h a san a t u r a l p o l y m e rc a r d e rm a t e r i a l s ，w i t h i t s s a f e t y ， e n v i r o n m e n t a lp r o t e c t i o na n dt h ef i n ep r o c e s sc o n d i t i o n s ，t h es o d i u m a l g i n a t e ，a g a r ，g e l a t i n ，e t c ，h a v en o wb e e nw i d e l yu s e d i n e n z y m e i m m o b i l i z a t i o n ，s ot ou s et h e mt oi m m o b i l i z et y r o s i n a s ei sp o s s i b l e i nt h i s p a p e r ，o n es t u d yi st os c r e e no u tt h eb e s ti m m o b i l i z e dm a t e r i a lf r o mt h e f i v ec a r r i e r sa n dt o o p t i m i z e t h ei m m o b i l i z a t i o nc o n d i t i o n sa n dt o i v 上海海洋大学硕七学位论文 c h a r a c t e r i z et h ei m m o b i l i z e de n z y m e sr e a c t i o nc o n d i t i o n s a f t e rt h a tw e c o m b i n ea g a ra n dg e l a t i nt oi m m o b i l i z et y r o s i n a s e ，t oi n d i c a t eh o wt h e c o m b i n a t i o no ft w op o l y m e r sw o r k 1 s e l e c t i o no ft h eb e s ti m m o b i l i z a t i o nm a t e r i a l o u rs t u d yf o u n dt h a ta g a ri st h eb e s tm a t e r i a la m o n gf i v ef i x e d c a r r i e r s a g a r a l g i n a t e ，a n dt h ei m m o b i l i z e dt y r o s i n a s e sa c t i v i t y r e c o v e r yr e a c h e s8 7 9 f i r s t ，t y r o s i n a s ew a si m m o b i l i z e dw i t hf i v ec a r t i e r m a t e r i a l sa n db ye m b e d d i n gm e t h o da n dc r o s s - l i n k i n gm e t h o dr e p e c t i v e l y t h ea c t i v i t i e so fi m m o b i l i z e dt y r o s i n a s ew e r ea n a l y z e d t h er e s u l t sa r e s o d i u ma l g i n a t e ：8 0 9 ，c a r r a g e e n a n ：5 0 2 ，g e l a t i n ：6 2 2 ，c h i t o s a n ： 3 8 3 ，a g a r ：8 7 9 t h i ss h o w st h a tt h ei m m o b i l i z e dt y r o s i n a s ei na g a r a n ds o d i u ma l g i n a t eh a v er e l a t i v e l yh i g hr e c o v e r yr a t e t h e nd e t a i l e d c o m p a r a t i v ea n a l y s i sw a sc o n d u c t e do nt y r o s i n a s e si m m o b i l i z e dw i t ha g a r a n ds o d i u ma l g i n a t er e s p e c t i v e l y i n c l u d e st o l e r a n c eo fp h ，t e m p e r a t u r e ， r e u s ef a c t o r sa n d s t o r a g es t a b i l i t y , w h i c h a r e i m p o r t a n tw o r k i n g p a r a m e t e r s o fi m m o b i l i z e d t y r o s i n a s e t h e r e s u l t ss h o wt h a tt h e i m m o b i l i z e dt y r o s i n a s er e t a i n sah i g ha c t i v i t y , w i t haw i d e rr a n g eo fp h ， b e t t e rr e - u s eo fa n dq u i t es t a b l e ，l o n g e rs t o r a g et i m e b u ti nt e r m so f o p t i m a lp hr a n g e ，t e m p e r a t u r er a n g e ，r e p e a tf r e q u e n c yo fu s ea n ds t o r a g e s t a b i l i t y , t h ei m m o b i l i z e dt y r o s i n a s ei na g a ri s b e t t e rt h a ni ns o d i u m v 上海海洋大学硕+ 学位论文 a l g i n a t e ，a n du n d e rt h eo p t i m a lc o n d i t i o n s t h e a c t i v i t yr e c o v e r yo f i m m o b i l i z e de n z y m ei ns o d i u ma l g i n a t ew a so n l y7 5 o ，w h i l et h ea c t i v i t y r e c o v e r yo fi m m o b i l i z e de n z y m ei na g e rr e a c h e s8 7 9 s o ，t h ea u t h o r c h o o s e sa g a ra st h eb e s ti m m o b i l i z e dm a t e r i a l 2 a g a r - g e l a t i nc o l l a b o r a t i v es t u d yo nt h ei m m o b i l i z e dt y r o s i n a s e i no r d e rt o d e v e l o pal o w c o s t ，h i g he f f i c i e n c ya n dg o o ds t a b i l i t y i m m o b i l i z e dc a r r i e r , t h ea u t h o rc o m b i n e sa g a ra n dg e l a t i nt o g e t h e r , t w o k i n d so fe n v i r o n m e n t a lf r i e n d l yn a t u r a lp o l y m e r s ，t oi m m o b i l i z et y r o s i n a s e u s i n ge m b e d d i n gm e t h o d c o m p a r i n gw i t ht h ea g a r a l o n ee m b e d d i n g m e t h o d ，a n ds t u d y i n gt h ec h a r a c t e r i s t i c so ft h ei m m o b i l i z e de n z y m e s ，w e o b t a i n e dt h eo p t i m a li m m o b i l i z a t i o nc a r d e rc o m p o s i t i o n sa n dt h eo p t i m a l c o n d i t i o n sf o re n z y m ei m m o b i l i z a t i o np r o c e s s t h er e s u l t ss h o wt h a tt h e b e s ti m m o b i l i z e dt y r o s i n a s ew a so b t a i n e di n 3 a g a ra n d8 g e l a t i n c o m p o s t i o n , a t4 cf o r2h o u r s i t se n z y m ea c t i v i t yi nt h ef i r s tf o u rr e a c t i o n c y c l e sr e a c h e dm o r et h a n9 0 u n d e rt h ec o n d i t i o n so fp h7 0 ，t e m p e r a t u r e 4 0 。c ，a n di t sr e l a t i v ee n z y m ea c t i v i t yr e t a i n e d6 8 9 a f t e ru s i n g10t i m e s ， t h er e s i d u a la c t i v i t yo ft h ei m m o b i l i z e de n z y m er e t a i n s7 0 4 a f t e r2 4 d ，s o t h el o s s e so ft h ei m m o b i l i z e de n z y m ea c t i v i t ya r ev e r yl o w c o m p a r i n g w i t ht h ei m m o b i l i z e dt y r o s i n a s ei na g a ro rg e l a t i na l o n e ，t h ei m m o b i l i z e d t y r o s i n a s ei na g a r - g e l a t i nn o to n l yh a sm a n ya d v a n t a g e so ft h ef o r m e r 上海海洋大学硕十学位论文 s y s t e m ，b u ta l s oh a sab e t t e rt e m p e r a t u r es e n s i t i v i t y , b e t t e rs t a b i l i t y , b e t t e r r e s p o n s et ot h es t o r a g es t a b i l i t ya n dl o n g e rs e r v i c el i f e t h e r e f o r e ，t h e i m m o b i l i z e dt y r o s i n a s eb yt h i sm e t h o dh a st h ep o t e n t i a lt ob ew i d e l y a p p l i e di ni n d u s t r i a lp r o d u c t i o n ，a n dl a y saf o u n d a t i o ni no r d e rt od e v e l o p a n du t i l i z ean e wi m m o b i l i z e dm a t e r i a l t y r o s i n a s ei sak i n do fp o l y p h e n o lo x i d a s e ，c l o s e l yr e l a t e dt oo u rd a i l y l i v e s ，w h i l ee n z y m ei m m o b i l i z t i o ni s an e wt e c h n o l o g y , h a sb e e n d e v e l o p e dr a p i d l yi nt h el a t es i x t i e so ft h et w e n t i e t hc e n t u r y , w i d e s p r e a d f o c u s e di nr e c e n ty e a r s w ee x p l o r e dt h ei m m o b i l i z a t i o no f t y r o s i n a s e w i t hc o m b i n e d a g a r - g e l a t i nm e t h o d ，a c h i e v e dg o o d r e s u l t s t h e i m m o b i l i z e dt y r o s i n a s ec o u l db eu s e di ni n d u s t r i a lp r o d u c t i o n ，a n dt h e s t u d yp r o v i d e sa ne x p e r i m e n t a lb a s i sf o rf u r t h e ri m p r o v i n gt h ep r o d u c t i o n p r o c e s so fe n z y m ei m m o b i l i z a t i o n a tt h es a m et i m e ，c o n c e r n e dw i t ht h e r e s e a r c ha n dd e v e l o p m e n to fe n z y m eb i o s e n s o ri nr e c e n ty e a r s ，t h i s e x p e r i m e n ta l s ol a y st h ef o u n d a t i o nf o rt h ee n z y m e t ob ef i x e do ne l e c t r o d e t h es t u d yw i l lb eh e l p f u li nt h ea p p l i c a t i o no ft h et r a d i t i o n a lf i x e d - e n z y m e p r e p a r a t i o ni nav a r i e t yo ff i e l d ，e x p a n s i o na n dt h ed e v e l o p m e n to f n e w e n z y m ei m m o b i l i z a t i o nc a r t i e r k e y w o r d s ：t y r o s i n a s e ，a g a lg e l m i l l ，e m b e d d i n g ，i m m o b i l i z a t i o n v i l 上海海洋大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位 论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除 文中已经明确注明和引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集 体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰写，我 对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：霹三三 日期：如f 。年弓月1 日 上海海洋大学学位论文版权使用授权书 学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定， 同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子 版，允许论文被查阅或借阅。本人授权上海海洋大学可以将本学位 论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、 缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密 口 ，在年解密后适用本版权书。 本学位论文属于 不保密曰 学位论文作者签名：蘑三三 日期：日fo 年弓月j 日 指导教师签名：袁逸蒙 日期：矽戽弓月f 日 上海海洋人学硕十学位论文 引言 酪氨酸酶( e c1 1 4 1 8 1 ；t y r o s i n a s e ，简称t y r ) 是由二价铜 离子与酶蛋白结合的金属酶，是多酚氧化酶( e c1 1 4 1 8 1 ；p o l y p h e n o l o x i d a s e ，简称p p o ) 的一种n 2 1 ，广泛存在于植物、动物和微生物中豳3 ， 其结构复杂，同时也是黑素合成的关键酶，限速酶h 3 。由于多酚氧化 酶廉价易得，作用底物范围广，应用领域多，因而在有机合成上具有 重要应用价值。在有机合成中，不但可以利用多酚氧化酶选择性羟基 化的能力，对含有苯酚结构的化合物进行定向修饰；也可以利用多酚 氧化酶催化反应生成的邻醌结构作为活泼中间体合成新的化合物畸吖3 。 在不同的生物体内酪氨酸酶具有各异但却都有很重要的功能。由于该 酶与色素障碍性疾病、恶性黑色素瘤、白化病和老年性痴呆等很多种 疾病的治疗有密切的关系，多年来，国内外主要集中在医药方面对该 酶进行结构功能的基础研究鹏瑚3 。随着现代经济的快速发展，人们生活 水平越来越高，同时对自身的健康问题也越来越重视，这就要求生活 中的各个方面都符合人类身体的需求。但是，近年来，发现很多食品、 药品、化妆品等领域中人为添加的多酚含量越来越高，对人类的健康 造成了严重的威胁，要严格检查并禁止这种破坏人类健康的行为发生， 这就与酪氨酸酶直接相关，因此，国内外对该酶的研究也越来越重视， 上海海洋人学硕士学位论文 如何高效的利用酪氨酸酶成了研究者们关注的热点。 游离酶在工业化应用时稳定性较差，易受外界因素的影响，发生 变性失活；反应结束后，即使酶有很高活力，也难于回收利用，同时 反应后酶与产物混在一起，给产物的分离纯化带来一定困难n0 | ，这在 一定程度上限制了酪氨酸酶的工业化应用。酶的固定化可解决上述问 题，与游离酶相比，固定化酶可以较长时间内反复分批反应和装柱连 续反应，从而能提高酶的使用效率，增加产物的收率，降低生产成本； 在反应完成后，固定化酶极易与底物、产物分开，简化了提纯工艺， 提高了产物的质量口1 j ，所以国内外对该酶固定化的研究越来越多，但 真正投入工业化应用的固定化酶很少，主要原因是固定化成本高、效 率低、稳定性比较差，因此，必须开发出简便、实用的固定化方法以 及新型的固定载体材料，以拓展固定化酶制剂在多种领域中的应用。 而海藻酸钠、琼脂、明胶等作为一种天然高分子载体材料，因其安全、 环保以及工艺方面的优良性己广泛应用于酶的固定化n 2 j3 i ，所以利用 它们来固定酪氨酸酶成为可能。研究酪氨酸酶的最佳固定化载体并优 化其固定化条件和固定化酶的反应条件就是本课题的主要研究内容。 固定化酶是二十世纪六十年代后期迅速发展起来的一项新技术 n 4 l 。由于有比游离酶众多的优势，广泛应用于工业生产、医学、环保 等领域，越来越受到人们的重视n 副。从1 9 7 0 年代初开始酶的固定化技 术研究发展很快，至1 9 8 0 年代初，每年约发表10 0 0 篇以上的文献和 上海海洋人学硕士学位论文 近2 0 0 篇专利，所报道的固定化方法达1 0 0 种以上口引。酶的固定化是 指采用有机或者无机固体材料作为载体，利用化学或物理手段将游离 酶定位于限定的空间区域包埋起来或束缚、限制于载体的表面和微孔 中，并使其保持催化活性和可回收及反复使用的一种酶化学方法与技 术n 7 “8 | 。不使用固体材料作为载体，通过酶分子之间的相互交联形成 聚集体，也可将酶固定化，称为无载体酶固定化。上世纪九十年代初 报道的交联酶晶体( c r o s s - - l i n k e de n z y m ec r y s t a l s ，c l e c ) 就属于无 载体固定化酶n 9 、2 0 1 。 目前己报道的酶固定化方法主要有吸附、包埋和交联法等晗u 。 吸附法是通过物理或化学过程，使载体表面和酶分子表面间的次 级键相互作用将酶担载到非水溶性载体上而达到固定目的的方法乜2 七3 | 。 它只需将酶液与具有活泼表面的吸附剂接触，再经洗涤除去未吸附的 酶便能制得固定化酶，是最简单的固定化技术，在经济上也最具有吸 引力。此法的优点是操作简单，可供选择的载体类型多，吸附过程可 同时达到纯化和固定化的目的，所得到的固定化酶使用失活后可以重 新活化和再生。缺点是酶和载体的结合力不强，会导致催化活力的丧 失和沾污反应产物；经验性强。根据结合形式不同，吸附法可分为离 子结合法、物理吸附法和共价结合法。 包埋法，顾名思义，是将酶物理包埋在高聚物网格内的固定化方 法。( 如将聚合物的单体和酶溶液混合后，再借助聚合促进剂的作用进 上海海洋大学硕士学位论文 行聚合，将酶包埋于聚合物中以达到固定化的目的) 。包埋法可分为网 络型和微囊型两种。前者是将酶包埋于高分子凝胶细微网络内；而后 者是将酶包埋在高分子半透膜中制备成微囊型。包埋法一般不需要与 酶蛋白的氨基酸残基进行结合反应，很少改变酶的空间构象，酶活回 收率较高，因此可以应用于许多酶的固定化。有人把明胶和海藻酸钠 的聚合作用与海藻酸钙凝胶球的包埋作用相结合，将贝壳状革耳菌漆 酶制成固定化漆酶。结果表明固定化漆酶耐热性、贮藏稳定性和操作 稳定性均有明显提高乜钊。包埋法的优点在于它是一种反应条件温和、 很少改变酶结构但是又较牢固的固定化方法。包埋法的缺点是只有小 分子底物和产物可以通过高聚物网架扩散，对那些底物和产物是大分 子的酶并不适合。这是由于高聚物网架会对大分子物质产生扩散阻力 导致固定化酶动力学行为改变，使活力降低。 交联法的基本原理是酶分子和多功能试剂之间形成共价键得到三 向的交联网状结构。交联法是利用双功能或多功能试剂在酶分子间、 酶分子与惰性蛋白间或酶分子与载体间进行胶联反应，把酶蛋白分子 彼此交叉连接起来，形成网络结构的固定化酶。除了酶分子之间发生 交联外，还存在一定的分子内交联，根据使用条件和添加材料的不同， 可制备不同物理性质的固定化酶。能起交联作用的试剂很多，但目前 常用的交联试剂是戊二醛和双耦联苯胺一2 ，2 一二磺酸。x i a o 瞳副等以戊 二醛为交联剂，利用反相悬浮法制备壳聚糖微球固定血红密孔菌漆酶， 上海海洋火学硕士学位论文 实现了生产工艺和检验操作的连续化和工业化。此法的优点是酶之间 连接牢固，具有良好的稳定性及重复使用性，缺点是有时难以很好的 控制反应条件，反应剧烈时，常常引起酶蛋白的高级结构发生变化， 并导致活性中心受到破坏，从而难于保证每次都能制得高活力的样品。 交联法常与吸附法结合使用，或者与包埋法配合，目的是使酶紧紧地 结合于载体上。 以上介绍的几种酶的固定化方法可以用下面的图示来形象的表 示。 h )5 )t 6 常见的酶固定化方法示意图 c o m m o nm e t h o d so fe n z y m ei m m o b i l i z a t i o n 2 6 】 ( 1 ) i o n i ca d s o r p t i o n ( 2 ) c o v a l e n ta t t a c h m e n t ( 3 ) c r o s s l i n k i n g 、i t l lr e a g e n t ( 4 ) p o l y m e re n t r a p m e n t ( 5 ) m i c r o e n c a p s u l a t i n gw i t hl i p i db i l a y e rm e m b r a n e s ( 6 ) l i p o s o m ee n t r a p m e n t 总之，酶可以通过不同的固定方法进行固定化，但是任何一种固 上海海洋火学硕士学位论文 定化载体和固定化方法，都不可能适用于所有的酶。对于不同的酶， 要想获得较好的固定化效果，制备出性能最佳的固定化酶，必须根据 具体的酶和催化反应类型，选择合适的固定化方法和载体来提高酶的 活性和稳定性，具体采用哪种固定化方法还是要依据酶本身的性质瞳引， 没有现成的规律可循，只能依赖于实验经验的积累，最后以是否能最 大限度地保留酶的活性和提高酶的稳定性为评价标准。本次实验采用 包埋法和交联法固定化酪氨酸酶，载体材料选择海藻酸钠、明胶、卡 拉胶、壳聚糖和琼脂，交联剂使用戊二醛。 海藻酸钠( s o d i u ma l g i n a t e ) ，是从海洋褐藻中提取出来的一种天 然多糖类物质，主要由海藻酸的钠盐组成。此天然高分子材料因其安 全、环保以及优越的稳定性、溶解性、粘性和安全性等工艺性能，被广 泛应用于食品酶工程n 3 3 、生物移植2 8 | 、药物释放凹1 及组织工程3 0 3 等 诸多领域，是一种近年来深受重视的酶固定化及生物医用材料。作为载 体，它是由b 一( 1 ，4 ) 一d 甘露糖醛酸( m ) 和q 一( 1 ，4 ) 一l 古洛糖醛酸( g ) 组成的线性高聚物b 1 | ，可被多价离子c a 2 + 、a 1 3 + 瞬时凝胶化，形成热不 可逆凝胶，凝胶可以在室温或任何高于1 0 0 的温度条件下形成，加热 也不融化，将酶物理包埋在高聚物网格内以达到固定化的目的，这就 是包埋法固定化酶呤2 1 ，它可以在温和条件下实现对酶的固定，有助于 保持酶的生物活性b 3 | 。 明胶( g e l a t i n ) 是一种从动物的结缔或表皮组织中的胶原部分水 上海海洋人学硕士学位论文 解出来的蛋白质。是一种无味、无色( 略带浅黄色) 、半透明、坚硬的 非晶态物，不溶于有机溶剂，吸水性强、粘度高，可溶于热水，形成 热可逆性凝胶，具有优良的胶体保护性、表面活性、粘稠性、成膜性、 稳定性和水易溶等物理化学特性，因此明胶是一种重要的食品添加剂， 如作为食品的胶冻剂、稳定剂。由于明胶的优良特性，它被广泛用于 纺织、印刷、印染、塑料、电子、国防、航空等工业和部门中。明胶 作为天然高分子材料因其安全、环保以及工艺方面的优良性还被广泛 应用于酶的固定化方面。明胶是多肽链物质，它对酶或细胞的亲和性、 适应性等有着优越的条件，是其他凝胶材料所不及的。焦云鹏等4 3 利 用明胶固定化果胶酯酶，戊二醛作为交联剂，由于明胶的保护作用， 果胶酯酶稳定性明显增强。 卡拉胶( c a r r a g e e n a n ) ，也称鹿角菜胶、角叉菜胶和红藻胶，是从 红海中植物红藻中提取的一种天然多糖亲水胶，一般为白色或淡黄色 粉末，无臭，无味。它的水溶性很好，在7 0 。c 开始溶解，8 0 。c 完全溶 解。在钾离子存在下卡拉胶能生成热可逆凝胶，且形成的凝胶是热可 逆的，即加热凝胶融化成溶液，溶液冷却时又能形成凝胶。柯昌武等 人b 副利用卡拉胶的高凝固点固定化诺卡氏菌细胞，取得了较好的结果。 卡拉胶的稳定性非常好，即使长期放置也不会降低其凝胶强度和粘度， 在中性和碱性溶液中即使加热也不会水解。卡拉胶与其刺槐豆胶、魔 芋胶、黄原胶以及海藻酸钠等胶体共同使用时，可发挥显著的协同增 上海海洋大学硕士学位论文 效作用，能明显改变其凝胶特性，使凝胶富有弹性和保水性。何俊培 等人呤6 1 利用海藻酸钠和卡拉胶的混合胶体作为载体固定化乳糖酶，研 究通过筛选乳糖酶固定化的条件，获得了最佳工艺参数，为固定化乳 糖酶在乳品工业中应用提供了技术参考。作为凝胶剂、增稠剂、稳定 剂、悬浮剂和澄清剂、分散剂等，卡拉胶被广泛应用于食品，医药， 日用化工，生物化学，建筑涂料，纺织印染和农业等方面。同时还可 用作微生物载体和固定化细胞载体等。福建省石狮市闽南琼胶有限公 司是国内早期的天然海藻胶生产厂商，从事琼脂和卡拉胶的生产与服 务已有多年历史。 壳聚糖( c h it o s a n ) ，又称脱乙酰几丁质、聚氨基葡萄糖、可溶性甲 壳素，是从蟹、虾等甲壳动物废弃的外壳中提取的一种氨基多糖7 1 ， 由甲壳素经脱乙酰化反应转化变成的分子量为1 2 - - 5 9 万的生物大分 子。外观为原白色或灰白色、无定形、半透明、有珠光色彩的片状或 粉状固体，不溶于水和碱溶液，可溶于稀盐酸、硝酸等无机酸，以及 大多数有机酸。它来源丰富，制备简单，应用广泛。近年来壳聚糖及 其衍生物已多次应用于生物医学、医药、食品加工、膜化学、化妆品、 环保等行业中。主要是由于壳聚糖在蟹壳中与蛋白质及无机盐交织成 网状结构，在去除钙盐和蛋白质之后，其机械性能大为改善，而且化 学性质稳定，耐热性好，特别是其分子中存在的氨基，既易于与酶共 价结合，又可络合金属离子，使酶免受金属离子的抑制，同时又易通 上海海洋大学硕士学位论文 过接枝而改性。它是一种固定化酶的良好载体，引起了很多学者的重 视b 8 39 | 。申炳华等人心阳研究得出壳聚糖与戊二醛发生s c h i f f 反应， 再与酶发生s c h i f 反应制得的固定化酶活力最高。目前，在日本，以壳 聚糖及其衍生物作为固定化酶载体及扫描电镜观察包埋剂已进入实际 应用阶段h 。 琼脂( a g a r ) ，别名琼胶、洋菜。它由琼脂糖( a g a r o s e ) 和琼脂 果( a g a r o p e c t i n ) 两部分组成，其中琼脂糖是不含硫酸酯( 盐) 的非 离子型多糖，是形成凝胶的组分，其大分子链链节在l ，3 苷键交替地 相连的b d 一吡喃半乳糖残基和3 ，6 一q - l - 1 1 比喃半乳糖残基。工业上 的琼脂色泽由白到微黄，具有胶质感，无气味或有轻微的特征性气味。 琼脂为亲水性胶体，分有条状和粉末状，不溶于冷水，易溶于热水。 琼脂在工业上具有独特的重要性，它的浓度即使低至1 仍能形成相当 稳定的凝胶( 冻胶) ，是食品工业、化学工业、医学科研所必需之原料。 早前，琼脂已被美国食品药物管理条例列为公认安全的产品，获准作 为食品添加剂作为专题载入食品化学品药典之中。在食品工业的应用 中，琼脂被广泛应用于制造粒粒橙及各种饮料、果冻、冰淇淋、糕点、 软糖、罐头、肉制品、八宝粥、银耳燕窝、羹类食品、凉拌食品等， 主要是因为它具有一种极其有用的独特性质：凝固性、稳定性，能与 一些物质形成络合物等物理化学性质，同时可用作增稠剂、凝固剂、 悬浮剂、乳化剂、保鲜剂和稳定剂等。近几年，也因为它的诸多优点， 上海海洋大学硕士学位论文 琼脂被广泛用作酶的固定化材料。黄铃h 2 1 利用琼脂作为酶的固定化包 埋剂对q 一淀粉酶进行研究，结果显示该固定化酶具有较好的贮存及反 应稳定性，且操作简单、酶活损失较小。 本文研究之一是通过对以上五种载体材料的分析、比较，筛选出 最佳固定载体，并优化和筛选出酪氨酸酶的固定化条件和固定化酶的 反应条件，获得最佳工艺参数，为进一步改进酶固定化的生产工艺提 供了实验依据，同时也为固定化酪氨酸酶酶在工业中的应用提供技术 参考。 在过去的研究中，这几种载体材料多数都是单独使用，很少见到 有载体间的协同固定化，近几年来才见到有混合使用的少数报道，而 且从报道中可以看出载体间的协同作用对酶的固定化效果很好。徐国 英等口利用海藻酸钠和壳聚糖共同固定化漆酶，使漆酶耐热性增加， 操作稳定性增加。王爱玲等n 3 1 利用海藻酸钠和明胶协同作用固定化黑 曲霉脂肪酶，研究表明所合成的这种新型双子表面活性剂比分子结构 类似传统型单亲油基和单亲水基表面活性剂具有更高的表面活性。载 体间的协同作用除了具有单一体系的诸多优点外，还能够提供更大的 固定化空间，更有利于内外物质的扩散n 钊。本研究之二是在得到酪氨 酸酶的最佳固定化载体琼脂的基础上，参考海藻酸钠与明胶协同固定 化的方法，将琼脂和明胶混合，进行协同固定化酪氨酸酶的研究，对 其固定化条件及固定化酶学性质进行初步探讨，并与单独使用琼脂固 上海海洋大学硕士学位论文 定化方法比较其优劣势，为新型酶固定化载体的开发利用打下了基础。 从文献资料看，国内尚未有琼脂一明胶协同包埋法固定化酪氨酸酶 的研究报告或报道，本课题首次将该方法应用于酶固定化的生产和应 用研究。酪氨酸酶是一种多酚氧化酶，和我们的日常生活密切相关， 笔者研究首次用琼脂一明胶协同固定法处理酪氨酸酶，取得了较好的结 果，该方法可进一步应用于酶固定化的工业生产，为进一步改进酶固 定化的生产工艺提供了实验依据。同时，随着近年来酶生物传感器的 研究发展，本实验也为研究多酚氧化酶在电极上的固定打下了基础。 该研究对传统固定化酶制剂在多种领域中应用的拓展与开发新型酶固 定化载体等方面，是一种有益的尝试。 上海海洋火学硕士学位论文 1 材料 第一章酪氨酸酶固定化载体的选择 1 1 仪器 a l 2 0 4 型电子天平、f e 2 0 k 型p h 计，梅特勒一托利多仪器( 上海) 有限公司； u v - 1 8 0 0 p c 型紫外可见分光光度计，上海美谱达有限公司；i - 研s 1 2 型水浴锅，上海 一恒科技有限公司；璃江牌t d l - s a 型台式低速大容量离心机，金坛市城西丽华实 验仪器厂；h j - 3 恒温磁力搅拌器，江苏金坛市金城国胜实验仪器厂。 1 2 试剂 t y r ( 5 3 7 0 u m g ，5 0 k u ) ：s i g m a 公司，用0 1 m o l lp h 为7 0 的磷酸盐缓冲液( p b s ) 稀释至2 0 u m l ，一2 0 保存；邻苯二酚：s i g m a 公司；琼脂粉( b r ) ：国药集团化 学试剂有限公司；海藻酸钠、明胶、卡拉胶( k c a r r a g e e n a n ) 、壳聚糖：化学纯； c a c l ：、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、柠檬酸等试剂均为分析纯。 2 方法 2 1 t y r 的固定化 2 1 1 海藻酸钠法h 列 将一定质量分数的海藻酸钠和酶液混合，在3 0 。c 水浴中使其充分混匀后，用5 i i