（食品科学专业论文）微小毛霉产凝乳酶条件及酶性质的研究.pdf

中文摘要 微小毛霉产凝乳酶条件及酶性质的研究 专业：食品科学硕士研究生：王明强 指导教师张惟广副教授 中文摘要 凝乳酶在食品、医药、工业等行业应用广泛，是重要的工业用酶之一。在奶酪生产过程 中，它起着凝结牛乳、改善风味的作用。根据来源的不同，可将凝乳酶分为三类：动物凝乳酶、 植物凝乳酶和微生物凝乳酶。而利用微生物生产凝乳酶是目前最有前途的发展方向。因此，本 论文借鉴现有相关研究成果，以微小毛霉( 九，p 埘f 跏a s3 3 4 4 5 ) 为研究对象，采用i 古i 态 发酵技术，对菌株的产酶条件以及酶学性质进行了研究，以期为实际生产提供一定的理论依 据。主要研究结果如下： 1 对菌株a s3 3 4 4 5 进行纯化与复壮后。接种麸皮培养基，观察其产酶规律，发现菌株 在发酵4 d 后获得最大酶活。采刚水浸提法，探讨加水量、浸提时间对酶活的影响。结果表明， 发酵酶曲经8 0 m l 蒸馏水浸提1 5 h 后，可基本把凝乳酶浸提完全，而此时的酶活比先前提高了 2 3 。 2 对菌株的发酵培养基进行了优化。通过单因素实验，研究了不同碳源、氮源种类、酵 母粉、m g ”、k 2 h p 0 4 3 h 2 0 对菌株矧态发酵产凝乳酶的影响。实验结果表明，以麸皮为基质， 培养基中添加o 8 果糖、o 5 奶粉、o 4 k 2 h p 0 4 3 h 2 0 、o 2 m f + 和o 2 酵母粉。提高的 凝乳酶的活性。 3 对菌株的培养条件进行了优化，确定了最佳接种量为1 0 ，最佳固液比为1 ：1 2 ，最 佳装瓶量为2 0 9 ，最佳培养温度为2 8 ，最佳颗粒人小为2 0 目到4 0 目之间。 4 在单冈素的试验的基础上，利用响应面分析法优化了培养基中影响凝乳酶产量的主要 因素，得到了果糖( x i ) 、奶粉( x 2 ) 、嗣液比( x 3 ) 对凝乳酶产量( y ) 的回归方程： y = 1 4 5 7 3 8 0 十5 3 3 5 0 x l + 3 5 4 3 8 x 2 + 2 1 3 8 6 3 x 3 + 51 6 7 5 x i x 2 + 9 0 8 7 5 x l x 3 - 7 2 0 0 x 2 x 3 1 5 5 3 6 5 x l 1 4 8 4 4 0 x 2 2 2 2 3 9 4 0 x 3 2 根据响应值典型分析求得了果糖( x 1 ) 、奶粉( x 2 ) 、固液比( x 3 ) 的最佳组合依次为：1 0 4 两南人学硕十学何论文 o 5 8 、l ：1 0 2 ，与其对应的响应值( y ) 为1 4 7 3 3 s 吮。 5 研究了微小毛霉固态发酵产酶进程。在发酵过程中，发酵曲中凝乳酶和蛋白水解活性 的变化有一定的相似性，都在发酵4 d 后获得了最大酶活。且此时凝乳酶活力与蛋白水解活性 之比值最大，为2 1 7 5 。培养基基质p h 在发酵时间内中基本维持不变，而水分、还原糖含量 到最后都呈现下降趋势。 6 对肋c d ，刖s j - 嬲a s 3 3 4 4 5 凝乳酶的酶学性质研究结果表明：该酶耐酸性比耐碱性 强，在p h 5 4 7 8 之间，随着p h 值的降低，酶活增加，其最适温度为6 0 ；该酶在5 0 以 下，p h 5 8 范围内稳定。 关键词：凝乳酶微小毛霉固态发酵响应面分析法 a b s t r a c t s t u d vo n ， f a c t o r so fp r o d u c i n gt h em i1 kc l o t t i n ge n z y m ef r o m m 1 i t c o rp h s i l l t l s a n de n z y m ec h a r a c t e r i z a t i o n f o o ds c i e n c em a st e r ：w a n gm i n g q i a n g s u p e i s o r ：p r o z h a n gw j e i - g u 觚g a b s t r a c t t h em i l kc l o t t i n ge r l z y 腓i sa l li n l p o r t a j l to n eo ft l l ei n d 吣t r i a le n z y i i 圮sw i d e l y 印p l i e di i lf 0 0 d ， m e d i c i n ei n d u s 时a n do t h e rf i e l d 1 1 1c h e e s e - m a k i n g ，i tp l a y sai m p o n a n tr o l eo fc o n d e n s i i l gi i l i l k a n di m p r o v i n gn a v o r a c c o r d i n gt od i f 诧r e n ts o u r c e s ，t h er e 衄e tc a nb ed i v i d e di n t ot h r e ec a t e g o r j e s ： r e l m e te 1 1 z y m e 胁ma 1 1 i n m l ，p l a n ta 1 1 dm i c r o b e o fa l lm e 硼m e t 觚md i f f e r e n tw a y ，r e l m e t p r o d u c e df 如mm i c r o b eh 舔t h eb e s tf o r e g r o u n dt o 印p l yt od a i r yi n d u s n y t h e r e f o r e ，b 孤e do n s o m er e s e a r c hr e s u l t st om e n t i o na b o v e ，w i ma 缸c o rp 凇f 娌泌a s3 3 4 4 5a so b j e c t ，m i sp a p e rs t u d i e d t l ec o n d i t i o no fe n z y m e - p r o d u c i n g ，e 1 1 z y m ep r o p e r t i e sb ys o l i ds 组c ef e 册e n t a t i o n 锄df i e 嬲i b i l i t yt o s e r v ef o rp r a c t i c a lp r o d u c t i o n r e s u l t ss u m m a r i z e d 嬲f o l l o w m g ： 1 a r e rs 印a 豫t i o na n dr e j u v e n a t i o n ，t h es t a i na s3 3 4 4 5w a si i l o c u l a t e dm t ob 舯m e d i u mt o c u l t u r e t h r o u g ho b s e r v i n gt h el a w so fp r o d u c i n ge n z y m e ，i tw 弱f o u n dt h a tt i l es 觚i ng e th i 曲e s t e m 秒m ea c t i v i t ya n e rf o u rd a y a n dw ed i s c u s s e dt 1 1 ee f r e c to ft 1 1 ew a t e rv o l u m ea n de x 觚c t i o nt i m e o nt h ee n z y m ea c t i v i t yo b t a i n e db yw a t e re x t r a c tm e t h o d t h er e s u l t ss h o w e dt i l a tm ef e 咖e n t a t i o n r r 硷d i u me x t r a c t e db y8 0 m ld i s t i l l e dw a t e rl5hc a na l m o s tg e tt h ea l lr e 衄e t ，a ss 锄e 弱t h ew a yc a n i m p r o v et h ep r e v i o u se n z y m ea c t i v i t yi n c r e a s e db y2 3p e r c e n t 2 n eo p t i m i z a t i o no ff e r n l e n t a i o nm e d i ao ft l l es t a i r i 、v a sr e s e a r c h e d n ee 舵c to f 舭t o r s ( c a r - b o n 、n i t r o g e n 、y e 硒tp o w d e r 、m g z + 锄dk 2 h p 0 4 3 h 2 0e t c ) o nt i l ei l l i l kc l o t t 洫ge n z y m ep r o d u c t i o n w e r ei n v e s t i g a t e db a s e do n 吐l es i n 9 1 ef a c t o rt e s t i tw 硒f o u n dt 1 1 a tt i l ee n z y m ea c t i v i t yw a sa g 伊a i l d i z - c dw h i l ea d d e ds o m e m i n gt ob r a nm e d i u mr e s p e c t i v e l y0 8 觚c t o ，o 5 n l i l k ，0 4 k 2 h p 0 4 - 3 h 2 0 ，o 2 m g p 肌do 2 y e 硒tp o w d e r 3 t h ec u l t i v a t i o nc o n d i t i o n so ft h es 臼限i nw e r es t u d i e d 柚dt l l er e s u l t sf o l l o w e d ：m ef i t t e s tp a r t i - c l es i 瑟i sb e t w e e n2 0 4 0p u 巾o s e ，t h ef i t t e s ti n o c u l a t i o np e r c e n t a g ei s1o ，m ef i n e s tf e m 舱n t a t i 西南大学硕十学位论文 - i o n e m p e r a t u r ei s2 8 ，t h ef i t t e s ts o l i d l i q u i dr a t i oi s1 ：1 2 ，t h ef i t t e s tm e d i u mq u 锄t i t yo ff 1 嬲ki s 2 0 9 2 5 0 n 1 l 4 b 髓e do nm cs 吨1 ef a c t o rt e s t s ，m 佗ei n g r e d i e n t s ( 触c t 0 x l 、m i l kx 2 、s o l i d - l i q u i dm t i ox 3 ) o fm e d i u mw 雏o p t i m i 跫dw i mr e s p o n s es u 嘞c ea n a l y s i s 1 1 1 e c “o n a lr e l a t i o n s h i p b e t 、e e nt h e m a i nf a c t o r sa n dr e s p o n s ev a l u e ( m i l kc l o t t i n ge n z y m ea c t i v i t y ，y ) w 雒e s t a b l i s h e d ，观dm e r e g r e s s - i o ne q u a t i o nw a so b t a i n e d t h er e g r e s s i o ne q u a t i o nw 弱： y = 1 4 5 7 3 8 0 + 5 3 3 5 0 x i + 3 5 4 3 8 x 2 + 2 1 3 8 6 3 x 3 + 5 1 6 7 5 x i x 2 + 9 0 8 7 5x i x 3 7 2 o o 粥x 3 1 5 5 3 6 5 x 1 2 1 4 8 4 4 0 x 2 2 2 2 3 9 4 0 x 3 2 b ya n a l y z i n gt 1 1 er e g r e s s i o ne q u a t i o n ，t l l e 叩t i i l l a lv a l u eo ft l l ef a c t o l l sw e r e0 b t a i n e d ：劬c t o s e1 0 4 ， m i l k0 5 8 ，s o l i d l i q u i dr a t i o1 ：1 0 2 t h ea c t i v i t yo f t h em i l kc l o t t i n ge 1 1 z y m er e a c h e d1 4 7 3 3 s “g 5 t h ep r o c e s sf o rp r o d u c i n gr e l l n e to ns o l i d s t a t ef i e r m e n t a t i o nm e d i u mw 觞r e s e a r c h e d d u r i n g 伦肌e n t a t i o n ，t h ec h a i l g et r e n do fi i l i i kc i o t t i n ge n z y m ea c t i v i t yi nf e r m e n t e dp r o d u c t i o nh a da c e r t a 洒s i m i 】捌t yw i t i lp m t 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a c em e t h o d o l o g y 独创性声明 本人提交的学位论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。论文中引用他人已经发表或出版过的研究成果，文中已加了 特别标注。对本研究及学位论文撰写曾做出贡献的老师、朋友、同仁 在文中作了明确说明并表示衷心感谢。 学位论文作者： 王四日强 签字日期：艚歹月 如日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规 定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅。本人授权西南大学研究生院( 筹) 可以将学位 论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩 印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：口不保密， 口保密期限至年月止) 。 学位论文作者签名： 王日日强导师签名押嘭妒 签字日期：2 叫陴s 月3 d 日 签字日期：，p8 年罗月弓9 日 文献综述 文献综述 1 凝乳酶简介 凝乳酶( c h y l l s m ，e c 3 4 2 3 4 ) 是天门冬氨酸蛋白酶中的一种主要由哺乳动物胃粘膜基底 腺以无活性凝乳酶原形式分泌的。在酸性肖液中，凝乳酶原通过分子间或分子内的激活途径。 从n 一端释放一部份肽段，形成不可逆的活性酶一凝乳酶。通常从反刍哺乳动物幼畜皱胃( 第 四胃) 中提取的凝乳酶n q 做皱胃酶( r e 衄e t ) ，其主要成分是凝乳酶和胃蛋白酶。皱胃酶经分离纯 化得到的纯酶称纯凝乳酶( c h y n l o s i n ) ，而将能够使乳凝固的一类蛋白酶( 如胃蛋白酶、植物蛋 白酶、微生物蛋白酶等) 统称为m i l k c l o t t i n ge n z y m e s 。 2 凝乳酶的应用 2 1 在干酪生产中的应用 干酪是以鲜乳为原料，经过添加发酵剂和凝乳酶使乳凝固，再经排出乳清、压榨、发酵 成熟而制成的一种发酵乳制品。干酪是欧美人喜食的传统食品，居各种乳制品之首。干酪营 养丰富，包含了儿乎所有的牛奶蛋白质、矿物质和常人呈脂肪的维生素，其中很多营养成分 对人体的健康有益，特别是防癌和提高免疫系统方面有重要作用。干酪又是钙的重要米源， 弗且干酪中的钙易于被人体吸收，几百克的干酪就能够提供绝大部分饮食所需要的钙量。同 时，干酪中还含有丰富的脂溶性维生素a 、维生素b 、维生素e 、生长素d 以及钠。 干酪生产已有很久的历史，相传，是由一位阿拉伯商人意外发明的，为了穿过沙漠，将 一个用羊胃制成的皮袋装了乳液，以备路上食用。皮袋中含有皱胃酶( c a l f r e m l e t ) ，再加上日 晒，一路的颠簸，皮袋中的乳凝同，然j 亓又震碎，凝乳与乳清分离，就形成了干酪。干酪的 制造一般分为= 个阶段：原料的预处理、凝块的形成及乳清的排出和干酪的熟化。凝乳酶是 干酪制作上艺中起凝乳作用的关键性酶。它主要通过二方面影响于酪的风味心1 ：( 一) 乳液中 的蛋白质在凝乳酶的作用下产生一些小分子肽，这些小分子肽中，某些有苦味，导致产品含 有苦昧。( 二) 凝乳酶生成的肽被微生物产生的蛋向酶和肽酶，继续降解生成小分子的肽、氮 基酸，这些化合物形成干酪的基本风味；同时微生物产生的酶，通过氨基酸分解代谢及其他 化学机理进行物质转化，生成一系列风味化合物，如胺、酸、氨气、硫醇等，这些物质是形 成千酪特征性风味的主要物质。( 三) 干酪质地的变化，影响风味和芳香化合物的释放。这些 物质是干酪咀嚼过程中，蛋白质分解，脂肪分解，糖酵解，次级代谢生成的，其中影响干酪 风味最显著的是蛋白质分解代谢。 早期的干酪制作中没有用到凝乳酶。到公元三世纪的时候，干酪的生产制作已经相当成 熟。在欧洲，模制和压制工艺结合凝乳酶的使用生产硬质干酪，与现在所采用的工艺已非常 相似。当时，所有的干酪都是以未经处理的乳为原料制作的。在1 0 世纪5 0 年代，干酪的生 西南大学硕士学位论文 产仅仅是一种小规模的、劳动密集型的生产。木经处理的乳本身含有一些微生物，制作过程 中稍不注意，不仅会使干酪变质，而且还会危害到食刚者的健康。法国微生物学家路易斯巴 斯德发明的巴氏杀菌法，使干酪制作工艺从此得以改善，第一次使干酪的大规模生产成为可 能。 在牛奶消费过程中，世界发达国家一般都经过了奶粉、液体奶、干酪及奶油三个阶段。 目前两方土要发达国家的牛奶消费已经处于第三个阶段即干酪及奶油阶段，而我国牛奶消费 主要集中在液态奶、酸奶和奶粉这三类上，干酪所r 的消费比例极低，但这并不意味着干酪 在中国没有生存的市场。一方面国内市场对干酪的需求量增加了，另一方面国内乳业经过最 近几年的不断发展，生产工艺日益稳定化、程序化，已具备了生产干酪的条件；这些都为我 国干酪行业提供了发展的契机。 2 2 在其他方面的应用 凝乳酶被广泛应用于社会生产实践中，在医药方面，治疗萎缩性胃炎，浅表性胃炎和各种 慢性胃炎的良药胃优乐胶囊，是以羔羊第四胃为主的提取物制成的复合凝乳酶胶囊，对各种 非器质性原因引起的消化功能障碍有很好的缓解作片j 。在1 二业方面，凝乳酶干酪素有良好的 染色附着力，挤压力强，主要作为添加剂用在塑料1 ：业上。由于凝乳酶具有j “泛的应用前景， 它已被列为国家8 6 3 计划优先发展的项目和国家“七五”、“八五”、“九五”重点攻关项 目副。 3 凝乳酶活性定义及其凝乳机理 凝乳酶活定义是指在一定温度下( 3 5 ) ，一定时间内( 通常为4 0 i i l i n ) ，l m l 酶液凝固1 m l 9 脱脂奶粉的酶量为一个酶活单位。标准液态凝乳酶的活力通常是1 2 0 0 0 1 5 0 0 0 u 纽，而粉 状凝乳酶的活力是前者的十倍h 。 乳中主要含有两种蛋白质：酪蛋白和乳清蛋白隋1 。前者占有乳蛋白质的8 0 左右。而酪 蛋白义含有四种基本蛋白质，即仅。1 一酪蛋白、a 。2 一酪蛋白、b 一酪蛋白和k 一酪蛋白。酪蛋白和 磷酸钙组成酪蛋白胶束m 1 。天然的酪蛋白胶束是以粒子的形式存在鲜奶中的，且是被分散在由 水、盐、乳糖和乳清蛋白质组成的连续相中。酪蛋白胶束的稳定性是由丁k 一酪蛋白分子层的 存在，k 一酪蛋白分子位于胶束的表面，弧基之间以疏水键和胶体磷酸钙相互作用的方式连接 在一起。 影响酪蛋白絮凝成胶体的因子主要有：酸、乙醇、盐类以及凝乳酶。一般来讲，凝乳酶 使牛乳凝结可以分为三步：( 1 ) 酪蛋白的水解，凝乳酶作用于酪蛋白胶束上的k 一酪蛋白，使 多肽链上1 0 5 1 0 6 位的苯丙氨酸和蛋氨酸之间的肽键发生水解，产生两个肽糖巨肽和副 k 一酪蛋白。( 2 ) 酪蛋白的聚集，经过凝乳酶的作用形成的糖巨肽是可溶的，释放到乳清当中。 而副k 一酪蛋白在乳浆中游离钙的作用下，彼此之间会形成“钙桥”，从而使副k 一酪蛋白相互 2 文献综述 间发生凝聚作刚，产生凝胶。( 3 ) 脱水作川，凝胶形成后，其中的水分便通过脱水收缩的过 程排除来。根据各种干酪的特点，适当控制水分，再通过后续t 艺制成干酪阳1 l 引。 4 影响凝乳酶凝乳的因素 ( 1 ) p h 值：凝乳酶在酸性环境中活力最强，p h 值越低凝乳速度越快。在干酪生产过程中 加入的发酵剂其目的就是使牛奶酸化，促进凝乳酶的凝乳作用。但酸也能使牛奶凝固，其机 制是当牛奶中p h 值达到奶中酪蛋白等电点时，牛奶发生絮凝作用。冈此当乳液中p h 值越低 酸度越高时，凝乳速度越快，但凝块切面变得也粗糙。实验表明，干酪生产中加入发酵剂后 酸度到2 0 t 左右时加入凝乳酶，可以得到较快的凝乳速度和较好的质地。 ( 2 ) 温度：不同来源的凝乳酶其最适温度也不相同。一般来讲，凝乳酶的活性在2 0 6 5 之间随着温度的上升而升高。其原理是温度影响酪蛋白胶束表面的电荷。温度升高，表面电 荷减少，酪蛋白胶束就互相聚集：当温度达到6 0 时，胶束表面电荷儿乎为零，此时凝乳活 力最人。但温度的升高会加快酶的变性，6 5 时凝乳酶仅表现出几十秒的活力n 州。在实际的 奶酪生产过程中，凝乳温度一般采用3 5 左右，这不仅考虑到干酪发酵剂乳酸菌的最适温度， 还可防止温度过高，凝块硬化速度太快，造成后期干酪切割困难。 ( 3 ) 金属离子：乳液中自由钙离子可以促进凝乳酶的凝乳作用。其作用机理为：首先，钙 离子通过与氢离子的交换作用，降低了乳的p h 值，间接促进酶促反应1 。其次，钙离子的存 在，使酪蛋白胶束的表面电荷减少，导致副k 一酪蛋白之间的空间排斥力减小，相互聚集，沉 淀下来。钙离子浓度增加，凝乳时间缩短，但千酪质地坚硬，因此应根据产品需要选择合适 的钙离子浓度n2 。另外，研究表明n 引，铝盐、铁盐对凝乳也有一定的促进作用，而锌盐、铜 盐却有一定的抑制作用。 ( 4 ) 另外，凝乳酶的活性还受牛乳成分等其他因素的影响。 5 凝乳酶的来源 传统凝乳酶的制备方法是将出生l o 3 0 d 的小牛屠宰，从其第四胃中用盐将凝乳酶浸提出 米。用离子交换柱分离纯化粗提的小牛凝乳酶，分析它的性质后发现，凝乳酶作用的最佳温 度为5 0 ，5 5 范同内酶活性仍稳定，最佳p h 值为6 左右，在p h 值为3 6 范嗣内稳定性较 好引。这种凝乳酶的特点是凝乳活力与蛋白水解能力的比值高。因此能被广泛应用于各种干 酪的生产。凝乳酶是奶酪生产中使牛乳凝同的关键性酶，但是随着世界奶酪产业不断发展， 每年宰杀4 0 0 0 万头犊牛以获得凝乳酶的方法，已不能满足生产需要，而且这也与现代一1 j 业发 展极不协调。凝乳酶的生产现状迫使人们不得不寻找来源广泛、价格低廉的凝乳酶代品。目 前。千酪生产中应用的酶从来源方面可分为三类：动物凝乳酶、植物凝乳酶和微生物凝乳酶( 见 表1 ) 。 3 两南人学硕= ：学位论文 表1 干酪生产中常用的凝乳酶n 引 t a b l e1 s o m em o s t l yr e l l n e tp r o d u c i n gc h e e s e 5 1 动物凝乳酶 动物凝乳酶代用品主要米源于哺乳动物胃。研究者们从许多反刍动物第四胃中提取胃蛋 白酶，对其性质进行研究，发现具有商业价值的动物凝乳酶代用品土要是牛、猪和鸡的胃蛋 白酶。但胃蛋白酶的蛋白分解力强，在单独使用其制作干酪时，干酪略带苦昧、凝乳时间 延长、凝乳较软、出品率下降。牛和猪的胃蛋白酶与凝乳酶也具有许多相似的性质，如在凝 乳张力及非蛋白氮的生成、酪蛋白的电泳变化等方面n5 1 ，冈此与凝乳酶混合使用时，能取得 比较好的效果。实际上千酪生产中使用的皱胃酶，至少有2 0 的凝块是由胃蛋白酶作用凝结形 成的。皱胃酶和牛胃蛋白酶的混合酶( 3 0 ：5 0 ) 已经被作为制作荷兰干酪的适宜酶。我国是 畜牧业不是很发达的国家，单靠宰杀小牛来获得凝乳酶极其不经济。而我国的猪的屠宰量很 大，猪胃蛋白酶比较容易获得，因此把猪胃蛋白酶作为皱胃酶的部分替代品是一可取的方法 u6 1 。另外胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶也具有一定的凝乳能力。但由于对蛋白质分解能力太强， 导致干酪出品率低，质地也粗糙，因此目前主要在科学研究中使用。 5 2 植物凝乳酶 许多植物中存在着能使乳凝固的蛋白酶。在植株的大多数部位，如果实、叶、花、茎、 4 文献综述 根等，都能分离得到蛋白酶。目前，这类酶约1 1 1 廿界凝乳酶刚量的1 左彳i 。小瓜蛋白酶是 从木瓜中提取的木瓜蛋白分解酶，可以使乳凝固。该酶在p h 3 剑p h l l 时稳定，且最适p h 随底物 的不同而变化，如在以酪蛋白为底物时，最适p h 为7 ，而以明胶为底物时p h 是5 。木瓜蛋白酶 具有较高的热稳定性，以牛奶作为底物时，p h 7 ，7 0 处理3 0 i i l i n ，活性仅降低2 0 。与动物 凝乳酶相比，在使用木瓜蛋白酶凝固牛奶时，不仅需要较高的凝乳温度u 0 1 ，而且制得的干酪 带有一定的苦味8 1 。研究表明，从菠萝中提取的菠萝蛋白酶( e c 3 4 4 2 4 ) ，从无花果提取 的无花果蛋白酶( e c 3 4 4 1 2 ) 都具有一定的凝乳能力。但菠萝、木瓜和无花果等所分泌的 蛋白酶，水解蛋白的能力强，j j 它们制作的干酪质地松软，商品价值低。而用从合欢树的叶 子、树皮和果实中提取的合欢树蛋白酶制作的干酪，其品质不亚于小牛凝乳酶制作的干酪。 研究表明n9 1 是因为合欢树蛋白酶能高效凝乳而水解蛋白酶的能力又不太强。植物凝乳酶虽来 源广泛，但其蛋白质水解能力强，原材料受时间、地域、生长周期长等条 j ，l ：的限制，发展前 景不理想。微生物生长周期短，产量人，受气候、时间、地域限制小。用其生产的凝乳酶成 本低、经济效益高。但微生物凝乳酶也存在蛋白水解能力高、特异性不强等缺点| 20 l ，因此可 通过诱变选育、优化工艺、基因工程以及蛋白质工程等技术来改善微生物凝乳酶的性质，提 高其产酶能力。 5 3 微生物凝乳酶 目前发现有四十种微生物可生产一定活力的凝乳酶，这些微生物主要是细菌、放线菌和 真菌把心引啦3 1 。刘振民等心钔发现酒药中的根霉，具有一定的产凝乳酶活力，可作为凝乳酶的潜 在生产菌。孙健等担副从1 7 株产凝乳酶的霉菌中初筛到产酶量较高的总状毛霉( 拟c d ， 加c 朗2 “s ) 菌株。现在应用最多微生物凝乳酶是利用微小毛霉( 缸，p 姗舭s ) 生产的。微小毛 霉凝乳酶的蛋白分解力比皱胃强，但比其它的蛋白酶蛋白分解力弱，对牛乳凝同力强。中科 院微生物所的钱世均等人把6 1 从1 9 株毛霉中筛选出一株微小毛霉菌株，并对其产生的凝乳性蛋 白酶进行了纯化和酶学性质的研究。常用凝乳酶生产菌种有三种：米黑毛霉、微小毛霉和寄 生内座壳菌( 栗疫霉) 。目前己有多种应用这三种菌生产的商品酶上市，如表2 凝乳酶及其代用品都是酸性蛋白酶，但其在干酪生产中应用效果却不相同。根据国际乳 业联合会( i n t e n l a t i o n a ld a 时f e d e r a t i o n ，i d f ) 要求引，凝乳酶代用品必须要使用安全，无抗菌 素，此外还需具备f 列特征：凝乳活性与蛋白水解活性比值( c p ) 要高，凝乳酶c p 比值平均 为4 0 9 ：在较高p h 范围( p h 6 5 7 0 ) 凝乳活性对p h 的依赖性较小：在干酪加工中应用的温度和p h 条件下活性稳定：在乳清加工中的热稳定性较低：生产山的干酪具备理想的风味、质地和结构 特征：贮藏期间稳定性好。但许多研究指出，微生物蛋白酶与小牛凝乳酶相比，具有下列缺点： 5 两南人学硕十学位论文 表2 商品微生物凝乳酶和生产厂家川 i a b l e2c o m m e r c i a lr e n n e ta n ds u p p l i e r 凝乳酶活性低，与蛋白酶水解活性比值低。鼬k u c h i 和t o y o d a 在应用多粘芽孢杆菌( b p o l y i n y x a ) 凝乳酶制作g o u d a 干酪时发现，乳消发生浑浊，同时干酪产生苦味，而且与应用小 牛凝乳酶制作干酪相比，乳清中非蛋白氮增加，蛋白质的水解程度大瞳7 1 ；使用该酶制作c h e d d 盯、 l i l s i t 和k o r t o w s k i 干酪与应用牛凝乳酶制作的干酪对比发现，干酪的成熟快，相对产量低，最 终产品比较脆心引。高蛋白分解能力是细菌来源的凝乳酶成为商品凝乳酶的主要障碍。 耐热性强，特别是微生物凝乳酶，在正常巴氏杀菌条件下，不易失活，造成乳清中蛋白 酶活性较高，无法处理和利用。为了降低微生物凝乳酶的热稳定性，研究人员发现h z o z ，n a c l 、 过硫酸钾、过氧乙酸等化合物比较适合降低酶的热稳定性。当然，如果能够直接分离到对热 稳定性差的凝乳酶，即可以免去后期对酶蛋白的改性处理。滕国新 1 报道在酒曲根霉b 4 m 2 凝乳 酶的最适温度为4 0 ，但其活力在5 5 2 0 i n i n 条件卜完全丧失，表现了较高的热不稳定性质。 这个性质满足干酪生产工艺中对乳清处理的要求。他还建议对酒曲根霉凝乳酶的结构进行测 定，与小牛凝乳酶进行对比，解决为什么根霉凝乳酶的热稳定性比其他凝乳酶低。 由于凝乳酶和蛋白酶特性的差别，在应用蚩白酶生产干酪时，要求适当调整一些工艺参 数，如温度、p i ，c a 2 浓度等。 6 微生物产凝乳酶的研究现状 在选择凝乳酶菌株时，不仅要注意菌株的凝乳酶活力，还应注意挑选凝乳酶活力与蛋白 分解活力比值高的菌株，这样才能得到优质的产品。为了获得高比值凝乳酶，一方面可通过 单独提高凝乳活力，或降低蛋白分解力，另一方面可同时改变两种活力，从而达到比值降低 的目的。利用一些生物技术，对菌种进行优化选育和改良是提高产品产量和质量的一条有效 6 文献综述 途径。 6 1 菌株的选育 在自然界获得的标本中，通常是微生物的混合物。为了获得目标菌株，就必须对样本进 行纯种分离。在凝乳酶菌株纯种分离过释中。我们采崩了酪蛋白培养基。许多实验证明，酸、 凝乳酶、醇以及盐类等因素能影响酪蛋白的凝固。凝乳酶凝乳酪蛋白所得产品质量高、风味 佳，冈此戍排除其他因素的影响，选择能产凝乳酶的菌株。杨佐毅等【2 训将自腐乳样晶中分离 得到的样本接入5 i t l l 豆浆培养基中，经培养，发现有部分菌株凝乳效果较好。但经实验证明其 为酸凝乳，p h 值为5 ，8 时开始凝乳，因此，还必须进一步筛选。蒋咏梅等阳刑从1 0 2 份土样的2 3 5 6 株中筛选了表现良好的1 2 株，其p h 值都在5 8 以上，排除了酸凝乳的可能性。同时，还考虑了 凝乳酶活力、凝乳时间、凝同状态选取菌株进行下一步实验。在筛选菌株的过程中，还应考 虑酪蛋白平板培养基上的凝乳圈与水解圈、水解圈与菌落直径的人小之比。 由于绝大多数野生菌株产凝乳酶活力较低，或因其产生的酶蛋白水解活力也高，而不适 合工业化生产。因此对菌株有目的地进行人t 诱变，能提高突变几率可迅速获得优良高产菌 种，产生巨大的经济效益。郭光远等人心3 1 对5 6 株酶活力超过1 0 0 u m l 的菌株进行反复对比后， 选定一株毛霉( 胁c o ，印) 代号y 8 5 8 5 1 2 和株芽孢杆菌( 肋c 讹s 印) 代号y 8 5 8 5 0 1 作为出 发菌，经诱变选育得到酶活比值高且凝乳活力分别可达到5 0 0 0 u g 和l 0 0 0 0 u g 的稳定高产菌 株。孙建等心引以总状毛霉r 3 为出发菌株，对其单孢子悬液进行不同剂量删c o r 射线照射后，变 异株r 1 3 2 的凝乳活力提高了8 0 ，酶活比值提高了6 5 。蒋咏梅嘞1 以y 一1 2 为出发菌株，经复合 诱变荆紫外线和硫酸二乙酯处理后，获得有3 株产酶水平比出发菌株提高2 0 0 以上的菌株。 6 2 工艺条件的优化 在培养微生物的过程中，可以通过改变培养基的成分配比、培养条件，以及对产酶影响 因素的研究，筛选出具有优良性状的菌株。h 2 l s h e m 【3 i 】从儿种真菌中发现p n 撇，f c ”m 是良好的 产凝乳酶菌种。以p 渊胁“m 为出发菌株，作者分别讨论了各种碳源( 糖蜜、淀粉、乳糖和乳 清粉) 和氮源( 玉米浆、人豆、尿素以及蛋白胨和酵母浸膏的混合物) 对菌株产酶能力，结 果发现在含有5 的蔗糖和混合氮源( o 3 酵母膏和o 5 蛋白胨) 的培养基上培养8 天后获 得了最人酶活，其酶最佳p h 值为6 ，最佳话性温度是6 0 。在缺乏葡莓糖的情况下，凝乳酶 的活力急剧下降。实验表明【3 2 】，葡萄糖浓度超过1 6 时，无法检测到培养液的凝乳能力。究 其原冈可能是底物浓度过高，微生物繁殖过快，黏度升高，导致培养液中溶解氧降低，营养 物质转移困难，乳凝固受阻。许多研究显示，在培养基中使用有机氮比无机氮更有利丁酶的 生成。m a s h a l y 【3 3 】在液体蛋白胨培养基中分别添加酪蛋白、牛血清蛋白、血红蛋白后，凝乳酶 的产最增加，尤其添加2 的酪蛋白效果最好。a h n l e df a b d e l f a t t a l l i ，4 】用玉米浆作为氮源， 发现当其浓度达到l g l 而碳氮比为2 l ：1 时，培养基有最大的c p 值。另外，金属离子也会影 7 西南大学硕十学位论文 响微生物产酶。p e ；j i n gy u 等f 3 5 】分别调夯，m g 孙、f e 3 + 、aj 3 + 等离子对酶活性的影响，发现 a 1 3 + 的添加使酶活比对照高1 5 5 倍，为1 9 u m l 。经各种条件优化后，h i g 豁h i o 【如】发现 缸c d ， r 口c 绷淞n o 5 0 菌株的最佳培养条件是：6 l 5 的麸皮液体培养基装在1 0 l 的发酵罐中；空气 流量，5 u i i l i n ：搅拌速度2 0 0 ，他v m i n ：温度为2 4 。在此培养条件下，凝乳酶的活力达到 6 0 0 u m l 培养基( 1 2 0 0 0 u g 麸皮) 。h i g 舔h i o 还发现当酶产量达到最人后，酶活性急剧减少， 用缓冲溶液调节初始p h 值到5 0 并维持在6 4 以下，可以阻i ：这一趋势。同样地，c h 0 ，c h p 等人用m a c i l v a i m 缓冲液( p h 4 5 ) 替代水分，与麸皮混合培养米黑霉，其酶活性有显著提高。 s h a l l 饥h m a 认为菌种l s l 的最佳接种赞是7 4 1 0 6 c 矗以m e d i u m ，过高的接种量会引起 酶产量的减少。在某种程度上，酶产量直接与搅拌速度相关。e s c o b ”】在用米黑毛霉生产凝 乳酶时，发现在3 8 0 印m 时获得了最大酶产量为2 7 0 8 1 o s u 儋底物，其生产力是2 2 l s u 百l h 。 酶合成与生物量的增加部分耦联。同时，当酶开始积累时，酶的生产速率下降，可能存在反 馈抑制。另外，j o s ee s c o b a r s t a i l l e yb 锄e t t f 4 0 j 用不同水解程度的酪蛋白来替代培养基中的酪 蛋白来产酶，结果显示随着水解程度的增加，酶的产量下降，证明游离氨基酸是一种无效氮 源。采用5 0 0 0 m w 的超虑膜除去培养液中的自由氨基酸，可使酶的产量提高8 到2 5 。s u l e 等【4 1 】用米黑毛霉连续发酵生产凝乳酶，发酵参数d 葡萄糖浓度、转速、稀释度分别为7 5 9 l 、 4 0 0 印m 和0 1 2 5 d a y - 1 ，发酵5 7 5 h 获得最人酶活力，为1 2 4 i u n 也一，其c p 值可与凝乳酶p i n a r 相比。发酵过程中，产晶积累有毒代谢产物的富集都会影响发酵。冈此，连续排出发酵液， 流加营养液可降低发酵罐中产品和有毒代谢物的浓度，延长发酵时间，使产量最大化。 7 基因工程凝乳酶 微生物凝乳酶作为皱胃酶良好的替代品，受到了广泛的重视。但，正如前所述，微生物凝 乳酶与皱胃酶相比还存在许多不足。另外，优化菌种生产工艺条件能够提高凝乳酶活力及其 与蛋白质水解活力的比值：此方法简单、易行，但其比活力提高幅度不火，试验结果缺乏预 见性。基冈工程技术的出现为凝乳酶的开发提供了理想的途径。研究者利用基冈j ：程技术，将 凝乳酶原的基因克隆并在适当的宿主细胞中表达，生产山凝乳酶，从而拓宽了凝乳酶的来源， 解决凝乳酶不足的现象。二十世纪8 0 年代以来，全世界有十多个国家相继开展研究。目前有 关基因工程凝乳酶的研究主要集中在对表达载体以及启动子的筛选方面。凝乳酶基因表达载 体的报道较多，但主要集中在大肠杆菌、酵母菌、黑曲霉和米曲霉1 4 引，尤其以火肠杆菌引和酵 母n 引研究的较多。邱重晏等h 副将微小毛霉的凝乳酶基因连接到表达载体p p i c 9 k 的信号肽下 游，获得重组质p i c 9 k 嗍c p ，并成功转入毕赤氏酵母p p 瓠t o r i s k m 7 l 中，发酵实验后，测得重 组菌酶活为5 4 u m l 。1 9 9 1 年，z h 锄g 等刚构建了含有t a c 启动子和牛凝乳酶b 基因的表达质粒 p 讹c ，并转化到人肠杆菌j m l 0 5 中，发酵后，酶产量达到1 4 2 0 m g 几。1 9 9 0 年，美国f d a 批准 了克氏乳酸菌凝乳酶、黑曲霉菌凝乳酶和大肠杆菌k 2 1 2 凝乳酶在干酪中的使用。基因工程凝 乳酶产品的纯度高且含1 0 0 凝乳酶( 小牛胃苹取液仅含7 0 9 0 凝乳酶) ，以其所制造的乳 8 文献综述 酪在收率与品质上均优丁以小牛胃凝乳酶制造的乳酪| 3 1 。 尽管研究者在提高凝乳酶活力，改善产品性质等方面做了许多努力和尝试，但仍有许多 问题有待解决。相信，随着基冈：r 程研究的深入，高比值酶的获得在今后一段时间内将会成 为科学t 作者们又一个新的研究热点，许多尚未解决的问题将会得到更进一步的探讨和揭示。 9 西南人学硕士学位论文 引言 凝乳酶广泛应用于食品、工业和医药等领域。在食品行业里，凝乳酶主要用于凝结牛乳 生产干酪。干酪的营养十分丰富，蛋白质含量达到2 5 左以，乳脂含量为2 7 左右，钙可达1 2 ， 而且钙、磷比值接近2 ：l ，最容易被人体吸收，吸收率达8 0 9 6 一8 5 ，因此它是补钙和补充优 质蛋白质的理想食品。随着生活水平的提高，干酪的消费量也增加，相应地干酪制作时的关 键性酶一凝乳酶的