（微生物学专业论文）sfamnpv诱导斜纹夜蛾细胞sl1凋亡时线粒体和钙离子的变化.pdf

硕士学泣论文 、 s t e r sl e s 【s 中文摘要 巍崤襞凄饕率匏谗多臻究表鼹，冬释诱等滚素，热：撬瘗菱魏、豫去燕长 馥予和纲胞因子等芍l 超璃亡时，线粒体和内成潮中都会经历系列静燮化，而 在昆擞细胞中这个方面的研究比较少。本实骏以杆状病毒s f a m n p v 诱群的斜 纹夜娥s l - i 缨飚蠲亡系统舞耪搴萼研究了病毒感染j i | 昆虫细艇鹣线粒体帮魂屡 嚣戆影壤。完藏熬工释篷捂淡下露拿方嚣： ( 1 ) 细胞内线粒体的变化 通进m t l 法研究病毒感染澍细胞线粒体功能的影响，同时用流式细胞仪 器共聚蘩；激竞显徽镱磷究线粒髂貘毫鑫( a w m ) 鹃交继，w e s t e r n 捻溅2 耱疆 亡调撩嚣鑫c y t oc 和b c l - 2 蛋囱的变纯。结聚旋明，在接种瘸毒蓐的敝辩s l - t 细胞的线粒体出现丁功能的变化，随着时间的艇长，功能邂渐降低且舅时间依 赖性。翅胞经罗丹骥( r h 1 2 3 ) 染色压在滚式螂骢仪上梭测，病毒感染斌s l - 1 囊筑程链囊露浅现了荧毙强发的下释，避爨鼗嚣砉蒺亳短程经瑟热下簿，麓螽 随着病海入侵、凝制、脱壳等过程的完成，绷胞膜电位逐渐下降且呈时间依赖 性。欺聚焦激光照微镜也可着剿s f h i n p v 的感染引起线粒体膜电位降低。 w e s t e r nb l o t t i n g 梭测线粒蒋e y t oe 秘1 2 禽爨酌载变纯，缍暴显示撬潞亡蛋 自b c l + 2 在病毒的感染过程中念鬣是逐渐降低浆，静病毒韵感染导致b c l * 2 鍪西 表达的下降。杂交w 看到s l 1 细胞在接种瘸瓣的4 h 后线粮体中的细胞憾素c 被释放到了细胞质中，这与很多程嚷孚l 动物绷腿中赝作的燎莱是相同的。 ( 2 ) 钙赛子嚣稔溅 1 、细胞内质网疑【c a 2 + 】i 的藏鬻储存场肼，以及【c 矗1 i 在细胞凋亡魄信号转 导通潞中所具有的煎要作用，举蜜验研究了s 洲p v 诱释s l 1 细胞凋亡过程 中绥骢态f c a p 】i 靛变纯鞋及器疆2 霹簸在撼亡信号转导逶路中懿意义。蓉宠震 共聚焦激光显徽镜稔灏f l u o - 3 a m 染毪继耱内蠡冬荧巍强寝，磅究籽狡瘸毒 s f a m n p v 对s l 1 细胞内i c a z + 】i 的影响，结聚农明s f a m n p v 作用于s l * 1 后， 可使腿晦f c a 2 + 】f 迅速嚣高，其荧光强度值必朱经病毒感染的细胞的荧光强度 筑3 倍。努羧囊羚蒜静t c a 2 q i 鲶来源，实验孛将捡嚣薅豹h a n k s 缓淳滚捺或无 钙离予的h a n k s 缓冲液对，s f a m n p v 诱导的8 l l 施覆内【c 铲+ 舞高即被抑制， i 硕士掌成论文 s t e r st l l s l s 提示 c a 2 + 】i 的增加部分来源于外镝内流。如果胞质内升高的c 舻+ 的确是来源于 胞外钙鹗予走流，那么在无钙离子蛉h a n k s 缓冲滚中搬入e a c h 后，再检测腿 质建c 矿豹滚疫霹寝该鸯一令秀离，歪舞我 ；f 】瑟疆辩戆，在梭溺蔻震蠹锷辫子 的浓度时的确升高了，这个结果褥次正明结论：【c a 2 + 】i 的增加部分来源于外钙 内流。 2 、挎磋究藏震内游离c 鑫2 + 势蠢、麓多 锷离予蠹流骧及浅袋隧锈瘁c 斡捧 空三稀潮素在s 懿心谤v 诱导静s l ，l 缀穗凋亡涎程串匏功裁懑义，在实验过程 中分别建立了两种不同的钳制状态，细胞质c a “钳制状态( 用2i x m r a p t a a m 、 l1 0 mc a e l 2 钳制腿质内的c a 2 + ) 和尾e g t a 阻颤胞外c 2 + 的 交流，然器矮竞了两种楚理条锌瓣s f a m n p v 诱番翡s l - i 缀麟撼亡夔影确。经 细胞经流式分析和梯澎带等定性及定量检测照豕，两种处理条件均未能抑制 s f a m n p v 诱导的s l 1 细胞凋亡，即胞质内游离c a 2 + 升高和胞步 钙离子内流都 不是诱弩绥照强亡的主要诱医，据示蠹震网钙露e a 2 + 搀空楚s f a m n p v 诱警蕊 s l - 1 缨魏凋亡售弩转静通黯孛黝圭簧媒奔。 关键词：杆状病毒斜纹夜蛾细胞系细胞凋亡钙离子线粒体b c l 2 膜电位 缨胞色爨c 痰质隧c a = 翎f 空e g t a b a p t a a m 漉震钙离子钳奄l 状态 硕士学位沦史 f s t e r st h e s i s a b s t r a c t 凇r e s e a r c h e sw e r ec a r r i e dt h r o u e 出i nm a m m a la n i m a l ss h o w e dt h a t n f r t o c h o n d r i a la r ie r m i g h t h a v e c h a n g e dm u c ha f t e ra p o p t o s i si n d u c e db y a v a r i e t y o fs t i m u l i ，i n c l u d i n gc y t o k i n e s ，a n t i - c a n c e rd r u g s ，g r o w t hf a c t o r d e p r i v a t i o na n ds o o n h o w e v e r , f e wr e s e a r c h e s w e r eg o n eo nt h ea p o p t o s i si nt h ei n s e c tc e i l s i nt h i s 嫡e f f e c t so fs 蠹楚谤v 张m i t o c h o n d r i a la n de r 捷s o lc e l l sw c l es t u d i e d ， 靛l em a i nr e s u l t s v e r e 曩sf o l l o w s ： e 行b c to fs f a m n p v ( m o i = 6 ) o nt h ef h n c t i o no fm i t o e h o n d r i 巅i ns l 1c e l l s w a s i n v e s t i g a t e db ym t t 舶s a y a n dm e m b r a n e p o r e 州a lw a sa s s a y e db yb o t hf l o w 哆沁嘲a n dc o n f o c a ll a s e rs c a n n i n gm i c r o s c o p e 翻嚣r e s u l t ss h o w e dt h a tt h e f i m c t i o r to fm i t o c h o n d r i a l b e g a n t od e c l i n ea f t e ri n d u c t i o nf o rg h ，a n dt h e d e c l i n i n g r a t ew a st y p i c a li nt i m e d e p e n d e n tm a l 蝴e r s u n d e rt h ef l o wc y t o m e t r ya s s a y , t h e e f f e c to fs 钕潮n p vo x am i t o e h o n d r i a lm e m b r a n e p o t e n t i a l ( a 翠m ) w a si n v e s t i g a t e d 努 毯一1 2 3s t a i n i n go fc e l l s 。t h e 嚣捧l 慧3f l u o r e s c e n ti n t e n s r yi ns l - ic e l l sx , v a s r e d u c e di n t i m e d e p e n d e n t m a n n e r t h er e s u l t so fc a n _ f o c a ll a s e r s c a n n i n g m i c r o s c o p ec o n f i r m e dt h a ts f a m n p vw a sa b l et or e d u c ea q j m t h ee f f e c t so f s f e 2 v r n p vo na p o p m s i s - r e l a t e dp r o t e i nb e t - 2a n de y t oe 鼍醒辑i n v x ! s t i g a t e db y w e s t e r nb l o t t i n g ，s f a m n p vc o u l d d o w n - r e g u l a t e t h el e v e lo f b c l - 2 e x p r e s s i o na f t e r i n d u c t i o nf o r8 h a l s o ，e y t ocw a sr e l e a s e df r o mm i t o e h o n d r i a lt o e y t o s o l i c a f t e r i n d u c t i o nf o r4 h e ri sw e l lc h a r a c t e r i z e d 氇喜鑫m o b i t i z a b l ec a l c i u ms t o r et h a ts e q u e s t e r se x c e s s c y t o s o l i cc a l c i u ma n dar e s e r v o i rf o rc a l c i u ms i g n a l i n gt om a i n t a i ni n t r a c e l l u l a r c a 2 + h o m e o s t a s i s e f f e c to fs f a m n p vo n c a 2 + 】io fs l - ic e i l sw a ss t u d i e db y o b s e r v i n gf l u o r e s c e n ti n t e n s i t y 职a r i a t i o n o fc e l t ss t a i n e dw i t hf l u o - 3 瓣u s i n g c o n f o c a ll a s e rs c a n n i n gm i c r o s c o p e 薯输r e s u l t ss 酗黼嵇t h a t 霹毪w a sr a p m l y i n c r e a s e da f t e rc e l l sw e r ei n d u c e d b ys f a m n p v t h e f l u o 一3f l u o r e s c e n ti n t e n s i t y 蝴3 - f o l do f t h a to f n o ti n d u c e dc e l l sa f t e rs 蠡vi n d u c t i o n 。w h e nr e m o v i n g c a l c i u mf r o mt h em e d i u m 壤c o m p o u n de g t a t om 蔽u m , 辩灼 r e s p o r s et o 硕士学位论文 、l a s le r 。st i 3 i s s f a m n p vw a si n h i b i t e d c o m p l e t e l y t h e s er e s u l t ss u g g e s t e dt h a t e x t r a c e l l u l a r c a l c i u mi o ni n f l u xi st h em a i ns o u r c eo fi n t r a c e l l u l a rc a l c i u mi n c r e a s e t od e t e r m i n ew h i c hf a c t o r sm i g h ts e r v ea st h ep r i m a r ym e d i a t o rf o rb a c u l o v i r u s s f a 仆i p v 血d u c e ds l 1 c e l l sa p o p t o s i s t h ee f f e c t so fe 0 1 aa n d 也ec l a m p e d c y t o s o l i cc 一+ c o n d i t i o no nb a c u l o v i r u s i n d u c e da p o p t o s i sw e r es t u d i e d h a v i n g e s t a b l i s h e dc e r t a i nc o n d i t i o n sb yc u l t u r i n gs l 1c e l l si ng r a c em e d i u mw i t h7 m v i b a p t a a ma n dll o g mc a c l 2 w h i c hs u s t a i n e da c y t o s o l i cc a 2 + c l a m py e td i dn o t d e p l e t e d i n t r a c e l l u l a rc a 2 + s t o r e sa n di n d u c e d a p o p t o s i s ，t h ea p o p t o s i s i n s f a d i p v - i n f e c t e ds l 1c e l lw a sd e t e c t e d t h er e s u l t ss h o w e dt h ec o n d i t i o nc o u l d n o tp r e v e n ta p o p t o s i si ns l - lc e l l s t a k e nt o g e t h e r , t h e s ed a t as u g g e s t e dt h a tt h e d e p l e t i o n o fe rc a 2 + s t o r e sr a t h e r 廿1 a nt h ee l e v a t i o no fc y t o s o l i cc a 2 + o r e x t r a c e l l u l a rc 一+ e n t r yc o n t r i b u t e dt os f a m n p v - i n d u c e ds l lc e l l sa p o p t o s i s 砸s r e s u l tw a st h es a m et om a n yr e s e a r c h e s k e yw o r d s ：b a c u l o v i r u s ，s p o d o p t e r al i t u r ac e l l ，a p o t o s i s ，d n al a d d e r ，c a l c i u m ， m i t o c h o n d r i a l ，avm ，c y t oc ，b c l 2 ，d e p l e t i o n o fe rc a 2 + s t o r e s ，e g t a ， b a p t a a m ，t h ec l a m p e dc y t o s o l i cc a 2 + c o n d i t i o n i 前言 硕士聋泣论文 、1 a s t e rsi - i e 【s 1 1 细胞凋亡概述 细胞凋亡( a p o p t o s i s ) ，是指在一定的生理和病理条件下，机体为维护内 环境的稳定，发生的受基因控制的、自动有序的死亡方式【1 1 ，也被称为程序性 细胞死i = ( p r o g r a m m e dc e l ld e a t h , p c d ) 。细胞凋亡过程的发生主要可以划分为 两个阶段，第一个阶段是凋亡信号的传递，包括凋亡信号的转导和凋亡基因的 激活：第二个阶段是效应发生，包括凋亡的执行和凋亡细胞的清除。细胞凋亡 是当前生命科学研究中最热门的领域之一，根据美国i s i ( i n f o r m a t i o ns c i e n c e s i n s t i t u t e ) 对1 9 9 7 年s c i 收录及引用论文关键词检索发现，全球自然科学研究中 论文发表最集中的3 个领域分别是细胞信号转导、细胞凋亡和基因组研究截 止到1 9 9 8 年的5 年内发表了2 万多篇有关细胞凋亡的文章【2 1 。目前，对细胞凋 亡的研究主要集中在如下几个方面，细胞接受胞内外信号的刺激启动凋亡、胞 内凋亡特异性蛋白酶c a s p a s e s 的活化、c a s p a s e s 对细胞结构的降解、线粒体及 b c l 2 蛋白家族对凋亡的调控等。 1 2 细胞凋亡的信号转导通路 目前在哺乳动物细胞中研究得比较清楚的信号通路有三条分别为：死亡受 体凋亡信号通路、线粒体凋亡信号通路和内质网凋亡信号通路。 1 - 2 1 死亡受体凋亡信号通路 死亡受体( d e a t hr e c e p t o r ，d r ) ，与相应配体结合后可诱导细胞凋亡的一类跨 膜受体。成员包括：f a s l f a s ( c d 9 5 a p o 1 ) ；t n f 一矿r n f r i ；t r a i l ( t n f r e l a t e d a p o p t o s i si n d u c i n gl i g a n d ) ( a p o 一2 l ) r 4 ，r 5 ( d d c o n t a i nr e c e p t o r ) ；a p o 一3 l ( t w e a k ) d r 3 ( a p o 3 ) 。死亡受体属于肿瘤坏死因子( t n f ) 基因家族，其共 同特征是胞外区n 端含2 - 4 个具有相似的、富含半胱氨酸的结构域( c y s t e i n e r i c h d o m a i n ，c r d ) ：胞内区含1 个由6 0 8 0 个a a 组成的同源的、称为死亡结构域 ( d e a t hd o m a i n d d ) ，其可与胞浆死亡结构域蛋白( d dp r o t e i n ，d d p ) 中的d d 同源结合，启动并传递凋亡信号。d d p 指得是分子中含d d 的凋亡信号蛋白， 包括t r a d d 、f a d d 、r p 、c r a d d 、m a d d 等。死亡结构域一般使死亡受 硕士学位论文 、 、s 。ie 致s 下h e s l s 体与胞内凋亡机制相避。3 ，但它们脊时也会介导岛凋亡无关或抑制凋亡的过糨。 哺乳动物中存在一独枫镱可使机体主动g 起某个纽胞自我毁灭，这种“指令” 往凌亡在受疫系统孛戈舞重要。嚣亡受傣是转罨特定死亡嚣体赘寒煞疆亡蕊露 的细胞畿面受体，它猩“指令”性捅亡中是很薰嚣的。这些受体可在配体结合 后凡秒钟内活化c a s p a s e s ，使细胞程几小时内凋亡【4 1 。 f a s ( a p o - 1 或c d 9 5 ) 缝构特点为魏浆区食海d e a t hd o m a i n 。嚣兔戴亡绻 耩瑗有彼藏结合静趋势，f a s 藩襄逐套菠受俸豹瓤亡鐾撺蠛聚集；一耱翻徽 f a d d ( f a s a s s o c i a t e dd e a t hd o m a i n ) 的接头蛋白质【5 】，通过自身死亡结构城与 聚集的受体死亡结构域结合。f a d d 还含有一个死亡效应缩构域( d e d ) 霹 与酶爨形式醵a s p a s e8 牵类馥熬圈文重复戆d e d 嫠梅壤缝合獬 7 1 0c a s p a s e 8 的寡聚纯导致其通过囱身切割使酶活化。最近的研究表明，绷胞内可能存在两 条f a s 储母转导通路瀚化c a s p a s e s 剐。在f a si 烈细胞中，有相渴数量的c a s p a s e 8 被活化，潘他的c a s p a s e8 透过髓糊c a s p a s e3 ，e a s p a s e6 褒c 氇蹲a s e7 壹接激添 这些下游翡c a s p a s e s 势雩l 袋装粒髂鹣援蘩蹲 滔。巍f a s t i 登缨臌中，灵青少爨 的c a s p a s e8 活化，c a s p a s e8 主要通道诱导细胞色索c 从线粒体释放活化a p a f - 1 ， 再使c a s p a s e9 活化1 1 1 _ | ”。 l + 2 2 线簸髂懑亡箍号遗路 线糖体是细施囊命活动控翻巾心，它不仪魁鞠胞呼吸链辎氧化磷酸纯韵中 心，而且熄细胞凋亡调撩中心【i3 1 。1 9 9 4 年，n e w m e y e r 等在研究爪蟾卵细胞提取 物躲无镏魏潺亡体系时发现郛缨腿提取镪斡线粒搭组成可敬健游离细腿核的 粢色薅凝祭，鬟示了线粒莽在缨藏獭亡孛魏佟溪孔4 1 。1 9 9 6 警穗稻势亵窭诱罨 c a s p a s e3 活化的三种鬣白，分别为c y t c 、a p a f - i 、e a s p a s e 9 。这样才明确了 细胞凋亡与线粒体在分子水平上的联系。 1 2 。2 + t 绥缝色素c ( c y t oe ) o 磷oc 是第一个教蕊定兹线粒髂靛缁魏藕亡分子，在摄常编施中c y t o # 位 于线粒体内、外膜之间，在电子呼i 毂传递链中起熏耍作用。但是当细胞被诱导 揭亡时，c y t oe 却可以轶线粒体释放遴入细胞旗。痿动c a s p a s e 活仡f l ”。活豫 遘程翡纂一步鸯c y t oe 与a p a f l 缀合。歪霉蘩凝下，器譬轰p a f l 含毒援蝥黢镰 合位点，但其结合a t p 戚d a t p 的挠力很弱。一艇a p a f l 与e y t oc 结合，a 脚f 1 2 硕士学位论丈 、1 s 1e r + sr l e s i 、 结合a t p 或d a t p 的亲和力至少提高1 0 倍，其原因可能是c y t oc 与a p a n 的结 合导致a p a f l 构象变化，从而打开了a p a t 上的核苷酸结合位点，或者c y t 0c 与a p a n 的结合进一步稳定了a p a f l 与a t p 或d a t p 的结合。但是c y t o c 与 a p a r t 的结合本身并不需要a t p 或d a t pu 6 】。c y t oe a p a f l 复合物与a t p d a t p 的结合激发其多聚化从而形成凋亡体( a p o p t o s o m e ) 【1 7 】。因此凋亡体是多个c y t o c a p a f l 复合物的多聚体。在凋亡体上，a p a f l 的c a r d 结构域向外暴露，以 吸引同样具有c a r d 结构域的c a s p a s c9 前体到凋亡体上来。c a s p a s e9 前体结 合到凋亡体上后将引起自活化( a u t o a c t i v a t i o n ) 。只有结合在凋亡体上的c a s p a s e 9 才能有效地切割和活化下游的效应酶，如c a s p a s e 3 t 1 3 l 。 线虫细胞凋亡与哺乳动物细胞凋亡的主要不同在于线粒体不在前者的细 胞凋亡中起作用，但却在后者的细胞凋亡中起重要作用。在线虫中，c a s p a s e 的活化是由于c e d9 从t e d3 c e d4 复合体上解离而导致的。而在哺乳动物细胞 中线粒体控制着细胞凋亡，因为在正常细胞中线粒体将一些细胞凋亡分子禁闭 在线粒体内，只有在受到细胞凋亡刺激后才释放。最近的研究进展表明，除c y t o c 外，还有其它几种线粒体蛋白可以从线粒体释放出来诱导细胞凋亡。 1 2 2 2s m a c d i a b l o s m a c d i 曲l o 是2 5 k d 的线粒体蛋白，在细胞凋亡过程中它可以从线粒体 释放进入细胞质l j 川。s m a c ( t h es e c o n dm i t o c h o n d r i a l d e r i v e da c t i v a t o ro f c a s p a s e ) ，是由核基因编码的，其n 端有5 5 个氨基酸的线粒体定位序列。当 s m a c 蛋白被转运进入线粒体后，这段序列被切去以形成成熟的s m a c 蛋白，以 与i a p s 凋亡抑制蛋白) 的b i r 构域结合【2 0 l 。i a p s 是一个很大的蛋白家族，其 成员都含有一个或多个b i r 结构域，b i r 结构域可以抑制活化c a s p a s e 的活性。 有活性的s m a c 蛋白n 端裸露的a l a 氨基酸是结合i a p $ 所必须的。因为只有 当s m a c 进入线粒体后切去信号肽，才会暴露出a l a 的残基。因此s m a c 的线 粒体定位是其发挥功能所必须的1 2 1 】 2 2 1 。活化s m a c 的n 端4 个氨基酸与活化 c a s p a s e 9 中负责与x i a p 结合的位点非常类似】。在c a s p a s c9 前体蛋白中，这 个4 肽序列不能暴露。但当c 越p a s e9 被活化后，c a s p a s e9 前体被切割成大、 小两个亚基，这个4 肽序列因此暴露，c a s p a s c9 可以与i a p 结合，这样c a s p a s e 的活化被抑制。s m a e 的功能就是拈抗活化c a s p a s e9 与i a p 的结合。除了x i a p ；曩 学能论文 v j f r 。sr l 浩、：、 的b i r 3 结构域外，s m a c 也可以通过x i a p 的b i r 2 结构域同x i a p 形成稳定 的复合物m j 。s m a c d i a b l o ( d i r e c ti a pb i n d i n gp r o t e i nw i t hl o wp i ) 与b i r 2 的缝 合氇哥辍孛帮x l a p 砖c a s p a s e9 藜捧镧； s m a c d i a b l o 、活化c a s p a s e 及熊与i a p s 之间的竞争和揣抗展示了细胞内 非常有趣的反馈调节系统。一旦c y t oc 从线粒体释放出来，c y t oc 可以以很高 故亲积性闲a p 娥结会，诱发凋亡体豹形成和c a s p a s e 的活他。僵是，如鬃鲴 瑰内存程高永平的i a p ，i a p 可酸孪窜翻漏亡谇中添纯c a s p a s e 鹃活性。这秘李牵 制很可能是不可逆的。因为绝大多数i a p 都含脊r j n g 指结构城，它可以将与 之结合的c a s p a s e 定能于蛋白酶小体0 r o t e o s o m e ) 上降解口5 1 口6 1 。这种安全保护 系统怼鬃戆来说是卡分重要静。爨麓c y t oe 是缀夺熬务子，旋线粒俸分裂、缨 胞分裂中期甚至某些厩常条件下都可能偶尔从线粒体漏出，翻此细胞内的遮个 体系保证细胞在此情况下仍能渡过“危急”状态而不至于凋亡。相反，如聚细 胞受到严夔移持续的攒恢，s m a c 将秘c y t oe 一越释放进入细臌质，c y t oc 零致 c a s p a s e 活亿，s m a c 捺抗i a p 静掷稍作蠲，导羧缩脆走淘璃亡。 s m a c 与l a p 之间的相互作用对细胞凋亡的调节并不仅仅局限于细胞凋亡 的线粒体途径。细胞袭颂死亡受体殿它们的配体( 如f a s f a s l 和t r a i l 受体t r a i l ) 毙够壹羧瘸动c a s p a s e 疆琵t 2 7 1 。毽怒由手这条邋爨窥线粒俸c y t oc 逶路在 c a s p a s e3 活化这一步骤上是重叠的。因此i a p s 识可通过对c a s p a s e3 的抑制而 关闭受体介导的细胞死亡通路。细胞如何解除i a p 对受体介搏的细胞凋亡的抑 制呢? f a s 配体和受体谯细胞表面的结合可以滔纯与f a s 受体偶联的上游 c a s p a s e8 ( c a s p a s e8j c 李x i a p 不敏慧渊，帮撞在麓拳平x i a p 存在兹猜况下穗绦 持其活性) ，切割b i d 。b i d 是一种烈含有b h 3 终构域的b c l 。2 2 家族蛋白。b i d 被切割聪其c 端可定位于线粒体导致c y t oc 和s m a c 的释放【2 9 】 3 0 l1 3 1 1 。这样c y t o c 夔释放聪导致下游c a s p a s e 妇c a s p a s e3 豹活纯， s m a e 麴转救霹以接获i a p 对c a s p a s e 的抑制，飙而傈证受体介导的细胞躅亡顺嗣实施。 1 2 2 3 凋亡诱导因子( a p o p t o s i si n d u c i n gf a c t o r ，a i f ) 凋亡诱导因子a i f 是一个5 7k d 的黄素蛋囱，与细菌氧化还原酶相似。 它定搜予线粒俸双瑟簇闽医1 3 2 l 。当凋亡竣诱导聪，a i f 霹鞋簸线粒露转经送入 细胞核，赢接导致染色质凝集和太片段d n a 降解( 5 0 k b ) m 】，舡f 的这些效应 4 硕士举慷论文 k l s f e r + sf l e $ 1 s 是不依赖于c a s p a s e 和其自身的氧化还原酶活饿的【3 3 l 。a i f 熬因敲除对动物发 育有缀大的影响。胚胎发育过程中，您胎体沟裂的形成与细胞的凋亡有关。a i f 缺失套鬣涎菸验不麓形或这些沟装。另癸缺乏a i f 憝薤戆予缁耱对维生素k 3 和血清饥饿诱导的细胞凋亡具有抗性【3 4 】。因为a i f 是一种氧化还原酶，可能在 维持线粒体的正常功能方面有重饕作用。因此现在还不清楚这些观察到的淡型 廷由予a i f 缓藏弱亡葫戆懿丧失逶楚由予a i f 畿纯还原酶涯力懿丧失。 1 2 3 内质弼渴亡信譬通路 内质网广泛存在予真核细胞中，大约l 3 蛋囱质进入内质网腔进行翻译后 的修饰、折叠和寡聚化两形成正确的构象。该过程主要依赖倦侣蛋白介导强自 蒺歪确辑叠，含量睾塞静是b i p g r p 7 8 ，宅霉零 l 蹋a t p 求瓣翁缝耋去燕速爨鑫 质的折藏和阻止蛋白质在内质网腔的堆积，使易位到内质网的蛋白质只有派确 的折叠厢才能输送到商尔基体，而没有正确折叠的蛋白质回到胞质中经2 6 s 泛 素酶降勰p ”，该反成为恢复蛋皇溪聂碴稳象所必霪，但过长辩阀或过强内溪网 应激反斑可诱导缅胞獭亡1 3 6 1 1 3 1 。 内质网在维持细胞内钙离子内环境稳定也肖很重要的意义肿1 。内质嘲是胞 内钙离子主要储存器宦，浓度为0 5 壮m o l 1 ，占总钙的1 4 ，通过内质网膜上 熬l p 3 逡逶释藏钙离予到蔻覆孛，褥逶逶c a 2 + a t p 酶凌蕤囊审戆钙豢天麴内霾 网中，作为钙库从而维持胞内锊的平衡。钙猩内质网内以离子或结合鬣自 f c a l r e t i c u l i n ) 的形式存在，c a l r e t i e u l i n 也与蛋白脯折叠及修饰肖关9 ”。其蛋囱质 摄叠部傻对胞蠹终琢境鲍变佬十分敏感。内矮蝴内环境发生内质网腔钙的溃 陈、天冬酰胺n 端耱麓讫攘裁、二虢键兹减少、突变蛋白和豢自碎片增热、过 氧化掏w 影响蛋白质的正确折叠，导致未折叠或异常蛋白在内质网腔堆积，引 起所谓的“未折叠鬣臼反应”( u n f o l d e dp r o t e i nr e s p o n s e ，u p r ) 4 0 1 * 药物如 强堙s i 躺g i 珏( 蘩半蕤爝肉蘸) 遂过季露潮蠹蒺网骥上菝羧a t p 戆钙泵嚣侵氖蹶疆 钙释放。当细胞外钙离子不能补充剐内质网时，质网钙释放，当细臆外鹊离子 不能补充到内质网时，可造成细胞内钙库耗竭m l 。u p r 和细胞内钙库耗竭均可 引起内矮网应激反应( e n d o p l a s m i c r e t i c u l u ms t r e s s ) 。 臻究袭弱蠹囊列谯凋亡售号鲶瑾过程孛发撵霪要捧溺t 霹致下辩e 黼a s e 和其他瀑白酶的激活。n a k a g a w a 婶【3 3 1 发现c m p 瓣e1 2 存在乎内质网，魁内质 5 踱圭学往论文 、1 、s ： 强sl l e s s 网应激( 如内质网钙离子内环境紊熬以及过鬟内质两蛋自积累) 诱导豹凋亡掰必 需的。当内质网钙离子动态平衡被破坏或过多蛋白积聚于内质喇时可激活 c a s p a s e1 2 ，同时也导致胞质中的c a s p a s e7 转移到内质网表面，c a s p a s e7 激 活c a s p 豁e1 2 4 1 】，激活的c a s p a s e1 2w 进一步剪切c a s p a s e3 而引发细胞凋亡。 的抗体阻断。y o n e d 等h 2 i 发现内质网成激反应时，c j u n - n 端抑制性激酶( j i 脚 活化，继而激活j n k 。j n k 使t n a f 2 ( t u m o rn e c r o s i sf a c t o rr e c e p t o ra s s o c i a t e d f a c t o r2 ) 磷酸化。磷酸化的t n a f 2 岛i r e l 形成复合物，导致t n a f 2 从其姆 c a s p a s e1 2 蓠体形成的复含铙上鳞离，c a s p a s e1 2 活化，弓l 起细胞凋亡。 t o s h i y u k i 等蒋绍憨破碎麓遮淼。分建竣、线粒薅、微粒钵( 悫震璃膜) 、 溶释褡冀，羟受疫绥蕤纯学彝w e s t e r n 馨滚证实c a s p a s e 家族孛莰c a s p a s e1 2 菇 在于内覆网貘上。霜b r e f e l d i na ( 内簇弼，高尔基俸蛋白转运搀铡剩) 、 t u m i c a m y c i n ( n 端糖基纯抑制剂) 、t h a p s i g a r g i n ( 质网膜上钙泵) 处理细胞诱繇 内质网应激反应，细胞出现凋亡，缀w e s t e r n 印迹检测发现c a s p a s e1 2 活化形 式及多聚核糖聚合酶活化，并且b i p 增加。b i p 是内质网应激反应的标志，绷 胞经f a s 抗体诱导凋亡时，c a s p a s e1 2 没有活化：c a s p a s e1 2 基因缺陷细胞经上 述药物诱导内质网应激反应时，细胞凋亡受抑制。而经死亡受体和线粒体介鼯 的凋亡途径不受影响。r o b e r t 等畔1 将神经元细胞经t h a p s i g a r g i n 处理后，细胞 融现凋亡。内质网中活性c a s p a s e1 2 和b i p 表达增加，并且活性c a s p a s e3 墩襻 在予凋亡鲴胞中，说明c a s p a s e1 2 憝肉矮嬲瘦激反应诱导凋亡的关键分子。 梵终，麦痿霹还是绥鼹内重装戆c a 2 * 贮痒，麓维持缨夔内c a 2 + 懿稳态怒鏊 簧俸麓鲻。e a 2 + 是重要鹣稳蠹僖琴转鼯弱子，施雨c 扩稳态在缨魏瘸毽生联避 程中占有举足轻重的地位，诲多绷臌以e a 2 + 作为第二信篌分子传递魏内信惑， 诱发一系列的细胞形态、生理、生化和分子生物学事件的发生。大爨研究袭明， 细胞内c d + 稳态的改变对细胞凋亡舆有重要的调控作用狮】。多种细胞凋亡的 诱导因素，包括生长因子撤除1 4 7 、激素刺激、药物处理等均可改变细胞威内 游离c a 2 + 的浓度以及亚细胞器内c d + 的分布，从而在细胞凋亡的信号通路中趣 调控作用。那些直接改变细胞内游离c a 2 + 浓度的试剂如c d + 离子载体 ( i o n o p h o r e s ) 或肌浆网内质网c a 2 + - a t p a s e 抑制剂t h a p s i g a r g i n ( t g ) 等，也可以诱 导多种类型细胞的漏亡1 4 l j 。 6 硕士学位论文 m a s t e r st ：s l s 研究表明内质网内钙失衡诱导应激反应时，激活钙蛋白激酶。活化钙蛋白 激酶切割内质网膜上的c a s p 姻e1 2 ，产生活性c a s p l s e1 2 片断；并且钙蛋白激酶 还可切割b e l - x l ，使其失活。将c 秘p a s e1 2 前体与钙蛋白激酶一起在体外孵育， 产生c a s p a s e1 2 活性片断；将活性的c a s p 踮e1 2 导入细胞，细胞出现凋亡【4 9 】。 n o b u h i r o 掣5 0 】将去除线粒体的小鼠成纤维细胞经t g 处理诱导内质网应激 反应，其结果显示：内质网反应诱导细胞凋亡时，c a g p 髂e1 2 活化启动c a s p a s e 级联反应；c a s p a s e9 前体是c a s p a s e1 2 的底物，并且c 粥p 嬲e9 的活化不需线 粒体释放细胞色素c ；细胞凋亡信号从c a s p a 1 2 传到c 嬲p 勰e9 再到c a s p a s e 3 ，c a s d 髂e3 是效应分子。但也有研究显示，用t g 阻滞内质网上的钙泵，干 扰胞内钙离子的平衡，从而影响线粒体的能量代谢，促其释放细胞色素c ，与 a p a f = - i 形成复合物，活化c a s p a s e9 ，由此认为线粒体途径与内质网应激反应途 径有一定的关联。研究还发现，内质网上的c a 2 + 释放通道( 即1 ，4 ，5 三磷酸 肌醇受体i p 3 r 和r y a n o d i n e 受体r y r ) 可能参与了c a 2 + 介导的细胞凋亡信号转 导通路【5 1 】。最近的研究显示，b c l 2 蛋白对细胞凋亡的抑制机制之一可能是通 过减少内质网内的游离c a 2 + 浓度来实现1 5 ”。 1 3 凋亡通路的调节 1 3 1p 5 3 基因 p 5 3 基因作为一种转录因子能促进或抑制很多与细胞周期及凋亡相关基因 的表达( 如p 2 1 和b a x 等) ，因此p 5 3 可通过直接或间接调节凋亡通路中多个关 键因子调控凋亡。p 5 3 对死亡受体通路和线粒体通路均有重要作用。b a x 和近 来新发现一些由p 5 3 促进转录的蛋白定位于线粒体，能影响线粒体跨膜电位， 而跨膜电位的改变是很强的凋亡信号 5 3 1 ；b e n n e t t 等发现p 5 3 能通过高尔基复合 体转运f a s 短暂促进血管平滑肌细胞表面f a s 表达，并促进f 鹊f a d d 的结合 诱导凋亡斟 ；b u m s 5 5 1 的研究发现人肿瘤细胞过表达p 5 3 能诱导该细胞凋亡，而 特异性抑制剂分别抑制c a s p a s e8 及c a s p a s e9 后均能抑制这种p 5 3 依赖的凋 亡，表明p 5 3 对死亡受体通路和线粒体通路均有影响。 1 3 2 凋亡抑制蛋白p 3 5 蛋白 p 3 5 蛋白由2 9 9 氨基酸构成，在结构上并没有明显的基元序列( m o t i f ) ，其 颁士学位论文 、 、s 1 i u r st i ie ，| 、 缩构中唯一明鼹的特征是分子中几个带呶残基的集簇，如分子中央及c 末端富 宙赖氨酸的结构域和n 末端的高电荷结构域，b e r t i n 等将n 末端的高电荷结 梭城分成c h r l 、c h r 2 帮c h p o 矧。b e r t i n 等人通过据记挽救实验诞疆了p 3 5 静c 末漆裙n 寒端对于p 3 5 麓能静重要稳，i ) 3 5n 束漆( 1 1 5 2 ) 瓣予突变最 敏感，在9 个捅八突变体中8 个能引起p 3 5 功能的消炎。p 3 5 的抗凋亡作用很 广泛，能在不同的动物中抑制细胞凋亡。a c m n p v 编粥的p 3 5 能农线虫纲、 熬受缨寒噬襞缨孛舞秘缨藏弼亡，接浏箕圾虿轻在凌亡途径上与一耱稳对毙较 保守的成分起作用，即执行毵亡的c a s p a s e 酶类。p 3 5 憝在8 7 位上的a s p 和 8 8 位的g l y 间断裂的，p 3 5 同c e d - 3 i c e 蛋白酶相豆作用，结果p 3 5 在 d q m d 8 7 g 勉或其耐近被势切，由其叛裂产物介导掷铡c e d - 3 心e 蛋自酶 瓣。 1 ，3 3b c l 一2 家族 迄今为止发现的b c l - 2 家族同源蛋白不少于1 5 种，均禽有一种以上b c l - 2 家 骏共专运源痔列( b h l - b h 4 ) 。按结季窀功熊不麓分蘸揭亡餐爨窝抗凋亡蛋白。嚣 蠲亡蛋白均含b h 3 结构域，多数抗凋亡骚自含b h i 鞫b h 2 区，与b c l - 2 高度 嗣源的含1 4 四个区。前凋亡蛋白主要有b a x ，b c l - x s ，b a k ，b a d ，b i k ，b i m ，b i d ， 壬 r k 和b o k ；抗凋亡蛋自主鼗有b c l 2 ，b c l * x l ，m c l 1 a 1 b f l - i 和b c l - w 。前凋亡 蘩鑫之阂、