（环境工程专业论文）耐盐硝基苯降解菌特性分析及其部分基因克隆.pdf

大连理工大学博士学位论文 摘要 硝基苯废水成分复杂，常含有大量对微生物有抑制作用的盐。基于此，本论文驯化、 筛选耐盐硝基苯降解菌，对其进行生理生化鉴定，研究其耐盐和降解硝基苯特性。在此 基础上，对其降解硝基苯代谢基因进行定位，并进一步利用现代分子生物学技术克隆到 部分基因并对其进行了生物信息学分析。 从活性污泥中驯化分离到2 株耐盐硝基苯降解菌，通过形态观察、生理生化分析、 g + c 含量分析和1 6 sr d n a 分析分别鉴定为s t r e p t o m y c e ss p d u ta h x 和m i c r o c o c c u s s p d u ta h x ，其1 6 sr d n a 序列的g e n b a n k 登录序列号分别为d q 4 0 9 0 8 0 和 d q 4 0 9 0 8 1 。 s t r e p t o m y c e ss p d u ta h x 的最适生长与降解条件为：温度3 0 0 c ，p h7 0 ，转速15 0 r m i n ，菌株在唯一碳源培养基中可耐受的最大硝基苯浓度为9 0 0m g l 。m i c r o c o c c u ss p d u ta h x 的最适生长与降解条件为：温度3 7 0 c ，p h7 0 ，转速1 5 0r m i n ，菌株在唯一 碳源培养基中可耐受的最大硝基苯浓度为6 0 0m g l 。2 株菌在以硝基苯为唯一碳、氮和 能源的无机盐培养基中生长和降解硝基苯过程中均释放出n h 4 + ，但未检测到n 0 2 。在 8 0h 内2 株菌株对硝基苯的降解率分别为9 8 8 和9 7 6 ，t o c 去除率为9 9 2 和9 8 1 ， 表明硝基苯最终被矿化为二氧化碳和水。2 株菌的粗酶主要以2 一氨基酚1 , 6 一双加氧酶活 性为主。这2 株菌降解硝基苯的途径可能都是好氧部分还原途径。 s t r e p t o m y c e ss p d u ta h x 是一株中度耐盐细菌。在盐胁迫下某些相容性溶质如甘 氨酸、脯氨酸、谷氨酸、甜菜碱、四氢嘧啶都能更好的促进其生长，其中甘氨酸的效果 最明显，四氢嘧啶的效果最差。利用s d s p a g e 和非变性梯度p a g e 电泳分析了盐胁迫 或硝基苯诱导下s t r e p t o m y c e ss p d u ta h x 蛋白质的合成变化，其中一些蛋白质的合成 被抑制；一些蛋白质的合成被增强；一些起主要调节作用的盐或硝基苯诱导蛋白被重新 合成。将非变性梯度p a g e 凝胶上的大小为1 4 1k d a 的硝基苯诱导蛋白条带切胶电洗脱 回收，其具有2 氨基酚1 , 6 双加氧酶活性，其活性大小为5 8 2 5i t m o l m i n m gp r o t e i n ，该 蛋白是s t r e p t o m y c e ss p d u t a h x 降解硝基苯代谢途径中的2 氨基酚1 ，6 双加氧酶。 从s t r e p t o m y c e ss p d u ta h x 提取到一大小约为1 7k b 的质粒p s n b l 。采用提高生 长温度和s d s 法相结合消除质粒，筛选到一质粒消除菌株a h x 4 ，失去了氨苄青霉素 抗性和降解硝基苯的能力。将质粒p s n b l 经c a c l 2 热激转化法进入大肠杆菌j m l 0 9 感 受态细胞，筛选到一个可在以硝基苯为唯一碳源的无机盐平板上生长的转化大肠杆菌阳 性子a h x j m l 0 9 ，其降解硝基苯的能力大大降低。质粒p s n b l 与s t r e p t o m y c e ss p d u t a h x 的抗性基因和降解硝基苯的基因有关，而与耐盐基因无关。 耐盐硝基苯降解菌特性分析及其部分基因克隆 以质粒p s n b l 为模板和r e d f 、r e d r 为引物的简并降落p c r 扩增到一大小为4 6 5b p 的基因片段，氨基酸序列检索表明，其与m a r i n ea c t i n o b a c t e r i u mp h s c 2 0 c 1 的y h s 域 蛋白的同源性较高；设计特异性引物进行盒式连接介导p c r ，拼接得到大小为2 0 2 6b p 的序列，开放阅读框分析发现一个编码1 2 6 个氨基酸的o r f ，属于y h s 域蛋白，其代 表的基因可能是s t r e p t o m y c e ss p d u ta h x 的硝基苯硝基还原酶基因p p ha h x ，其 g e n b a n k 中登录的序列号为e f 9 9 8 8 7 4 。生物信息学分析表明，p p ha h x 基因编码的蛋 白理论等电点为4 8 ，理论分子量为1 3 4 9 0 8 9k d a ，为一位于细胞质的弱酸性、水溶性 球状蛋白。通过不同程序预测其二级结构和三级结构，并构建了该蛋白部分三维结构模 型。 关键词：硝基苯；耐盐；诱导蛋白；质粒；基因 大连理工大学博士学位论文 t h ec h a r a c t e r i s t i ca n a l y s i sa n dp a r t i a lg e n ec l o n eo fn o v e ls a l t - t o l e r a n t b a c t e r i ac a p a b l eo fd e g r a d i n gn i t r o b e n z e n e a b s t r a c t t h ep u r p o s eo ft h i sd i s s e r t a t i o ni st oi n v e s t i g a t et h ec h a r a c t e r i s t i c sa n dt h ep a r t i a lg e n eo f n o v e ls a l t - t o l e r a n tb a c t e r i ac a p a b l eo fu t i l i z i n gn i t r o b e n z e n e ( n b ) a st h es o l ec a r b o n ，n i t r o g e n a n de n e r g ys o u r c e s t h ee x p l o i t a t i o no fs a l t - t o l e r a n tb a c t e r i aw o u l db ear e m a r k a b l e i m p r o v e m e n ti nn bb i o r e m e d i a t i o n a n dw a s t e w a t e rt r e a t m e n ti nh i g h s a l i n i t y t h e p h y s i o l o g i c a la n db i o c h e m i c a lt e s t sa n d16 sr i b o s o m a ld n a ( r d n a ) s e q u e n c ea n a l y s i sw e r e c a r r i e do u t 1 1 l ec h a r a c t e r i s t i c so ft o l e r a t i n gs a l ta n dd e g r a d i n gn bo fs t r e p t o m y c e ss p d u ta h xa n dm i c r o c o c c u ss p d u ta h xw e r ea l s oi n v e s t i g a t e d m e a n w h i l e c a t a b o l i c g e n e so fd e g r a d i n gn bw e r el o c a l i z e d t h ep a r t i a lg e n ew a sc l o n e db ym o d e mm o l e c u l a r b i o l o g i c a lt e c h n i q u e sa n dt h e nw a sa n a l y z e db yb i o i n f o r m a t i c st e c h n i q u e s t w on o v e ls a l t t o l e r a n tb a c t e r i as t r e p t o m y c e ss p d u ta h xa n dm i c r o c o c c u ss p d u ta h x ，w h i c hw e r ei s o l a t e df r o mt h es l u d g ea n dc o u l du t i l i z en b 弱t h es o l ec a r b o n n i t r o g e na n de n e r g ys o u r c e s ，w e r ei d e n t i f i e do nt h eb a s i so fp h y s i o l o g i c a la n db i o c h e m i c a l t e s t sa n dl6 sr d n as e q u e n c ea n a l y s i s ，t h e16 sr 【小i as e q u e n c e so fs t r e p t o m y c e ss p d u ta h xa n dm i c r o c o c c u ss p d u ta h xw e r es u b m i t t e dt og e n b a n kw i t ht h ea c c e s s i o n n u m b e rd q 4 0 9 0 8 0a n dd q 4 0 9 0 8 1 ，r e s p e c t i v e l y t h eo p t i m a ld e g r a d a t i o na n dg r o w t hc o n d i t i o n so fs t r e p t o m y c e ss p d u t a h xa r e 嬲 f o l l o w s ：t e m p e r a t u r e3 0 0 c 。p h7 0a n ds h a k i n gs p e e d15 0r m i n i tc a ng r o wi nt h ep r e s e n c e o fn bu pt o9 0 0m g li nm i n e r a ls a l t sb a s a l ( m s b ) m e d i u m 1 1 1 eo p t i m a ld e g r a d a t i o na n d g r o w t hc o n d i t i o n so fm i c r o c o c c u ss p d u ta h xa l e 勰f o l l o w s ：t e m p e r a t u r e3 7 0 c p h7 0 a n ds h a k i n gs p e e d15 0r m i n i tc a ng r o wi nt h ep r e s e n c eo fn bu pt o6 0 0m g li nm s b m e d i u m b e s i d e s n b g r o w nc e l l si nm s bm e d i u mc a nd e g r a d en bw i t ht h ec o n c o m i t a n t r e l e a s eo fa m m o n i a t h en bd e g r a d a t i o nr a t eo fs t r a i n1 群a n ds t r a i n2 稃w e r e9 8 8 a n d 9 7 6 i n8 0ha n dt o cr e m o v i n gr a t ew e r e9 9 2 a n d9 8 1 t h u s n bi sm i n e r a l i z e dt o c 0 2a n dh 2 0 t h ee n z y m ea c t i v i t y t e s t ss h o wt h a tc r u d ee x t r a c t s m a i n l yc o n t a i n 2 - a m i n o p h e n o l1 , 6 - d i o x y g e n a s ea c t i v i t y t h u s ，t 1 1 e ym a yi n v o l v eap a r t i a lr e d u c t i v ep a t h w a y o fd e g r a d i n gn i t r o b e n z e n e s t r e p t o m y c e ss p d u ta h x c a nt o l e r a t em o d e r a t e l yn a c lb u td o e sn o tr e q u i r en a c lf o r g r o w t h h e n c e ，i ti sn o th a l o p h i l i cb u th a l o t o l e r a n t 1 1 1 ee x o g e n o u s l ya d d e do s m o p r o t e c t a n t s s u c ha s g l y c i n , g l u t a m i ca c i d ，p r o l i n e ，b e t a i n ea n de c t o i n ec a ni m p r o v eg r o w t ho f s t r e p t o m y c e ss p d u t - a 似i nt h ep r e s e n c eo f10 ( w v ) n a c i t h ep r o t e i n si n d u c e db y i i i 耐盐硝基苯降解菌特性分析及其部分基因克隆 s a l i n i t ys t r e s so rn bw e r ea n a l y z e db yn a t i v e - g r a d i e n tp o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s ( p a g e ) a n ds o d i u md o d e c y ls u l f a t e ( s d s ) - p a g e t h e r ew e r et h r e ep r o m i n e n tt y p e so f m o d i f i c a t i o n s ，w h i c hs e v e r a lp r o t e i n sw e r ed e c l i n e d ，c e r t a i np r o t e i n sw e r ee n h a n c e da n ds o m e p r o t e i n sw e r ei n d u c e dd en o v o i nn b - i n d u c e dp r o t e i n sd en o v o 14 1k d ap r o t e i no nt h e n a t i v e g r a d i e n tp a g eg e lw a se x c i s e da n de l e c t r o e l u t e d f u r t h e r m o r e e n z y m et e s t se x h i b i t t h e 2 - a m i n o p h e n o l1 , 6 d i o x y g e n a s ea c t i v i t y o f p u r i f i e d 1 4 1k d ap r o t e i ni s5 8 2 5 p m o l m i r d m gp r o t e i n ，w h i c hi sl l - f o l dt h a to ft h ec e l l f r e ee x t r a c t s t h u s ，14 1k d ap r o t e i ni s t h e2 - a m i n o p h e n o l1 6 一d i o x y g e n a s eo fs t r e p t o m y c e ss p d u ta h x a17 一k bp l a s m i dw a sd e t e c t e di ns t r e p t o m y c e ss p d u ta h xa n dd e s i g n a t e dp s n b1 t h eu s eo fe l e v a t i n gg r o w t ht e m p e r a t u r et o g e t h e rw i t l ls d sw a se f f e c t i v ei nc u r i n gt h e p l a s m i dp s n b 1 ac u r e dd e r i v a t i v ed e s i g n a t e da h x gl o s tn b d e g r a d a b i l i t ya n da m p i c i l l i n r e s i s t a n c e m o r e o v e r , p s n b 1w a ss u c c e s s f u l l yt r a n s f o r m e di n t oec o l ij m 10 9c o m p e t e n t c e l l sb yc a l c i u mc h l o r i d em e t h o da n do n et r a n s f o r m a n tah x - j m10 9c a p a b l eo fd i v 独创性说明 作者郑重声明：本博士学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工 作及取得研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外， 论文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，也不包含为获得大连理 工大学或者其他单位的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的贡献均已在论文中做了明确的说明并表示了谢意。 作者签名：亟l 盘查日 甘h 珂、厂 期： 大连理工大学博士研究生学位论文 大连理工大学学位论文版权使用授权书 本学位论文作者及指导教师完全了解“大连理工大学硕士、博士学位 论文版权使用规定”，同意大连理工大学保留并向国家有关部门或机构送 交学位论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权大连理 工大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，也 可采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编学位论文。 作者签名鲎遣垫 导师签名：嗡化 竺生年j 月蚯 大连理工人学博士学位论文 1 硝基苯废水处理和硝基苯生物降艉研究进展 近儿年来，世界经济处于高速发展阶段，中国、印度、俄罗斯和巴西更是被誉为世 界新兴经济体中的“金砖四国”，但同时环境污染问题也日益严重。仅2 0 0 7 年国内就发 生多起重火的环境污染事件，例如，云南滇池久治不愈的蓝藻污染，江苏太湖和安徽巢 湖先后暴发监藻污染，武汉东湖大规模死鱼事件，江苏沭阳水源污染事件等等。当今社 会环境污染问题日益严重，对国民经济发展和人民身体健康已构成严重威胁如何走出 经济发展与能耗污染并行的两难困境，创造自然与社会和谐相处的新发展道路是每一 个中国人都不能不面对、也不能不解决的终极命题。 圉1 i2 0 0 5 年1 1 月硝基苯污染的松花扛 f i g 】1s o n g h 岫r i v e r p o l l u t e db yn i t r o b e n z e n e i n n o v e m b e r2 0 0 5 随着现代化工业，尤其是医药、农药、染料、炸药以及塑料等化工行业的快速发展， 作为重要化1 二原料的硝基苯被大量释放到环境中，由于硝基苯的高毒性和难生物降解 性，造成硝基苯在自然环境中的长期沉积，已严重威胁到人和其他生命体的生存【ij ：尤 其是2 0 0 5 年11 月1 3 日中石油吉林石化公司双苯厂爆炸导致大量硝基苯和苯进入松花 江，造成严重的松花江污染事件( 罔11 、12 ) ，更将世人的目光重新聚焦到1 5 1 益严重的 硝基苯环境污染问题上。 目前，已发展了众多硝基苯废水处理方法，主要有物理法、化学法和生物法。由于 生物法具有处理成本低、运行管理简单、无二次污染和处理效果显著等独特的优势而备 受青睐口j 。目前，已经分离纯化到多种高效降解硝基苯的微生物并对其降解机理、代谢 途径和基冈调控机制进行r 深入研究。但硝基苯废水一般是高盐的有机废水j ，普通的 耐盐硝基苹降解菌特性分析及其部分基因克隆 微生物在高盐条件下生长和代谢被抑制，使传统生物处理方法的效率太大降低 4 1 ，而对 于高盐条件下硝基苯的生物降解研究较少，因此开展耐盐微生物高盐条件下降解硝基苯 的研究为生物法处理高盐的硝摹苯废水提供了理论和现实的意义。 图12 硝基苯污染导致的橙花江死鱼 f i g 12d e a d f i s ho f s o n g h u a r i v e r p o l l u t e db yn i t r o b e n z e n e l1 硝基苯废水处理研究进展 1 1 1 硝基苯的物理化学性质 古脯 图13 硝基苯的化学结构 f i g 13c h e m i c a is t r u c t u r eo f n i t r o b e n z e n e 纯的硝基苯是无色油状液体，工业品常因含杂质而显淡黄色，有苦杏仁汕味，所以 又称人造苦杏f 油。分子式是c 6 h s n 0 2 ( 如图13 ) ，熔点57 0 c ，闪点8 78 。c ，沸点2 1 08 。c ， 相对密度12 0 3 7 ( 2 0 4 0 c ) 硝基苯的主要环境参数如表11 所示。难溶于水、酸、碱， 溶于乙醇、乙醚、苯等。苯环易发生亲电取代，不易发生氧化反应，且硝基是强钝化基。 冈此，硝基苯须在较强的条件下才发生亲电取代反应生成间位产物。硝基苯主要_ l j 于 大连理工大学博士学位论文 生产苯胺、染料、炸药等有机合成物的原料和中间体。硝基苯毒性较强，吸入大量蒸气 或皮肤大量沾染，可引起急性中毒，使血红蛋白氧化或络合，血液变成深棕褐色，并引 起头痛、恶心、呕吐等。因此，硝基苯已被美国环保署、欧盟和中国等列为环境优先控 制污染物【5 ，6 1 。 表1 1硝基苯的主要环境参数 t a b 1 1e n v i r o n m e n t a lp a r a m e t e r so fn i t r o b e n z e n e 环境参数值 分子量 水溶解度( s ) 蒸气压( p v ) 辛醇一水分配系数( r o w ) 沉积物- 水分配系数( k o c ) 生物转化和降解系数( ) 生物富集系数( b c f ) 危险标记 1 1 2 硝基苯废水的来源和危害 硝基苯是染料、医药、农药、炸药、橡胶和塑料等众多有机化合物的原料和中间体， 还是重要的有机溶剂，其最重要的用途是生产苯胺和染料。因此，硝基苯废水一般主要 由硝基苯和苯胺组成，另外还含有少量的苯、硝基酚和二硝基苯等有机化合物及大量的 无机盐( 主要是n a c i 和n a 2 s 0 4 ) 例。 硝基苯密度大于水，在水中具有极高的稳定性，进入水体的硝基苯会沉入水底，长 时间保持不变；其在水中又有一定的溶解度，所以造成的水体污染会持续相当长的时间。 水中的硝基苯常以黄绿色油状物沉在水底，当浓度为5m g l 时，水体呈黄色，有苦杏 仁味；当浓度超过3 3m g l 时，能造成水中生物如鱼类等死亡；当浓度达到1 0 0m g l 时，水几乎是黑色，并有黑色沉淀。中国对硝基苯在废水排放标准中的浓度有严格的规 定( g b8 9 7 8 1 9 9 6 ) ，一级标准要求不超过2m g l ，二级标准要求不超过3m g l ，三级标 准要求不超过5m g l 。 硝基苯对人体的毒性机理主要表现在：( 1 ) 形成高铁血红蛋白的作用：主要是硝基 苯在体内生物转化所产生的中间产物对氨基酚、间硝基酚等的作用。( 2 ) 溶血作用：发 生机制与形成高铁血红蛋白的毒性有密切关系。硝基苯进入人体后，经过转化产生的中 间物质，可使维持细胞膜正常功能的还原型谷胱甘肽减少，从而引起红细胞破裂，发生 一一一弭弘姗一 圪贬锵 3 z 心 耐盐硝基苯降解菌特性分析及其部分基因克隆 溶血。( 3 ) 肝脏损害：硝基苯可直接作用于肝细胞致肝病变，引起中毒性肝病、肝脏脂 肪变性，严重者可发生亚急性肝坏死。( 4 ) 肾脏损害：急性中毒者还有肾脏损害的表现， 此种损害也可继发于溶血。 1 1 3 硝基苯废水处理技术 硝基苯废水成分复杂，通常含有多种有毒难降解的化合物和高浓度的盐，一般难以 用常规的方法处理，因此，几十年来发展了众多物理、化学和生物处理方法。 ( 1 ) 吸附法 吸附法是通过某些介质的表面如活性炭、树脂和膨润土等对有机物的吸附作用，将 污染物从废水中除去，通过解吸可以回收有机物。吸附法主要用于预处理和深度处理， 缺点是成本高和需要再生，所以低成本吸附剂的研制成为研究热点。徐中其等【7 】用活性 炭纤维( a c f ) 作为一种新型的吸附材料处理硝基苯废水，该材料处理硝基苯废水吸附量 较大，可达到2 1 4m g g ，吸附速度快，其吸附与解析量基本一致。毛连山等【8 】采用h 1 0 3 树脂吸附法处理硝基苯废水，表明h 1 0 3 树脂吸附性能好于c h a 1 11 树脂，酸性条件 下吸附性能好于碱性条件，甲醇脱附性能好于其它脱附剂。顾曼华等【9 】用氯化十六烷基 吡啶( c p c ) 和溴化十六烷基三甲铵( c t m a b ) 改性膨润土，对硝基苯的吸附效率提高了4 5 倍，c t m a b 膨润土比c p c 膨润土处理效果好。膨润土吸附硝基苯主要通过表面活性剂 的非极性脂肪链的萃取作用进行。尽管改性的有机膨润土的吸附效率大大提高，但其吸 附效率仍然不高，远低于活性炭和树脂的吸附效率。 ( 2 ) 萃取法 萃取法是利用与水不相溶的萃取剂将废水中的有机物去除，萃取剂和有机物都可以 回收利用。苯是常用的萃取剂，林中祥等【lo 】以苯作萃取剂预处理硝基苯废水，使硝基苯 浓度降到1 0m g l 以下，再用水蒸气汽提，使苯浓度降至3m g l 以下，达到国家二级 排放标准。但苯在水中也有一定的溶解度，因此该方法会造成苯的二次污染。沙耀武等 【l l 】用四氯化碳作萃取剂处理高浓度硝基苯类废水，由于四氯化碳在水中溶解度极小，萃 取效率较高，硝基苯去除率达到9 6 ，因此是一种比较理想的萃取剂。n a k a i 等【1 2 】在逆 流萃取器中采用超临界c 0 2 萃取法处理硝基苯废水，理想条件下可完全去除硝基苯。 萃取法虽工艺简单，去除效率高，可二次回收，但也较易造成二次污染。同时，可 选择的萃取剂有一定的局限性，硝基苯在两相内有一定的分配系数。因此，当处理浓度 较高的硝基苯废水时，效果较差。寻找低成本、溶解度小、水分配系数大的萃取剂并辅 以其它工艺处理硝基苯废水成为今后发展的方向。 ( 3 ) 超声波法 大连理工大学博士学位论文 超声波法是利用超声波的空化效应和非线性振动产生的辐射力降解有机物。超声波 的空化效应可产生局部高温，进而产生强氧化剂羟基自由基；超声波的非线性振动可形 成具有周期性激波的锯齿波面和各种直流定向力，从而导致硝基苯苯环裂解。熊宜栋1 1 3 j 采用不同频率和强度的超声波以多种方式对模拟和实际硝基苯废水处理，硝基苯降解率 和c o d 去除率可达到9 2 和8 7 。h u n g 等1 1 4 j 进一步研究了f e o 促进超声波还原降解硝 基苯的机理与动力学。 ( 4 ) 氧化法 化学氧化法是处理硝基苯废水常用的一种方法，常用的氧化剂有次氯酸钠、氯气、 过氧化氢和臭氧等。其特点是反应速度快、去除率高，但耗电量大、成本高，而且很多 氧化剂有毒，较难处理，易造成二次污染。臭氧是使用较多的氧化剂，赵军l l5 】采用臭氧 处理含硝基苯和苯胺的废水，硝基苯和苯胺的去除率可分别达到9 9 和9 5 。l a t i f o g l u 等【l6 j 采用臭氧和紫外光技术处理硝基苯废水，取得良好的效果。石枫华等【i 7 】采用臭氧和 过氧化氢复合氧化剂使硝基苯的氧化速率比单一氧化剂臭氧或过氧化氢显著加快。 近年来采用f e n t o n 试剂作为氧化剂成为新的热点，黄晓东等l l 埘认为h 2 0 2 主要影响 可生化性和降解率，f e 2 + 主要影响反应动力学。c h a m a r r o 等【1 9 】用低剂量的f e n t o n 试剂 预氧化硝基苯废水能提高其可生化性。田依林等【2 0 】利用f e n t o n 试剂处理硝基苯，f e 2 + 与h 2 0 2 反应生成自由基，并且在适宜p h 条件下生成f e ( o h ) 3 ，既可以氧化硝基苯又具 有一定的絮凝作用。傅厚暾等【2 l 】更将f e n t o n 试剂和超声波联用处理硝基苯废水，取得 良好的降解效果，进一步分析了其降解产物。使用f e n t o n 试剂处理时用量较大，处理成 本较高，难以投入实际应用。 催化氧化技术最近几年发展迅速，尤其是光催化氧化技术成为近几年的研究热点。 h 2 0 2 和0 3 在紫外光照射下可激发羟基自由基和其它某些激发态物质，可氧化有机污染 物【2 2 。r o d r i g u e z 等【2 3 】利用紫外光对水相中的硝基苯进行光降解，其原理是利用紫外光 的能量使水溶液中产生羟基自由基氧化硝基苯，但仅紫外光产生羟基自由基的效率较 低，因此使用h 2 0 2 和f e 3 + 促进羟基自由基的产生效率。实验结果表明，h 2 0 2 的效果比 f e ”强，在紫外光照射下h 2 0 2 很容易分解成羟基自由基，可以大大提高紫外光降解硝基 苯的效率。胡德文等1 2 4 1 也证明了h 2 0 2 、f e 2 + 和紫外光体系降解硝基苯的效率大大提高， 浓度为5 0m g l 的硝基苯仅经过l h 的光降解，去除率可达9 1 7 以上。t i 0 2 作为催化 剂光降解硝基苯的研究成为新的研究热点。t i 0 2 化学稳定性高，耐光腐蚀，无毒无害， 是比较理想的催化剂。其原理是硝基苯和氧化剂吸附到催化剂表面的活性中心上，发生 催化氧化反应，产物随后从催化剂表面脱附回到溶剂主体。程沧沧等【2 5 】以t i 0 2 为催化 耐盐硝基苯降解菌特性分析及其部分基因克隆 剂、f e n t o n 试剂为氧化剂光降解硝基苯类化合物，降解率高达9 6 。t a d a 等【2 6 】开展了 a g t i 0 2 光催化还原硝基苯成苯胺的研究，效果理想。 超临界水氧化技术是近年来迅速发展起来的一种处理有机废水的高新技术，其原理 是水在超临界状态下物理和化学性质发生显著的变化，能与有机物和氧气以任意比例互 溶，成为一种理想的介质。所以，当有机废水加温加压至超临界状态时，有机污染物和 氧气能充分溶解于超临界水中，在均相中反应，不受相间传递和氧浓度的限制，反应速 度极快，可在短时间内达到很高的有机污染物去除率。赵东风等【27 j 利用超临界水氧化技 术处理硝基苯废水，当硝基苯为2 5 0 0m g l 时，仅1 0m i n ，硝基苯去除率高达9 9 9 。 超临界水氧化技术快速，高效，可彻底降解有机污染物为二氧化碳和水，无二次污染， 但需高温高压的反应条件，反应器腐蚀较严重，处理成本较高。 ( 5 ) 电化学法 非平衡等离子体技术在治理环境污染的过程中日益受到重视，电子束技术、电水锤 技术、气液混合体脉冲电晕技术都展现了良好的应用前景。郭香会等【2 8 】利用脉冲放电等 离子体处理硝基苯废水，其原理是脉冲放电非平衡等离子体为无需辐射屏蔽的高能电子 源，具有形成自由基的能量，高能自由电子促使环境物质激发裂解或电解，生成自由基； 同时还能利用放电形成的紫外线和臭氧。其研究结果表明，酸性和碱性条件更有利于硝 基苯的降解。李劲等 2 9 1 利用电流体直流放电降解水中的硝基苯，硝基苯为5 0m g l 时， 经过2 次放电，降解率可达8 0 ，且裂解苯环生成丙酮等小分子物质。新型催化电极活 性炭纤维电极能通过电化学过程产生自由基，并具有导电、吸附和催化的多种性能。朱 先军等【3 0 l 的研究表明玻璃碳电极对硝基苯的电还原有很高的催化活性。李玉平等【3 l 】研究 了硝基苯在碳纳米管电极上的电化学行为。宋卫锋等【3 2 】的研究表明d s a 类电极能有效 催化降解硝基苯，降解过程符合一级动力学模型。傅敏等【3 3 】更把超声波技术与电化学技 术结合协同降解硝基苯。 ( 6 ) 生物法 物理化学法处理硝基苯废水尽管处理效率高、工艺相对简单，但反应条件一般有特 殊要求、处理成本较高、易造成二次污染，难以大规模应用到实际废水处理工程中。相 比较而言，生物法处理硝基苯废水处理成本较低、运行管理简单、无二次污染，且微生 物具有较强的变异性、驯化适应性，适用于各种类型和条件的废水，易于大规模应用到 实际废水处理工程中【2 】，但同时硝基苯的生物难降解性和硝基苯废水的复杂性使传统的 活性污泥等生物处理方法降解硝基苯的处理效果较差，因此先以物化法预处理，改进废 水可生化性，再以生物法处理，在实际硝基苯废水处理工程中得以大规模应用。o r s h a n s k y 等【3 4 】采用吸附生物降解工艺处理硝基苯废水，先用具有强吸附能力的活性炭吸附废水 一6 一 大连理工大学博士学位论文 中的大部分有毒污染物，再在低浓度下生物降解硝基苯类化合物，处理效果理想。任源 等【3 5 】采用厌氧好氧工艺处理硝基苯废水，硝基苯降解率高达9 9 ，c o d 去除率达到6 5 以上。蔡天明【3 6 】采用微电解与生化工艺结合处理硝基苯类废水，废水的c o d 去除率为 8 6 ，硝基苯的去除率达到9 9 。张键等【37 j 采用f e n t o n 试剂一微电解一厌氧滤池一序批式 活性污泥法工艺处理高浓度硝基苯类废水，c o d 总去除率大于9 9 ，出水达到国家一 级排放标准。 1 1 4 盐对生物处理方法的影响 高盐废水一般指含有有机物且含有至少3 5 的总溶解固体物( t o t a ld i s s o l v e ds o l i d ， t d s ) 的废水，除含大量有机污染物外，还含有大量的无机盐，如c i 。、s 0 4 2 - 、n a + 和c a 等【3 8 j 。硝基苯废水成分复杂，除含有硝基苯和苯胺等有机污染物外，还含有大量对微生 物有抑制作用的盐。z o b e l l t 3 9 】于1 9 3 7 年首次通过实验研究了盐对有机废水处理的影响， 用分别来自于生活污泥、土壤和海水的微生物处理含盐废水，发现在含盐2 8 介质中三 种不同来源的微生物的存活率分别为0 、小于1 和小于2 。众多研究 4 0 a 1 】表明，当废 水中的盐度高于8g l 时，常规生物处理系统受到的冲击较大，影响处理效率，盐度越 大，影响越严重。盐度超过5 的废水一般不能用常规的生物法处理。盐对常规生物法 的影响主要有以下三个方面 4 2 - 4 8 】： ( 1 ) 对出水水质影响：当系统受高盐废水冲击时，系统有机物去除率降低，微生物 呼吸速率降低，污泥指数( s v i ) 增大，出水生化需氧量( b o d 5 ) 升高，盐度突增2 就能对 系统产生显著破坏。 ( 2 ) 对微生物活性影响：盐度的增加能破坏微生物的代谢活力和降低微生物的降解 能力，微生物内源呼吸速率降低。在含盐3 5 的系统中，每毫克污泥( m l v s s ) 降解总有 机碳( t o c ) 能力从0 3m g h 降低到0 1 2m g h 。 ( 3 ) 对微生物种群的影响：盐度的增加使处理系统中的原生动物和丝状微生物减少， 出水悬浮物浓度较高( 一般高于1 0 0r a g l ) 。实际高盐废水处理系统中微生物的种群发生 明显变化，高盐环境中存在的原核微生物主要是黄杆菌、盐杆菌、脱硫弧菌、变异微球 菌、盐副球菌等耐盐和嗜盐微生物。原生动物的种类随盐度的不同有所变化，当含盐低 于8 l 时，有大量轮虫、游泳性纤毛虫、有柄纤毛虫和其它高级原生动物；当含盐8 1 3 l 时，以游泳性纤毛虫和不活跃的有柄纤毛虫为主：当盐浓度为2 0g l 时，原生动物 和丝状菌消失，仅剩菌胶团。含盐环境中也存在少量浮游生物，当含盐低于6g l 时， 啮蚀隐藻占优势地位；当含盐6 1 2g l 时，尖尾蓝隐藻占优势地位；随着盐浓度的增加， 浮游动物的优势种演替趋势为：桡足类一轮虫一桡足类和游仆虫。 耐盐硝基苯降解菌特性分析及其部分基因克隆 1 1 5 耐盐微生物的应用 有鉴于盐对传统生物处理方法的影响，在含盐废水进入生物系统前，常先采用脱盐 预处理措施如离子交换、电渗析、反渗透等去除盐分，但这常导致处理成本大大增加【4 9 1 ， 直接改进生物处理系统，尤其是含耐盐或嗜盐微生物的活性污泥的驯化和开发成为新的 研究热点，对耐盐微生物的研究也逐渐成为大家所关注的焦点【5 0 , 5 1 】。 ( 1 ) 耐盐微生物的分类 k u s h n e r 5 2 1 根据微生物在不同盐浓度下的生长情况将其划分为非嗜盐微生物、弱嗜 盐微生物、中等嗜盐微生物、极端嗜盐微生物和耐盐微生物( 表1 2 ) 。必须在有盐情况下 才能生长的微生物为嗜盐微生物；在有盐和无盐条件下均能生长的非嗜盐微生物为耐盐 微生物。尽管不少嗜盐菌在不同的培养条件下如营养条件、p h 和温度等，会具有不同 的最适生长盐浓度，但到目前为止，国内外基本是按照上述标准划分的【5 3 - 5 6 1 。 表1 2 耐盐微生物的分类标准 t a b 1 2c l a s s i f i e dc r i t e r i ao ft h es a l t - t o l e r a n tm i c r o o r g a n i s m ( 2 ) 耐盐微生物的耐盐机理 耐盐微生物的细胞在外界环境渗透压胁迫下的应激反应可以划分为3 个阶段：即短 期k + 的积累，中期相容性溶质的积累和长期蛋白质的调节。 离子调节机理 耐盐微生物细胞内k + 的浓度是细胞外的1 0 0 倍左右，而细胞外n a + 的浓度是细胞内 的4 倍，因此耐盐微生物具有灵活的吸钾排钠的生理功能以适应盐的胁迫【5 7 击o 】。k + 在耐 盐微生物细胞内含量较高，其浓度在一定范围内与培养基渗透压成正比，而且其在细胞 内的含量与耐盐微生物对高渗透压的耐受能力成正相关性【6 1 1 。与n a + 相比，k + 直径较小， 水合程度低，对生物大分子的作用较弱，积累少量的k + 能提高细胞内的渗透压，而且 对细胞的毒害作用较小。但是，k + 在细胞内积累的浓度是有限的，导致对渗透压的提高 作用较小。k + 渗透胁迫时在细胞内积累的主要作用是中和氨基酸的负电荷和调控其它相 大连理工大学博士学位论文 容性物质的合成。n a + 能和酶的特殊位点相结合来影响酶的活力，这种影响方式有时甚 至比直接破坏酶的空间结构降低酶活力更广泛。 渗透调节机理 尽管k + 在耐盐微生物应对高渗胁迫的初期起很重要的作用，但细胞内高浓度k + 的 积累会影响到细胞许多重要的生理功能，随后细胞内积累大量的相容性溶质，部分替换 k + ，保持细胞正常的生理代谢。相容性溶质( c o m p a t i b l es o l u t e s ) 是一类易溶的、在生理 p h 条件下不带净电荷的有机渗透物质，既能在细胞内积累很高的浓度，也能特异性的 快速释放，而不影响蛋白质和细胞的主要生理功能，又称为相容性物质或渗透保护剂 ( o s m o p r o t e c t a n t ) 1 5 7 , 6 2 1 。相容性溶质在细胞内主要有2 种不同的作用：一方面在盐胁迫下 增加细胞质的体积和细胞中游离水的含量，作为渗透保护性物质，调节细胞内外的渗透 压平衡；另一方面可以作为细胞内能量的贮备，在营养物质缺乏时，作为碳源或氮源供 细胞代谢使用，但不是在所有微生物中的相容性溶质都具备上述2 种功能f 6 3 1 。在细胞内 积累的相容性溶质主要有：氨基酸类，如谷氨酸、脯氨酸；氨基酸衍生物类，如四氢嘧 啶、甜菜碱；小分子肽类，如n 乙酰谷氨酰胺；多元醇类，如甘油、蔗糖和海藻糖【6 硒羽。 蛋白质调节机理 盐胁迫下耐盐微生物经过短期k + 调节和相容性溶质的积累和释放，最终由细胞内 某些特异性蛋白质的合成、转运和代谢调节细胞内外的渗透压。耐盐微生物在盐胁迫下 蛋白质的性质、代谢途径、信息传递和空间结构等方面都发生特异性的改变，盐胁迫下 细胞中会增强或抑制某些蛋白质的合成，也会合成一些特异性的新蛋白质【6 7 , 6 8 】。耐盐微 生物细胞中许多蛋白质在高浓度k + 和n a + 条件下才具有最佳活性，对某些蛋白质和核糖 体也起到稳定作用；细胞质酶和核糖体一般都需要高盐浓度来维持其活性和稳定性，常 表现出对k + 的专一依赖性。这是微生物在盐胁迫下经过长期的适应和进化的结果，是 细胞结构与功能高度适应外界盐环境的自然选择的必然结果；但对于蛋白质和核酸在盐 胁迫下的相互作用问题尚不清楚。 ( 3 ) 耐盐微生物的遗传学研究 大肠杆菌和沙门氏菌等的耐盐遗传机制已研究的较为深入，众多调