（发酵工程专业论文）脱枝酶的分离纯化及酶学性质研究.pdf

摘要 摘要 江南大学生物工程学院生物资源研究中心赵献春同学从山东青岛公路沟渠土样中 筛选到多株产脱枝酶的细菌，初步鉴定为芽孢杆菌( b a c i l l u ss p ) 。为提高该菌株所产淀 粉脱枝酶的酶活和稳定性，更好的将淀粉脱枝酶应用于淀粉加工业中，本研究对该芽孢 杆菌所产淀粉脱枝酶进行了分离纯化，且对其酶学性质作了初步研究。 将纯化好的菌种接种至诱导培养基中，于3 7 、1 8 0 r p m 摇床培养3 6 h ，测定发酵 液中的胞外淀粉脱枝酶活力。复筛出酶活最高的菌株b a c i l l u ss p c b b 2 7 2 作为出发菌株。 在同样的诱导培养基中多次传代复壮菌种直至产酶稳定。经过1 1 次传代以后，酶活从 初始的8 9 u m l 提高至1 1 4 u m l ，提高倍数约为1 2 8 倍。选择此时的菌株进行大量粗 酶液的制备以待分离纯化使用。 淀粉脱枝酶酶液的制备在1 5 l 不锈钢机械搅拌全自动发酵罐中发酵完成。于9 l 的 培养基中以1 0 的接种量接入经过2 4 h 一级培养和1 2 h 二级培养后的种子，3 7 发酵 3 6 h ，获得9 l 发酵液。经过冷冻离心，超滤浓缩，得到1 6 l 蛋白浓度为1 3 m g m l 的酶 液。采用3 0 8 0 饱和度的硫酸铵分部沉淀酶蛋白，复溶后分别进行s e p h a c r y ls 一1 0 0 凝胶过滤层析，d e a ef f 弱阴离子交换层析以及m o n oq 强阴离子交换层析，获得的活 性组分经过聚丙烯酰胺凝胶电泳检测为单一条带，证明获得了淀粉脱枝酶纯品。将每一 步分离纯化得到的蛋白质样品，以牛血清蛋白作为蛋白质标准，依据b r a d f o r d 法测定蛋 白质含量，同时以碘量法测定酶活，计算每一步纯化步骤的比活力，收率和纯化倍数， 最终得到的淀粉脱枝酶纯品收率为1 9 2 ，纯化倍数为3 6 9 2 1 。 对淀粉脱枝酶的酶学性质研究发现，其最适反应温度高达7 0 ，在8 0 下仍具有很 高的催化活性，并且对高温有较强耐受性，优于大多数已知的淀粉脱枝酶。该酶的最适 p h 在6 0 左右，当p h 低至4 5 时酶活损失5 0 以上，在p h4 5 9 0 的范围内基本保持 稳定。此外，c a 2 + 、m 9 2 + 、m n 2 + 等金属离子对于该酶具有显著的激活效果，尤其是工业 中常用的淀粉酶高温保护剂c a 2 + ，在8 0 高温下对于该淀粉脱枝酶也有很好的保护作 用。对该酶的动力学性质研究表明，当以支链淀粉为底物时，该淀粉脱枝酶的值为 4 0 3 2 4 m g m l ，最大反应速度缸值为0 1 8 4 1 m g m i n m l 。f e ”对淀粉脱枝酶的抑制属 于典型的非竞争性抑制类型。 本研究获得了淀粉脱枝酶纯品并研究了部分酶学性质，对将来进行其氨基酸序列分 析，蛋白质结构与功能分析和进一步的修饰及改造，从而提高淀粉脱枝酶的产量，增强 其稳定性，降低生产成本打下了基础。 关键词：淀粉脱枝酶芽孢杆菌分离纯化酶学性质 l a b s t r a c t a b s t r a c t b a c i l l u ss p w a si s o l a t e df r o mah i g h w a ys o i ls a m p l ei nq i n gd a ob yr e s e a r c h e rz h a o x i a n c h u no fc e n t r eo fb i o m a s sr e s o u r c eo fs c h o o lo fb i o t e c h n o l o g y , j i a n g n a nu n i v e r s i t y d u et oi t sr e l a t i v e l yh i g hs t a r c hd e b r a n c h i n ge n z y m e ( d b e ) a c t i v i t y , t h i ss t r a i nc a l lb ea p p l i e d i nf a c t o r i e sa san e ws o u r c et os y n t h e s i sd b e f o rt h ep u r p o s eo fi m p r o v i n gt h ea c t i v i t ya n d s t a b i l i t yo fd b ep r o d u c e db yt h es t r a i na b o v e ，w ep u r i f i e dd b ef r o mb a c i l l u ss p a n ds t u d i e d i t sb a s i cp r o p e r t i e s p u r i f i e ds t r a i nw a si n o c u l a t e di n t oi n d u c t i o nm e d i u ma n dc u l t u r e du n d e r37 o n 18 0 r p ms h a k i n gt a b l ef o r3 6 h t h es t r a i nb a c i l l u ss p c b b 2 7 2w i t hh i g h e s td b e a c t i v i t yw a s c h o s e na ss t a r ts t r a i na f t e rs e c o n d a r ys c r e e n i n g r e j u v e n a t et h es t r a i n2 7 2 b yas e r i a lp a s s a g e s t i l lt h ea c t i v i t yr e a c h e das t a b l el e v e l a f t e r1 1 p a s s a g e s ，t h ed b ea c t i v i t yi n c r e a s e db y1 2 8 t i m e s p r e p a r i n gc r u d ee n z y m ei n 15 lc o m p u t e rc o n t r o l l e df e r m e n t o r p u r i f i e ds t r a i no f t w o s t e pc u l t u r i n g ，l a s t i n g2 4 ha n d12 hr e s p e c t i v e l y ，w a sa d d e di n t o9 lm e d i u mw i t ha n i n o c u l a t i o na m o u n to f1 0 a f t e r3 6 hf e r m e n t a t i o na t3 7 c ，t h e9 lp r o d u c tw a sc o n c e n t r a t e d t o1 6 lc r u d ee n z y m ew i t hap r o t e i na m o u n to f1 3 m g m lb yc e n t r i f u g ea n du l t r af i l t r a t i o n t h et a r g e tp r o t e i nw a sp r e c i p i t a t i o nb e t w e e n3 0 - 8 0 a m m o n i u ms u l f a t es a t u r a t i o na n dt h e s e d i m e n tw a sr e d i s s o l v e di n2 0 m mt r i s h c ib u f f e r ( p h8 2 ) t h ep r o t e i ns o l u t i o nw a sr u n t h r o u g hs e p h a c r y ls - 10 0g e lf i l t r a t i o n ，d e a ef fi o ne x c h a n g ec o l u m ea n dm o n oqi o n e x c h a n g ec o l u m n t h ef i n a lp r o t e i ns o l u t i o nw a sv e r i f i e do ns d s - p a g ew i t ho n eb a n d ， w h i c hp r o v e dt h a tt h ee n z y m ew a sp u r i f i e dt oh o m o g e n e i t y t h ep r o t e i nc o n c e n t r a t i o na n d d b e a c t i v i t yw e r em e a s u r e da f t e re a c hs t e po fp u r i f i c a t i o na n dt h es p e c i f i ca c t i v i t y , f o l da n d y i e l do fe a c hs t e pw a sc a l c u l a t e d i nt h ee n d ，a3 6 9 21 - f o l dp u r i f i c a t i o n 州t hay i e l do f19 2 w a so b t a i n e d p r o t e i nc o n c e n t r a t i o nw a sm e a s u r e di nt e r m so fb r a d f o r dm e t h o du s i n gb s aa s t h es t a n d a r d ；d b ea c t i v i t yw a sm e a s u r e db yi o d i n em e t h o d t h eb a s i cp r o p e r t i e so fd b ew a ss t u d i e d 1 1 1 em a x i m a la c t i v i t yo c c u r r e da t7 0 1 2a n d p h6 0 i tw a ss t a b l ea tat e m p e r a t u r eb e t w e e n3 0 a n d7 0 a n dr e t a i n e da tl e a s t7 0 o r i g i n a la c t i v i t yf o r6 0 m i ni nt h ep hr a n g ef r o m4 5 9 0 a tp h 6 0a n d5 0 ct h e f o r 支链 淀粉w a s4 0 3 2 4 m g m la n dt h eg m a xw a so 18 41m g ( m i n m ld e b r a n c h i n ge n z y m e ) t l e e n z y m ew a sa c t i v a t e ds t r o n g l yb yc a 2 + ，m 9 2 + a n dm n 2 + ( u pt o 141 31 ) ，w h a ti sm o r e ， c 一+ ，w a ss h o w nt ob ea ne x c e l l e n tp r o t e c t o ro ft h ee n z y m ea tat e m p e r a t u r eu pt o8 0 t h eh o m o g e n o u ss t a r c hd e b r a n c h i n ge n z y m ea n di t sb a s i cp r o p e r t i e sw e r eo b t a i n e d t h r o u g ht h i ss t u d y , w h i c hl a i daf o u n d a t i o nf o rt h ef u t u r es t u d yo fd b ea m i n oa c i ds e q u e n c e a n dt h er e l a t i o n s h i po fd b e s t r u c t u r e & f u n c t i o n a c c o r d i n g l y , w ec a ni n c r e a s et h eo u t p u ta n d q u a l i t yo fd b eb ym o d i f y i n gt h ee n z y m et oe n h a n c ei t sa c t i v i t ya n ds t a b i l i t y k e y w o r d s ：s t a r c hd e b r a n c h i n ge n z y m e ；b a c i l l u ss p ；p u r i f i c a t i o n ；p r o p e r t i e s i i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得 的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不 包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南大学或 其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究 所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 签名： 垄醴： 日期：功1 年6 月l 胡 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定：江 南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论 文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文，并且本人 电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 名 躲拯u导师躲2 勃 日期：z o 。q 年6 月f 佃 第一章绪论 第一章绪论 淀粉是一种自然界中的贮藏多糖，存在于植物的根、茎或种子中。淀粉组成可以分 为两类，直链淀粉( a m y l a s e ) 与支链淀粉( a m y l o p e c t i n ) 。不同植物合成的淀粉中直链淀粉 和支链淀粉自然淀粉中直链，支链淀粉的比例视植物种类、品种、生长时期的不同而异 【l 】。工业上使用的谷物淀粉中支链淀粉的含量约为7 0 9 5 ，如玉米为7 4 ，马铃薯为 7 6 ，小麦为7 5 ，稻谷为8 l ，糯米更是接近1 0 0 。直链淀粉是d 葡萄糖基以0 【( 1 ，4 ) 糖苷键连接的多糖链，分子中有2 0 0 个左右葡萄糖基，分子量1 2 1 0 5 ，聚合度9 9 0 ， 空间构象卷曲成螺旋形，每一回转为6 个葡萄糖基【2 】。支链淀粉分子中除有0 【1 ，4 糖苷 键的糖链外，还有a 1 ，6 糖苷键连接的分支，分子中含3 0 0 4 0 0 个葡萄糖基，分子量 2 1 07 ，聚合度7 2 0 0 ，各分支也都是卷曲成螺旋形。淀粉与碘呈颜色反应，直链淀粉为 蓝色，支链淀粉为紫色【3 】。 将淀粉原料转化为还原糖( 麦芽糖和葡萄糖) 是许多产品生产过程的第一步。淀粉酶 在淀粉加工工业中发挥着十分重要的作用。工业中具有较大应用价值的淀粉酶主要有a 淀粉酶，p 淀粉酶，葡萄糖淀粉酶和淀粉脱枝酶。 表1 淀粉酶分类情况m - 1 6 1 名称别名来源作用位点底物 产物 e小c渊321酶1，a葡-l萄,4(ec321瓣警葜妻喾内蒜扩淀粉 )葡萄糖水解酶霉大麦等糖苷键 雠糈、淀觜芽芽鬻大糕嬲淀粉ec3212(ec ) 糖苷酶麦等 a ：l ：藩蕃鑫 忆1 刀 葡萄糖淀慧警 糖化酶黑曲霉 ( e c 3 2 1 3 1 ”“、 外切酶隔一 个单位水解淀粉 a 1 ，4 糖苷键 糊精还原糖 麦芽糖 葡萄糖 脱枝酶 普鲁兰酶异 蝴牛棚 分支点的支链淀粉糖 麦芽三糖麦 ( e c 3 2 1 4 ) 淀粉酶 吼1 0 【一1 ，6 一糖苜键原等芽糖 直链淀粉和支链淀粉结构的差异造成了其被淀粉酶水解产物的不同。在已大规模应 用a 淀粉酶，1 3 淀粉酶和葡萄糖淀粉酶的淀粉加工工业中，经过液化( 9 5 1 0 5 ，p h 5 5 - 6 2 ) 和糖化( 5 7 6 3 ，p h 4 0 - 4 5 ) ，直链淀粉可被水解为麦芽糖；而支链淀粉 只有外围的支链能够被水解为麦芽糖，支链的存在阻碍淀粉的分解，影响到淀粉的利用 率和产品的质量。同时，在主流的发酵工业中，原料在总生产成本中都占据着相当大比 重。以酒精工业为例，其原料成本占总成的比例就超过了7 9 【_ 7 1 。在这个背景下，提高 支链淀粉的利用率意味着原料成本的降低，从而为企业带来巨大的经济价值，这就引发 了对淀粉脱枝酶研究的兴趣。 1 1 淀粉脱枝酶的分类 日本的n i s h i m u r a 于1 9 3 1 年首次在酵母中提出了淀粉脱枝酶( d b e ) 这个概念， 在对支链淀粉进行染色时检测到了这种酶的活性，因此将这种酶命名为“支链淀粉合成 酶”i s 】。然而在之后的研究中，人们发现在马铃薯块茎和水稻胚乳中发现的同样的酶并 江南大学硕士学位论文 不能合成淀粉，而是能够水解支链淀粉的分枝从而生成直链淀粉，因此这种酶随后被命 名为淀粉脱枝酶。在多年的研究中，人们共发现了两种类型的淀粉脱枝酶，普鲁兰类型 的淀粉脱枝酶( p u l ) 和异淀粉酶类型的淀粉脱枝酶( i s a ) 。 普鲁兰酶类型的淀粉脱枝酶和异淀粉酶类型的淀粉脱枝酶都能够专一地切开支链 淀粉分支点中的a 1 ，6 糖苷键，将小单位的支链分解，从而切下整个侧枝，最大限度 地利用淀粉原料【9 1 。其不同在于，普鲁兰酶作用底物的最小单位是2 个麦芽糖基含1 个 仅1 ，6 糖苷键，异淀粉酶作用底物的最小单位是麦芽三糖基或麦芽四糖基含1 个a 1 ，6 糖苷键，不能水解只有2 个葡萄糖基的0 【1 ，6 糖苷型1 0 j 。表现为前者以普鲁兰和支链淀 粉为底物，不能作用于植物和动物糖原；后者能够去除支链淀粉和植物，动物糖原中的 分枝链，却不能作用于普鲁兰。异淀粉酶类型的淀粉脱枝酶相较普鲁兰类型的淀粉脱枝 酶具有诸多优点，首先它能同时从内部和外部水解支链淀粉的分支点；其次它的催化反 应具有不可逆性；再次，异淀粉酶的催化活性不会被麦芽糖所抑制。 表2 淀粉脱枝酶对底物作用表1 t a b l e2d b ea c t i n go nv a r i o u ss u b s t r a t e s 麦芽糖转化率( ) 底物 淀粉脱枝酶与p - 淀粉酶的协同作用 单独使用p 一淀粉酶孺继使甫一面莳硬甬 异淀粉酶普鲁兰酶异淀粉酶普鲁兰酶 糯玉米支链淀粉 5 09 99 5 1 0 8 9 5 支链淀粉b 极限糊精0 8 09 79 77 2 马铃薯支链淀粉 4 79 69 81 0 39 7 牡蛎糖原 3 8 1 0 24 61 0 09 9 糖原b 一极限糊精0 7 93 17 69 9 兔肝糖原42 1 0 0 5 19 99 8 1 2 淀粉脱支酶的来源 1 2 1 植物来源的淀粉脱枝酶 人们在植物中首先发现了普鲁兰类型的淀粉脱枝酶，在1 9 4 5 年，k e e n 首次报道 了高梁芽的提取物具有降解糊精的活性，后来假设这种和0 【淀粉酶及b 淀粉酶有协同 作用的酶的主要作用是打破0 【1 ，6 糖苷键，这种假设的正确性为后来的文献所证实1 1 2 1 。 1 9 7 0 年，人们又从谷物中发现了一种淀粉脱枝酶，这种淀粉脱枝酶作用于普鲁兰，得到 的水解产物为麦芽三糖，它是a 淀粉酶的相对不适底物。随后，人们又从多种植物中发 现了异淀粉酶类型的淀粉脱枝酶。其中对于马铃薯淀粉脱枝酶的研究较为深入。马铃薯 含有3 个异淀粉酶类型的淀粉脱枝酶的同功酶( s t i s a l ，s t i s a 2 和s t i s a 3 ) ，n 端均含有叶绿 体靶向转移多肽，引导酶进入质体中，参与淀粉合成。并且他们是被三个不同的基因家 族所编码。s t i s a l 与s u l ，水稻s u g 1 等蛋白属于同一基因家族( i s a l ) 的产物；s t i s a 2 与 拟南芥a t i s a 2 属于第二个i s a 基因家族( i s a 2 ) 的产物；s t i s a 3 则属于一种新的异淀粉酶 类型的淀粉脱枝酶。在功能上，s t i s a l 与s t i s a 3 的单体均能够独立发挥异淀粉酶类型的 淀粉脱枝酶的功能；而s t i s a 2 的单体无法独立发挥功能【i3 1 。 2 第一章绪论 由于植物中淀粉脱枝酶含量过低，并且对于植物的改造复杂而困难，使得它无法作 为淀粉脱枝酶大规模生产的来源。之后的研究者将注意力转移到了淀粉脱枝酶对于植物 淀粉生物合成过程的影响。希望通过研究作为植物淀粉生物合成过程中几种关键酶之一 的淀粉脱枝酶的性质，利用分子生物学的手段对植物编码该酶的基因进行改造，从而改 变植物合成淀粉中直链淀粉和支链淀粉的比例，以生产符合各种特殊要求的淀粉产品。 1 2 2 微生物来源的淀粉脱枝酶 微生物中的细菌，真菌和放线菌均能产生淀粉脱枝酶，据不完全统计，在国内外已 报道的菌株中，细菌有十余种，其中多数为杆菌，如b a c i l l u ss t e a r o t h e r m o p h i l u s t l 4 】，b a c i l l u s 加v d m ，c 妇，f 螂【15 1 ，a e r o b a c t e ra e r o g e n e s l l6 1 ，b a c i l l u sc e r e u s 17 1 ，b a c i l l u s p o l y m y x a ，b a c i l l u s s p 2 0 2 1 ，b a c i l l u ss p 2 8 0 1 1 1 ，b a c i l l u ss p x a l 6 0 1 1 引，t h e r m o a n a e r o b a c t e ，s p 1 1 9 】， a n a e r o b r a n e ag o t t s c h a l k i i 2 0 1 ，p y r o c o c c u sf u r i o s u s 2 ，d e s u l f u r o e o e c u sm “c 淞【2 2 1 ， p s e u d o m o n a sa m y l o d e r a m o s a 2 3 1 ，c y t o p h a g as p 2 4 】，b a c i l l u sa m y l o l i q u e f a c i e n s t 2 5 1 ， e s c h e r i c h i ac o l i 2 6 1 ，f l a v o b a c t e r i u ms p 2 7 】，和b a c i l l u sc i r c u l a n s 2 9 】等；酵母仅有 s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a 1 1 】和l i p o m y c e s 勋，z 挖p 船幻口p 【2 8 1 两种。来自不同微生物的淀粉脱枝 酶的酶学性质存在很大的差异，这种差异不仅表现在不同种类的微生物之间，而且还表 现在种属之间，部分菌株及其产淀粉脱枝酶的特性见表3 表3 不同来源脱枝酶性质表 t h b l e3d b eo fv a r i o u ss o u r c e s 综上可知，已报道的有关产淀粉脱枝酶的微生物主要为细菌中的芽孢杆菌，而且性 质也各不相同。目前，主要利用微生物来生产淀粉脱枝酶，是因为其具有以下优点：( 1 ) 种类繁多，易变异，可根据酶作用的p h 值、作用温度及底物特异性的不同而定向选育 优良产酶菌株；( 2 ) 微生物生长繁殖快，易获纯培养，便于进行连续的工业化生产；( 3 ) 产酶周期短，原料来源广，发酵产物单纯，易获高纯度的制剂。但由于己筛选得到的菌 株绝大部分产酶量都很低，国内尚无具备大规模工业化生产淀粉脱枝酶的能力的企业。 所需酶全部进1 2 1 自丹麦n o v o e n z y m e 公司( 由酸性普鲁兰芽孢杆菌丑a c i d o p u l l u l y t i c u s 生 产) 且代价昂贵。故不少学者在致力于筛选和培养新的产酶菌株，期望筛选出能产生适 江南大学硕士学位论文 应不同应用目标的淀粉脱枝酶的野生菌株，并运用现代生程技术加以改造，使其能够增 加与底物的亲和性，并通过优化产酶条件，以得到产酶量大、酶活力高、稳定性好的产 淀粉脱枝酶酶菌株，从而实现该酶低成本，国产化的生产。 1 3 淀粉脱枝酶的分离纯化 酶的分离纯化一般都是依据酶的分子量大小，形状，点和性质，溶解度，专一性结 合位点等性质而建立的。淀粉脱枝酶作为一种酶蛋白，可以用常规酶抽提和纯化的方法 加以分离和纯化，主要包括盐析法，有机溶剂沉淀法，离子交换层析，凝胶过滤层析， 疏水层析及其他一些层析技术。 由于淀粉脱枝酶常和其他糖苷酶共存，它们的理化性质也非常相似，因此对其提纯 很困难。现己从微生物和植物中纯化出许多种淀粉脱枝酶。一般采用的方法有电泳及硫 酸铵、乙醇和丙酮等化学试剂沉淀，但都存在缺陷且容易使酶失活，因此目前采用最多 的是色谱技术。色谱技术由于其具有分辨率高、操作条件温和及酶识别方便等优点已广 泛用于淀粉脱枝酶的分离纯化。用于淀粉脱枝酶提纯的色谱技术主要有凝胶过滤、离子 交换层析、亲和层析、层析聚焦和疏水作用等。提纯方法的选择常因淀粉脱枝酶的特性 而异。为了获得足够高的纯度，常常需要几种方法联用。 表4 不同分离纯化方案 ! 垒! ! 呈兰里i 垡! ! ! 翌! p 竺! i ! i 型i 2 翌! ! 垡兰g ! 兰! 纯化步骤纯化倍数 回收率( ) 参考文献 超滤浓缩，qs e p h a r o s e 层析，硫酸铵沉淀，p h e n y ls e p h a r o s e 层析 凝胶过滤，离子交换层析 硫酸铵沉淀，d e a e s e p h a r o s ef f 离子交换层析， p h e n y l s e p h a r o s e 疏水层析，s e p h a c r y ls 1 0 0 分子筛层析 s e p h c r y ls - 2 0 0 凝胶层析，p h e n y ls e p h a r o s ec l - 4 b 层析 硫酸铵沉淀，d e a e s e p h a r o s ef f 离子交换层析，b i o g e op 6 0 排阻层析，p e b7 4 层析聚焦，p h e n y l s e p h a r o s e 疏水层析 凝胶过滤，疏水层析，离子交换层析 丙酮沉淀，u l t r o g e la c a 5 4 凝胶层析，q s e p h a r o s e 离子交换层 析，s d s p a g e 硫酸铵沉淀，p h e n y l s e p h a r o s ef f 疏水层析，d e a e s e p h a r o s e f f 离子交换层析，s e p h a c r y ls 1 0 0 分子筛层析 硫酸铵沉淀，s u p e r d e xg 10 0 凝胶层析，d e a e s e p h a r o s ef f 离子交换层析 硫酸铵沉淀，s e p h a d e xg 1 0 0 凝胶层析，p r e p a r a t i v ep a g e 4 8 4 1 4 6 1 7 8 5 1 5 6 63 7 6 6 2 2 9 3 8 3 9 1 4 淀粉脱枝酶的应用 1 4 1 在食品工业中的应用 1 利用淀粉脱枝酶生产高麦芽糖浆 依麦芽糖含量高低，分为普通高麦芽糖浆和超高麦芽糖浆。高麦芽糖浆在食品工业 和医药工业中都有广泛应用。食品工业如高级糖果，医药工业中可供糖尿病人使用。高 麦芽糖浆代替酸水解淀粉糖浆制造硬糖，不仅口味柔和，甜度适中，产品透明度高，不 易着色，可延长保藏期，而且由于高麦芽糖浆绝少含有蛋白质，热稳定性比怡糖高，更 4 如 儿 勉 驺 舛 ” 弘 ” 抛 m 8 呈； 掀 勰 姗 撇 的 槲 第一章绪论 适合于连续真空薄蜡熬糖和浇制成型。用超高麦芽糖浆得纯麦芽糖代替葡萄糖静脉注射 比葡萄糖注射液有一个好处：即使以较大浓度输入时亦不会升高血糖浓度。纯麦芽糖还可 以用做生产麦芽糖醇的原料( 麦芽糖醇是甜度与蔗糖相当但热值低的甜味剂) 。另外麦芽 糖通过异构化生产麦芽酮糖双歧因子也是一个极有前景的开发方向。传统麦芽糖浆生产 过程，糖化阶段只使用一种酶如b 淀粉酶，由于许多d 极限糊精无法被水解，使最大转 化率不超过6 0 ，如用d 淀粉酶和淀粉脱枝酶协同作用，可使3 0 的酶化液化淀粉浆的 转化率超过8 0 ，成为高麦芽糖浆，应用此法无疑可大大提高大米等淀粉质原料的价值。 2 利用淀粉脱枝酶生产高葡萄糖浆 高转化率的葡萄糖浆可用来生产结晶葡萄糖或作为高果糖浆的原料。七十年代，全 酶法水解淀粉成葡萄糖的生产发展很快，全世界葡萄糖浆的年产量约为3 0 0 万吨，当时 全酶法生产工艺中葡萄糖最高转化率为9 6 。这是因为糖化酶对淀粉的0 【1 ，6 糖苷键 作用速度较慢，从而影响淀粉的最终水解度。降低淀粉浆浓度或增加糖化酶量，在理论 上可突破此极限，但前者必将影响企业效益，后者则会在增加成本的同时，导致葡萄糖 合生成异麦芽糖等，加入淀粉脱枝酶不但能提高a 1 ，6 糖苷键的水解速度，降低糖化酶 用量，而且不会发生聚合反应。由酶法生产葡萄糖进一步转化为一系列衍生物如葡萄糖 醇和葡萄糖酸，将可使该酶在医药领域大显身手。通常全酶法葡萄糖浆的生产过程包括 两个酶水解步骤一液化和糖化。以n o v o 公司的p r o m o z y r n e 2 0 0 l 为例，液化过程中，通 常在3 0 3 5 固形物的淀粉浆中加耐高温旺淀粉酶，在1 0 5 于蒸煮器中用直接蒸汽喷射 液化，保温5 1 0 m i n ，闪冷至9 5 1 0 0 ，保持1 2 h 。糖化阶段使用淀粉脱枝酶和糖化酶 协同作用，可有效提高淀粉的水解速度，降低糖化酶用量，缩短反应时间，提高淀粉浆 浓度。 3 利用淀粉脱枝酶制取直链淀粉 直链淀粉是由数百个葡萄糖残基通过a 1 ，4 糖苷键构成的链状分子，通常条件下并 不是伸展状态，而是呈螺旋结构，每6 个葡萄糖残基为一圈，圈与圈之间的距离为 1 0 4 1 0 5 纳米。该结构使直链淀粉能包接有机或无机化合物，如碘与直链淀粉的复合物。 直链淀粉很易老化，溶液不稳定，易形成凝胶，利用此特性可制成淀粉薄膜，这种薄膜 对氧气和油脂有良好的隔绝性，可食且易水溶，可用于食品涂布及内包装，也可作食品 增稠及糖果改性剂等。利用淀粉脱枝酶可以将支链淀粉转化为高纯度的直链淀粉。在 l o 1 5 的淀粉水解液中加入淀粉脱枝酶，4 5 条件下反应1 - 2 天，即可分离得到聚合度 为3 0 0 个以上葡萄糖残基的长直链淀粉。冷却到5 又可得到聚合度为1 5 5 0 个葡萄糖 残基的短直链淀粉，收率达9 5 。 4 利用淀粉脱枝酶提高酒精原料出酒率 淀粉质原料时我国发酵生产酒精最主要的原料。当以淀粉质原料生产酒精时，原料 所占成本的比例高达7 9 。因此，降低酒精生产成本的一个重要途径即为提高原料的利 用率。淀粉质原料先后经过添加了a 淀粉酶的液化( 9 5 1 0 50 c ，p h 5 5 6 2 ) 和添加了糖化酶 的糖化( 5 7 6 3 c ，p h 4 0 4 5 ) 两步处理转变为可发酵性糖，才能为酵母所利用。要想提高 原料的利用率，就要提高淀粉质原料转化为可发酵性糖的比例，因此糖化和液化过程大 江南大学硕士学位论文 有潜力可挖。将淀粉脱枝酶应用于糖化过程，可以降低糖化后残留的p 极限糊精的含量， 得到更多的可发酵性糖，提高原料的利用率。当前，淀粉脱枝酶在该领域的大规模应用 还存在着一定的障碍，这是因为目前获得的淀粉脱枝酶绝大多数无法适应液化和糖化的 温度，p h 条件( 6 0 c ，p h 4 左右) 。因此，筛选能够生产在该环境下保持较高催化活性的 淀粉脱枝酶的菌株以及对现有产酶菌株进行改造以使其生产地淀粉脱枝酶适应该环境 仍是国内外研究者努力地方向。 1 5 研究目的及意义 自上世纪7 0 年代起，酶制剂工业逐渐成为一个重要的产业，目前世界酶制剂总产 值达1 0 0 亿美元，我国的产值约为1 0 0 亿人民币，并且随着应用领域的不断扩大和新酶 种的开发，酶制剂市场在迅速的发展。淀粉酶作为一类酶制剂不仅在我国，而且在世界 上都拥有巨大的应用价值，尤其是近年来随着生物质能开发的兴起，以淀粉为原料生产 乙醇等工业中应用广泛。然而目前我国的淀粉酶开发并不完善，a 淀粉酶、d 淀粉酶、 葡萄糖淀粉酶等的研究开发水平较丹麦n o v o 公司和美国杰能科公司有一定的差距，尤 其对淀粉脱枝酶的研究自7 0 年代至今，开发得到的普鲁兰酶和异淀粉酶在耐酸性和耐 热性方面仍有缺陷，使其工业化应用受到了极大的限制，这使得我国工业中使用的淀粉 脱枝酶仍需大量进口。因此，如何降低脱支酶的成本、形成较大规模的生产，并使其在 工业中得到最大限度应用等问题函待解决。国外关于淀粉脱枝酶的研究如火如茶，有很 多值得我们借鉴和深入研究的成果。淀粉脱枝酶作为很有应用前途的酶，其研究必将日 趋广泛和深入。本研究在实验室已初筛出的产淀粉脱枝酶菌株基础上选择8 株进行复筛， 选定酶活较高菌株进行诱导复壮，然后对酶进行分离纯化，测定酶学性质，对菌株进行 鉴定，旨在为有良好性能的淀粉脱枝酶基因克隆做前期准备工作。 6 第二章材料与方法 第二章材料与方法 2 1 实验材料 2 1 1 实验材料 菌株：b a c i l l u ss p c b b 2 7 2 购自江南大学中国高校工业微生物资源与信息中心 ( h t t p ：c i c i m - c u j i a n g n a n e d u o n ) 。 透析袋：直径3 6 m m ，进口分装，武汉亚法生物技术有限公司。 2 1 2 实验试剂 硫酸铵 过硫酸铵 醋酸钠 冰醋酸 氯化钙 氯化钠 氯化锌 酒石酸钾钠 无水硫酸钠 水碳酸钠 无 碳酸氢钠 硫酸铜 无水乙 葡萄糖 磷酸 碘 s d s 三胺基甲烷t r i s 聚乙二醇1 0 0 0 0 考马斯亮蓝r 2 5 0 牛血清白蛋白b s a 丙烯酰胺 n ，n 亚甲基双丙烯酰胺 o y s t e r 糖原 支链淀粉 麦芽糊精 p r o t e i nm a r k e r 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 分析纯中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 分析纯中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 分析纯中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 分析纯中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 分析纯中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 f l u k a , u s a s i g m a , u s a f l u k 钆u s a r o q u e t t e ，f r a n c e f e r m e n t a s ，l i t h u a n i a 7 江南大学硕士学位论文 d n s 试剂：称取酒石酸钾钠1 2 2 1 6 7 4 9 ，放入4 0 0 m l 去离子水中，加热溶解后再加 入3 ，5 二硝基水杨酸3 1 5 9 ，继续加热溶解后加入氢氧化钠1 0 5 9 ，加热溶解后加入苯 酚2 5 9 ，加热溶解加入n a 2 s 0 4 7 h 2 04 9 9 7 2 9 ( 期间加热温度控制在6 0 c 以内) ，冷却后 去离子水定容至5 0 0 m l ，贮于棕色瓶中避光保存，放置2 周后使用。 碘试剂：称取2 2 9 碘、4 4 9 碘化钾，用去离子水将其完全溶解后定容至1 0 0 m l ， 贮于棕色瓶中避光保存。 糖原溶液( o 5 ) ：称取牡蛎糖原o 5 0 9 ，加入9 0 m l 去离子水，7 0 。c 水浴保温1 0 m i n ， 后定容至l o o m l 。 支链淀粉溶液( 0 5 ) ：称取支链淀粉o 5 0 9 ，加入9 0 m l 去离子水，1 0 0 。c 沸水浴 1 0 m i n ，后定容至1 0 0 m l 。 麦芽糊精溶液( 0 5 ) ：称取麦芽糊精0 5 0 9 ，加入9 0 m l 去离子水，1 0 0 沸水浴 1 0 m i n ，后定容至l o o m l 。 磷酸缓冲溶液( p h 6 0 、0 2 m 磷酸氢二钠磷酸二氢钠缓冲液) ：将配制好的0 2 m 磷酸 氢二钠和磷酸二氢钠溶液以1 2 3 ：8 7 7 比例混合。 2 1 3 培养基 种子培养基：支链淀粉( 0 2 ) ，k h 2 p 0 4 ( 0 0 1 5 ) ，n a 2 h p 0 4 ( 0 0 1 ) ， m g s 0 4 7 h 2 0 ( 0 0 5 ) ，n a c i ( o 1 ) ，蛋白胨( 0 5 ) ，p h7 0 。 发酵培养基：将种子培养基中的支链淀粉( 0 2 ) 换为糯米淀粉( 1 ) ，p h7 0 。 以上培养基使用前均于1 2 1 灭菌2 0 m i n 。 2 2 主要仪器 卷式超滤膜 陶瓷微滤膜 a b 2 0 4 一n 型电子天平m e t t l e rt o l e d o d t 5 0 0 多功能电子天平常熟衡器工业公司 离心沉淀机上海医用分析仪器厂 台式高速离心机上海医用仪器厂 精密数显酸度计( 0 0 1 级) m e t t l e rt o l e d o 超净工作台江苏无锡空气净化设备厂 离心沉淀机上海医用分析仪器厂 台式高速离心机上海医用仪器厂 7 2 1 分光光度计上海第三分析仪器厂 电热恒温培养箱上海森信实验仪器有限公司 回转式恒温调速摇瓶柜上海新星自动化控制设备成套厂 循环水式多用真空泵s h b i i i河南省巩义市站街光亚仪器厂 h p l c 美国a g i l e n t 公司 c f 7 0 2 型冷冻离心机日本日立公司 u v 2 1 0 2 p c 型紫外可见分光光度计u n i c o 仪器有限公司 冷冻干燥机l a b c o n o n 公司。 a k t a e x p l o r e r1 0 0 层析系统 g eb i o t e c h 超声破碎仪 s o n i c & m a t e r i a l si n c u s a 第二章材料与方法 电泳仪 h i p r e p2 6 10d e s a l t i n gc o l u m n h i p r e p1 6 1 0d e a ef fc o l u m n s o u r c e30 qc o l u m n m o n oqc o l u m n 超滤离心管 b i o r a d 公司 g eh e a l t l l c 2 u r eb i o s c i e n c e g eh e a l t h c a r eb i o s c i e n c e g eh e a l t h c a r eb i o s c i e n c e g eh e a l t h c a r eb i o s c i e n c e m i l l i p o r e 2 3 实验方法 2 3 1 液体发酵复筛 将纯化好的菌种接入装有2 5 m l 液体培养基的5 0 m l 三角瓶中，3 7 ( 2 、18 0 r p m 摇床 培养3 6 h ，离心得到发酵液，于高速离心机中8 0 0 0 r p m 离心1 0 m i n ，取上清液测定胞外 酶活力。复筛遵循的原则：( 1 ) 发酵上清液的活力高且产酶稳定；( 2 ) 酶热稳定性好；( 3 ) 酶作 用的温度域广，最适作用温度高。据此复筛原则，筛选合适的菌株。 2 3 2 菌株的复壮 将纯化好的菌种接入装有5 0 m l 液体培养基的1 5 0 m l 三角瓶中，3 7 ( 2 、1 8 0 r p m 摇 床培养1 2 h r ，取部分菌悬液以1 0 接种于5 0 m l 新鲜液体培养基的三角瓶。部分发酵液 于高速离心机中离心8 0 0 0 r p m 离心1 0 m i n ，取上清液测定胞外酶活力。经多次传代复壮 至发酵