（化学工艺专业论文）dl苯丙氨酸的合成和拆分.pdf

浙江大学颂上学位论文 摘 i 野 y 2 3 5 9 0 要 苯丙氨酸又称a 氨基0 苯丙酸，其种类有外消旋d l 型、l 型、d - 型。 l 苯丙氨酸是人和动物必需的氨基酸之一，还是合成抗病毒和抗癌药物及新型甜 味剂的原料，d 苯丙氨酸能增强人体的免疫功能，具有出色的镇疼作用。 本文以苯丙氨酸为研究对象，先采用化学合成法合成苯丙氨酸，然后再对 其进行手性拆分，得到旋光纯态的l 一苯丙氨酸和d 苯丙氨酸。 化学合成法以甘氢酸为起始原料，在氯化亚砜作用下与乙醇酯化反应生成 甘氨酸乙酯，再与苯甲醛作川生成s c h i f f 碱一苯亚甲氨基乙酸乙酯。然后，利用 n 亚甲基的氢原子的活泼性，使之在相转移催化剂的作用下，分别与溴化苄或 氯化苄进行烷基化反应。最后，在浓盐酸的作用下水解得到d l 苯丙氨酸。以氯 化苄为反应原料时单程总收率可达5 2 3 。 本文考察了两种拆分方法：手性试剂拆分法和酶促拆分法。手性试剂拆分法 是选择某种手性试剂，如l ( + ) - 酒石酸，将其与苯丙氨酸乙酯在甲醇中成盐， 得到( 一) - 苯丙氨酸- ( + ) 酒石酸沉淀和溶于甲醇的( + ) 苯丙氨酸( + ) 一滔石酸，两者经分离后在碱性条件下水解除去l ( + ) 酒石酸，可得到e e = 7 0 的d - 苯丙氨酸，收率4 1 2 ，e e = 5 8 9 的l 苯丙氨酸，收率3 3 9 。 酶促拆分法利用氨基酰化酶能立体专一的水解氨基酸的特点，选择性地水解 n - 乙酰- l - 氨基酸得到l 苯丙氨酸，经分离后再水解n 乙酰d 苯丙氨酸得到d 苯丙氨酸。研究中分别考察了p h 值、温度、酶用量、底物和钻离子浓度对反应 的影响。在最优化条件下得到e e = 9 8 8 的l 苯丙氨酸，收率7 0 3 ： e e = 9 6 f 1 7 , jd 一苯丙氨酸，收率6 3 。 本文还考察了l - 苯丙氨酸在不同p h 和温度下旋光度的变化，发现只有在温 度和碱性强度都较高的情况下，l 一苯丙氨酸消旋化程度才比较高。 、；， 捌司：苯丙藏相转移催化根涮氨基酰化酶、消旋化 关键词：苯丙氨酸、相转移催化、蹴、坼分、氨基酰化酶、消旋化 浙江大学坝：学位论文 a bs t r a c t p h e n y l a l a n i n e ，a a m i n o 一0 p h e n y l p r o p i o n i ca c i d ，i n c l u d ed l p h e n y l a l a n i n e ， l - p h e n y l a l a n i n e ，d p h e n y l a l a n i n e ，i sak i n do f a m i n oa c i d l - p h e n y l a l a n i n ec a nb e u s e dt o s y n t h e s i s n e wm e d i c a m e n ta n ds w e e t e n e r d - p h e n y l a l a n i n eh a sa n a l g e s i c a c t i v i t y t h et e c h n o l o g i c a lc o n d i t i o n so ft h es y n t h e s i so fd l p h e n y l a l a n i n eb yu s i n g p h a s et r a n s f e rc a t a l y s t ( p t c ) a n do t h e r s a r ed i s c u s s e d t h eo r i g i n a lm a t e r i a li s g l y c i n e t h es y n t h e t i c a ls t e p sa r ea sf o l l o w s ：e s t e r i f i c a t i o n ，a l d i m i n a t i o n ，a l k y l a t i o n a n d h y d r o l y s i s t h e t o t a ly i e l dh a sr e a c h e d5 2 3 ar e s o l u t i o no f d l p h e n y l a l a n i n ei sc a r r i e do u tv i af o r m a t i o no fao p t i c a l l y a c t i v es a l tw i t hl ( + ) t a r t a r i ca c i di nm e t h a n 0 1 w h e nt h es a l tr e a c t e dw i t ha q u e o u s n a o h ，o p t i c a l l y a c t i v e l - p h e n y l a l a n i n e ( e e 2 5 8 9 ) a n d d p h e n y l a l a n i n e ( e e = 7 0 ) a r es e p a r a t e d t h el - p h e n y l a l a n i n ea n dd p h e n y l a l a n i n ec a nb ep r e p a r e di n h i g ho p t i c a l p u r i t yb yt r e a t i n gn 。a c e t y l p h e n y l a n i n ei nw a t e ru s i n gf r e ea m i n o a c y l a s ea sac a t a l y s t an u m b e ro f i n f l u e n c i n gf a c t o r st ot h er e s o l u t i o nr e a c t i o na r ed i s c u s s e d ，i n c l u d ep h v a l u e ，r e a c t i o nt e m p e r a t u r e ，a m o u n to fa m i n o a c y l a s e ，c o n c e n t r a t i o no fs u b s t r a t ea n d c o ”i ne n d ，l - p h e n y l a l a n i n ei so b t a i n e dw i t h9 8 8 o p t i c a lp u r i t yi n7 0 3 y i e l d d - p h e n y l a l a n i n ec a nb eo b t a i n e dw i t h9 6 o p t i c a lp u r i t yi n6 3 y i e l d t h er a c e m i c p e r c e n t a g e s o f l p h e n y l a l a n i n e u n d e rd i f f e r e n t c o n d i t i o n s ( t e m p e r a t u r e ，p hv a l u e ) i sc o m p a r e da n dt h er a c e m i cr e g u l a r i t yi sd i s c u s s e df r o m s t r u c t u r a lt h e o r y k e y w o r d s ：p h e n y l a l a n i n ep h a s e t r a n s f e r c a t a l y s ts y n t h e s i s r e s o l u t i o n a r n i n o a c y l a s er a c e m i c 2 “v r 西- ”女li 塑望查堂堡：! ：兰竺堡兰一 第一章文献综述 1 1 概述 手性异构体( 对映体) 的存在是自然界的一种普遍现象，生命界中普遍存 在的糖为d 型，氨基酸为l 型，蛋白质和d n a 的螺旋构象又都是右旋的。在医 药化学领域中这一点尤为突出，已知药物中约有3 0 - - 4 0 是手性的。分子 结构互为镜像但不能重合的两个化合物称为对映体，由相等数目的对映体分子组 成外消旋体。对映体的分子式完全相同，物理和化学性质大都相同，只是原子或 原子团在空间的取向不同，它们彼此不能重合的性质称为手性。手性药物( c h i r a l d r u g ) 是指有药理活性作用的对映纯化合物。生命体内许多内源性化合物，包括 可与药物发生药动学和药效学相互作用的天然大分子都具有手性，不同手性的药 物作用于生物体时，它们所起的作用是不同的，在活性、代谢过程及毒性等方面 往往存在着显著差异。最著名的例子是“反应停”( 酞胺哌啶酮，t h a l i d o m i d e ) ， 此药在5 0 年代作为镇静剂用于消除孕妇早期妊娠反应，但不久就发现服用此药 的孕妇生出的婴儿出现畸形，经研究发现其右旋物具有镇静作用而左旋物具有致 畸作用。再如抗哮喘药“沙丁胺醇”中的有效成分光学纯化合物“左沙丁胺醇” 的使用剂量仅为原来的2 5 。这样看来，化学合成药生产中采用“手性合成” 技术生产的单一异构体不仅可以消除或减轻原有消旋体药物的副作用。还能降低 使用剂量，提高疗效。1 9 9 2 年美国食品药品管理局( f d a ) 规定，今后凡研制 具有不对称中心的药物，必须给出手性拆分的结果，欧共体也采取了相应的措施。 故开发手性合成技术生产光学纯药已成为国际制药工业的共识。 白9 0 年代以来，手性化合物开发开始走上快车道，其销量迅速增长。具有 关部门估计，2 0 0 1 年世界手性药物市场总销售额有望超过1 0 0 0 亿美元。不仅如 此，手性分子还在功能材料领域，如液晶、非线性光学材料、导电高分子等方面 显示出诱人的前景1 2 】。随着人们对手性分子的认识的不断深入，人们对单手性 物资的需求量越来越大，对其纯度的要求也越来越高。广阔的应用前景和巨大的 市场发展推动了探索新的更有效的获得单一手性化台物方法的研究。本文的研究 浙江人学坝i 学位论殳 课题就是在这一背景下开展的。 单一手性化合物的获得方法有三种：1 ) 手性源合成法：以手性物质为原料合 成其他手性化合物。这种方法是有机化学家最常用的方法。但是由于天然手性物 质的种类有限，要合成多种多样的目的产物会遇到很大困难，而且步骤繁多的合 成路线也使得最终产物成本十分高昂。2 ) 不对称合成法：是在催化剂或酶的作 用下合成得到单一对映体化合物的方法。化学不对称合成和生物不对称合成近 2 0 年来取得了长足进展，并且已丌始进入工业化生产。但是化学不对称合成高 旋光收率( 如e e 9 0 以上) 的反应仍然有限，所得产物的旋光纯度对于大多数实际 应用来说仍不够高。生物不对称合成具有很高的对映选择性，反应介质通常为缓 冲水溶液，反应条件温和，但对底物的要求高，反应慢，产物分离因难，因而在 应用上也受到定的限制。3 ) # b n 旋体拆分法：是在手性助剂的作用下，将外消 旋体拆分为纯对映体，这种方法已被广泛使用。掘统计，大约有6 5 的非天然 手性药物是由外消旋体或中i t 日j 产物的拆分得到的【3 】。 氨基酸广泛应用于营养食品、饲料添加剂、医药等领域，通过化学合成法 得到的是外消旋混合物，以往人们认为生命物质只存在l 一氨基酸( l a ) ，并将 l a 冠以“天然”，而d 一氨基酸( d a ) 就成了“非天然”，然而随着分析方法的 发展，人们相继地在海洋动物、陆生动物、种子植物和人体中发现了各种d a 4 1 ， 从而意t 到d a 与l a 一样，作为医药、农药和食品的重要组成起着重要作用， 所以氨基酸的光学拆分一直受到人们的关注。 本文以苯丙氨酸为研究对象。先采用化学合成法合成苯丙氨酸，然后再对其 进行手性拆分，得到旋光纯的对映体 苯丙氨酸又称a 氨基b 一苯丙酸，其种类有外消旋d l 型、l 型、d 型。 l 一苯丙氨酸具有生理活性，人和动物体内不能合成它，必须从外界摄取；l 苯丙 氨酸是人和动物必需的氨基酸之一，同时也是生物体内合成酪氨酸的重要原料， 可影响甲状腺激素和毛发、皮肤的黑色素，在体内参与消除肾与膀胱的功能消耗。 成年人每同对l - 苯丙氨酸的最低需要量为3 i m g k g 。同时l 苯丙氨酸还是合成 抗病毒和抗癌药物如苯丙氨酸氮芥，甲酰溶肉瘤素，甲氧芳芥及新型甜味剂阿斯 巴甜( 天冬酰苯丙氨酸甲酯，a s p a r a n i e 简称为a p m ) 的原料孔。近几年来正 是a p m 产量的激增，从而引起了l 一苯丙氨酸生产的迅速发展。d 苯丙氨酸营养 上价值虽小，但它能增强人体的免疫功能，能够抑制脑啡肽( 一种内源性镇痛物 浙江人学倾i 一学位论文 质) 的分解，从而抑制羧肽酶( 脑啡肽的降解酶) 的活性，因而有出色的镇疼作 用i 。目前市场价格远高于l 苯丙氨酸。临床实验已表明它对一批长期用各种 疗法无效的肌肉疼、关节疼、腰腿疼患者疗效显著，并且无副作用，因而具有镇 疼作用，专家们估计它有可能取代阿司匹林f 7 _ 8 l 。苯丙氨酸结构式如下： c h 2 c h c o o h i n h 2 英文名：p h e n y l a n i n e ，缩写为p h e 分子式：c g h l l n 0 2 分子量：1 6 51 9 苯丙氨酸为无色至白色片状晶体或结晶性粉末。有特殊气味和苦味。约在 2 7 1 2 7 3 熔化并分解。l - 苯丙氨酸和d - 苯丙氨酸的熔点为2 8 3 2 8 4 ( 分解) 。 1 0 水溶液的p h 值为5 4 - 6 0 。在受热、光照、空气中稳定。与葡萄糖一起加热 则着色。碱性下不稳定。溶于水( 3 9 1 0 0 m l ，2 5 c ) 。难溶于乙醇、稀无机酸和 碱性溶液。l - 苯丙氨酸的旋光度为- 3 5 。( c = 2 ，水) ，d 一苯丙氨酸的旋光度为 + 3 5 。( c = 2 ，水) 。 9 1 1 2 苯丙氨酸合成路线论述 自1 8 7 9 年s c h o l z e 和b a r h i e r i 首先发现并从羽扇豆中分离得到苯丙氨酸后， 苯丙氨酸的制备方法不断得到改进。l 苯丙氨酸可由发酵法、酶法、化学合成法 得到。d l - 苯丙氨酸只能经化学合成法得到，经旋光分离得到l 苯丙氨酸和d 苯丙氨酸。而利用不对称合成可直接制备出光学纯的l p h e 和d p h e 。 1 2 1 发酵法 发酵法培养基有糖质的和非糖质的两种。由于使用的菌种及原料不同，最 终发酵液中p h e 的含量相差很大。要想获得苯丙氨酸的高收率，主要需选择高产 菌株及合理调节代谢过程。发酵结果表明，在筛选过的菌种中，产氨黄杆菌 a t 3 9 4 0 的糖质发酵最好，l - p h e 含量可达4 2 6 9 l 。发酵法因原科便宜，可以 大规模生产，被认为是最经济的方法。 浙江人学坝l 学位论文 1 2 2 酶法 据报道能够d j 酶法转化成l p h e 的原料有：n 乙酰一d l 一苯丙氨酸、苯丙酮 酸、d l 一苯基乳酸、乙酰胺肉仕酸、d l 一苄基乙内酰脲( 俗称海因) 、肉桂酸等。所 采用的酶分别为：氨基酰化酶、氨基转移酶、苯丙氨酸脱氢酶、苄基乙内酰脲酶 等。与发酵法相比，酶法具有产物浓度高、纯化步骤少、生产能力强等优点，不 足之处是原荆成本高。专家们认为由苯甲醛一海因一苯丙酮酸一苯丙氨酸，或由 苯甲醛一肉杜唆一苯丙氨酸的路线是最具竞争力的方法。其化学一生化过程 可表述如下： 肉挂醢 图1 一l 酶法生产苯丙氨酸示意图 1 2 3 化学合成法 化学合成苯丙氨酸历来受到人们的关注，因为它可以利用更多的起始原料 如苯甲醛、苯乙醛、氯苄、甘氨酸等，获得更高的生产效率。下面介绍几种具有 代表性的方法。 1 氰氨法( s t r e c k e r 法) 产令广m c l i o u h 2 h c o o h 以苯乙醛为原料，经氰醇、氨基腈等合成苯丙氨酸，对氰醇的收率为7 2 。 该方法是合成氨基酸的典型方法，步骤较简单。但要使用剧毒的氰化物，原料 不易得到，且产生大量含氰污水，难以处理。对殴备和操作的要求都较高，同时 有害于操作人员的身体健康。对浚路线而- _ a ，降低生产成本的关键在于要有廉价 的苯乙醛。1 1 2 1 2 酰氨基丙二酸乙酯、酰氨基氰基乙酸乙酯法 吼 司 ，_ 最0 等 一 一 。一 心 叫 铲 一 叫 扩 呈f 总 扩 主f 熙 扩 浙江人学坝i 学位论史 0 - 呲叶“溉：骂广n 艇蒜唧。扩m c h c n h ：0 0 h 酰氨鹱i ，e j 一：酸乙酯或酰氦基氰基乙酸乙酯与氯化苄进行缩合反应，所得的 缩合体用酸或碱水解，脱除羧基后即得苯丙氨酸，总收率约为6 0 - - 6 8 。酰基 可用甲酰基、乙酰基、苯l 1 酰基等，合成时无需分离中间产物，操作简单。但起 始原料合成收率较低，生产成本较高【1 3 i 。 3 通过苯甲醛的缩合反应的方法 苯甲醛与丙酮、马尿睃、乙内酰脲、乙酰基甘氨酸，甘氨酸( 酯) 等进行缩合 的反应，很早以来就用f 二p h e 的合成，反应如下： 广积删，一旷一c o c 眦h c o c h 3 掣。 m c c o c 磊n a o h9 删2 r m 。 h k c o o h 一( a c k ) - 0 - - n a a c一广r曲h c o rkb 酊篇一9 m 黑旦 r ：c 6 m c h 3 盯+ c c ? o 竺 弋矿肛瓣h 掣 黑h 扩嚣删 卫9 薯删 骡 9 浙江人学颂卜学位论_ 盘： 卅弋一，鬻 、 h 2 c h c o o h u h 。 。k 眦一 叫h 2 c o o q h ，龠吣_ 一r c k h c o 。o cm - 广m c h ? c 。h r 反应类型一致，都是将苯甲醛与某一原料的缩合物加氢还原后再水解的 到p h e ，只是起始原料和加氢还原时所用的催化剂略有不同。还原反应收率较低，以 苯甲醛计总收率在4 1 5 7 之阳j ，且需要高压加氢，对设备要求较高，工业化难度 较大。值得注意的是显示了由苯甲醛生产海因的一种合成途径。 是典型的固液相转移苄基化反应，首先将甘氨酸自g 羟基和氨基进行保护，生 成苯哑甲氨基乙酸乙酯，利用a - 亚甲基的氢原子的活泼性，以三乙基苄基氯化铵 ( t e b a c ) 为相转移催化剂进行烷基化反应。相转移烷基化反应具有反应条件温和， 选择性好，操作简便和费用低廉的特点。该路线原料易得，无剧毒原料，无难以处理 的三废问题，总收率达5 8 4 。我国上海有机化学所的陈金泰等采用手性催化剂( ) 一氯化- n - 苄基辛可尼可丁鼢代替t e b a c ，诱导阴离子不对称烷基化，直接得到d 苯 丙氨酸i l 。成都有机化学所邓涧华等发现氯苄在微波作用下活性大大提高，仅用1 r a i n 就完成苄基化反应，总收率提高到6 2 5 1 2 0 l 。 4 a 取代脂肪酸氨化法 仃眦l c h2 c o 帅o r 霉9 h c 0 0 8 黔盯m 尸 6 鼹 卧 浙江人学颂l ：学位论_ ：【： 罂9 叫! 攀 一删， 以氯苄计总收率3 4 如改用乙酰乙酸乙酯替代丙二酸二乙酯， 。1 2 2 1 该路线对设备要求较高，溴化反应得率不高，导致总收率较低 应用。 【2 i 】 则收率可达5 4 难以在工业上 5 不对称合成法 不对称合成对氨基睃很有意义，因而受到普遍重视。在这方面有很多人曾 作过大量研究【2 3 - 2 5 1 。乙酰氮基肉桂酸在铑与双( n 3 ，4 - 二氯苯甲酰一2 ，4 二苯基 磷亚甲基) 一吡咯络合物催化下，加氢! 匕成l n 乙酰苯丙氨酸，在经水解即得到 l 一苯丙氨酸。收率在9 0 以上。该路线目前还未得到普遍应用，其原因是催化 剂价格昂贵，反应后催化剂的分离、旧收和再生问题尚未解决。 9 喊然m 旦卜秒i 淼，kt o - m c h ? co h嘶 6 其他方法： f = 本相模中央化学研究所的尾岛岩以苯基环乙烷为原料与乙酰胺、c o 、h 2 在钴催化下合成p h e 。收率在9 0 以上。是一种非常有前景的方法。只是同样也 存在催化剂合成困难，回收利用相当麻烦的问题，目前还难以工业化。 v 了c h v - - c h 2 + m k 乌c o h a 9 h 2 k c h c o 咖o h ，三o - c h 2 n h c o o h 。 1 2 4 合成路线的选定 虽然前面列出了许多合成苯丙氨酸的方法，各有优缺点，但最终适用于工 业化舰模生产的很少。路线3 采用将甘氨酸经酯化，亚胺化、烷基化、水解 制得苯丙氨酸。该方法的优点是反应条件温和，选择性好，操作简便和费用低廉。 从原料来源分析，路线3 一中所用的原料，如甘氨酸、苯甲醛、无水乙醇、二 氯甲烷和催化剂三乙基苄基氯化铵等都是市场上容易购得的化合物，而且价格也 不高，虽然原料中溴化苄、氯化亚砜的价格相对较高，但可以考虑在试验中采取 替代的合成路线和替代原料，从而降低苯丙氨酸的生产成本。另外，在整条合成 浙江人学f i ! j l 学位论史 路线中，反应所要求的工艺条件都很温和，所用的设备也均是常见设备，没有特 殊要求，并且体系所排放的三废总量不是很大，所用之有机溶剂可以回收利用， 对环境的污染较小，工艺中也没有用到毒性特别大，腐蚀性特别强的物质。 综合考虑原料的来源、价格、合成工艺条件实现的难易程度、各步反应生 成副产物的多少、收率的高低以及对环境的影响程度等诸多因素，决定在路线3 一的基础上加以改进束合成苯丙氨酸。 1 3 拆分方法论述 由于采用化学合成泫得到的苯丙氨酸为外消旋体，必须将两个对映体分开， 使之成旋光纯态的l p h e 与d p h e 。拆分的方法很多，其中主要有结晶法、形成 和分离非对映立体异构体法、色谱法、膜分离法及酶拆分法。 在介绍拆分方法之6 u ，先介绍一些术语： 光学纯度百分率：如果在不对称反应中，生成的两个立体异构体为对映体的 关系，那么不对称合成的效率可以从反应产物和纯净的立体异构体的旋光性测定 和计算求得，即为光学纯度百分率( p e r c e n to p t i c a lp u r i t y ) ： 光学纯度百分率( 。p ) = 慧x 1 0 0 对映体过量百分率( p e r c e n te n a n t i o m e r i ce x c e s s ) ：在一般情况下，常假定旋 光性与产物的组成成直线的难比关系，所以“0 e ”即等于“对映体过量百分 率”。 对映体过量百分率( e e ) = r 一 s e r + s 1 0 0 = r 一s 其中 r 为主要对映体产物的量( 假定它的结构属于r 构型) ，【s 为次要对 映体产物的量。 1 3 1 结晶拆分法 1 3 1 1 晶体机械拆分法 外消旋混合物的( + ) 和( 一) 对映体常自发地以宏观晶体分别析出，如这些 晶体可以被看出区别来，那么就有可能在放大镜的帮助下，用镊子将它们分开。 l p a s t e u r 在1 8 4 8 年制备了外消旋酒石酸的铵钠盐，利用晶体的非对称性，将两 浙江人学坝1 1 学位论史 种互为实物一镜像关系的晶体捡出分j t 。【2 8 1 晶体机械拆分法所存在的困难是它过 于繁琐，而且不能应用于外消旋化合物和外消旋固体溶液。它只能用于两种对映 的晶体可以被看出区别的那些外消旋体混合物。 1 3 1 2 接种结晶拆分法 如果在一个外消旋混合物的饱和溶液中加入一种纯对映体作为晶种，并适 当冷却，那么该晶体的量就会增长，使相当量的对映体析出。 如果没有纯的剥映体的晶体可以用末接种，有时别的旋光性化合物的晶体 也可以作为品种。仞j 如，为使酒石酸铵钠盐自其外消旋体的溶液中结晶析出，不 仅可以用此( d - ) 一曲的，锗体，而且可以用( ) 一天门冬氨酰胺 h 2 n c o c h 2 c h ( n h 2 ) c o o h 的晶体接种。 2 9 1 接种结晶拆分法工艺简便，成本较低，而且对某些外消旋体效果较好。在 不断探索下，可用此方法拆分的外消旋体不下2 5 0 例，并且有若干产品用此类方 法大量拆分。l 3 0 j 1 3 2 手性试剂拆分法 些非对称的具有旋光性的天然碱类，如奎宁碱和番木鳖碱等的两种酒石 酸的盐具有很不相同的物理性质，包括溶解度和旋光性。这是因为一对旋光性的 对映体分别地与另一个旋光试剂反应，所得到的是两个非对映立体异构体的衍生 物的缘故。例如，对映体( 4 - ) - a 和( ) a 酸分别地与( 一) b 碱反应，所 生成的赫( 4 - ) - a ( ) 一b 和( 一) - a ( 一) b ，它们的分子实际上彼此已 不再互为对映体了，而是非对映立体异构体的关系： ；二i ：二：二 非对映立体异构体( 一) 酸( 一) 碱j 因为分子的立体结构的变动，对晶体结构有较大的影响，而使非对映立体异构体 的溶解性，结晶性呈现明显的差别，可利用结晶等方法将他们分离、精制。然后 利用逆反应去掉拆解剂，得到纯的旋光性化合物，达到拆分的目的。通常可用马 钱子碱、奎宁和麻黄素等旋光纯的生物碱拆分酸性外消旋体：用酒石酸、樟脑磺 碱 一 )一(+ 酸 酸 - 一 ) ) + 一 ( ( ，l，、l 体映对 塑婆叁兰竺! ! 堂丝堡：! 兰； 队 酸等旋光纯的有机碱拆分城性外消旋体。在文献中都有很成功的例子： 1 将d l p h e ( d l 1 ) 平n - 段苯甲酰l 天冬氨酸( l i i ) 在稀硫酸中成 赫，得到纯度为9 8 的l i l i i 晶体，将其溶于水中并调节p h 值至7 0 ，l p h e 结晶析出川。 2 将d l p i l e ( d l - i ) 和l 一苯乙醇酸( l i i ) 在稀硫酸中加热成盐，并加 入少量的l i l i i 作为品种，冷；口后l i l i i 结晶析出，置于n a o h 溶液 稍加热后分离得到l p h e l j ”。 3 将溶于稀盐酸溶液的d l p h e ( d l i ) 与溶于甲醇的n 苯甲酰基一d 苯 丙氨酸( d i i ) 混合，得到l i d i i 晶体，滤液减压蒸馏后调节d h 至6 ，d p h e 结晶析出；将l i d i i 晶体溶于稀盐酸溶液，加热回流回收d i i ，处理滤液 得到l p h e 。或者用n 苯甲酰基一l - 苯丙氨酸( l i i ) 作为手性试剂，得到的就 是d i l i l 晶体【3 3 l 。 4 以苏氨基物( l ( + ) 苏一对硝基苯基- 2 氨基一1 ，3 丙二醇，生产氯霉素的 中间体) 作拆分剂，使其与d l 乙酰苯丙氨酸成复盐，利用l 复盐溶解度小而与 d 复盐分开。得到l 乙酰苯丙氨酸，用酸水解后就可得到l p h e 3 4 】。 5 以手性拆分试剂r ( 一) 四氢噻唑2 硫酮4 羧酸( r ( ) t t c a ) 对 d l 氨基酸酯进行手性拆分。分别得到r ( 一) t t c a 氨基酸酯和光学活性的 氨基酸酯，再将r ( 一) t t c a 氨基酸酯在碱性条件下分解得到另一种光学活 性的氨基酸酯，光学纯度在4 0 - - 7 5 ，r ( 一) t t c a 可回收利用f 3 5 】。 除此之外还有相当多的拆分氨基酸的例子，如用非手性的邻甲基苯磺酸 ( o t s ) 来拆分d l 一对羟基苯甘氨酸( d l h p g ) ，得到的d h p g o t s 的e e 值达9 7 4 ，转化率8 l ，经重结晶和水解得到的d h p g 的e e 值达9 9 5 【3 6 1 b h a t t a c h a r y a 等用手性试剂d 一3 - 溴樟脑磺酸盐( d b c s ) 与d l 对羟基苯甘氨酸 成盐得到的d - h p g d - b c s 黼的e e 值达9 9 9 ，转化率达9 9 f 3 7 】。h o n g o 等 用d - 樟脑磺酸( d c s ) 与d l 苯甘氨酸直接成盐，得到d p g c s 盐，纯度9 5 9 ，转化率6 2 3 8 1 。 拆分剂必须具备的条件和可能存在的问题： ( 1 ) 拆分剂和被拆分的外消旋体之1 白j 的化合物必须容易形成，而且又容易被分 解成原来的组分。因为当两个非对映立体异构体之被制纯之后，就必须用化学 方法予以分离，以便获得纯的( + ) - a 或( 一) 一a ，和回收( 一) b 。一般采 浙江人学顺i + 学位论文 r 体问亲和性的差异，通过凋节于性识别位置周围的亲水- 疏水性质，来增大固定 在膜上的手性识别位置的拆分能力。将具有手性识别能力的膜放在一个被控制的 亲水一疏水微环境中，根据它们的分配或渗透行为，得到对旋光物质更高的选择 性。从大量制备f 1 勺角度看脱法具有优势，但目前选择性和效率还比较差。 1 3 5 酶促拆分法 酶的催化作用表现在酶蛋白质的活性中心是一个不对称环境，有利于识别消 旋体，在一定条件下，酶只能与消旋 术中的一个对映体发生反应而成为不同的化 合物，从而使两个对映体分jr ，反应产物的对映过剩百分率( e e 值) 可达1 0 0 。 因此，用催化效j 罄高、专陛强的酶拆分消旋体是获取对映纯化合物的捷径。 酶促作用的生物化学析解，对于制备旋光性的氨基酸特别有用。较常用的是 利用氨基酰化酶的立体专一f l , ， a c 解作用拆分氨基酸。如猪肾酰化酶i 对n 乙酰一l 氨基酸的水解反应【2 8 i ： r c lh c o o h n 乙酰- d l - 氨基酸 n h c o c h 3 h 2 。l 猪肾酰化酶i c o o h c o o h h + n h c o c h3h 2 n 十h r 。 r n 寺酰- d - 氨基酸l 氨基酸 i 酸水解 c o o h h 1 n h ， r d 氨基酸 图l 一2 猪肾酰化酶i 拆分n 乙酰d l 氨基酸示意图 除天门冬氨酸外，猪肾酰化酶i 对普通氨基酸n 乙酰化衍生物的不对称水 解都是有效的，对于天门冬氨酸必须用猪肾酰化酶l i 才能奏效。 另外木瓜蛋白酶也可用rn 酰基d l 氨基酸的析解。其作用过程见图l 一 3 1 4 0 1 ： 浙江人学坝l 。学位论史 肛c h - - c r o ，川z n 一棚：n 一 一， h c o 刚 + h 2 n 一一夕 或h 2 n 一 一c h 3 n 酰基d l 氨基酸 4 0 c l 木瓜蛋门脯 ii 量c o o n ：；c o r 眦1 1 。n 辛菩h h ”h n _ h +h 乙u 州r r 1 一h 友 r n 一酰塾d 一氨罐酸n 酰基l 氨基酰苯胺 l酸水解 沉淀) c o o h l 酸水解 h _ n h 2c ；o o h 史h2n十h d 氮基酸 r 图1 3 木瓜蛋白酶拆分n 一酰基d l 一氨基酸示意图 使用水溶态酶反应过程的操作十分简便，只需调节合适的p h ，控制一定的 温度、时间和溶液的浓度b p 可。但最后的分离、精制操作比较麻烦，而且酶无法 回收，所以在此基础上发展了固定化酶拆分法，克服了以上缺点。 固定化就是将酶固定在不容性载体、多官能团试剂或凝胶等上面。这样可以 增加酶的稳定性，易j ：分离，提高纯度和回收率，并可实现酶的再利用和反应连 续化。s t a n e l y bm i r v i s s 等利用胰凝乳蛋白酶能高选择性地催化l 苯丙氨酸甲酯 水解反应的特性，采用琼脂糖凝胶固定化的胰凝乳蛋白酶从外消旋的d l 苯丙氨 酸甲酯成功的拆分出l 苯丙氨酸和d 一苯丙氨酸甲酯。化学收率( 8 5 ) 和光 学纯度( 9 7 ) 较令人满意但出于琼脂糖凝胶价格昂贵且质地较柔软，故难以 在工业上应用。我国武汉人学的刘立建等人在此基础上，采用机械强度高且价格 低廉的多孔硅球为固体载体所制备的固定化胰凝乳蛋白酶拆分d l 苯丙氨酸甲 酯，同样取得了满意的结果( 4 2 f ，收率达8 5 ，光学纯度为9 6 3 。而且其制备 的固定化胰凝乳蛋白酶柱反复使用1 5 批次后，酶活力仍然保持在9 5 以上，使 用寿命明显高于游离酶。 浙 人学烦i j 学位论史 ，h 2 。“、。 d “c 6 h c h m v m m o 哪b i l l z e df h 2 c 。h 5p z c 6 h s d l - - h ! n o h c 0 0 1 1 + l 1 1 3 0 1 1 一h c j d 卜m n c l h c o o c h 3 。! 翌竺掣”l - - h 2 n e 矗磊j 十d 州2 n ；c o o h 3 我国南丌大学的壬道宾等人以交联聚n 二甲基丙烯酰胺为载体，采用自制 的米曲霉氨基酰化酶制备成固定化酶柱，用于拆分n 乙酰d l 对氯苯丙氨酸， 分别得到l 埘氯苯丙氯酸( 收率8 0 ) 和n 一乙酰一d 对氯苯丙氨酸( 收率7 6 ) 【4 3 】。 ：= 、 i m m o b i l l z e d同 一 。u “! - - 眦( 1 2 h c 删o o t l 、。竖掣虻庐“等0 0 睢虻庐m - 7 c 。o 。o 。， ( l j i dj 1 3 6 拆分方法选择 各种拆分方法各有优劣，结晶法比较原始，多用于某些特定物质的拆分；色 谱拆分法和膜拆分法限于本实验室的条件目前还难以丌展；相对而苦，手性试剂 拆分法和酶促拆分法反应机理清楚，适用物质范围广，较易在实验室进行并有可 能进一步做工业化试验。虽然文献中直接针对d l - 苯丙氨酸的拆分方法较少，但 由于氨基酸的拆分具有一定的通用性，可以参照其他氨基酸的拆分方法对d l - 苯丙氨酸进行拆分。 有关手性试剂拆分法路线中，用于d l 一苯丙氨酸的拆分剂如n 羧苯甲酰l 天冬氮酸、l 苯乙醇酸等不易直接购得，若在实验室中自己合成手性拆分剂，一 是合成路线复杂，合成不易：二是自制成本太高，往往拆分剂的价格就已超过了 最终产品的价值，从经济上讲一：合适。拆分剂苏氨基物是生产氯霉素时产生的无 用中间体，价格低廉，但目前困内厂家基本已不生产氯霉素，故也无法得到苏氨 基物。 手性试剂拆分法的一个基本原则是用手性有机碱拆分酸性外消旋体：用手 性有机酸拆分碱性外消旋体，有相当多的文献提到用d 樟脑磺酸、d ( l ) 酒石 酸拆分d l 对羟基苯甘氨酸和d l 苯甘氨酸4 4 - 4 5l 。d l 苯丙氨酸和这两种物质 属于同一类型的氨基酸，从手性试剂拆分法的原理上讲，同样可以用d 樟脑磺 酸或d ( l ) 酒石酸对d l - 苯丙氨酸进行拆分。而且这三种手性拆分剂比较容易 得到，三者之中又以l ( + ) 一酒石酸最为廉价易得，以至于可以放弃回收。故 决定尝试采用l ( + ) - 酒石睃为手性拆分剂对d l 一苯丙氨酸进行拆分。 酶促拆分法具有催化效率高、专一性强的特点，而且拆分产物旋光度高、 浙江人学坝i 。学位论文 副产物少、产品分离捉纯简单。特别是氨基酰化酶是较理想的适合拆分的酶，因 为其造价低、不需昂贵的辅助因子、对有机溶剂耐受力强，对氨基酸有较好的立 体选择性。 氨基酰化酶中，木瓜蛋白酶和猪肾酰化酶都可对n 酰基一d l 氨基酸进行拆 分，但两者所起的作用赴不同的。木瓜蛋白酶促致的是n 酰基l 氨基酸对芳香 胺的酰化反应，生成酰苯衍生物；猪肾酰化酶则催化n 酰基一l 氨基酸的水解反 应，生成l 氨基酸。这两种酶对n 酰基d 一氨基酸都没有作用。这是它们可对 d l 一氨基酸进行析解的根本原因。在所涉及的反应中，木瓜蛋白酶的作用属于： “不对称合成”，而猪肾酰化酶的作用属于：“不对称分解作用”。从实验过程上 讲，采用猪肾酰化酶拆分的方法更简便，反应步骤少。故决定采用猪肾酰化酶为 酶促拆分剂。 在具体的操作过程中，使用水溶态酶会导致分离、精制操作比较麻烦，而 且酶的使用是一次性的，无法回收利用，采用固定化酶拆分法克服了水溶态酶的 上述缺点，但它涉及到柱的制作，其固体载体的材料不易得到，目前较难在本实 验室进行。使用水溶态酶的反应过程相对于固定化酶来说要简单，适合在实验室 内开展初步的研究。 浙江人学颁i 学位论史 第二章研究方案及反应机理 2 1 合成部分 利用选定的方法合成d l 苯丙氨酸，所涉及的反应有酯化反应、亚胺化反应、 烷基化反应、水解反应。f 面就按反应类型的不同，对各反应的反应机理及某些 可能影响反应进行的因素加以综合分析。 2 1 1 甘氨酸乙酯化 为了使甘氨酸的丽个功能基团一羧基和氨基在分子内其他部分进行反应时 能保持不变，所选择的路线先对羧基和氨基进行保护，使之生成苯亚甲氨基乙酸 乙酯。其中，对羧基的保护采用酯化法，一般氨基酸的酯化方法有两种： 方法1 是将氨基酸分散在过量的无水甲醇或乙醇中，通入干燥h c i 气体或 在过量浓硫酸存在下，加热回流，减压蒸馏去除水分和过量的醇，即得氨基酸酯 的盐酸盐的固体或粘稠物。加入碱中和，可除去盐酸盐得到酯。 方法2 在已进行过无水处理的无水甲醇或乙醇中，冷却至5 一1 0 。c ，搅拌 下滴加s o c l 2 ，然后加入氨基酸，加热回流，反应液冷却结晶，即得氨基酸酯箍 酸盐。1 4 6 1 除去盐酸盐的方法可参照方法1 进行。 两种方法收率都很高( 8 5 ) ，本实验采用方法2 对甘氨酸酯化。 以氯化亚砜与无水乙醇反应生成氯化亚硫酸乙酯，再与甘氨酸反应生成甘 氨酸乙酯。对甘氨酸的酯化是一种简便而有效的方法，乙醇与氯化亚砜的反应甚 易进行，且不会发生重排反应。副产物s 0 2 和h c l 均为气体，易于分离提纯。 其反应过程为： c 2 h s o h + s o c h + c 2 h s o s o c i + h c i n h 2 c h 2 c o o h + c 2 h s o s o c i 卜n h 2 c h 2 c o o c 2 h 5 , h c l + s 0 2 反应中要避免氯化亚砜和乙醇在加热条件下直接生成氯乙烷。 c 2 h 5 0 h + s o c l2 兰；：c 2 h 5 c 1 + s 0 2 + h c l 反应机理如下： 浙江人学颂1r 学位论文 c h 3 是o 西，一尜蒂叫a 。n + a ，一u 文n 鼯 一m s 八h i 妒1 。一吲涂f 。 j ” 丙酰基t 乙酰基 甲酰基 苯甲酰基。如果酰化基团为苄氧羰基则酶不水解。不同来源的酰化酶对底物化 学结构专一陛也不一致：酰化酶i 水解脂肪族l 氨基酸酰化物速度较快，而从 微生物霉菌中制备的酰化酶水解芳香族l 氨基酸酰化物比较快 5 3 1 。 氨基酰化酶i 主要存在于哺乳动物的肾脏和微生物中，是生物体进行氨基酸 代谢时一个重要的水解酶，它可逆地催化酰化l 氨基酸的水解反应该酶由7 7 2 个氨基酸组成，分子量为7 6 5 0 0 ( 猪肾) 1 5 3 1 ，是一个寡聚酶，由两个相同亚基组成， 每个亚基含有一个锌离子。j f 肾a c y - - i 与人的a c y i 的核酸序列有8 8 3 的 同源性1 5 4 j 。 a c y i 广泛存在于各利- 组织中，但它的生理功能还不是很清楚一种观点 认为，在分解代谢n 术端的乙酰化蛋白时，a c y i 与酰基氨基酸释放酶( a c y l a m o a c i d r e l e a s i n ge n z y m e ，一种催化n 未端乙酰基氨基酸从肽链上释放的酶) 结合 5 5 1 。在工业上，由于a c y i 具有光学异构专一性，仅能水解q - n 酰基l 氨基 酸生成自由的l 一氨基酸，而不作用于它的对映体a - n 酰基d 氨基酸，因此被广 泛用来制备具有光学活性的i 。型和d 型氨基酸。 浙江人学坝 学位论文 3 1 实验原料 第三章实验部分 表3 1 列出了在整个。艾验过程中所用到的主要原料，并将其规格、产地等 作了说明。 表3 1 主要原料一览表 序号原料名称产地 备注 l 甘氨酸上海试剂厂 a r 2 无水乙醇杭州长征化工厂a r 3 氯化亚砜杭州双林化工厂a r 4 溴化苄上海化学试剂公司 a r 5 氯化苄上海双喜香料助剂厂a r 6 二氯甲烷杭州双林化工厂a r 7 苯甲醛上海化学试剂站a r 8 无水碳酸钾上海兴塔化工厂a r 9 氢氧化钟上海虹光化工厂a r 1 0 氢氧化钠浙江萧山化工厂a r 1 2 浓盐酸杭州瓶窑医药化工厂 c p ( 3 6 - 3 8 ) 1 3 = 厶基苄基氯化铵上海化学试剂公司a r 1 4 环氧丙烷上海试剂一厂a r 1 5 乙醚杭、i l 化学试剂公司a r 1 6 无水硫酸镁浙江兰溪化工厂a r 1 7 乙酸酐无锡化学试剂厂a