（发酵工程专业论文）吸水链霉菌谷氨酰胺转胺酶的活化机制和生理功能.pdf

摘要 捅要 谷氨酰胺转胺酶( 7 k 胛芦础7 扰扬螂p 五- c2 3 2 j 3 简称t g a s e ) 是一种能够催化蛋白 质或肽分子闯形成共价交联的酶，是食品领域极为重要的酶制剂之一，同时在医药和纺 织等工业领域具有广阔的应用潜力。链霉菌谷氨酰胺转胺酶是目前唯一商业化的能够交 联蛋自的酶制荆。恐有研究表明，茂源链霉菌( 繇印物硼露嚣搬a 6 秽驻掰怨) 中t g 鑫s e 以 酶原( p r 0 t g a s e ) 形式分泌，并受蛋白酶活化。然而有关链霉菌t g a s e 活化过程的机制 还不清楚，链霉菌t g a s e 的生理功熊也未见报道。本研究室近来从土壤中筛选到一株高 产谷氨酰胺转胺酶的菌株吸水链霉菌( 勋印幻叼孵黜而多伊例c 印耙淞) 。为进一步推动 & 囊y g 加s c 印幻淞产t g h s e 的发酵水平，同时也为揭示更多链霉菌t g 2 l s e 的微生物学机制， 本论文对& 咖唧纪淞产t g a s e 的活化过程及t 国s e 盼生理功能进行了研究。主要 研究结果如下： 1 s y g 邶s c 印f c 淞液体培养过程中存在从p r o t g a s e 到t g a s e 的转化过程。 t g a s e 和p r o t g a s e 存在于& 矗耀加s p 七凇液体培养中，可通过乙醇沉淀和阳离子 交换色谱( f r a c t o g c le m ds 0 3 。柱) 分离等步骤进行纯化。t g a s e 和p r o 譬g a s e 的分子量 分别为4 0k d a 和4 4k d a 。p r o t g a s e 的n 端氨基酸序列为：a s g d d e e r e g 。 & 曩y g 抛掰筚蟊瓣液体培养中t g 辎e 以酶原形式分泌并存在从酶原至l 成熟酶的转纯过 程。厦y g 阳s c d p f c 螂液体培养中p r o t g a s e 出现在2 4 h ，在3 6 h 达到最高，之后p r o t g a s e 蛋自浓度逐渐下降艚苣着p r o t g a s e 蛋白浓度的降低，t g a s e 蛋白浓度逐渐增加。与t g a s e 蛋囱浓度的增加相对应，t g a s e 酶活力也开始增加。t g a s e 酶活力在6 0 h 达至l 最高( 2 4 u m l ) ，此时对应p r o t g a s e 的蛋白已全部转化为成熟酶t g a s e 的蛋白。 2 s 矗耀煳s p 缸螂液体培养中，t g a s e 活化蛋白酶分泌到胞外环境中并受抑制因子抑 制。 t g a s e 活化过程在无细胞上清液中发生沉默。在无细胞上清液培养过程中，从0 至 2 4 h ，p r 0 t g 鹚e 和t g a s e 蛋白的浓度保持恒定，没有发生从p r o 。t g a s e 蛋白向t g a s e 蛋 自的转化：同时t g 鹬e 活力保持恒定。 1 0m 欧n lc t a b 能够唤醒无细胞上清液沉默的t g 2 l s e 活化过程。添加c 研m 的无 细胞上清液中p 妁。t g a s e 蛋酝睨显的两粥a s e 蛋自发生转化，同时对应着t g a s e 活性的 显著增加( 从1 2u m l 增加到2 3u 触l l ) 。 3 & 矗嬲泖瑟淞液体培养孛，t g a s e 活纯过程受多种蛋宣酶催化调控。 通过d e a e s e p h a r o s ef f 柱纯化获得到了t a p 样品。纯化的t a p 样晶( 0 0 3 m 酗札) l o 越，加入到1 0 0 蝎p 羚一t g 猫e ( o 2 6 擞酵虹，) 中，3 0o c 培养3 0 捌醯，翼谨能够 切割p r o t g a s e 获得t g a s e 蛋白，同时可以检测到酶活从o 提高到o 9 2u m l 。纯化的 w 心为丝氨酸蛋白酶。 无细胞上清液中t g 觞e 活化过程是多种蚤白酶参与的：包括丝氨酸蛋白酶和金属蛋 摘要 白酶。1 0m m o l l 的e d l a 抑制下，无细胞上清液中t g a s e 的酶活没有增加，p r 0 t g a s e 和t g a s e 的电泳条带浓度也保持稳定；1l i u l l o 。的p m s f 抑制下，t g a s e 的酶活的增加 以及p r 0 t g a s e 蛋白条带向t g a s e 蛋白条带的转化过程明显滞后。 4 t a p i 的纯化和鉴定及性质研究。 通过f r a c t o g e le m ds 0 3 。柱和p h e n y ls e p h a r o s e6f f 柱对t a p i 进行纯化，t a p i 的 蛋白收率为6 3 6m g l 。t a p i ( o 4 嵋) 能够抑制t a p ( 0 2 鹇) 对p r o - t g a s e ( 2 鹇) 的 活化。 t a p i 的n 端氨基酸序列为：g i ，y a a t t a i ，v ，属于s s i 蛋白家族。t a p i 具有表面 活性，在液体培养中主要分布在气液界面。5 分钟内，t a p i ( o 1m 咖l ) 使水的界面 张力从7 2 降到6 0m j m 2 。在此基础上，提出了基于t a p i 界面分布的t g a s e 活化过程 调控模型。 5 在s 矗增加s c 印f c 硼固体培养中，t g a s e 在菌体发生分化、形成气生菌丝时开始分泌 和活化，并在形成孢子后停止活化，它可能参与了分化过程。 t g a s e 在矗耀阳s c 印缸淞营养菌丝的的生长阶段并不分泌，而是在开始生分化形成 气生菌丝时才开分泌和活化，并在形成孢子后停止活化。4 8h 固体平板上开始出现白色 的气生菌丝的同时，检测到胞外蛋白浸提液中t g a s e 活性显著提高( 0 5 1u p l a t e ) ；1 4 4 h 固体平板上开始出现黑色孢子，此后已检测不到t g a s e 活性。p r o t g a l s e 当量活性在 4 8h 开始出现( 0 0 3u p l a t e ) ，之后逐渐升高并在菌体形成孢子后保持稳定( 0 6 5u p l a t e 左右) 。 胱胺能够抑制j i 增加s c d p f c 珊液体培养种纯化到t g a s e 的活性，2 5m m o 讥，的胱胺 可以抑制活性为0 1 7u m l 的t g a s e7 5 的活性。2 5 舢 i l o n 。的胱胺能够显著延迟s 办增加j p f c 淞的分化过程。 关键词：谷氨酰胺转胺酶，吸水链霉菌，活化机制，生理功能。 i i a b s t r a c t a b s t r a c t t r a i l s g l u 伽m n a s e ( r g a s e ；p r o t e i n 9 1 1 n a 瑚i n e g l 咖y l t r a i l s f e r a s e ，e c2 3 。2 13 ) i s 觚 e 懿刁径ec 神曲l eo f 弧觚d 疆e i 蔽ge o v 蕾e 躐c f o s s - l i 放sb 丽黼睨p t e i 魅s 豁w e l l8 s 辨蛳& s 。 t g a s ei sav e 巧i m p o r t a l l te 舭y m ei i lf o o di n d u s t 巧a i l dh a s 掣e a tp o t e n t i a l 印p l i c a t i o ni n p h a 黝a c e u t i c a la n dt e x t i l ei n d u s t r i e s 脚幻班弦g st g a s ei s 也eo m y 删m e r c i a le n 巧m e 也a tc o u l dc o v 越e n tp r o t e i 璐i th a sb e e 鼓r e p o r t e d 像a tt g a s e 叠o m 脚幻磁弦嚣掰d 6 9 搬g 淞括 w a ss e c r e t e da sz ) 嗽o g e na i l dc o u l db ea c t i v a t e db yp r o t e a s e h o 、e v e r ，i l oi 拳“d e n c ee x p l a i n 也e 爹姆s i o l o g i c a l 血辩t i o no f & 哩喊豫弦嚣t ( 蠢囊s e ；8 n d 娃羚越e e h a 越s mo ft g a s ea c t i v 短强 w 黼s t i l lu n c l e a ri l l 脚幻碾弦船r e c e n t l y ，i i lo u rl a b ，an e ws 扛a i nc a p a b l eo fp r o d u c i n ga 1 1 i 曲a c t i v i 够o ft g a s e ，c l 嬲s i f i e da s 胁印幻磁垆船匆矿d s c 印耙淞，w a si s o l a t e de ms o i l t o p f o 惦d e 壤e o 踞p p 砥幻越l 鑫娃e e 也ef e 糯e 嫩鑫童主。薤o f 越ss 专商秘穗e 瓣i v a 圭i o nm e e h 跹i s m a n dp 1 1 y s i o l o g i c a lf 妇c t i o no ft g a s e 疗o ms 而秽d s c 印缸淞、e r es m d i e di l lm i sd i s s e 删i o n 弧e 疵n r c s u l t sa r el i s t e da sf o l l o 谢n g ： 1 t r a n s l a t i o n 舶mp r o - t g a 8 et 0t g 嬲ee x i s t sm 1 i q u i dc u l u r eo fs 办终，竹s c d 矽f c 螂 t g a s e 擞通p t g a s ew e 瓣s e e 辑t e d 协也el 诵u i dm e 撼a 越de o 堪db ep 谢基e db y 砒a 芏l o l p r e c i p i t a t i o na n df r a c t o g e le m ds 0 3 。t g a s ea 1 1 dp r o t g a s ee x m b i t e dm o l e c u l a rm a s sa s4 0 l i d a 戤1 d4 4k d 巩r e s p e c t i v e l y n t e 撇i n a l 锄i n oa c i d ss e q u e n c e so fp r o t g a s ew e r e ： a s g d d e e 跹g 【) u r i n gm el i q l l i dc u l t u r eo f 鬟矗y 9 7 。d s c c 矽f c l 峨t g a s ev ，a ss e c r e t e da saz y m o g e na r l dw a s s u b s e q u e n t l ya c t i v a t e d p r o - t g a s ea p p o 粼da t2 4 ha n dr e a c h e dam a x i m l 】瑚c o n c e 鼬僦i o na t 3 6 h 。s u b s e q u e n t l y ，w i mt kl e v e lo fp r o t g a s ed e e r e a s i 芏l g ，t 融l e v e lo fm a t 皤et g a s e i n c r e a s e d 黟a m 埝1 1 ya c c o m p a m e db yas i g n i f i c a n ti n c r e 嬲eh lt g a 8 ea c t i v 埘t g a s ea c t i v i t y 愆k d 专h e 撼曲e 或v 越u eo f2 4u 勉l 戤a b o 啦6 0kw k 致p t g 嚣s ew a s 既矗起l ye o 狲嘲饶d i n t om a t u r et ( a s e 2 。 t g a s e - 鑫蕊硼畦魏gp 羚t e 鑫s ei s | o e a 谂d 试斑ec e l l 蠡e 蠹臣c 甚。鼓鑫魏di s 遗拯i 钯纛b ya t g a s e a c t i v a t i n gp r o t e a s ei i l l l i b i t o r t g a s ea c t i v a 五o nw a ss i l e 粼e di nc e l l - r e m o v e ds v s t e m b o 吐lp r o t g 豁el e v e l 砒l dt g a s e a c 畦v i 罐主l l 协ee e l l 盘o e 蠹a c t i o 藏勰m a i l l e ds 专e a d y 筋mot o 。2 4 圭1 10m g m lc 啊| t r i m 酬时la m m o l l i u mb r o m i d e ( c 1 a b ) c o u l dw a k e nt g a s ea c t i v a t i o ni n c e l l 一羚擞o v e ds y 熨e m c 1 1 ab 骶a 专e ds u p e 越如封敷s h o w 甜魄a 毫也e 誓g a s e l 沁& t i o np r o e e s s r c s u m e da n dm er a t eo f a c t i v a t i o n ( 蠡0 m1 2t o2 3u a n l ) 3 瓢麓鑫s g l 越缀i 珏a s 。缀i v 蘸。毂i se 舔越y z 甜b y 擞曩t i p 烈e 鑫s e s 速& c u l t i l r e 1 i a pp d e p a r a t i o n ( o 0 3m g m l ) 吼sp u r i f i e db yd e a e s e p h a r o s ef f 1 如( 1op l ) w a s a d d e dt o1 0 0 皿p r o - t g a s e ( q 2 6m 鳓雌聪sm i 煳腮w a s 妇西鑫t e da 鼍3 0o e 细3 商n p r o - t g 嬲et 1 1 e nw 嬲c u t e di n t ot g a u s e ，a n dp r o - t g a s ew a s r e a d i l yc o i e r t e dt ot g a s eb ym e 垤一蠢c h 弦弘戚。秘a n d 囊臻t ( 趣e 觚t i v i 锣娥l se l e 越y 融e e 专e d ( o 。9 2u 艟l l ) 垤w 鹤 d e t e c t e da ss e r i n ep r o t e a s e - m a b s t r a c t s e r i n ep r o t e a s ea 1 1 dm e t a l l o p r o t e a s ei n v o l v ei 1 1t 1 1 et g a s ea c t i v a t i o ni nc e l l - r e m o v e d s y s t e m u n d e rt h ei i 吐曲i t i o no fe d t a ( 1om m o 0 ，t g 粥ea c t i v i 够i i lc e l l 一r e m o v e ds y s t e m d i dn o ti n c r e a s e da n dc o n c e n t r a t i o no ft g a s ea n dp r o - t g a s ek e p ts t a d y ；w 1 1 i l eu n d e rt h e i n h i b i t i o no fp m s f ( 1m m o 。) ，t g a s ea c t i v i 锣毗l dt 圭1 ec o n v e r t i o n 丘o mp r 0 - t g a s et ot g 2 l s e 、w r ea b s o l u t e l yd e l a y e d 4 p u r i f i c a t i o n m d e n t i f i c a t i o n 甜l dc h a r a c t e r i z a t i o no ft a p i t a p lw a sp u r i f i e db yf r a c t o g e le m ds 0 3 c o l u 衄a 1 1 dp h e n y ls e p h a r o s e6f f c o l u r n n y e i l do ft a p lw a sa b o u t6 3 6 m m l t a p i ( 0 4p 曲c o u l di n l l i b i t ep r o - t g a s e ( 2 “g ) a c t i v a t i o nm e d i a t e db yt a p ( o 2 “g ) n t e m i n a la c i ds e q u e n c e so ft a p lw e r e ：g l y a a t t a ivt a p ib e l o n g st o 勋印幻嗍旧e s s u b t i l i s i ni n m b i t o r ( s s i ) 缸n i l y 心ih 嬲s u r f a c ea c t i v i 够t a p i ( 0 1m g m l ) d e c r e a s e d 让l e s u r f i a c et e n s i o no fw a t e r 行o m7 2t o6 0m j m zw i 也i 1 15m i n b a s e do nt h e s ef l n d i n g s ，am o d e l f o rt a p i r e g u l a t e dt g a s ea c t i v a t i o np r o c e s sw a sp r o p o s e d 5 1 1 1s ，l 增加s c d 矽f c 螂s 0 1 i dc u l t l l r e ，t g a s e 、v a ss e c r e t e da i l da c t i v a t e dd u r i n gd i f r e r e m i a t i o n t g a s em a yb ei n v o l v e d 证d i r e n t i a t i o no f 。s 抛p 幻砸y c e s 。 t g a s ew 嬲s e r e t e da r l da c t i v a t e dd u r i n gt 1 1 ee m e 玛e n c eo fa e r i a lh y p h a er a m e rt l l e n d u r i n gt h ev e g e t a t i v eg r o w 血缸l dt h es e r e t i o na r na c t i v a t i o np r o c e s ss t o p p e dw h e ns p o r e s 、e r ef 0 彻e d w h e nw b j t ea e r i a lh ) ，p h a cf i r s t 印p e a r e da t4 8h ，t g a s ea c t i v a t yw 嬲d e t e c t e d 矗o mt h ee x t r a c tl i q u i d ( 0 51u p l a t e ) ；m e rs p o r e s 印p e a r e da t1 4 4h ，t g a s ea u c t i v 时c o u l dn o t b ed e t e c t e d p r o t g a s ea c t i v i 锣行o mb o v i n et r y p s i na c t i v a t i o nf i r s t 印p e a r e da t4 8h ( o 0 3 u p l a t e ) s u b s e q u e n t l y ，t h i sa c t i v 埘i n c r e a u s e d 铲a d 砌1 yt i l lr e a c h0 6 5u p l a t e c y s t 锄i n ec o u l di i 】血i b i t et g a s ea c t i v i t y c y s t 锄i n ea tt h ec o n c e n 仃a t i o no f2 5m m o l l i n l l i b i t e d7 5 a c t i v i 锣o ft g a s e ( 0 1 7u m l ) c y s t 锄i n e ( 2 5n n o 儿) r e m 酞a b l e l yd e l a y e d d i f r e r e m i a t i o no fs 矗) i l y d s c o p f c o 岱 k e y w o r d s ：t r a n s g l u t a m i n a s e ，& ，印幻叼，c e s 缈矿d s c 9 p f c 淞，a c t i v a c i o nm e c h a n i s m ， p h y s i o l o g i c a l 觚c t i o n 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是举人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 签名： 日 期：2 笤23 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可。以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名： 导师签名： 日 期：2 妒g 2 弓 丝醒游 第一章绪论 第一章绪论 1 i 谷氨酰胺转胺酶简介 l 。1 1 谷氨酰胺转胺酶的功能争应焉 谷氨酰胺转胺酶( t 眦s g l l n a 瑚i n a s ee c2 3 2 1 3 全称r - 9 1 u t a m i n y l - p e p t i d e ： 鼬i 糙吖g l 毽像y l e 赶撼s f e r 弱e 简称t g a s e ) ，又称转谷氦魏胺酶或谷氨酰胺酰肽了谷氨酰 胺酰基转移酶，具有多种催化功能。它能够通过催化蛋白质分子间或分子内形成8 ( y 谷氨酰基) 赖氨酸共价键，弓| 起蛋白质分子内、分子闻发生交联、蛋自质和氨基酸之间 的连接以及蛋白质分子内谷氨酰胺基的水解。t g a s e 可催化的反应包括：( 1 ) 可催化 蛋白质以及肽键中谷氨酰胺残基的丫羧酰胺基和伯胺之间的酰胺基转移反应( 图 董1 a - a ) ；( 2 ) 当蛋自质中的赖氨酸残基的8 l 氨基作为酰基受体时，蛋白质在分子内 或分子间形成( 丫谷氨酰基) 赖氨酸共价键( 图1 1 a _ b ) ；( 3 ) 当不存在伯胺时， 永会成力酰基受体，其结果是谷氨酰胺残基脱去氨基生成谷氨酸残基( 匿王。l a - e ) ；( 4 ) 此外，t g a s e 还能够催化蛋白质g l i l 残基与脂肪酸羟基间的转胺反应( 图1 1 b ) 【卜卯。 矗 llll 岔n h 2 + h 2 帐l y s 啼g i n c o n 心l ：j 毫+ n h 3 lill b 1 g l 淞e o n h 2 + r n h 2 _ g 细心c k n h r + n h 3 il 厶 ll g 酗* c e k n 拜2 + | o h 。g 耘- c h + n 辩3 ll a 縻黧、q ；慝雾壁黧9 墨= ：= ：麓。竺，唆：。* 裟。w 芸：戳铆i 吣鼍v o 东毒品。： 隧蒺三医篓尊縻蒸誊 b 图1 1t g a s e 参与的催化反应a 。t g a s e 催化蛋白质( 肽) 间的转胺反应唑a 通过催化形成n c _ 似 谷酰胺 键采交联蛋白质；b 。通过催化程氨基争p 谷酰胺阍的酰基转移反摩来催化蛋白和多肽阅的交 联；c 。催化谷氨酰胺的脱氨基反。b t g 弱e 催化的蛋白质g l n 残基与脂肪酸羟基间的辖胺反应【2 1 f 埝1 1r e a c t i o n sc a t a l y z e db yt g 撼e a t g 熊ec a t a l 弘e d y 1 批a n s f e rr e a c t i o n s 1 1 ：钆t 1 1 ec r o s s l i n k i n go f p 妁l e 魏s 姆勤您妇gn 8 0 一番氆戳拶1 ) 移s 巍eb o n 幽；b 。斑e 撼e p 嚣蕊强o f p o l y a m i n e s 穗l op 斑e 攮；e 氇o d e a n l i d a t i o no f p r o t e i n - b o u n dg l u t a m i l l e s b t g 鹳_ ec a t a l y z e dc o v a l e n ta t t a c 胁e n to fp r o t e i i l st o 1 0 n 争c h a 讽h y d r o x y lo fl i p i db ye s t e rb o n df o 彻矗：c ：i o n 【2 】 由于t g a s e 可以通过催化作用使蚤白质分子内、分子间发生交联，从而提高蛋白质 的营养价值，生产出满足人们需求的新型蛋白食品，被誉为“2 1 世纪超级粘合剂，是 目前食品领域研究最为活跃的酶制剂之一雕弼。其在食品领域主要用于：( 1 ) 将一些 限制性氨基酸引入蛋白质以改善蛋白质的营养特性从而进一步改善蛋白质功能性质； ( 2 ) 改变蛋自质的等电点及溶解度；( 3 ) 使蛋自质分子发生交联，从丽改变食物的质 构，改善蛋白质的溶解性、起泡性、乳化性等许多物理性质【h 以6 1 。链霉菌t g a s e 是目前 唯商品化了的能够交联蛋朗的酶制剂【r 7 1 9 1 。此外，t g a s e 的催化功能还可用于对各种 非食品蛋自质进行改性，通过它的催化可以获得具有较高的分予量、对机械力的破坏作 江南大学博士学位论文 用和蛋白酶的水解有较高的抵抗能力的蛋白超分子，因此t g a s e 在医药、纺织等工业也 具有广阔的应用前景【2 0 之6 】。 1 1 2 谷氨酰胺转胺酶的来源和性质 t g a s e 是生物体生命活动中一类非常重要的酶，它广泛存在于生物界中，在动物、 植物和微生物( 酵母、芽孢杆菌和放线菌等) 中都有发现【2 0 ，2 7 1 。动物t g a s e 参与了许多 重要的生理过程：包括凝血作用、表皮细胞角质化、伤口愈合、细胞凋亡、细胞分化和 细胞间通信【2 1 2 8 。3 0 1 。目前有关动物和植物体内的t g a s e 的催化机制和生理作用的研究很 多口1 ，3 0 3 2 1 ，但相关的微生物t g a s e 的研究还很少，目前还没有关于链霉菌t g a s e 生理功能 的报道。 表1 1 几种动物来源的谷氨酰胺转胺酶的生理功能【3 3 3 4 1 t a b l e1 1p h y s i o l o 百c a lf u l l c t i o n so fs e v e r a lt g 2 l s e s 丘o m 锄i n a l s 【3 3 3 4 1 t g a s e 最初由w a e l s c h 等于二十世纪5 0 年代中期从豚鼠肝脏中分离出来，随后c 1 矾 等人首次提出“t r a n s g l l 】t a m i n a s e ”一词，其用来描述该酶的胺基转移活性【”】。后来发现 哺乳动物的血液中的t g a s e 具有凝血作用，称为x i i i 因子，它们在生物体内有着重要的 生理功能【l ，3 刚。按照来源分类的几种t g a s e 的性质、分布及生理功能见表1 1 。 和动物t g a s e 具有相同功能但不同来源的微生物谷氨酰胺转胺酶，其性质、分子量 大小都有所不同，等电点也各不相同。不同来源的谷氨酰胺转胺酶性质列于表1 2 中。 其中微生物t g a s e 同动植物来源的t g a s e 一样可以催化蛋白质之间的交联反应，但它不需 要c a 2 + 激活【3 7 1 。 2 第一章绪论 表l 砭不霹来源的谷氨酰胺转胺酶的酶学性质 t 出l el - 2c h a r a c t e r i z a t i o no ft g a s e s 疳o md i 妇f e r e n ts o u r c e s 随着对谷氨酰胺转胺酶研究的深入，人们相继阐明了不同来源的酶的结构特征。其 中凝血因子x i i i 的性质研究最多，其三维结构已被测定出来【4 6 5 0 1 。n o g u c m 等人【5 1 】通过 对红海鲷鱼舅于脏组织中分离啦的谷氨酰胺转胺酶( f t g ) 的晶体结构分析发现，该酶与 人类的凝血因子i i 具有3 3 的同源性，并且活性中心都含有依赖c a 2 十的序列。砧磁 与其合作者于2 4 年测定了表皮型t g a s e 的三维结构【5 2 1 。k a n a i 等人阐明了 跏印幻w ，踟垅姗s p s 仃a j ns 8 2 来源的t g a s e 的一级结构吲，并于2 0 0 2 年采用x 射线晶 体结构分析法测定了来源于& 撇d 6 删露凇p 的谷氨酰胺转胺酶的三维空间结构【5 4 1 ，它的三 维空间结构与凝血因子i l 完全不同，如图1 2 所示。链霉菌来源t g 鑫s e 为单聚体，呈球 形盘状结构，表面有一个较深的凹陷结构是酶的活性中心。带有自由巯基的位于链上6 4 位熊c y s 残基位于凹槽的底部，与临近的2 5 5 位a 蹬残基和2 7 4 位h i s 残基正好组成与凝血 因子x i i i 完全相同的催化三角区“c y s h i s a s p ，这两种酶的这些氨基酸残基的二级 结构都很相似，意味着这两种不同来源的t g a s e 因趋网进化而相互关联。与动物来源的 酶不同的是，t g a s e 的活性不依赖c 矿+ 的序列。来源于链霉菌的t g a s e 具有很高的同源性 程度，但是它们的氨基酸序列还是略有差别【5 5 1 。 3 江南大学博士学位论文 图1 - 2 t g a s e 的蛋白质分子三维空间结构” f 1 1 2o v e r a l ls t m c t u ro f m i c r o b i a 】t g 船e 1 5 1 1 3 谷氨酰胺转胺酶的生产 谷氮酰胺转胺酶最早来源于动物中，b r o o k h a r t ，f a l c o n e ，y a s u e d a 阿”1 等人分别以 豚鼠肝脏、向日葵组织、鱼组织为原料，通过均质、抽提、离心、离子交换、过滤、层 析等分离纯化过程得到纯化的谷氨酰胺转胺酶。最初豚鼠肝脏是商用t g a s e 的唯一来源， 因其来源少，分离纯化复杂，导致了该酶的价格较高，限制了其在工业中的应用口。而 来自于鱼及植物组织( 豌豆种子、羽扇豆种子) 的谷氨酰胺转胺酶的分离纯化工艺还不 成熟。 随着动物来源的t g a s e 的作用被人们所认识，也引起了人们对其它来源的t g a s e 的 注意，因此对该酶的研究也异常活跃。由于动物来源的t g a s e 高额的售价，研究人员纷 纷将目光转向微生物领域，期望能够找到高产谷氨酰胺转胺酶的微生物菌株，采用传统 发酵的方法实现大规模的工业化生产。a i l d o 等人首先报道了利用微生物发酵法生产 谷氨酰胺转胺酶。他们从各地土壤中筛选出5 0 0 0 株菌，发现菌株脚印f o v p r r f c 册删( 现 已被归入脚p 珊o m y c 盯属) 能够分泌这种酶，其中株s 卅0 6 口阳g h 5 产生的酶活力较 高。1 9 9 3 年日本味之素公司与天野制药公司合作成功利用微生物发酵生产了该酶制 剂，投入市场即获得巨大成功，在同本酶制剂产业中，成为单一酶种类利润最高的商品 酶。虽然人们对链霉菌来源谷氨酰胺转胺酶的研究历史较短，但因其来源广泛，最适作 用条件具有多样| 生，且工业化生产成本低，产酶周期短和不受环境制约等优点，使它的 研究和应用进展相当迅速 4 叫”。后来还有人筛选到能够分泌t g a s e 的芽胞杆菌，但丁g a s e 酶产量较低岬“j 。 近年来，利用基因工程技术构建基因工程菌用来生产t g a s e 也取得了一些进展。目 前，s 州0 6 日p 瑚中编码t g a s e 的完整基因和t g a s e 的氢基酸顺序已经被克隆和测序。 h s i l i z u 等人将此编码t g a s e 的基因转入宿主s ，l v 胁h 中表达；1 酞e h a n a 等人将编 码t g a s e 的基因转入宿主e ，j 中表达，遗噫的是他们得到的t g a s e 都是大部分以包涵 体形式表达的。m a ，ck 等将s 肌0 6 d m p 瑚打中编码p r 0 t g a s e 的基因转入e c o ，i 尹， 获得了少量的可溶性表达。最近，尉k u c h i 等人【删将编码t o a s e 酶原的基因转入宿主 莓 第一章绪论 伽p 6 口c 招，f “聊“地历f c “聊中表达，并将一段可以特异切割t g a l s e 酶原的蛋白酶 ( s a m p 4 5 ) 基因也转入宿主表达，结果使c “幻聊f c 啪中表达的t g a l s e 前体酶原经 过切割，实现了t g a s e 的可溶性表达并获得了较高的产量。 目前商业化谷氨酰胺转胺酶酶制剂的主要生产菌株是链霉菌。链霉菌分泌t g a s e 的 过程己吸引了越来越多科学家的研究兴趣。对链霉菌中t g a s e 酶原活化过程的深入了 解，不仅能够直接促进链霉菌生产t g a s e ，而且对产t g a s e 基因工程菌的成功构建也可 提供指导。 1 2 链霉菌简介 1 2 1 链霉菌概述 链霉菌是一类革兰氏阳性的土壤细菌，属于原核生物界放线菌目链霉菌科，是土壤 中主要的微生物类群之一。链霉菌属于原核生物类群，却不同于普通原核生物主要采用 二分裂等无性繁殖方式进行繁殖。相比而言，链霉菌具有独特的发育分化生活史，其相 对简单又较为完整的细胞分化发育周期包括了萌芽、生长、发育和分化的整个循环。首 先单个孢子萌发形成芽管，通过顶端延伸和分枝，逐渐侵入到固体培养基中，形成较细 的基质菌丝。接下来，基质菌丝不断向空间延伸，分化出较粗的气生菌丝，气生菌丝通 过不同的形态变化( 如形成螺旋或卷曲) 后，分化形成孢子丝，并通过横割分裂的方式， 产生成串的干粉状灰色孢子链( 图1 3 ) 。链霉菌这种相对简单而生活史较为完整的原 核生物是研究原核生物基因时空表达和分化调节的良好材料【6 5 ，硎。 链霉菌的g + c 含量高达7 0 7 4 ，是迄今为止自然界中已知g + c 含量最高的生物 类群之一。目前发现的所有链霉菌的染色体都是线状的，不成环。链霉菌基因组具有遗 传不稳定性，自发突变频率至少为o 1 1 ，与染色体上某些特定区域的高频扩增和缺 失密切相关，对链霉菌的发育过程和抗生素形成、耐药性与酶的形成等次生代谢过程有 一定的影响 6 7 7 2 1 。外界因素，如紫外线照射、d n a 嵌入诱变剂、修复抑制剂，甚至简 单的冷冻储存和原生质体制备过程都有可能影响链霉菌的遗传稳定性r 7 3 7 6 j 。 图1 3 链霉菌生长和分化过程示意图 f i g 1 3g r o w t l la n dd i f f e 他n t a t i o no f 脚幻形弦嚣i sr e p r e s e m e ds c h e m a t i c a l l y 目前医药领域应用的大部分抗生素都是使用链霉菌来生产，自然界中三份之二以上 的已知天然抗生素都是由链霉菌产生的 7 6 1 。其中包括用于抗家畜寄生虫及杀螨虫的阿维 菌素，防治水稻纹枯病的井岗霉素，用于医疗和兽医的红霉素、四环素，用作动物生长 5 江南大学博士学位论文 促进剂的泰洛星，用于植物保护的春日霉素、多氧霉素，用做抗癌药物的柔毛霉素，用 做免疫抑制剂的f k 5 0 6 和雷帕霉素等。同时链霉菌还是众多工业用酶制剂的生产菌株。 它分泌的蛋白酶、纤维素酶和谷氨酰胺转胺酶等，在食品和洗涤剂等领域有广泛的应用 ”“”1 。链霉菌独特的分化过程提供给人们一个研究细胞凋亡和组织分化的原核生物样 本，同时这一过程也和抗生素以及谷氮酰胺转胺酶等重要的发酵产品的生物合成密切相 关7 8 ，7 ”。 1 2 2 链霉菌的生长和分化 链霉菌的发育循环开始于孢子发芽并长出一个或多个长的多核的菌丝。这些菌丝通 过顶端生长伸长，并不断分支，形成在培养基表面和内部发展的营养菌丝( 基质菌丝) 。 这种菌丝接触基质生长，形成穿透培养基的错综复杂的菌丝网络，通过胞外水解酶的作 用溶解有机分子。这种丝状形态允许充分利用土壤中的固体资源，并使得链霉菌可以比 不运动的单细胞微生物更高效的拓殖固体基质。随着菌体变老和营养耗尽，苗体的表面 出现了专门的分支，气生菌丝发生向上生长，垂直的进入空气，气生菌丝进一步分化形 成孢子( 图i 4 ) m8 ”。 基质菌丝的主要功能是营养：气生苗丝的作用主要是繁殖：形成孢子和使孢子置于 更易于被分散的位置，从而解决基质苗丝不能移动所带来的问题。在菌体生长周期的末 尾，气生菌丝经过多分隔作用，形成单核的间隔，最终将形成厚壁的孢予。与基质苗丝 不同，气生苗丝细胞壁更厚并较少分支，含有基质菌丝投有的色素，且表面是疏水的。 由于气生菌丝是在相当特殊的条件下发育的( 非水环境中生长) ，它们必须被保护起来 防止脱水。围绕菌丝的疏水鞘( 由疏水蛋白组成) 可以解决这问题。一些疏水| 生很强 的表面活性蛋白在分化开始时即分泌出柬，在菌体表面包住菌丝，这样帮助它们从水环 境中脱离弘8 ”。 囤 图1 - 4 不同熹型链霉菌茵丝的细胞形态a 基质苗丝，b 气生菌丝( 顶端已开始分化形成抱子) f 镕14s t c m r eo f 跏印，。删c e l l y p e s 呲as u b s t r m e m y c e i ba e m l ”y c e l i u m ( b 。g i n n i “g t o s e p m ei n t os p o r e s ) 第一章绪论 作为基质菌丝早期生长的延续，气生菌丝在营养耗尽的基质中生长，这就带来了菌 丝如何获得营养来生长和产生孢子的问题。有报道气生菌丝发展主要靠“吃营养菌丝”， 即通过营养菌丝的凋亡给气生菌丝的形成提供营养，孢子形成时靠近基质部分的气生菌 丝又发生凋亡。在这一容易受攻击的时期，程序| 生死亡的营养菌丝可以很容易的被侵入 的运动性微生物消耗，这时就需要化学防卫机制的启动了。这也可以解释为什么大部分 链霉菌抗生素的产生是与气生菌丝形成和基质菌丝退化同步的”e “ 。 1 2 3 链霉菌分化中的细胞凋亡 在链霉菌形成气生菌丝和孢子的同时，分别伴随着营养菌丝和气生苗丝的凋亡。当 气生菌丝开始形成时，营养菌丝中的细胞物质( 染色质和蛋白质等) 开始发生分解，但 细胞壁结构保持完好；当气生菌丝开始分化形成孢子的时候，靠近基质部分的气生菌丝 中的细胞物质( 染色质和蛋白质等) 开始发生分解，同时细胞壁结构保持完好( 图1 5 ) 。 和大部分多细胞生物系统中的细胞凋亡相同，链霉菌的菌落发展依赖于细胞间增殖、细 胞分化和细胞死亡几个过程的协同作用。在菌落生命周期中，很多菌丝( 包括最初的基 质菌丝和任何部分的没有分化成孢子的气生菌丝部分) 退化和死亡( 7 9 ” 。 b 一g 鬻二一一一。高- _ 笋 了= = = ；葛两十1 广= ，掣；一心；、竺 芋一_ 争_ ：搴二一噶r 、 图1 5 链霉菌分化过程中细胞凋c 所至的茵丝细胞物质的变化【洲 f 分别为固体培养中2 4 4 8 h 营 养茵丝的电镜照片正常的茵体有黑色的细胞浆和大小各异的类核物质。a ，、d - 和e 分别为a 、d 和 e 的局部放太照片。 f 培i 5 c h a n g eo f c e i ic 。m a 洲“gd u d n g 脚印胁u e e 5d l k r e n 韫t l a l i s e db yc e j id e a 恤驯a 一 u i t r 拍呲m m l a m r e s o f n 0 肌ma n dd 。g e n e r m