（食品科学专业论文）香菇中甲醛的影响因素及其存在状态研究.pdf

摘要 i 1 1 摘要 香菇是一种山珍，却由于含有甲醛而遭遇国际“绿色壁垒”本论文以香菇为主要原料。研 究了香菇中导致甲醛产生的酶活力的影响因素；并通过不同的提取方法，研究了香菇中甲醛 的存在状态；建立甲醛与多糖和蛋白质结合的模拟体系探讨了香菇中与甲醛结合的主要物 质s 同时对甲醛溶液与香菇提取液的遗传作用迸行了比较，对香菇食用安全性评价提供了一 些数据获得如下结果： ( 1 ) 通过比较香菇及其他食用菌中伸氨酰转肽酶和半胱氨酰亚砜裂解酶的活力，进一 步确定香菇中甲醛形成的机理：香菇自身代谢可产生甲醛。有两种不同的酶参与该反应分 别为悴氨酰转肽酶和半胱氨酰亚砜裂解酶。p i i7 o 3 t c 条件下俺氨酰转肽酶活力为3 6 2 j p h9 0 ，3 7 c 条件下半胱氨酰亚砜裂解活力为2 3 8 。 ( 2 ) f 备氨酰转欣酶的最适p h 为7 0 ，最适温度为3 7 ( 2 。c a z + 对转肽酶活力有促进作用。 c a + 、p b 2 + ，知2 + 可以抑制该酶的活力除亮氨酸和甘氨酸外。i ，半胱氨酸、k 脯氨酸、i ， 色氨酸、缬氨酸对该酶的活力有激活作用 ( 3 ) 半胱氨酰亚砜裂解酶属于碱性酶类。最适温度为3 7 c 。( i | 2 + ，p b 2 + 、q 1 2 + 、m 矿可 以促进酶活力的增强，而办2 + 对裂解酶活力有抑制作用b 半胱氨酸、脯氨酸、甘氨酸可以 抑制裂解酶的活性。 ( 4 ) 乙酰丙酮分光光度法测定香菇中的甲醛，香菇各部位甲醛含量高低与t 珞氨酰转肽 酶和半胱氨酰亚砜裂解酶活力相对应 ( 5 ) 香菇中的甲醛分别以游离态和结合态存在，通过不加酸水蒸馏提取游离态甲醛。加 酸水蒸馏提取香菇中的总甲醛，乙酰丙酮分光光度法测定。此方法回收宰为1 魄鹤1 1 7 5 l 。具有较好的重复性香菇样品中。结合态甲醛含量占总甲醛的7 1 7 - 7 4 6 ，游离态甲醛 与结合态甲醛之比为3 4 1 一3 9 5 ( 6 ) 香菇中蛋白质和多糖可以结合甲醛，结合量分别为7 1 6 和2 2 9 9m 眺g ，甲醛主要 与多糖结合蛋白质与甲醛的结合几乎不受p h 、温度、时间的影响。随着甲醛浓度增大结合 量缓慢增加；多糖结合甲醛的最适p h 为7 o 。结合量随时间的延长而减少随甲醛浓度增大 而增加，不受温度影响 ( 7 ) 各种不同浓度香菇提取液处理过的蚕豆根尖细胞徽核率与自来水阴性对照组相比。 分别存在极显著性差异( p 氨基酸：分别取蝴氨酰转肽酶于5 支试管中，各加入5 m i 浓度为2 m m o l l 的谷氨酰 对硝基苯胺，摇匀后加入5 m l 、0 1 n m l 几的l 半胱氨酸、l 亮氨酸，l 脯氮酸、k 色氨酸、甘 氨酸、谷氨酸、缬氨酸溶液，在3 7 ，p h 7 o 的缓冲液中反应l h ，4 1 0 r i m 处显色，测定对硝 基苯胺的含量 3 4 3 2 不同因素对半胱氨酸亚砜裂解酶活力的影响 ( 1 ) 温度：1 9 裂解酶与5 m l 浓度为o 知叫儿的l 一半胱氨酸于试管中，不同湿度( 2 5 ，3 7 4 0 。4 5 ，5 0 5 5 ，) ，p h 9 0 的缓冲溶液中反应l h 。加入5 m 1 2 , 4 - - = 硝基苯肼， 5 m l2 4 啪v i ，的n a o h ，5 2 0 r i m 处显色，测定丙酮酸的含量。 ( 2 ) p h ：l g 裂解酶与5 m 10 2 m o l ，l 的l 一半胱氨酸于试管中。不同p h ( 3 ，4 。5 ，6 ，7 ，8 ， 9 ，1 0 ) ，3 7 下反应1 h ，加入5 m 1 2 a - - = 硝基苯肼，5 m iz 4 n l 几的n a o h ，5 2 0 a m 处显色。 测定丙酮酸的含量 ( 3 ) 金属离子：l g 裂解酶与5 m 1 0 2 m 面l 的l 一半胱氨酸于不同试管中，分别加入o 1 m o 儿 的m g s o 、c u s 0 4 、确州氇) 2 、勐( c h 3 0 kc 觚池，在3 7 条件下，p i l 垒d 的缓冲液中反 应1 h 。加入5 m l2 4 一二硝基苯肼，5 m l2 4 m o l ，l 的n a o h ，5 2 0 a m 处显色 ( 4 ) 氨基酸：分别取1 9 裂解酶与5 m lo 2 啪l ，l 的l 一半胱氨酸于不同试管中，摇匀后各加入 0 1 m o l ，l 的l 半胱氨酸、l 亮氨酸、l 脯氨酸、l 色氨酸、甘氨酸、谷氨酸、缬氨酸，在3 7 。 p 聃0 的缓冲液中反应l h 。加入5 m i2 ，4 一二硝基苯肼，5 m iz 4 n “i 的o h 。5 2 0 r i m 处显色。 测定丙酮酸的含量 3 4 4 乙酰丙酮法测定香菇中的甲斟珏5 2 l 称取5 0 9 打成匀浆的香菇，放入5 0 0 m l 蒸馏瓶加入约1 0 0 m l 水，2 m l 液体石蜡、1 0 m l l 嗡 ( v ) 磷酸，数粒玻璃珠，蒸馏用置于冰浴中的l 皿容量瓶接收馏出液。待蒸出近1 0 0 m l 的馏出液时。停止蒸馏，取下接收容量瓶，用蒸馏水定容至1 0 0 m 1 取蒸馏液5 m i 于2 5 m i 容量瓶中，加入l “乙酰丙酮，蒸馏水定容。于沸水浴中加热3 m i a , 取出冷却，以样品空白调零点，于0 5 m 处以1 锄比色杯进行比色，记录吸光度查标准 曲线计算结果 甲醛含量c ( m g k g ) 计算公式l 工：! 坐 k + 肼 式中，a ：从标准曲线上查得的甲醛含量( 眶) v i t 馏出液总体积( m l ) v 2 ：测定时取馏出液的体积( m l ) 实验材料和方法 m ：样品质量( g ) 3 4 5 香菇中甲醛的存在状态 3 4 5 1 香菇中不同状态甲醛的测定 3 4 5 1 1 香菇中游离态甲醛的测定 5 0 5 3 1 取打成匀浆的香菇3 0 9 于5 0 0 m l 蒸馏瓶中，加入约6 0 m l 水。2 m l 液体石蜡、数粒玻璃珠， 蒸馏3 0 r a i n ，用置于冰浴中的2 5 0 皿容量瓶接收馏出液，待蒸出近2 5 0 m l 的馏出液时，停止 蒸馏，取下接收瓶。用蒸馏水定容至2 5 0 m l 。取5 m l 蒸馏液。加入l m l 乙酰丙酮，蒸馏水定容 至2 5 m l ，测定蒸出的游离态甲醛含量。 3 4 5 1 2 香菇中总甲醛的测定f 3 1 1 取打成匀浆的香菇3 0 9 于5 0 0 m l 蒸馏瓶中，加入约6 0 1 1 1 1 水，2 , - 1 液体石蜡、数粒玻璃璩， 1 0 m 1 1 0 磷酸蒸馏3 0 r a i n ，用置于冰浴中的2 5 0m l 容量瓶接收馏出渡，待蒸出近2 5 0 m l 的馏 出液时，停止蒸馏，取下接收瓶，用蒸馏水定容至2 5 0 m l 。取5 m l 蒸馏液，加入l m l 乙酰丙酮， 定容至2 5 m l ，测定蒸出的总甲醛含量 3 4 5 2 香菇中甲醛存在状态的探讨 称取打成匀浆的香菇5 0 9 于5 0 0 m l 蒸馏瓶，加入约1 0 0 m l 水，2 m l 液体石蜡、玻璃珠数清 蒸馏，用置于冰浴中的1 0 0m l 容量瓶接收馏出液分别收集1 0 、加、5 0 、6 0 r a i n 的 馏出液，待蒸出近1 0 0 m l 的馏出液时，停止蒸馏，取下接收瓶。用蒸馏水定容至1 0 0 m 1 收集 完6 0 r a i n 的蒸馏液后，向蒸馏瓶中加入1 0 m l ，1 0 磷酸继续蒸馏，收集7 0 、8 0 、9 0 r a i n 的蒸 馏液。取5 m l 蒸馏液。加入1 r i d 乙酰丙酮，蒸馏水定容至2 5 m l ，测定甲醛含量 3 4 6 香菇中多糖和蛋白质与甲醛的结合及其影响因素 3 4 6 1 香菇多糖与甲醛的结合及其影响因素 香菇多糖的提取i ”哪：称取一定量的香菇，粉碎，加入1 0 倍体积蒸馏水，8 5 ( 2 加热5 h ， 过滤，提取2 次，合并滤液。常压加热浓缩向浓缩液中缓缓加入乙醇至乙醇含量为。 过夜抽滤。沉淀物干燥得到香菇多耱租品 3 4 6 1 1p h 对香菇多糖结合甲醛的影响 取香菇多糖0 5 9 ，加入l m ll m g m l 的甲醛溶液，9 m lp h 分别为4 0 、5 0 、6 0 、7 0 ，8 0 、 9 0 的缓冲液，2 5 ，磁力搅拌l h ，3 0 0 0 r r a i n 离心1 5 m i a ，取下部沉淀，测定其中的甲醛浓度 3 4 6 1 2 时间对香菇多糖结合甲醛的影响 取香菇多糖o 5 9 ，加入1 0 m l1 0 0 m g l 的甲醛溶液，2 5 磁力搅拌0 5 、1 0 、3 0 、5 0 、 7 0 、9 0 h ，3 0 0 0 r m l u 离心1 5 r a i n ，取下部沉淀。测定其中甲醛浓度。 3 4 6 1 3 温度对香菇多糖结合甲醛的影响 西南大学硕士学位论文 取香菇多糖0 5 9 。加入1 0 m l1 0 0 m g l 的甲醛溶液，在5 、1 0 、1 5 、2 0 、2 5 、3 0 下磁力 搅拌l h ，3 0 1 ) 0 r m i n 离- f i , 1 5 r a i n 。取下部沉淀，测定多糖中的甲醛浓度。 3 4 6 1 4 甲醛液浓度对香菇多糖结合甲醛的影响 取香菇多糖0 5 9 ，加入1 0 m l 浓度为1 0 、5 0 、1 0 0 、2 0 0 、3 0 0 、4 0 0 m 玑的甲醛溶液，2 5 c 。 磁力搅拌l h ，3 0 0 0 r m i n 离心1 5 r a i n 。取下部沉淀。测定甲醛浓度 3 4 6 2 香菇中蛋白质与甲醛结合的影响因素 香菇蛋白质的提取f 7 1 7 6 l ：香菇粉碎，用含n a c l7 0 、含n a g q o - # 0 2 o 2 5 的溶液， 按1 ：1 0 蜘1 ) 的辩涟比，h 0 5 0 c ，搅拌1 5 2 0m i t t ，再缓缓加0 2 5 n a o h 浓度碱液，调 p h 值到8 5 9 0 左右p h 值调好后再搅拌反应约1 2 0r a i n ，用1 0 0 目筛绢滤除料浆中的残 渣，滤液于4 0 0 0r r a i n 离心1 0 m i n , 得到上层乳清液向乳清液中加入1 0m o plh c i 溶液 降p h 到3 4 ，乳液中析出絮状蛋白，放置1 5 2 h ，除去上清液，下部便为蛋白向蛋白胶 内按1 1 1 56 的比例加入蒸馏水洗涤，4 5 5 0 搅拌1 5h ，离心，丢弃上清液，如此 重复2 3 次至蛋白为中性。洗后蛋白胶体经离心脱水后。千燥为成品香菇分离蛋白 3 4 621 p m 对香菇蛋白质结合甲醛的影响 取香菇蛋白质o s g ，加入l m l l m g j m l 的甲醛溶液，9 m l p h 分别为4 0 、5 0 、6 0 、7 0 、8 0 、 9 0 的缓冲液，使蛋白质溶于1 0 m l 浓度为1 0 0 m g l 的甲醛溶液，2 5 。搅拌l h 。3 0 0 0 r r a i n 离心1 5 m i n ，取下部沉淀，测定甲醛浓度。 3 4 6 2 2 时闻对香菇蛋白质结合单醛的影响 取香菇蛋白质o s g ，加入1 0 m l l 0 0 m g l 的甲醛溶液，2 5 c ，分别搅拌0 5 、1 0 、3 0 、5 0 、 7 o 、9 眈3 0 0 0 r r a i n 离心1 5 r a i n ，取下部沉淀，测定甲醛浓度。 3 4 6 2 3 温度对香菇蛋白质结合甲醛的影响 取香菇蛋白质0 s g ，加入1 0 m l1 0 0 m g l 的甲醛溶液，分别在5 、1 0 ，1 5 、2 0 、2 5 、5 0 c 下搅拌l h ，3 0 0 0 r r a i n 离心1 5 r a i n ，取下部沉淀，测定甲醛浓度 3 4 6 2 4 甲醛液浓度对香菇蛋白质结合甲醛的影响 取香菇蛋白质0 s g ，分别加入1 0 m l 浓度为1 0 、5 0 、1 0 0 、2 0 0 、3 0 0 、4 0 0 m g 几的甲醛溶 液。2 5 ，搅拌l h ，3 0 0 0 r r a i n 离心1 5 r a i n ，取下部沉淀，测定甲醛浓度。 3 4 7 香菇提取液对遗传作用的影响 香菇提取液的制各：将粉碎并过筛的鲜香菇，加入适量蒸馏水。煮沸提取过滤，收集滤液 共提3 次，每次煮沸3 0 m i n 合并滤液浓缩到l m l 提取液相当于1 幢鲜香菇 3 4 7 1 香菇提取液对蚕豆根尖的诱变作用f w - s o l 选择饱满、大小均匀的蚕豆种子于蒸馏水中浸泡1 d ，让其吸胀。2 5 恒温培养，1 2 h 换 1 4 实验材料和方法 水1 次待根长至2 3 c m 时，分别用自来水，5 m l l 0 m g m l 环磷酰胺溶液，0 1 、0 2 、0 4 、 0 6 、0 8 、1 0 9 m l 浓度的香菇水提取液处理曲，不同浓度香菇处理液由浓度为l g m l 的香菇 提取储备液配制，香菇储备液中所含甲醛含量为3 8 7 2 m g l ；另外用蒸馏水，5 m l l 0 雌g m l 环 磷酰胺溶液和1 2 、4 7 、9 3 、2 3 4 、4 6 8 、9 3 6 、1 4 0 4 、1 8 7 2 、2 3 4 0 u g m l 9 种浓度的甲醛溶 液处理曲，用作对比。用卡诺氏固定液( 无水乙醇：冰醋酸- - 3 ：1 ) 固定2 4 h ，置7 0 乙醇于4 c 冰箱中保存取根尖的分生组织，常规制片，用碱性品红染色。镜检。每个浓度的诱变剂镜 检3 个根尖，每个根尖至少观察1 0 0 0 个闻期细胞，统计细胞观微核数按下式计算微核率： m a q _ 6 。苤塑堕堂曼! 鱼堑堕! 墼! 翌窒型塑堕燮 某测试样品( 或对照) 观察的细胞数 3 4 7 2 香菇提取液的a m e s 实验i s l 删 将香菇提取液分别稀释为0 5 ，0 1 5 、0 0 5 、0 0 1 、0 0 0 5 9 m l 的溶液，则受试物作用于测 试菌株的终浓度为0 0 5 、0 0 1 5 、0 0 0 5 、0 0 0 1 、o o 0 0 5 9 n n ，不同浓度香菇处理液由浓度为l g m l 的香菇提取储备液配制，香菇储备液中所含甲醛含量为3 8 7 2 m e , l 。由于香菇中甲醛含量范围 一般为6 3 0 0 m g 礓【7 l ，另外配置浓度为5 、1 0 、5 0 、1 5 0 、2 5 0 u g m l 的甲醛溶液作对比，受试 物与菌株作用的终浓度分别为0 5 、1 0 、5 0 、1 5 、2 5 u g n n 本实验采用平板掺入法 s o l ：取营养肉汤培养基5 m l ，加入无菌小三角瓶或无菌试管中，将 主平板或冷冻保存的菌株培养物接种于营养肉汤培养基内，”培养1 0 h 至对数增长期，每 血不少于1 2 x 1 0 9 活菌数另外准备底层培养基若干，在保温的顶层培养基中依次加入测试 菌株新鲜增菌液o 1 m l ，混匀；分别加浓度为5 1 0 、5 0 、1 5 0 、2 5 0 u g m l 甲醛溶液及0 5 、0 1 5 、 0 0 5 、0 0 1 、o 0 0 5 9 m l 香菇提取液0 1 m l 再混匀，迅速倒入底层培养基上，转动平皿使顶层培 养基均匀分布在底层上，平放固化，每个剂量设三组平行，3 7 培养4 8 h 观察结果另做一 阳性对照和空白，t a 9 7 阳性对照为1 5 u g m l 的n a n 3 ，每皿0 1 m l 即1 5 u g n n t a 9 8 阳性对照 为黄曲霉毒素b 1 ( a f b l ) ，剂量为1 5 u g n n 结果判断：与溶剂对照组相比较，突变率( m r ) 值为样品处理平皿的回变菌落数， 瞽剂对 照平皿的回变菌落数大于或等于2 ，并具有剂量反应关系者判断为阳性结果 3 4 8 不同处理方法对香菇中甲醛的影响 3 4 8 1 浸泡：称取5 份l o o g 香菇，洗净，分别于2 0 0 m l 自来水中浸泡5 、1 0 、2 0 、3 0 、4 0 r a i n ， 如方法3 4 4 测定通过不同浸泡时问处理后香菇和汤汁中的甲醛含量。 3 4 8 2 炖煮：称取5 份1 0 0 9 香菇，洗净，分别在2 0 0 m l 水中煮沸5 、1 0 、1 5 、2 0 、2 5 m i n ，如 方法3 4 4 测定通过不同炖煮时间处理后香菇和汤汁中的甲醛含量。 3 4 8 3 油炸：称取5 份l o o g 香菇，洗净，分别油炸0 5 、1 0 、1 5 、2 0 、3 0 、4 0 m i n ，如方法 3 4 4 测定不同油炸时间处理后香菇中的甲醛含量。 1 5 西南大学硕士学位论文 3 5 数据分析处理 实验数据均为3 次以上测得的平均值回归方程和方差分析由e ) 【旺l 软件得出。 结果与分析 曙窟皇曼置曼曼舅曼曼皇舞曼量e 皇_ ii 一 第4 章结果与分析 4 1 香菇中香菇酶活力 1 9 7 1 年，日本学者k y o d e ny a s u m o t o 等嗍研究得出香菇酸在酶的作用下转化成香菇糟， 还产生丙酮酸、乙醛、甲醛和n i i j 在此酶解过程中。有两种不同的酶参与反应，即t 珞氨 酰转肽酶( y - g l u t a m y lt r a n s p e p t i d a s e ) 和半胱氮酰亚砜裂解酶劬“，叫卿妇9 h 娩6 幡田， 统称香菇酶 4 1 1 香菇及其它食用菌中香菇酶活力 香菇自身代谢会产生甲醛。有2 种酶参与该反应，分别为t 谷氨酰转肽酶和半肮氮酰噩 砜裂解酶反应过程为： r 珞氨酰转肚酶( 7 - g t u t a m y t 肌辨脚妇靶) 作用脱去香菇酸上的谷氨酰部分，生成脱谷 氨酰香菇酸i 接着半胱氨酰亚砜裂解酶( s - a k y l - l , - c y 皤e n es u a 矗d e 驷w ) f 乍用脱谷氮酰香菇酸 产生不稳定的中间产物并同时转化为香菇香精和甲醛等物厨” 测定了香菇等食用菌中俗氨酰转肽酶、半胱氨酸亚砜裂解酶的活力，测定结果见表4 - - 1 ： 裹4 - - 1 不同食用藿的香菇酶活力 一t a b l e 生1a c t i v i t yo f2 , - g l u t a m y l t r a n s p e p t i d a s ea n dc - s l y a s ei nd i f f e r e n tm u s h r o o m 用菌酶活力 谷氮酰转肚酶半胱氨酸亚碱裂解爵 甲醒 ! ! ! 璺! ! ! ! 鲤21 驾熙! 香菇3 6 22 3 8 9 6 2 风尾菇来检出来检出 1 刀 金针菇未检出未检出 。7 1 3 6 白鸡腿菇未检出 未检出束检出 誓菇来检出未检出 来检出 木耳未检出未检出 来检出 由表4 一l 可知，在检测的香菇、木耳等6 种食用苗中，只有香菇含有导致甲醛产生的t 谷氨酰转肽酵和半胱氨酸亚砜裂解酶，其活力分别为3 6 2 和2 3 8 ，甲醛禽量为9 6 2 m g k g s 其 他食用菌均未检出f 备氨酰转肽酶和半胱氨酸亚砜裂解酶，这些食用菌中甲醛含量很低或未 检出由此进一步证实，香菇中所含的甲醛主要与t 谷氨酰转肽酶和半胱氨酸亚砜裂解酶密 切相关，香菇可以通过自身代谢产生甲醛；所检测的其它食用菌中未检出p 爸氨酰转肽酶和 半胱氨酸亚砜裂解酶，不具备自身代谢产生甲醛的条件 1 7 西南大学硕士学位论文 4 1 2 香菇不同部位香菇酶活力 将香菇分为菇盖、菇褶、菇柄三个部分，分别提取t 谷氨酰转肽酶和半胱氨酸亚砜裂解 酶，测定其活力。结果见表4 2 表4 2 香菇不同部位香菇酶活力 酶活力 不同部位t 谷氨酰转肚酶 半胱氨酸亚砜裂解酶 (um01)(em01) 菇柄 2 3 91 2 2 菇盖1 4 6 o 3 6 菇褶 z 1 31 0 s 整菇 3 6 22 3 8 由表4 2 可知，香菇各部位都含有导致甲醛产生的t 谷氨酰转肽酶和半胱氨酸亚砜裂解酶， 并且各部位的卜谷氨酰转肽酶活力均高于半胱氨酸亚砜裂解酶说明与半胱氨酸亚砜裂解酶 比较，俺氨酰转肽酶在产生甲醛的酶促反应中起主导作用，是导致香菇代谢产生甲蹩的主要 酶类 4 2 香菇酶活力的影响因素 4 2 1 y - 谷氨酰转肽酶活力的影响因素 4 2 1 1 p h 对t 谷氨酰转肽酶活力的影响 提取的t 谷氨酰转肽酶与谷胺酰基对硝基苯胺在3 7 、不同p h ( 3 0 、4 0 、5 0 、7 o 、 8 0 、9 0 、1 0 0 ) 的溶液中反应1 h ，测定对硝基苯胺含量，计算酶活力，结果如图4 1 ； 234，67， ml i _ l l 圈4 一lp h 对转肤莓活力的影响 f l g 4 - 1 e f f mo fp h o nr 剧衄明叫靠埘啊鹎p l i 妇a c t i v i t y -i言日j)|r蜉t 结果与分析 由图4 1 可知：在p h 2 o 7 0 条件下转肽酶活力逐渐增加，当p h = 7 0 时达到最大。 p h 7 0 ，酶活力逐渐下降，当p h = 1 0 0 。转肚酶活力只有p h 7 6 时的4 6 9 2 实验结果表 明，1 皤氮酰转肽酶为中性酶。其最适p h 值是7 0 由于香菇自身以及常用的香菇加工方式如干燥、盐渍等方法的p h 均为中性，因此无论在 香菇生长还是加工过程中。转肽酶都具有相当的活力，有利于甲醛的产生通过调节加工过 程的p h 可能减少香菇中的甲醛含量 4 2 1 2 温度对t 谷氨酰转肽酶活力的影响 提取的t 珞氨酰转肽酶与谷氨酰基对硝基苯胺在p l 玎0 t 不同温度( 2 5 c 。3 7 4 0 。 4 5 ，5 0 ，5 5 ，) 的溶液中反应1 h ，测定对硝基苯胺含量，计算酶活力，结果如图 4 2 2 02 53 03 54 04 55 0 贷 6 0醪 沮度( ) 图4 2 温度对p 谷氯酰转肽誓活力的影响 f i 9 4 - 2 f m e c t o f t e m p e r a a m 。y - g u t a m y l t r a n s 印t d a s e a c t i v i t y 从图4 2 得出，当温度在2 5 - 3 7 c 时，t - 谷氨酰转肽酶活力随温度的增加缓慢增加，在 3 7 c 时其活力达到最大；超过3 7 后，活性呈明显下降趋势。当温度达到卯时，酶活力基 本消失在香菇的加工处理中，晾晒，热风干燥的温度一般在4 5 ，真空干燥为5 0 、真空 冷冻干燥的温度低于5 0 c ，这些温度都不能使t 珞氨酰转肚酶很快失活，因此在干燥过程中 香菇仍然具有产生甲醛的能力 4 2 1 3 金离子对t 谷氨酰转肽酶活力的影响 谷氨酰基对硝基苯胺溶液中加入0 1 m o l l 的m g s 0 4 、c 1 1 s 0 4 、f o ( n 0 3 ) 2 、z a ( c t l , c o o ) z 、 c a c l 2 溶液，与提取的t 珞氨酰转肽酶在p h 7 0 ，3 7 c 条件下反应1 h ，测定对硝基苯胺含量， 4：3拈2，帖。 毫邑r船髓 西南大学硕士学位论文 计算酶活力，结果见表4 3 表4 3 金属离子对t - 谷氨酰转肽酶活力的影响 t a b 1 e 4 - 3 e f f e c t o f i o n s o n y - g 1 u t a m y 1 t r a n s p e p t i d o s e a c t i v i t y 处理方式酶活力( u m 0 1 ) 对照 m 矿 o p 帕” z a 2 + c a 2 + 3 5 8 4 0 2 o 6 8 2 7 3 1 9 3 1 1 8 6 将表4 - - 3 的结果经统计分析发现，m 9 2 + 影响的酶活力与对照相比不具有显著性差异， c 1 2 + 影响的酶活力与对照相比具有极显著性差异( p o 0 1 ) 。表明c 分+ 对转肽酶活力有促进 作用。而在香菇栽培过程中只有m 矿+ 是其生长发育所需要的矿质元素之一。而c f + 可以抑制 香菇菌丝的生长所以不被使用【明 经统计分析发现，c 铲+ 、r 0 2 + 、z , n 2 + 可以抑制转肽酶活力且都具有显著性差异( p o 0 5 ) ， 可能由于转肽酶的活性中心含有巯基嘲，而c u z + 、p b 2 + 、z n 2 + 与巯基具有较强的亲和力从而 导致酶活性位点的结构发生改变，使酶活力降低。 4 2 1 4 氨基酸对t - 谷氨酰转肽酶活力的影响 谷氨酰基对硝基苯胺溶液中加入0 1 m o i l 的l 半胱氨酸等氨基酸溶液，与提取的f 谷氨 酰转肽酶在p h 7 0 ，3 7 c 条件下反应1 h ，测定对硝基苯胺含量，计算酶活力，结果见表4 - - 4 表4 4 氨基酸对十谷氨酰转肽酶活力的影响 t a b l e4 - 4e f f e c to f a m i n oa c i do ny - g l u t a m y lt r a n s p e p t i d a s ea c t i v i t y 处理方式酶活力( u m o i ) 2 0 结果与分析 从表4 4 得出，除缬氨酸、谷氨酸和甘氨酸外，其余4 种氨基酸均对十谷氨酰转肽酶活 力有激活的作用，且与对照组相比差别均具有极显著性( p 7 o 后，酶活力呈显著增加由此可见，半胱氨酸亚砜裂解酶属于碱性酶类，在碱性条件下 酶活力较高香菇生长和加工过程的p h 多为酸性和中性环境i s 0 ，这些条件对裂解酶活力不具 有促进作用，进一步验证了香菇中甲醛产生是f 奢氨酰转肽酶起主导作用 4 2 2 2 温度对裂解酶活力的影响 提取的半胱氨酸亚砜裂解酶与半胱氨酸在p h 9 0 ，不同温度( 2 5 c ，3 7 c ，4 0 c ，4 5 1 2 ， 5 0 ，5 5 ，) 的溶液中反应1 h ，测定丙酮酸含量，计算酶活力，结果如图4 4 3 2 坫 。 ” o (，i，io目n)r蜉麓 西南大学硕士学位论文 3 2 5 莹 2 邑1 5 r 鏊 ， 0 5 0 加笛3 5柏舒卯耶 酷 温度( ) 图4 - - 4 温度对裂解酶活力的影响 f i g4 - 4e f f e c to fp ht e m p e r a m mc - s l y a s ea c t i v i t y 从图4 4 得出，在2 5 c - 3 7 c 半胱氨酸亚砜裂解酶活力随温度的增加有缓慢增加，在3 7 c 时其活力达到最大；超过3 7 c 后，活性开始下降。 4 2 2 3 金属离子对裂解酶活力的影响 半胱氨酸溶液中加入0 1 m o l l 的m g s 0 4 、c u s 0 4 、l b ( n 0 3 ) z 、z n ( c h 3 c 0 0 ) 2 、c a c l z 溶液， 与提取的半胱氨酸亚砜裂解酶在p h 9 0 ，3 7 c 条件下反应1 h ，测定丙酮酸含量，计算酶活力， 结果见表4 5 表4 5 金一离子对裂解酶活力的影响 坠! ! ! 量丝塑2 至唑婴箜篁苎登垒垡垃业 丝垄立垄 堡适垄垒! ! ! 型 对照 2 3 0 m 9 2 + 5 8 1 ca2+811 n p6 2 9 z a 2 +1 7 9 ( o +3 2 1 由表4 - 5 得出，c a 2 + 、p b 2 + 、c u 2 + 、m 9 2 可以促进酶活力的增强，而z n 2 + 对裂解酶活力 有抑制作用经统计分析，各组与对照组相比差别均具有显著性( p o 0 5 ) ，其中c 曩2 + 、m 矿 + 也可以促进t 谷氨酰转肽酶活力增强。p b 2 + 、c u 2 + 做为重金属离子不是香菇生长发育必需的 矿质元素。m 9 2 + 作为香菇生长过程中所需的营养物质【研，对转肽酶和裂解酶的活力均具有激 活作用，因此在香菇栽培过程中适当减少m 矿+ 的用量，可以减少代谢产生的甲醛含量 结果与分析 4 2 2 4 氨基酸对裂解酶活力的影响 半胱氨酸溶液中加入o 1 m o l l 的l 半胱氨酸等氨基酸溶液，与提取的半胱氨酸亚砜裂解酶 在p n 9 0 ，3 7 条件下反应l h ，测定丙酮酸含量，计算酶活力，结果见表4 6 表4 6 氨基酸对裂解酶活力的影响 坠生丝呈丝璺竖鲤鲤型! ! ! 箜坦丝啦 丝堡立垫曼适垄垒竺型 对照2 8 3 l 半肮氨酸1 3 6 l 亮氨酸3 1 0 l 腑氨酸 1 6 1 i ，色氨酸 2 4 0 甘氨酸 1 5 4 谷氨酸2 8 6 缬氨酸2 从表4 6 得出，o 半胱氨酸、【，脯氨酸、甘氨酸可以抑制裂解酶的活力，实验结果经统 计分析表明与对照组相比均具有极显著性差异( p o 0 1 ) ，其中甘氨酸对转驮酶活也有抑 铡作 用，与对照组相比具有显著性差异( p o 0 5 ) s 而i ，半胱氨酸，l 脯氨酸对转肤酶活有促进作 用，又由于导致香菇中甲醛产生的主要酶类是r 珞氨酰转肽酶，因此除甘氨酸外。大多数氨 基酸都可以促进甲醛的产生 4 3 香菇中甲醛存在状态的研究 4 3 1 乙酰丙酮法测定香菇中不同状态的甲醛 水蒸馏处理样品，提取香菇中的游离态的甲醛另加入l o m l1 0 磷酸处理样品。提取香 菇中的总甲醛，乙酰丙酮法测定甲醛含量。结果见表4 - - 7 表4 - - 7 香菇中不同状态的甲醛含量 t a b l e4 - 8 d e t e r m i n a t i o nd i f f e r e n tf o r m o f f o r m a l d e h 2 d ei n l e n t i n u s 堂曼! 坚： 垫堡曼! ! 贮璺量! 竖!墅! ! 錾垩! 坚： 1 1 6 2 6 1 4 6 2 5 2 7 8 1 1 0 6 0 未加酸1 0 1 0 91 4 6 2 52 5 2 7 31 0 3 6 8 1 0 6 1 51 4 6 2 52 7 8 0 01 1 7 5 1 4 0 4 3 72 9 2 54 3 4 6 9 1 0 3 鹋 加酸4 1 4 4 82 9 笛4 4 4 8 0 1 0 3 醴 4 1 9 5 32 9 2 54 4 9 8 61 0 3 6 8 西南大学硕士学位论文 表4 8 精密度实验结果 t a b l e4 - 8p r e c i s i o no ft h em e t h o d 塑塞墨旦苎盗型堡焦! ! ! e 墼： 王垫笪! ! ：e 堑! 堡壅茎壅墨墨墼堑 游离态甲醛 3 舯3 4 43 5 73 0 1 82 6 3 结合态甲醛 9 6 21 0 1 19 7 3 9 8 2 旦靼! ! ! 通过表”可知，不加酸的条件下采用水蒸馏法提取香菇中游离态的甲醛，同样条件下在 香菇样品中加入1 4 6 2 5 u g 的甲醛标准溶液，测得回收率为1 0 3 6 8 1 1 7 5 1 。加入酸的条件 下水蒸馏提取出香菇中的总甲醛，同样条件下在香菇样品中加入2 9 2 5 u g 的甲醛标准溶液，涮 得回收率为1 0 3 鹋。 由表4 8 可见，乙酰丙酮法测定游离甲醛的标准偏差为0 1 8 ，变异系数为z 醪l 测定 结合甲醛的标准偏差为0 2 6 ，变异系数为5 0 1 说明采用水蒸馏提取，乙酰丙酮法适合于 测定样品中不同形态的甲醛，具有重复性好，精密度较高，操作简便等优点 4 3 2 香菇中甲醛存在的状态 收集每1 0 m i n 的蒸馏液，用乙酰丙酮法测定甲醛蒸馏至6 0 r a i n 时向样品中加入1 0 m l ， 1 0 磷酸继续蒸馏，收集每1 0 m i n 的蒸馏液，乙酰丙酮法测定甲醛。结果见圈4 5 o4 0 时闻( 耐i ) 图4 5 不同方法处理样品时甲醛含量的变化 f i g4 - 5c o n t e n to f f o r m a d e h y d ei nd i 盎e r e n tm e t h o d s 由图4 5 可以看出，在不加酸的条件下蒸馏出的游离甲醛含量随蒸馏时问的增加而减少， 蒸馏到6 0 m i n 时基本可将香菇中的游离甲醛全部蒸馏出来；当向样品中加入酸时，蒸馏出的 甲醛含量随蒸馏时间的增加而增大，说明样品中存在结合态的甲醛。这些甲醛相对稳定，需 要在酸性条件下才能被分解并被蒸馏出来 弘；：笱坫加5 o 结果与分析 裹4 - 9 香菇中游离态与结合态甲醛的比倒 样品游离甲醛( m l g 厅回结合甲醛( m g ，k 酚总甲醛( m l g 坳结合甲瞳，总甲醛( 多) 由表4 9 可以看出，香菇中结合态的甲醛含量较游离态甲醛多，在测定的香菇样品中， 游离态甲醛含量范围为3 4 4 3 s 0 m # , 8 ，结合态甲醛含量在9 6 2 1 0 1 1m g l 喀之问，总甲醛 中结合态甲醛含量范围为7 1 7 7 4 6 。香菇中的甲醛主要以结合态存在 4 4 香菇中蛋白质和多糖与甲醛结合及影响因素 多糖和蛋白质是香菇中主要的大分子物质。而甲醛等醛类物质含有羰基极性基团，为极性 吸附质嗍，甲醛还可以和蛋白质的氨基结合i 蛳 根据香菇的生长条件，建立香菇多糖和蛋 白质结合甲醛的模拟体系，研究香菇中多糖和蛋白质与甲醛可能的结合和影响因素，为进一 步研究香菇中结合态甲醛的性质奠定基础 4 4 1 香菇蛋白质和多糖与甲醛的结合 提取香菇中的多糖和蛋白质，模拟香菇生长条件，在2 5 、p h 6 0 条件下。使多糖和蛋 白质浸泡在1 0 m l1 0 0 m g 1 的甲醛溶液中，搅拌l h ，3 0 0 0 r r a i n 离心1 5 m i n ，取下部沉淀测定蛋 白和多糖中的甲醛结果如表4 - 1 0 ： 衰4 - 1 0 香菇蛋白质和多糖与甲醛的结合量 t a b l e 4 - 1 0 c o n t e n t o f f o r m a l d e h y d ec o m b i n e d w i t h p r o t e i n a n d a m y l a s e i n t h e l e n a n u se d o d e a 曼墨! ：查塞! 璧! ! j e 丝! 丝金! 蹩! 氅丝： 多糖0 5 1 3未检出2 2 9 9 蛋白质0 5 嘴未检出7 1 6 由表4 - 1 0 可见，提取出的香菇蛋白质和多塘中不含有甲醛，但当环境中存在甲醛时，蛋 白质和多糖对外源性甲醛都具有结合作用可能是由于甲醛等醛类物质含有羰基这个极性基 团，可以被多糖这样的极性大分子吸附闭i 甲醛可以和蛋白质中的氨基发生反应，与蛋白质 结合【i 。在模拟香菇生长环境的体外试验中，多糖结合的甲醛含量是蛋白质结合甲醛含量的 3 2 倍，说明与蛋白质相比，多糖结合甲醛的能力较强。 4 4 2p h 对香菇蛋白质和多糖结合甲醛的影响 ， - - 0 5 9 香菇蛋白质、多糖分别与1 0 m l1 0 0 m g l 的甲醛溶液，在不同p i t ( 4 0 、5 0 、6 0 、 7 0 、8 0 、9 0 ) 条件下结合1 h 测定其中的甲醛含量结果如图4 一“ 2 s 西南大学硕士学位论文 24681 0 p h 田4 - - 6 p h 对结合甲醛的影响 瑰4 - 6 e f f e c t o f p r i o n f o r m a l d e h y d e c o m b i n a t i o a 从图4 - - 6 可以看出，香菇多糖和蛋白质都可以结合甲醛。多糖结合甲醛的能力较强，最 大结合量是香菇蛋白质结合量的3 3 倍。但香菇蛋白质与甲醛的结合几乎不受环境p h 的影响， 多糖与甲醛的结合受p i l 影响较大，在i 为7 0 时，多糖结合甲醛的量达到最大，可以结合 2 5 8 1 9 m g k g 甲醛香菇生长的p h 大多为酸性环境唧，加t 过程的p h 多为中性，因此香菇 生长和加工过程的p t i 对多糖与甲醛的结合影响较小 4 4 3 温度对对香菇蛋白质和多糖结合甲醛的影响 - - * 0 5 9 蛋白质、多糖分别与1 0 m l1 0 0 m g l 的甲醛溶液，选择香菇生长过程中的温度范围 5 、1 0 、1 5 、2 0 、笛、3 0 条件下结合n 测定其中的甲醛含量结果如图4 - - 7 3 2 5 0 0 o51 01 52 02 5曲3 5 温度( ) 图4 7 温度对结合甲醛的影响 f i g4 - 7e f f e c to f t e m p e r a t u r eo nf o r m a l d e h y d ec o m b i n a t i o n 瑚 瑚抛 瑚 瑚如 。 奄善u)舡邋 抛 脚 蛳 卯 ，t|i，l_ 旨v如馓 结果与分析 从图4 7 可以看出。香菇多糖结合甲醛的能力明显强于蛋白质。它们与甲醛结合的量几 乎不随温度而变化：蛋白质与甲醛结合的量随温度的增大缓慢减少在香菇生长过程中多糖 与甲醛的结合并不受该范围温度变化的影响 4 4 4 时间对对香菇蛋白质和多糖结合甲醛的影响 如5 9 香菇蛋白质、多糖分别与1 0 m l1 0 0 m g l 的甲醛溶液结合不同时问( o - 5 、1 0 、3 0 ， 5 0 ，7 0 、9 o ) ，测定其中的甲醛含量结果如图4 8 3 5 0 3 o2468l o 时问c a ) ” 圈4 - - 8 时问对结合甲醛的影响 f i g 4 , se f f e c to f l l m eo nf o r m a d e h y 出c o m b i n a t i o n 由图4 8 可知，香菇多塘与甲醛的结合随时问的延长而减少，香菇多糖与甲醛结合轴 时的量为2 5 8 8 9 m g k g ，而结合9 h 时的量为1 5 6 4m g k g 。与孙的结合量相比降低丁9 3 9 6 可能是由于香菇多糖与甲醛的结合仅仅是物理上的粘和或吸附，是可逆的 蛋白质与甲醛的结合比较稳定，结合甲醛的量随着时间的变化并不发生很大变化，可能 由于甲醛与蛋白质中的某些基团发生了反应，其结合是不可逆的 4 4 5 甲醛浓度对对香菇蛋白质和多糖结合甲醛的影响 如- 5 9 蛋白质、多糖分别与1 0 m l 不同浓度( 1 0 m g l , 5 0 m g i n1 0 0 m g l 、2 0 0 m g l 、3 0 0 r a g i , , 4 0 0 r a g l ) 的甲醛溶液结合1 h ，测定其中的甲醛含量结果如图4 9 瑚 珊 瑚 椭 卯 。 冒巷日i舡斑 西南大学硕士学位论文 o1 0 02 0 03 0 04 0 0 甲醛涟浓度( 唧 囝4 - - 9 外源甲醛的浓度对结合甲醛的影响 h g4 - 9e f f e c to f f o r m a l d e h y d ec o n t e n to rc o m b i n a t i o n 由图4 9 可知，香菇多糖和蛋白质结合甲醛的量都随着外源性甲醛添加量的增加而增大 当甲醛添加量在1 0 2 0 0 m g l 时，香菇多糖与甲醛的结合量几乎呈直线上升l 添加量为 2 0 0 m g t , 时，香菇多糖结合甲醛的含量为7 8 1 3 5 m e k s 当甲醛的添加量超过为2 0 0 m 玑时， 香菇多糖结合的甲醛含量趋于稳定 当甲醛添加量在1 0 4 0 0 m g l 时，蛋白质与甲醛的结合随着外源性甲醛添加量的增加始 终呈缓慢增大趋势。吸附量由1 8 5 1 m g k g 上升至1 3 7 5 7 n 珞k g 4 5 香菇提取液对遗传作用的影晌 4 5 1 香菇提取液对蚕豆根尖微核率的影响 蚕豆根尖微核( m z _ o n u c e u sm c l q ) 赫；是一种检测化学品对生物毒害的遗传毒理学方法 徽核是常用的遗传毒理学指标之一，是真核生物细胞中的一种异常结构。是染色体畸变在问 期细胞中的一种表现形式一般认为微核是由有丝分裂后期丧失着丝粒的染色体片断产生 在细胞有丝分裂时，受到有害理化因子的损伤，染色体发生断裂在下一次分裂后期，丧失 着丝粒的染色体片断行动滞后，不能进入子细胞的主核，形成滞