（食品科学专业论文）高压和热处理对蛋黄体系中蛋白质的影响.pdf

摘要 摘要 学科、专业：食品科学、食品生物技术入学时间：2 0 0 7 年9 月1 日 研究生姓名：阎微答辩时间：2 0 0 9 年7 月2 7 日 导师：杨严俊授予学位时间： 蛋黄是食品加工中不可或缺的一种原料，其较高的营养和优良的功能性质如乳化 性、凝胶性等得到广泛应用。为保证蛋制品的安全性，鸡蛋要经过适当的杀菌过程。在 保证微生物符合要求的前提下，蛋黄的功能性质及其他理化指标也是表征杀菌过程的重 要参数。本论文对蛋黄蛋白质体系研究了以下几个方面，得到如下结论： ( 1 ) 蛋黄经冷冻离心得到组成成分上清( p l a s m a ) 和沉淀( g r a n u l e s ) 部分，对各部分理 化性质进行了研究。s d s p a g e 电泳确定了三部分的蛋白质组成。三部分蛋白质的溶解 度在0 5 m 氯化钠中最高，达9 0 以上。在蛋白质溶解度相当的情况下，研究各部分的 乳化性，结果表明：蛋黄的乳化活力主要由上清部分贡献，乳化稳定性主要由沉淀部分 贡献。颗粒分析结果显示，上清部分结构主要为聚集体形式，沉淀部分主要为球状。 ( 2 ) 高压对蛋黄理化性质的影响。结果表明，1 0 0 5 0 0 m p a 压力处理1 0 m i n ，蛋黄 蛋白质的溶解度逐渐降低；表面疏水性逐渐降低；表面巯基含量在3 0 0 m p a 处理后显著 下降，5 0 0 m p a 处理后巯基含量降为零。蛋黄在4 0 0 m p a 处理1 0 m i n 后大部分形成凝胶， 5 0 0 m p a 处理1 0 m i n 后完全形成凝胶。蛋黄的乳化活力在压力处理后变化不明显，乳化 稳定性在1 0 0 m p a 处理后上升，随后又下降。 ( 3 ) 热处理对蛋黄理化性质的影响。研究了6 2 、6 5 和6 8 加热不同时间蛋黄 的乳化性、蛋白质变性情况、表面巯基含量的变化及蛋黄液的流变性。得出在6 8 加热 3 5 r a i n 蛋黄大部分出现凝胶，巯基含量降低为零；6 5 加热不同时间和6 2 加热不同 时间蛋黄的乳化性几乎没发生变化，蛋白的其他理化指标变化也不大。电泳表明，在6 2 加热2 5 r a i n 后丫卵黄蛋白出现变性；对于其他蛋白质的变性在不同温度和不同时间 则不明显。继续研究了6 5 加热不同时间蛋黄蛋白质的其他性质变化，包括黏度、蛋白 质溶解度、表面疏水性等。结果表明，6 5 蛋黄加热是个可逆的热变性，加热3 5 r a i n 后蛋白质疏水性基团开始外露，随着加热的继续进行外露的疏水性基团重新聚合。6 5 加热到9 5 r a i n 后蛋黄发生部分凝胶。 ( 4 ) 傅立叶红外研究蛋黄蛋白质在加热过程中二级结构的变化。利用红外光谱拟 合得到蛋黄蛋白质二级结构组成为：b 折叠3 2 6 ，p i1 2 8 3 ，a 螺旋15 8 5 ，1 - 转角 1 8 5 8 ，丫无规则卷曲2 0 1 5 。蛋黄中的蛋白质二级结构以d 构象为主，1 3 + a 构象含 量几乎占总构象的5 0 。从最大吸收峰的位置迁移可以表明蛋黄在加热过程中是个可逆 的变化。 关键词：蛋黄；蛋白质；理化性质；流变学；二级结构； a b s t r a c t a b s t r a c t h e n se g gy o l k ( e y ) i sak e yi n g r e d i e n ti nm a n yf o o dp r o d u c t s e g gp r o t e i n sa d da h i 【g h n u t r i t i o n a lv a l u et oe g g c o n t a i n i n gf o o d sa n dt h e ya r ea l s oa s s o c i a t e d 、 ，i t hs e v e r a lf u n c t i o n a l p r o p e r t i e sf o ri n d u s t r i a la p p l i c a t i o n s t h e s ei n c l u d eg e lf o r m a t i o n ，f o a m i n gc a p a c i 哆a n d e m u l s i f y i n ga b i l i t ya m o n go t h e r s t oe n s u r et h a te g gp r o d u c t sa r ef r e ef r o mp a t h o g e n i c b a c t e r i aa n dp a r t i c u l a r l ys a l m o n e l l a , e g gy o l kn e e dt ob ep a s t e u r i z e du n d e rc e r t a i nc o n d i t i o n s e g gp r o c e s s o r sa f ec o n c e m e da b o u tt h e s et i m e - t e m p e r a t u r et r e a t m e n t sb e c a u s et h ep r o d u c t s s h o u l dn o to n l yb em i c r o b i o l o g i c a l l ys a f eb u ts h o u l da l s op e r f o r m s a t i s f a c t o r i l y e g gy o l kw a sf r a c t i o n a t e db yal o ws p e e dc e n t r i f u g a t i o ni n t og r a n u l e sa n dp l a s m a t h e c o m p o s i t i o n , s o l u b i l i t ya n de m u l s i f y i n gp r o p e r t i e so fg r a n u l e sa n dp l a s m aw e r ei n v e s t i g a t e d s d s p a g ei n d i c a t e dt h a tp l a s m ac o n t a i n e dm a i n l yl o w - d e n s i t yl i p o p r o t e i n s ( l d l ) a n d l i v e t i n , h i g h - d e n s i t yl i p o p r o t e i n ( h d l ) a n dp h o s v i t i ni ng r a n u l e s n es o l u b i l i t yw a sd i f f e r e n t a td i f f e r e n ts a l tc o n c e n t r a t i o n s a ti r o ns t r e n g t h0 5 ms o d i u mc h l o r i d e ，t h ep r o t e i ns o l u b i l i t i e s w e r ea b o v e9 0 a n da tt h i ss o l u b i l i t yw ef o u n dp l a s m ah a dt h eb e s te m u l s i f y i n g a c t i v i t ya n d g r a n u l e st h eb e s te m u l s i o ns t a b i l i t y t h ee f f e c t so fh i g hp r e s s u r e ( i - w ) t r e a t m e n to ns o m ep h y s i c o c h e m i c a la n df u n c t i o n a l p r o p e r t i e so fe g gy o l kw e r ei n v e s t i g a t e d t h ev i s c o s i t y , p r o t e i ns o l u b i l i t y , e m u l s i f y i n g a c t i v i t i e s ，e m u l s i o ns t a b i l i t y , d i f f e r e n t i a ls c a n n i n gc a l o r i m e t r i cc h a r a c t e r i s t i c s ，s u r f a c e h y d r o p h o b i c i t y ( h o ) ，f r e es u l f h y d r y l ( s h ) c o n t e n tw e r ee v a l u a t e d h pt r e a t m e n ta t 10 0 - 5 0 0 m p ar e s u l t e di nad e c l i n ei ns o l u b i l i t y , a n das l i g h td e c l i n ei nh 0 f r e es hc o n t e n to f e yw a ss i g n i f i c a n t l yd e c l i n ea f t e rh pt r e a t m e n ta t3 0 0 m p a h pt r e a t m e n ta t10 0 m p as l i g h t l y d e c r e a s e de m u l s i f y i n ga c t i v i t i e s ，b u ti n c r e a s e de m u l s i o ns t a b i l i t y t h e nw ei n v e s t i g a t e dh e a tt r e a t m e n to nt h ep r o p e r t i e so fe y t h ce m u l s i f y i n gp r o p e r t i e s ， e x t e n to fp r o t e i nd e n a t u r a t i o n , f r e e s u l f h y d r y lc o n t e n ta n dr h e o l o g yp r o p e r t i e sw e r e i n v e s t i g a t e di nv a r i o u st h e r m a lc o n d i t i o n s m o s to ft h ey o l kw e r et u r n e di n t og e la f t e r3 5 m i n a t6 8 c o t h e rp r o p e r t i e sw e r et h es a m ea t6 2 。ca n d6 5 * c n a t i v e p a g ei n d i c a t e dt h e 7 - v i t e l l i n ed e n a t u r a t e da f t e r2 5 m i na t6 2 c w ea l s os t u d i e do t h e rp r o p e r t i e so fy o l kp r o t e i n a t6 5 ( 2f r o md i f f e r e n tt i m e si n c l u d i n gv i s c o s i t y , s u r f a c eh y d r o p h o b i c i t ya n d p r o t e i ns o l u b i l i t y w ef o u n dt h eh y d r o p h o b i cg r o u p sr e v e a l e da f t e r3 5 m i na t6 5 ( 2 1 1 1 e ym i g h tc o l l e c ta g a i ni f p r o l o n g e dt h et i m e 1 1 l ep r o t e i nd e n a t u r a t i o nt o l du si tw a sar e v e r s i b l ep r o c e s s f t i ri n d i c a t e dt h es e c o n ds t r u c t u r eo fy o l kp r o t e i n ：1 3 - r e p l i c a t e 3 2 6 ，p l1 2 8 3 ， c t - h e l i x l5 8 5 ，t - c o m e r l8 5 8 ， 2 0 15 。 k e y w o r d s ：e g gy o l k ；p r o t e i n ；p h y s i c a la n dc h e m i c a lp r o p e r t i e s ；r h e o l o g yp r o p e r t i e s ；f t i r 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 签名：上巫邀一 日期：吖年7 月7 。日 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 e t 期：御 引言 1 1 液态蛋的生产加工现状 1 引言 液体鲜蛋是指鸡蛋经打蛋去壳后，将蛋液经一定处理后包装，代替鲜蛋消费的产品。 这种用容器盛载的液态蛋，除了抗污染能力强外，还有效解决了鲜蛋易碎、难运输和难 贮藏的问题。液态蛋在美国和欧洲等国已经相当普及，不仅有全蛋液、蛋白液、蛋黄液， 而且有经过不同配料调制而成的产品，可专门用于烹调菜肴和焙烤使用【l l 】。然而我国在 这方面的产品仍很缺少，只有几家工厂进行液蛋的初级加工。 1 9 3 8 年液态蛋加工技术在欧洲就完全具备商品化生产的能力，巴氏杀菌液态蛋制品 在澳大利亚、欧洲、日本和美国已经占鸡蛋产量的3 0 4 0 ，而早在1 9 7 6 年美国生产 的去壳蛋中约4 2 制成冷冻蛋，约8 制成干燥蛋，约4 7 制成液态蛋，其余3 为不 可食用蛋。我国的液态蛋生产刚刚起步，近年已有液态蛋专业厂家开始了生产，另有企 业正在上此项目，说明液态蛋的生产正日益引起重视。2 0 0 5 年我国禽蛋产量为2 8 6 0 万 吨，占世界总产量的4 3 ，如果将其中的l o 制成液态蛋，我国的液态蛋的日需要量能 接近8 0 0 0 吨。液态蛋具有十分广阔的市场前剽1 2 】。 液态蛋生产的关键技术之一是蛋液的杀菌技术。由于禽蛋中的蛋白质热凝固温度都 比较低，经过较高温度或长时间热处理，就会导致蛋白质变性，蛋白功能性下降。蛋液 只有在经过杀菌后，并保持鲜蛋的品质及功能特性，才能成为真正的液态蛋。 1 2 鸡蛋蛋黄的化学组成及其结构 鸡蛋是富含高营养价值的蛋白质、脂质，同时也是维生素和矿物质的良好来源。在 鸡蛋的全蛋中，蛋壳重量约占1 0 3 ，蛋黄占3 0 o ，蛋白占5 9 4 ，即蛋白与蛋黄的 重量比约为2 ：1 。蛋黄是鸡蛋中营养价值最为丰富的一部分，蛋黄不仅结构复杂，其化 学成分也极为复杂，鸡蛋蛋黄( e g gy o l k ) 的化学成分见表1 1 。 表1 - 1 鸡蛋蛋黄的化学成分1 1 1 t a b 1 一lt h ec o m p o n e n to fe g gy o l k 蛋黄的干物质约占5 0 ，是一个天然的油水乳状液体系，含有6 5 的脂肪，3 1 的 蛋白质，4 的碳水化合物、维生素和矿物质。鸡蛋储存1 2 个星期后，蛋清中的水分会 江南大学硕士学位论文 向蛋黄转移2 - 4 ，这会导致蛋黄体积变大黏度降低【3 】。蛋黄是假塑性的非牛顿流体，其 黏度取决于剪切力 4 1 。鲜蛋蛋黄的p h 值约为6 0 ，贮存期间有所升高，但变化缓慢【5 】； 鲜蛋蛋黄黏度为0 。1 1 0 2 5p a s ，表面张力为4 5 - - - 5 5m n m ，冰点为0 5 7 0 5 9 c n 。 蛋黄中的蛋白质大部分为蛋白质和脂肪结合的脂蛋白，其中包括低密度脂蛋白、卵 黄球蛋白、卵黄高磷蛋白和高密度脂蛋白。由于组成成分及其之间的相互作用关系的复 杂性，因此对于蛋黄功能特性的研究及组成成分和结构的分析就相对于研究纯蛋白体系 而言困难的多。但是为了保证蛋黄体系的完整及防止在提取蛋白过程中破坏其结构及功 能特性，其本身不经过任何处理研究可以较全面的反应加工过程中各种物理场对体系的 影响，但同时也带来了研究及分析的困难性。 1 3 蛋黄的功能特性与加工条件的关系 蛋黄是个天然复杂而又极其稳定的乳状液体系，加工过程中容易受温度、压力及剪 切等外界加工条件的影响，这些物理场因素对蛋黄的功能性质都会有影响。目前只采用 乳化性这一指标来表示蛋黄多元体系的功能特性，这并不能全面表征其体系的功能特 性，也不能反映出加工过程中各种物理因素对蛋黄体系中的多元成分的结构和功能的介 导作用。 ( 1 ) 热处理( 巴氏杀菌) 的作用： 加工过程中对蛋黄的热处理主要是对其进行巴氏杀菌以保证其微生物指标。巴氏杀 菌后的蛋液一定要保持其功能特性。蛋黄的热凝固温度为6 8 7 1 5 c n ，在凝固过程中， 蛋白质和脂蛋白形成络合物是引起蛋黄在受热时黏度增加的原因，l d l 是在蛋黄的热凝 固过程中起重要作用【7 j 。蛋黄因为脂类含量高，所以起泡性很差，喷雾干燥蛋黄的复水 产物的起泡性则更差【l o 】。而且蛋液中的蛋白质极易受热变性( 蛋白变性温度为5 7 5 8 c ， 蛋黄变性温度为6 5 1 2 ) ，并发生凝结，各国对蛋液的巴氏杀菌条件不一致，部分国家的 蛋液低温杀菌条件见表1 2 【1 2 1 。而我国在蛋液杀菌上目前还没有明确的规定。 有研究人员发现蛋黄经过某一杀菌温度后其乳化性并未明显改变，但是当应用到食 品体系中时就与使用未经处理的鲜蛋黄的效果明显不同，但由于上述原因又难以找出具 体原因和预防的方法。因此往往只能使用未经：打n - r 处理的鲜蛋黄液作为食品原料，这样 既大大阻碍了蛋制品工业的发展，同时也容易发生蛋品的食品安全风险。每年全球都会 发生因食用新鲜的、未经j nr 的蛋品而导致的食物中毒。因此，找出蛋黄在加热过程中 蛋白体系的变化规律是十分重要的，这也为工厂连续化生产提供理论指导。并为今后研 究蛋黄蛋白体系提供一个方法参考。 ( 2 ) 压力作用： 高压是不同于热处理的另一种杀菌方式，同样在保证微生物达标的基础上，研究压 力对蛋黄功能特性及组分结构的影响是至关重要的，但是目前关于压力对蛋黄体系的研 究很少。 赵洪霞等人【1 3 】在对鲜蛋液进行高压加工时发现，蛋白在4 0 0 m p a 压力下出现部分变 性，采用压力3 0 0 m p a ，5 m i n 杀菌的生产条件，不但可完全满足食品卫生条件，而且其 2 引言 货架期和营养特性指标也完全能通过工业化生产达到。这个研究侧重了微生物及货架期 的研究，并没有涉及蛋黄的功能特性。 而早在1 9 8 9 年h a y a s h i 1 4 】分析了压力对鸡蛋蛋黄的影响。此后，蛋白质在高压下的 变性机理一直是研究者所感兴趣的领域。但在此之后一直没有人研究压力对蛋黄功能性 及结构的影响。 表1 - 2 部分国家液蛋杀菌条件【1 2 1 t a b 1 - 2t h ep a s t e u r i z a t i o nc o n d i t i o n so fe g gy o l kf r o ms o m ec o u n t r i e s 1 4 蛋白质二级结构的研究情况 蛋白质具有的特定生理活性在很大程度上由其构象决定【1 5 , 1 6 。目前常用的分析蛋白 质结构的技术主要有x 射线衍射、圆二色谱( c i r c u l a rd i c h r o i s m ，c d ) 、核磁共振( n m r ) ， 但这些方法都各有其局限性。对于研究蛋黄体系中蛋白质而言，其含量较高( 1 6 ) ， 属于较高浓度的蛋白体系，因此，对于蛋白质二级结构的某些研究方法有一些缺陷。 x 射线衍射需要获得合格的晶体，对于蛋黄这一复杂体系很难获得单晶体；核磁共 振技术只能测定小分子蛋白质的结构，蛋黄蛋白质是大分子居多，因此也不合适；荧光 和紫外光谱只能测定蛋白质分子中少数带有发色的氨基酸残基( 如t r p ，t y r 等) 。 对于红外光谱，每种氨基酸残基都是发色基团，它适用于不同状态、不同浓度及不 同环境中蛋白质和多肽的测定【1 7 1 。蛋白质的二级结构与其分子内形成的不同氢键类型密 切相关，f t 瓜技术是研究氢键的强有力手段，它可以在各种环境条件下得到几乎所有 生物物质的红外光谱图。此外，f t i r 还具有样品用量较少，蛋白质分子的大小几乎无 影响，没有光散射和荧光的影响等优点。将f t i r 与去卷积( d e c o n v o l u t i o n ) 、二阶导数 谱( s e c o n dd e r i v a t i v es p e c t r u m ) 和曲线拟合( c u r v e f i t t i n g ) 等数学处理方法结合起来研 究蛋白质的二级结构，是未来发展的趋势。 蛋黄是一复杂的统一的整体，参考傅立叶红外研究牛乳、豆浆、血清【1 8 , 1 9 , 2 0 】等完整 体系的方法用于蛋黄体系中蛋白质二级结构的研究。 圆二色谱用于测定极稀溶液中蛋白质的二级结构，它可以排除其他物质对测定结构 的干扰。 3 江南大学硕士学位论文 1 5 课题的提出及国内外研究进展 尽管蛋黄是许多食品体系中的一种重要原料，但是它的功能性质并没有得到应有的 重视，这很大程度上是因为蛋黄组成和结构的复杂多样性。关于蛋黄功能性的研究就更 少。在十年前k i o s s e o g l o u 2 1 1 研究了蛋黄的化学组成和功能性质，w o o d w a r d 2 2 】研究了加 热过程蛋黄凝胶结构的形成。近几年，p a r a s k e v o p o u l o u 和k i o s s e o g l o u 2 3 】研究了从蛋黄 中提取出胆固醇和其他脂类物质后蛋白浓缩物的功能特性。近来关于蛋黄和蛋白的研究 主要是m i n e 2 4 1 进行的。现在研究的重点放在蛋黄蛋白质的功能特性上，因为蛋白质是 蛋黄的主要组成成分并决定着其功能特性。 w e n g e r 掣2 5 1 发现将蛋黄稀释后调节p h 在6 0 以下，尤其是在p h 3 0 - - 5 0 ，此蛋黄 浆在1 4 5 水蒸汽杀菌1 5 秒，发现没有出现蛋白凝结现象。a k a s h e 等【2 6 】发现将蛋黄稀 释后调节p h 7 5 以上，然后升高温度至4 0 以上并保温3 0 m i n 以上，冷却至室温，调节 p h 7 0 。这样得到的产品能够承受苛刻的条件，而且使用较少的量就可以达到同样的质 构、口感、稳定性、风味强度和流变学性质，节约了成本。c o l a r o w 等口7 】发现往蛋黄中 添加大豆溶血卵磷脂，超声波处理后得到的产品制成的蛋黄酱能够承受高强度的杀菌而 不会有油析出。刘剑秋等【2 s j 发现利用复合风味蛋白酶部分水解全蛋的蛋白，可以将鸡蛋 的热凝固温度提高到7 5 。d i x o n ak 和c o t t e r i l loj 2 9 】研究发现盐和糖类能提高蛋黄的 耐热性，1 0 添加量的蔗糖和n a c i 可分别提高蛋黄耐热极限温度3 和6 。 1 6 课题意义及研究内容 本课题为今后研究加工条件对蛋黄体系的物理化学及功能特性建立了一个初步的 研究方法，也为企业的生产提供了理论指导，同时也为组成成分复杂的物质提供了研究 的方法，通过本方法的完善可以在此基础上提出更好的杀菌条件及杀菌方式。 本论文以新鲜蛋黄为研究对象，通过研究蛋黄体系中蛋白质及其他指标的变化来表 征加工条件热处理和高压对蛋黄的影响，并利用傅立叶红外、圆二色谱、荧光、流变仪、 d s c 等分析方法研究热处理和高压对蛋黄体系中蛋白质在结构、组成成分及流变学上的 变化及它们之间的相互作用。初步建立分析加工条件对蛋黄体系蛋白质影响的分析方 法。 课题主要研究内容包括： 1 蛋黄组成成分的基本性质研究 2 高压对蛋黄蛋白质的功能性及理化性质的影响 3 热处理对蛋黄蛋白质的功能性及理化性质的影响 4 傅立叶红外研究热处理对蛋黄蛋白质二级结构的变化 4 实验材料与方法 2 1 实验材料 2 实验材料与方法 2 1 1材料和试剂 鸡蛋 一级葵花籽油 十二烷基硫酸钠( s d s ) 牛血清白蛋白( b s a ) 福林酚试剂f 0 3 0 16 1 巯基乙醇 考马斯亮蓝r 2 5 0 n ，n ，n ，n 四甲基乙二胺( t e m e d ) 溴酚兰 过硫酸铵( a p ) 丙烯酰胺 n ，n ，甲叉双丙烯酰胺 三羟甲基氨基甲烷( t r i s ) 分子量标准蛋白 5 ，5 二硫代二硝基苯甲酸盐( d t n b ) 1 苯氨8 萘磺酸( a n s ) 其他试剂均为国产分析纯 2 i 2 实验仪器 h e a l f o r c e 高速冷冻离心机 u n i c ou v - 2 0 0 0 分光光度计 f l u k a 高速乳化机 b t - 1 6 0 0 图像颗粒分析仪 d y v m 2 3 a 型电泳槽 6 5 0 6 0 型荧光分光光度计 a r l 0 0 0 流变仪 高压发生器 d s c n 】w 2 0 旋转黏度计 傅立叶变换红外光谱仪( n i c o l e tn e x u s ) 市售 金龙鱼葵花籽油 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 上海紫菊生物科技发展有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 中国上海前进化学试剂厂 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 上海华美生物工程公司进口分装 上海华美生物工程公司进口分装 国药集团化学试剂有限公司 上海生物工程 s i g m a 公司 s i g m a 公司 上海肯强仪器有限公司 上海尤尼柯仪器有限公司 上海弗鲁克机电设备有限公司 丹东市百特仪器有限公司 北京市六一仪器厂 日本日立公司 英国t ai n s t r u m e n t 包头五二所研制 p e 公司 上海精密科学仪器有限公司 t h e r m oe l e c t r o nc o r p o r a t i o n 江南大学硕士学位论文 2 2 实验方法 2 2 1蛋黄及其基本成分的制备 蛋黄经分蛋器分离后，用滤纸吸掉多余的蛋清液和系带，挑破蛋黄膜，得到新鲜的 蛋黄液。蛋黄液与o 1 7 m o l l 的氯化钠溶液等重量混合，磁力搅拌l h ，在1 0 ，1 0 0 0 0 x g 下冷冻离心5 0 r a i n ，得到上清( p l 姗a ) ，沉淀( g 删咖l e s ) 【3 0 1 。 2 2 2 基本成分的分析 水分含量的测定：采用g b 5 0 0 9 3 1 9 8 5 方法测定。 脂肪含量的测定：采用有机溶剂提取法【3 1 1 。 蛋白质含量及溶解度的测定：采用f o l i n - 酚法( 略有改进) ：鲜蛋黄用0 5 m o l l 氯 化钠溶液稀释配成2 m g m l 蛋黄液，取l m l 样品，加入l m o l l 的氢氧化钠溶液2 m l ， 立即混合均匀，静置1 5 m i n ：再加入2 m l 与超纯水1 ：1 稀释的f o l i n 酚综合指示剂并立 刻混匀，2 5 水域反应显色4 5 m i n ，于5 6 0 n m 下进行比色，以牛血清白蛋白为标准蛋白 质，以不加样品为空白。另取2 0 m l 样品在1 0 ，0 0 0 x g ，1 0 下冷冻离心2 0 m i n ，取上清 部分l m l 测定蛋白质含量( 方法同上) 。 蛋白质溶解度计算公式为：上清部分蛋白质含量( m g ) 总蛋白质含量x1 0 0 每个样品测两次平行取平均值。 2 2 3 蛋黄的热处理 称取约3 o g 新鲜蛋黄液，密封于大小相等的玻璃安培瓶中，于超级恒温水浴中加热， 边加热边振荡使加热均匀，于不同加热温度，加热不同时间后取出冰水冷却，进行各指 标检测。 2 2 4 乳化活力及乳化稳定性的测定： 取蛋白质浓度为0 5 ( w v ) 的蛋黄氯化钠溶液2 4 m l ，加入1 6 m l ( 油体积分数0 4 ) 的葵花籽油，在1 0 ，0 0 0r p m 下均质l m i n ，乳化后立即在底部取5 0 1 a l 乳状液放入3 0 m l 0 1 ( w v ) 的s d s ( 十二烷基硫酸钠) 溶液，混合均匀，于5 0 0 n m 下测定吸光度，以 相同的s d s 溶液作参比液，乳化活性e a 用零时刻的吸光度表示。经过6 m i n 后同样 从底部取5 0 此乳状液，测定吸光度值，以乳化稳定性指数表示乳化稳定性大小，公式 如下f 3 2 1 ： 乳化稳定指数( e s i ) ：一a o x a _ t t 为时间间隔( m i n ) ；a 为吸光度差；为0 z j 以 时刻的吸光度值。每个样品测五次平行取平均值。 2 2 5s d s p a g e 电泳测定蛋黄、上清、沉淀部分组成 用s d s p a g e 电泳分析三部分的蛋白质组成【3 3 1 ，样品用o 5 m o l l 氯化钠溶解配成 2 m g m l 溶液，取5 0 止样品，加5 0 1 a l 样品处理液，沸水浴煮5 r n i n ，取1 0 1 a l 上样。采 6 实验材料与方法 用浓缩胶4 ，分离胶1 0 进行电泳。电泳在2 5 m a 下进行1 5 h 。 2 2 6n a t i v e p a g e 电泳测定加热过程蛋黄蛋白质变性程度 用n a t i v e p a g e 电泳分析蛋黄蛋白质变性情况【3 3 】，加热处理后的样品用0 5 m o l l 氯化钠溶解配成2 m m t , 溶液，取5 0 1 x l 样品，加5 0 i t l 样品处理液，取1 0 此上样。电 泳在2 5 m a 下进行1 5 h 。根据电泳条带的多少及浓度的变化情况分析加热过程蛋黄蛋白 质的变性情况。 2 2 7b t - 1 6 0 0 颗粒分析仪分析蛋黄、上清部分的颗粒形态 将蛋黄用0 5 m o l l 氯化钠溶解配成浓度为2 m m l 溶液，对p l a s m a 和蛋黄液进行 颗粒形态分析，放大倍数为1 6 0 0 倍。 2 2 8疏水性的测定 表面疏水性是用1 苯氨一8 萘磺酸0 气n s ) 作为荧光探针进行测定的【3 4 】。称取0 1 0 9 蛋 黄样品溶于0 0 1 m o l l ，p h 7 0 的磷酸盐缓冲溶液中，在室温下间歇搅拌约3 0 m i n ，配成 约l m m l 的蛋白质溶液，然后在1 0 0 0 0 x g 下离心3 0 m i n ，用f o l i n - 酚法测定上清液中 的蛋白质含量。用o o l m o l l ，p h 7 0 的磷酸缓冲液稀释至蛋白浓度在0 0 0 5 0 3 0 m g m l 之间( 5 个样) 。取不同浓度的稀释样品4 m l ，采用6 5 0 6 0 型荧光分光光度计在3 9 5 n m 的 激发波长( 狭缝校正5 r i m ) 和4 7 5 n m 的发射波长( 狭缝校正5 r i m ) 下测定样品的荧光强度( f i o ) 和样品加入2 0 u l a n s 溶液( 用0 0 1 m o l l ，p h 7 0 的磷酸缓冲液配成浓度为8 m m o l l ) 后 的荧光强度( f 1 1 ) ，f i l 和f i o 的差值记为f i ，以蛋白质浓度为横坐标，f i 为纵坐标作图， 曲线初始阶段的斜率即为蛋白质分子的表面疏水性指数。 2 2 9 表面巯基含量的测定 参考e l l m a n t 5 】用5 , 5 t 二硫代二硝基苯甲酸盐：( d t n b ) 的方法并加以改进。 表面巯基的测定：取1 o g 蛋黄样品加入0 1 m i r i s - 甘氨酸缓冲液( p h 8 0 ，含0 0 0 4 m e d t a 、0 0 9 m 甘氨酸和0 5 m 氯化钠) 定容到1 0 m l 。取0 3 m l 样品液与3 7 m lt r i s 甘 氨酸缓冲液混合均匀，加入4 0 l d t n b 试剂( 4 0 m g5 ，5 - 二硫代- 2 - 硝基苯甲酸溶于1 0 m l 0 1 m 、p h 8 0 的瞄s 甘氨酸缓冲液) ，2 5 显色3 0 m i n ，测定4 1 2 n m 处的吸光度。以 不加样品而加e l l m a n 试剂为空白，以不加e l l m a n 试剂，而加样品溶液测其浑浊度。 表面巯基计算如下：p ms h g 蛋黄= 7 5 5 3 * a 4 1 2 * d c ，其中a m 为加d t n b 时样品 的吸光度减去不加d t n b 时样品的吸光度；c 为蛋黄的浓度，单位g m e ，d 为样品稀 释倍数( 1 6 8 ) 。 2 2 1 0 差示扫描量热仪测定蛋白质焓变( d s c ) 将处理过的蛋黄液精确称取2 0 m g 后放入铝盒中，铝盒放入d s c 样品池内，空白 为空铝盒，从3 0 加热到9 5 ，升温速率为5 * c m i n ，根据峰面积和峰温度测定其在高 压处理前后蛋白质的焓变【3 6 j 。 7 江南大学硕士学位论文 2 2 1 l 蛋黄动态流变特性的测定 采用a r l 0 0 0 型流变仪( 英国t a 公司) ，选择直径为4 0 m m 的不锈钢平行板测量系 统。测量数据用a ri n s t r u m e n tc o n t r o lv e r s i o n1 0 7 4 软件分析。 平行板间距为l m m ，2 0 。c 下在线性粘弹区范围内，固定振荡应力为l ，测定蛋黄 液的贮能模量g 和损耗模量g ”随振荡频率的变化，振荡频率的变化范围为0 1 1 0 h z 。 2 2 1 1 1 蛋黄黏度的测定 采用a r l 0 0 0 型流变仪和旋转黏度计测定蛋黄在不同热处理温度和时间及高压处理 后的蛋黄黏度。 2 2 1 2 圆二色谱测定蛋白质二级结构 将蛋黄溶于p h 7 0 磷酸盐缓冲液配制成i m g m l 的蛋黄溶液。应用j - 7 1 5 型圆二色 光谱仪在远紫外区( 1 9 0 2 5 0n m ) 记录c d 谱。采用光径o 1 c m 的比色池，分辨率为1 0 r i m ， 谱带宽度为1 0 r l m ，灵敏度为2 0 m d e g ，响应时间为0 2 5 s ，扫描速度为1 0 0 n m m i n 。室 温2 5 0 c 下测定。图谱经过仪器本底消除和溶液空白差减，根据c h e n y a n g 原理计算a 螺旋、1 3 折叠和无规卷曲等二级结构的百分含量。 2 2 1 3 加热处理前后蛋白质二级结构的红外分析 蛋白质在红外区有若干特征吸收带，酰胺i 带( 1 6 0 0 1 7 0 0c m 。1 ) 对于研究二级结构 最有价值，但h 2 0 在1 6 4 0c m 。1 附近的吸收会对结构造成一些影响，但可以采用吹扫、 减差及氘代等方法消除水的干扰，本研究采用减差的方法消除水的影响。 红外光谱的测定和数据处理：测试前用干燥的空气连续吹扫样品仓，消除水蒸气的 影响，移取2 m l 蛋黄液平铺于附件a t r ( 水平衰减全反射附件) 上进行全波段 ( 4 0 0 0 - 4 0 0 c m ) 扫描，扫描次数为5 0 0 次，分辨率为4c m 1 。以相应的空气和水作为背景， 扣除背景后得到红外光谱图。 2 2 1 4 谱图处理 红外图谱分析采用o m n i c 6 0 数据处理软件，所得的红外谱图与同样条件下的水的 谱图进行差减，并以2 0 0 0 1 7 0 0 c m l 处基本差减为一条直线为依据，从而得到相应蛋白 质的红外谱图。差减后的谱图在1 6 0 0 1 7 0 0 c m 。1 范围内进行宽带1 8 c m 1 和分辨率大于2 4 的f s d 处理，然后进行基线校正，得到分辨率提高的原谱。 得到的谱图用s y s t a t 公司的p e a k f i t4 1 2 软件进行处理，选择g a u s s e 峰型，手动调 整各子峰的峰高和半峰宽，对谱图进行曲线拟合，计算机多次拟合使残差( r 2 ) 大于0 9 8 。 拟合之后重叠在一起的不同普带完全分辨开，当确定了各子峰与不同二级结构的对应关 系后，根据其积分面积计算各种二级结构的相对百分含量。 8 结果与讨论 3 结果与讨论 3 1 蛋黄、上清、沉淀部分基本化学成分测定 检测了蛋黄、蛋黄经冷冻离心得到的上清和沉淀组分的组成成分含量，结果见表 3 1 。 袁3 - 1 蛋黄，上清沉淀三部分的成舟刹定 t a b 3 - 1 t h ec o m p o n e n to f e g gy o z k , p l a s m aa n d g r a n u i e s 水分( )脂肪( 哟蛋白质( )其他( ) 结果表明，分离得到的p l a s m a 含量约占蛋黄的8 41 ，g r a n u l e s 含量约占蛋黄的 1 37 ，则可知蛋黄中的p l a s m a 占主要成分。从表3 - 1 中还可以看出，蛋黄和p l a s m a 中 的脂肪含量相对较高。因为他们中含有大量的l d l ，其中的8 9 为脂肪咖。g r a n u l e s 中 蛋白质含量很高，其成分主要为h d l 。其他成分主要是一些糖类和灰分，在g r a n u l e s 中的其他成分含量占有一定比例。 3 2s d s - p a g e 电泳结果 。一1 7 5 k d a ( a p o - l d l ) 9 74 k d a 一- 一一+ 一1 0 5 0 ( 4 p ”o ) 一一一，至曼1 ：_ 二；竺 筹盛 4 3 k d a + - 3 2 i o a ( a p o - h d l ) + 一1 5 k d a ( a p o - l d l ) 标准蚩白 蛋黄电泳图 上清倒a s m a ) 电泳圉 沉淀( 灯a n u l e s ) 电淋图 圉3 - 1 蛋黄上清，沉淀部分电津图片 f i g 3 - 1s d s - p a g e & t h ee g g y o l k , p l a s m aa n d g r a n u l e s 以标准蛋白s d s p a g e 的相对迁移率作对照，根据样品的相对迁移率，计算得到各 组分相对分子质量。利用q u a n t 时o n e 软件分析得到各蛋白的相对含量。 s d s - p a g e 电泳图结果显示上清部分( p l a s m a ) 的组成：低密度脂蛋i 刍( l d l ) 8 5 和卵 誓 江南大学硕士学位论文 黄蛋白1 5 ，沉淀部分组成为高密度脂蛋白( h d l ) 7 0 ，卵黄高磷蛋白1 6 和l d l l 2 ， 这一结果与c o o k 的报道的结果相一致【3 引。l d l 有四个脂蛋白，分子量分别为1 7 5 k d a ， 1 4 0 k d a ，7 0 k d a ，1 5 k d a ：h d l 主要有三个脂蛋白，分子量为1 0 5 k d a ，8 0 k d a ，3 2 k d a ； 卵黄蛋白有三个异构体分别为a 、p 、丫，分子量分别为8 5 k d a ，4 2 k d a ，1 6 5 k d a 。 3 3 不同离子强度下各部分蛋白质溶解度变化 蛋白质的溶解性是其最重要的也是最基本的性质，因为它往往影响着蛋白质的其他 性质，例如：起泡性、乳化性、凝胶性和吸水、保水，增稠等。不溶性蛋白质的应用是 非常有限的。另外，影响蛋白质溶解性的因素有很多，包括蛋白质颗粒的大小，以及蛋 白质自身的平均疏水性、电荷、p h 、离子强度、温度以及有机溶剂等。因此本实验研究 了在不同的离子强度下蛋黄及其组成部分p l a s m a 和g r a n u l e s 的溶解度变化情况。 o0 10 z0 30 4 o 5o 6o 7 氯化钠浓度( m o l l ) 图3 - 2 不同氯化钠浓度下蛋黄、上清、沉淀蛋白质溶解度变化 f i g 3 - 2e f f e c to fi o n i cs t r e n g t ho nt h ep r o t e i ns o l u b i l i t yo fy o l kg r a n u l e