（环境工程专业论文）米根霉利用鱼粉废水生产乳酸的研究.pdf

大连理工大学硕士学位论文 摘要 本研究以米根霉( r h i z o p u so r y z a e ) a s3 2 5 4 和a s3 4 l 为菌株，考查了两株菌以鱼 粉废水为替代培养基的产乳酸情况。目的是在寻求廉价原料、降低乳酸生产成本的同时 实现鱼粉废水资源化。 以合成培养基和鱼粉废水替代培养基为原料，考查了种龄、接种量、摇床转速、初 始p h 、鱼粉废水浓度、培养基组成、碳氮比等因素对菌株生成乳酸的影响。结果表明， 1 0h 的种龄、6 接种量、摇床转速1 5 0r m i n 对菌株生长和产酸有利；初始p h 在6 8 经4 8h 后均降为3 2 左右，乳酸产量只有5 l 。在鱼粉废水c o d 为50 0 0m g l 、对米 根霉3 2 5 4 和米根霉3 4 1 的葡萄糖外加量分别为3 0 l 和4 0 班时，乳酸产酸得率最大； 以淀粉为外加碳源时，只有米根霉3 2 5 4 可生产乳酸。 进一步研究表明，米根霉3 2 5 4 前2 4h 总氮降低显著，去除率达4 8 ，之后氮的利 用较缓慢，7 2h 时总氮去除率约为5 5 。不同氮源下，米根霉3 2 5 4 的乳酸得率均高于 米根霉3 4 1 。以鱼粉废水为氮源时，米根霉3 2 5 4 和米根霉3 4 1 的乳酸产酸得率达到最 大，二者分别为0 6 6g g 和0 。4 5g g 。从经济和产酸量看，酵母膏和蛋白胨不适宜用作 产酸的氮源。 考察了盐度对菌株产乳酸和生物量的影响。随着盐度的增大，乳酸和生物量都逐渐 降低。菌株3 2 5 4 和菌株3 4 l 抗盐度抑制能力不同，氯化钠完全抑制3 2 5 4 和3 4 1 生长 的浓度分别为1 2g l 和1 6 l 。 关键词：鱼粉废水；米根霉；乳酸；生物量 大连理工大学硕士学位论文 p r o d u c t i o no f l a c t i ca c i di n t e g r a t e dw i t hf i s h m e a lw a s t e w a t e rt r e a t m e n t b yr h i z o p u so r y z a e a b s t r a c t p r o d u c t i o no fl a c t i ca c i di n t e g r a t e dw i t hf i s h m e a lw a s t e w a t e rt r e a t m e n tb yr h i z o p u s o r y z a ea s3 ，2 5 4a n da s3 4 1w a si n v e s t i g a t e di nt h i st h e s i s n l ea i mw a st of i n do u tc h e a p e r r a wm a t e r i a lf o rl a c t i ca c i dp r o d u c t i o na sw e l la st ot r e a tt h ef i s h m e a lw a s t e w a t e r t h ei n v e s t i g a t i o nm a i n l yf o c u s e do nt h e e f f e c to fs e e da g e ，i n o c u l a t i o n ，i n i t i a lp h ， r o t a t i o n ，c o n c e n t r a t i o no ff i s h m e a lw a s t e w a t e r , c o m p o s i t i o n so ff e r m e n t a t i o nm e d i u ma n dt h e r a t i oo f c a r b o nt on i t r o g e no n1 a t t i ca c i dp r o d u c t i o n ，c o dr e d u c t i o na n db i o m a s sf o r m a t i o n t h eo p t i m a ls e e da g e ，i n o c u l a t i o na n dm t a t i o nw e r e1 0h ，6 a n d15 0r r a i n ，r e s p e c t i v e l y i n i t i a lp hw i t h o u ta d d i t i o no fc a c 0 1c o u l dl c a dt ot h ei o w e rp h3 2a t4 8hi n c u b a t i o nt i m e a n dt h el a c t i ca c i dp r o d u c t i o nw a so n l y5g l t h eo p t i m a lc u l t u r em e d i u mw a sa sf o l l o w i n g ： t h ec o n c e n t r a t i o no ff i s h m e a lw a s t e w a t e rt e r m e da sc o dw a sa b o u t50 0 0m g l t h e a d d i t i o no f g l u c o s ew a s3 0 lf o rr h i z o p u so r y z a ea s3 2 5 4a n d4 0 叽f o rr h i z o p u so r y z a e a s3 4 1 ，r e s p e c t i v e l y w h e os o l u b l es t a r c hw a su s e da sc a r b o ns o u r c e ，r h i z o p u so r y z a ea s 3 2 5 4c o u l du t i l i z ei tt op r o d u c e1 a t t i ca c i d h o w e v e r ，n ol a c t i ca c i dw a sp r o d u c e db y r h i z o p u so r y z a ea s3 4 1u n d e rt h ea d d i t i o no f s o l u b l es t a r c h r h i z o p u so r y z a ea s3 2 5 4c o u l du t i l i z e dt h eo r g a n i cn i t r o g e ni nf i s h m e a lw a s t e w a t e r n l et o t a ln i t r o g e nr e d u c e d4 8 d u r i n gt h ef i r s t2 4h t h e nr e m o v a lr a t eg r a d u a l l yi n c r e a s e d s l o w l ya n dc o u l dr e a c h5 5 i n7 2h w h e nu s i n gd i f f e r e n tn i t r o g e ns o u r c e ，t h ey i e l do f l a c t i c a c i do fr h i z o p u so r y z a ea s3 2 5 4w e r eh i g h e rt h a nt h a to fr h i z o p u so r y z a ea s3 4 1 t h e m a x i m a ly i e l do fl a c t i ca c i do ft w os t r a i n sw a so 4 5g ga n do 6 6g g r e s p e c t i v e l y f r o mt h e v i e wo f t h ec o s ta n dt h ea m o u n to f l a c t i ca c i d y e a s te x t r a c ta n dp e p t o n ew e r en o ts u i t a b l ef o r t w os t r a i n st op r o d u c el a c t i ca c i da st h en i t r o g e ns o u r c e t 1 1 ee f f e c to fs a l tc o n c e n t r a t i o no n1 a c f i ca c i dp r o d u c t i o na n db i o m a s sf o r m a t i o nw a sa l s o i n v e s t i g a t e d b o t hl a c t i ca c i dp r o d u c t i o na n db i o m a s sf o r m a t i o ng r a d u a l l yd e c r e a s e dw i mt h e i n c r e a s eo fs a l i n i t y t h ei n h i b i t i o nc o n c e n t r a t i o no fn a c it or h i z o p u so r y z a ea s3 2 5 4a n d r h i z o p u so r y z a ea s 3 4 1w e r e1 2g la n d1 6e r i e ，r e s p e c t i v e l y k e yw o r d s ：f i s h m e a lw a s t e w a t e r ；r h i z o p u so r y z a e ；l a c t i ca c i d ；b i o m a s s 独创性说明 作者郑重声明：本硕士学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工 作及取得研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外， 论文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，也不包含为获得大连理 工大学或者其他单位的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的贡献均已在论文中做了明确的说明并表示了谢意。 作者签名：董遗日期：2 型：! 兰：圭z 大连理工大学硕士研究生学位论文 大连理工大学学位论文版权使用授权书 本学位论文作者及指导教师完全了解“大连理工大学硕士、博士学位论文版权使用 规定”，同意大连理工大学保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子 版，允许论文被查阅和借阅。本人授权大连理工大学可以将本学位论文的全部或部分内 容编入有关数据库进行检索，也可采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编学位论 文。 作者签名 董叠 导师签名：煎壹皇鲨鉴 2 坠鱼年月苴日 大连理工大学硕士学位论文 引言 采用生物技术实现有机废弃物的资源化是社会可持续发展的重要方向之一。食品加 工废水因含有丰富的碳源、氮源、微量元素，是理想的生物资源化原料。微生物可以利 用这些廉价原料生产柠檬酸、乳酸、乙醇等工业原料或燃料i l j 。乳酸是一种重要的有机 酸，它已广泛用于食品、医药、化工等领域，还可作为生物降解塑料聚l 乳酸的原料【2 】。 目前，乳酸是需求量仅次于柠檬酸的第二大有机酸，并有逐年扩大的趋势。 鱼粉是饲料工业的重要原料之一，畜牧业、水产养殖业的蓬勃发展导致了对鱼粉需 求的快速增长。但是，由于鱼粉厂经济类型差不多都是集体和个体所有制，生产和管理 水平不高，没有对鱼粉废水进行治理，造成周边环境的极大污染【3 1 。近年来，对鱼粉废 水的处理只有厌氧硝化的报导，且硝化量只有2 0 6 5 t 4 1 。另一方面，鱼粉废水中富含 大量蛋白质和脂肪，若能将这些蛋白质和脂肪转化利用，在实现废水处理的同时生产具 有高附加值的产品，这可能是鱼粉废水资源化利用的重要途径之一。 本文以米报霉为产酸菌株，首先通过合成培养基对两株米根霉的培养条件进行了初 步优化。然后，考察并优化了两株菌株对鱼粉废水的利用条件，为鱼粉废水的资源化利 用以及开发低成本生产乳酸技术提供科学依据。 米根霉利用鱼粉废水生产l - - l 酸的研究 1 研究背景 1 1 乳酸的性质及应用 1 1 1 乳酸的性质 乳酸( l a c t i ca c i d ) 又名a - 羟基丙酸( 2 - h y d r o x y p r o p a n o i ca c i d ，c 2 h s o c o o h ) ，是一种天 然存在的有机酸。其相对分子量为9 0 0 8 ，相对密度在2 5o c 时约为1 2 0 6 ，其结构式如 图1 1 所示。乳酸分子中有一个不对称碳原子，故具有旋光性【5 】。l 碍l 酸为左旋性，d - 乳酸为右旋性，当d - 孚l 酸和l 哥l 酸等比例混合时，即成为消旋的d l - 乳酸，乳酸异构 体的物理性质如表1 1 1 6 j 。 洲 h 。h h 3 c 杉o h l 。h ； c h 3 ( 2 - h y d r o x y p r o p a n o i ca c i d ( 固- 2 一h y d r o x y p r o p a n o i ca c i d l ( + ) 一乳酸d ( + ) - 乳酸 图1 1 乳酸的结构式 f i g 1 1m o l e c u l a r s t r u c t u r e s o f l a c t i ca c i d 表1 1 乳酸异构体的物理性质 t a b l e1 1p h y s i c a lc h a r a c t e ro f l a c t i ca c i di s o m e r 构型熔点比旋光度解离常数 熔化热 ( o c )m d 2 0 0 0 m 0 1 ) l5 2 8 5 4 3 3 1 3 7 x l 旷 1 6 8 7 d5 2 8 5 4- 3 31 3 7 x 1 0 11 6 8 7 d l1 6 3 3 3 0 1 3 7 x 1 0 4n 3 5 由于人体和动物体只含有l 乳酸脱氢酶，因此，只能利用自身产生或摄入的l 乳 酸。l - - 孚l 酸是哺乳动物体内正常代谢产物，在体内分解为氨基酸和二羧酸物。经机体实 验证明：d l 乳酸可以使肝糖增高，d 乳酸使血中乳酸盐增高。因而，过量食用d l - 乳 酸和d 哥l 酸，会导致血中富含d 乳酸，使尿中酸度过高，引起代谢紊乱而致病。世界 卫生组织( w h 0 ) 限制人体每天摄入d 一乳酸量在1 0 0m g k g 体重以下，d 一型、d l 型乳酸 大连理工大学硕士学位论文 不应加入到三个月以下婴儿的食品中，对l 广乳酸没有限制【7 】。所以在食品、酿造及医药 行业中应使用l 广乳酸，而在其它行业中对乳酸的构型则不加限制。 由于d 乳酸不能够用于食品工业中，所以关于d 乳酸的研究相关资料还比较少， 但是现在关于d 乳酸的研究有逐渐变热的趋势，主要原因是最近的研究发现其可以作 为生产高性能聚乳酸的原料，用含有d 乳酸和l 一乳酸混合物做原料生产出的聚乳酸， 比单纯只用l 型或d 型生产出的聚乳酸的熔点热稳定性好很多，大约高出约5 0o c i s - 9 。 1 1 2 乳酸的应用 乳酸是三大有机酸之一，是一种重要的化工原料，广泛应用于食品、医药、化工、 纺织和农业等领域。 由于l - $ l 酸对人体无毒副作用，且易吸收，可直接参与体内代谢，因此被广泛的应 用于食品工业和酿造工业中i l o l 。在罐头、酱菜、饮料生产中加入l - 孚t 酸作为防霉防腐 抗氧化剂和果蔬保鲜剂以替代对人体健康有毒害作用的苯甲酸钠。在酿造工业中，加入 乳酸可以作为灭菌剂能防止杂菌繁殖，促进酵母菌发育，防止酒混浊，而且乳酸较磷酸、 盐酸安全性好，对人体有益，在1 0 0 0l 糖化醪中加入ll 食品级乳酸，能促进糖化完全， 提高啤酒品级，并延长保质期。 l 乳酸可直接配制成药物或制成乳酸盐使用i l ”。由于l - $ l 酸对人和畜无害，而且具 有很强的杀菌作用，其杀菌能力是柠檬酸、酒石酸、琥珀酸的数倍，因而，乳酸可直接 用做室内外环境、饮食、病房、实验室、车间等场所的消毒剂。l 乳酸、l 乳酸钠与葡 萄糖、氨基酸等复合配制成输液，可治疗酸中毒及高钾血症。l 一乳酸铁、l 乳酸钠、l 乳酸钙均是补充金属元素的良好药品。l 哥l 酸酯在制药业中作压制药体的润滑剂，还可 以用于锦4 备降压类药物。由l 乳酸聚合而成的无毒的高分子化合物聚l 哥l 酸，具有生 物兼容性，在人体内能被分解成l - ? l 酸为人体代谢，不引起变态反应。另外，乳酸还可 用于生产缓释胶囊制剂，以使血液中药液浓度相对降低，提高疗效，降低副作用。 在化学领域中，l - - 孚l 酸是合成聚乳酸的原料，聚乳酸无毒、无刺激性，具有良好的 生物兼容性且可生物降解，它易被自然界中的各种微生物或动植物体内的酶分解，最终 形成二氧化碳和水，不污染环境。因而被认为是最有前途的可生物降解高分子材料，备 受关注。聚乳酸有望在不久的将来代替p v c 、p p 等不可降解塑料，以消除“白色污染” 所造成的环境危机。聚乳酸因为具有优良的生物相容性，无毒，可生物降解，降解产物 不会在重要器官聚集。同时，聚乳酸及其共聚物具有良好物理化学性质，其强度、机械 性能、降解速率等可通过分子量控制、共聚体的组成及配比得以方便的调节。而且制成 米根霉利用鱼粉废水生产l 乳酸的研究 的形状可从微球、纤维膜、到膜塑成品等，因此，可用于医用手术缝合线、注射用胶囊、 微球及埋植剂1 1 2 1 。 此外聚乳酸还具有良好的机械性能、透明性、透气性等而被大量应用于农业、制造 业等领域。 1 2 乳酸的生产 1 2 1 化学合成法 化学合成法的工业化生产由美国m o n s a n t o 公司于1 9 6 3 年实现。目前，世界上采 用化学合成法生产乳酸的有美国m o n s a n t o 公司、日本武藏野化学研究所。化学合成法 生产乳酸可通过多种途径进行，其中具有现实意义的是乳腈法( 又叫乙醛法) 【1 1 ，”】。 该法是乙醛与氢氰酸经碱性催化剂作用生成乳腈，这是一个液相反应，在常压下进 行，粗乳腈通过蒸馏回收纯化并用浓盐酸或硫酸水解为乳酸，还产生相应的氨基酸副产 物，粗乳酸用甲醇酯化得乳酸甲酯，蒸馏后再进行水解生成乳酸与甲醇，甲醇可再循环 利用。此法只能生产外消旋体乳酸，且其原料氢氰酸的剧毒性大大限制了生产和发展。 c h 3 c h o ! 墅l c h 3 c h ( o h ) c n c h 3 c h ( o h ) c n 备扣c h 3 c h ( o h ) c o o h c h 3 c h ( o h ) c o o h 马c h 3 c h ( o h ) c o o c 2 h 5 + h 2 0 c h 3 c h ( o h ) c o o c 2 h ，生生斗c h 3 c h ( o h ) c o o h + c 2 h 5 0 h ( 1 1 ) ( 1 2 ) ( 1 3 ) ( 1 4 ) 另外，还可以以丙酸为原料生产乳酸，首先丙酸经氯化得2 氯丙酸，再与氢氧化钠 反应得粗乳酸，而后经酯化、精镏、水解得到产品，该法原料价格较贵，仅日本大赛路 公司等少数厂家采用【l l 】。 c h 3 c h 2 c o o h - - - - q ! q c h 3 c h c i c o o h c h 3 c h c i c o o h 马c h 3 c h ( o h ) c o o h ( 1 5 ) ( 1 6 ) i 2 2 酶法 日本东京大学的木畸等人研究了用酶法生产乳酸嘲。他分别从恶臭假单胞菌和单胞 菌1 1 3 细胞中纯化出l - 2 卤代酸脱卤酶和d l 2 卤代酸脱卤酶，前者能够催化l 2 卤代 酸脱卤，后者既可以催化d ，又可以催化l 2 卤代酸脱卤，并且都发生构型的转变。 4 一 大连理工大学硕士学位论文 将l - 2 卤代酸脱卤酶和d l 2 氯丙酸混合反应，就可得到d 乳酸，未参加反应的d 2 氯丙酸与d l - 2 卤代酸脱卤酶反应生成l 乳酸。 1 ，2 3 微生物发酵法 发酵法是以淀粉、葡萄糖等糖类或牛乳为原料，接种微生物( 乳酸菌或霉菌) 经发酵 生成乳酸而得。发酵法生产乳酸，可以通过菌种和培养条件的选择而获得具有立体专一 性的l 孚l 酸或d 碍l 酸或者是两种异构体以一定的比例混合的消旋体。 另外，发酵法生产得到的乳酸会使环境的p h 值降低，对生产菌株的活性和乳酸的 产生都有严重的抑制作用。h o f v e n d a h l 等口4 1 发现乳酸乳球菌发酵全面粉2 4h 后，p h 值 由最初的5 8 5 降至3 2 ，只得到3 3g l 的l - 乳酸；当控制p h 在6 0 时，可得到9 6 9 l 的l 哥l 酸，而且随着p h 值的降低还会影响产品的纯度。为了减轻产物抑制作用，提高 乳酸产量，发酵工业中人们常在发酵液中加入碳酸钙等作中和剂，通过进一步的工艺分 离出乳酸。在本实验的后期，设计了没有加入中和剂进行产酸的实验，实验结果进一步 验证了乳酸的产物抑制作用。因此加入中和剂来调节发酵液的p h 值是必要的。 由于发酵法具有原料来源广泛、生产成本低、产品光学纯度高、安全性高等优点而 成为生产乳酸的重要方法。 1 2 3 1 细菌发酵法 国内外乳酸生产菌种【”】主要是德氏乳杆菌，在一定的温度、p h 值下进行厌氧批式 发酵，可以得到主要构型为d l 型的乳酸。用于工业生产乳酸的细菌主要有以下四个属 中的四十余种，乳杆菌属( l a c t o b a c t i l l u s ) 、链球菌属( s t r e p t o c o c c u s ) ，明串珠菌属 ( l e u c o n o s t o c ) 、足球菌属( p e d i o c o c c u s ) 。也有用嗜热脂肪芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌生产 l 乳酸的报道。 按微生物发酵糖类经由的过程和生成产物的不同，可将乳酸发酵分为同型乳酸发酵 ( h o m o f e r m e n t a t i o n ) 、异型乳酸发酵( h e t e r o f e r m e n t a t i o n ) 和混合酸发酵( m i x e da c i d f e r m e n t a t i o n ) 。 同型乳酸发酵是微生物以葡萄糖为底物通过e m p 途径将其降解为丙酮酸，丙酮酸 在乳酸脱氢酶的催化下还原为乳酸，其发酵途径如下式。 c 6 h 1 2 v 6 01 滞2 c h 3 c o c o o h 黔2 c h 3 c h o h c o o h + 2 a t p ( 1 7 ) 在同型乳酸发酵过程中，微生物利用1t o o l 葡萄糖可以生成2t o o l 乳酸，理论转化 率为1 0 0 。但由于发酵过程中微生物有其它生理活动存在，实际转化率不可能达1 0 0 ， 5 一 米根霉利用鱼粉废水生产l 乳酸的研究 一般认为转化率在9 0 以上者即视为同型发酵。异型乳酸发酵是某些乳酸细菌利用h m p 途径分解葡萄糖，其发酵途径见下图。 一篇巢攀仁酸一_ 乳酸 l 乙酰磷酸 乙醇 l 甘油醛 此过程1t o o l 已糖生成1m o l 乳酸、lm o l 二氧化碳和1t o o l 乙醇，乳酸对糖的转化 率只有5 0 。 混合酸发酵是同型乳酸发酵菌在特殊的情况下，如葡萄糖浓度受到限制、p h 提高 或温度降低，而采用的一种乳酸发酵机制，经由e m p 途径，而丙酮酸的代谢途径却发 生了改变，除了生成乳酸外，还生成其它有机酸副产物。 1 2 3 2 根霉发酵法 除了细菌可以用来发酵生产乳酸外，真菌中的根霉也可以用来生产乳酸，能用来生 产乳酸的菌株如下1 1 6 1 ：黑根霉僻n i g r i c a n s ) 、小麦曲根霉 加f f f c f ) 、华根霉( r c h i n e n s i s ) 、 甘薯根霉b a t a t a ) 、米根霉( i to r y z a e ) 、高温根霉( r t h e r m o s u s ) 、少根根霉a r r h i z u s ) 、 美根根霉限e l e g a n s ) 等。其中，以米根霉为生产菌株进行研究的较多。米根霉是工业发 酵中一种重要的菌株，作为好氧真菌，能在低营养状态下将淀粉直接转化为单一的l 乳酸，在乳酸生产中具有一定的优势【i ”。 关于米根霉乳酸发酵的代谢通量模型及代谢工程的文献报道很少。w r i g h t 等【1s j 通过 【1 4 c 】放射性同位素标记的方法确定了米根霉体内的代谢网络，用 1 4 c 】标记葡萄糖和醋酸 盐，来估计代谢的最终产物和糖的利用率，并通过t f l u x 程序分析所得到的数据，程 序分析得到的结果和实际线粒体及细胞质中的产物如丙酮酸盐，苹果酸盐，延胡索酸盐 是一致的，从而确定了米根霉的代谢模型。它是经e m p 途径生成丙酮酸，然后丙酮酸 分成两个支路，一部分丙酮酸进入线粒体中进行t c a 循环，而另一部分存在于细胞质 内的丙酮酸在乳酸脱氢酶、丙酮酸脱羧酶和丙酮酸羧化酶的催化下分别生成乳酸、乙醇、 苹果酸和富马酸。依据形成产物情况，该发酵也属于混合酸发酵类型， 一6 一 大连理工大学硕士学位论文 图1 2 米根霉的葡萄糖代谢途径 f i g 1 2m o d e lo f g l u c o s em e t a b o l i s mi nt h ef i l a m e n t o u sf u n g u sr h i z o p u so r y z a e 和细菌相比，米根霉生产乳酸具有其自身优点：细菌营养要求复杂，而米根霉营养 要求简单；米根霉菌丝体比细菌大，易于分离，有利于制得高质量的乳酸产品；尤其重 要的是根霉属发酵可得到光学纯度很高的i 广乳酸，而细菌发酵常因消旋作用得到的是 d l 一乳酸。 1 2 ，4 乳酸生产方法的比较 化学合成法所用的原料是乙醛和氢氰酸，乙醛要从石油中获得，石油是一种不可再 生物质，而氢氰酸是剧毒物质，如果制得的乳酸用于食品制造，要考虑到安全性问题， 而且化学合成法的成本也较高。因而用化学合成法生产乳酸大大受到限制。 酶法生产乳酸可以专一性得到单一旋光乳酸，但工艺比较复杂，应用到工业上还有 待于进一步研究。 微生物发酵法生产乳酸，可以通过菌种和培养条件的选择而得到具有专一性的i 广 乳酸、d 一乳酸或是d l 乳酸，而且方法简单，对环境无污染，可以利用废物，是一种很 有发展前途的乳酸生产方法。根霉发酵可得到光学纯度高的l 乳酸，这对进一步生产乳 酸聚合物尤为重要。 米根霉利用鱼粉废水生产l 4 l 酸的研究 1 3 乳酸的提取 l 乳酸发酵液成分复杂，除乳酸外，还包括菌体、残糖、蛋白质、色素、胶体、有 机杂酸、无机盐等，所以l 哥l 酸的提取比较困难。常用的方法有：钙盐法，电渗析法、 溶剂萃取法、吸附法等。 1 3 1 钙盐法 钙盐法【1 9 j 是较为传统的提取纯化工艺，虽具有易于控制、工艺成熟的优点，但其流 程长、硫酸及活性炭用量大、副产物石膏c a s 0 4 大、劳动强度高、产品收率低。 荔麓叶过滤仁竺脱色叶过炒浓缩_ 结p 离帆洗黔复溶一 l 硫酸钙滤渣 酸解脱色- + 1 滤液叶浓缩斗脱色斗过牺成品包装 f i g 1 3f l o wc h a r to f l a c t i ca c i de x t r a c t i o nf r o mf e r m e n t i o nb r o t h 该工艺的基本化学原理为： 中和：2 c 3 h 6 0 3 + c a c 0 3 - c a ( c 3 h s 0 3 ) 2 + h 2 0 + c 0 2 个 酸解：c a ( c 3 也0 3 ) 2 + 1 2 s 0 一2 c 3 h 6 0 3 + c a s 0 4 ( 1 8 ) ( 1 9 ) 1 3 2 电渗析法 电渗析法的基本原理是利用离子在直流电场作用下的定向移动和离子交换膜的选 择透过性而进行的分离过程。其特点是分离效率高，能耗低，便于自动控制，产物乳酸 能原位分离，不需添加中和剂，但微生物吸附在膜上，增大了石墨电阻，降低了电流效 率。 汪群慧等例通过电渗析法分离回收厨余垃圾发酵液中的乳酸，发现采用电渗析法能 将厨余垃圾发酵液中的乳酸与还原性糖进行有效分离，在电流密度2 0a d n l 2 的条件下 电渗析1 0 个小时，可使乳酸回收率 8 2 4 0 0 , 5 ，还原糖扩散率 9 1 8 6 。 一8 一 大连理工大学硕士学位论文 1 3 3 萃取法 萃取法不用石灰或石灰石以及硫酸，故不产生c a s 0 4 废渣，同时具有溶剂选择性好、 无细菌污染、操作过程自动化等优点。近年来，国内外开发出多种萃取技术，如双水相 萃取、膜萃取和超临界萃取等【1 2 】。 双水相萃取【2 1 1 是近年来出现的新型分离技术，双水相体系不会对细胞产生毒害作 用，为发酵提供了一种生物相容的环境，可利用在双水相中发酵而消除产物抑制。双水 相体系用于发酵萃取，需解决三个主要问题：乳酸组分优先进入细菌含量少的相中；还 原糖等杂质在另一聚合物相中；聚合物回收利用。 溶剂萃取法【2 1 l ：萃取乳酸为离子缔合反应机理，萃取乳酸溶液所用萃取剂，一般选 用胺类，尤以叔胺为多，但该类萃取剂具有一定毒性；且存在乳酸发酵过程中要求p h p k a ，而其萃取过程要求p h 1 3m g l 、无机氮 2 - 1 0 i m a o l l 、无机磷 o 4 5i l m o l l 时易诱发赤潮的发生【6 ”，赤潮生物产生大量毒素，引起 包括鱼类在内的多种生物大量死亡；有机质大量消耗溶解氧，造成水体缺氧，影响鱼类 的生长发育；同时有机物质腐败产生大量的细菌和病毒，除了直接危害到鱼类的生长外， 还会通过食物链危害人体；废水中的蛋白质在微生物作用下腐败产生硫化氢、吲哚、粪 臭质、硫醇和氨等臭味物质，对空气造成严重的污染，进而威胁到人类健康；从鱼粉废 水分离出来的油脂易氧化产生复杂的过氧化物，不但气味难闻，而且对水生生物和人体 具有毒害作用和致癌作用。 2 0 0 6 年，中国的水产业和畜禽养殖业继续快速发展，鱼粉作为不可或缺的蛋白质原 料，其需求也进入持续高增长阶段 6 2 删。据初步统计，我国生产鱼粉的企业有5 0 0 家左 右唧。因此，鱼粉废水的处置是一个函待解决的问题。 1 5 3 鱼粉废水的研究进展 目前，生产出来的鱼粉废水主要有以下几个处理方式：废水经过浓缩得到浓缩鱼汁 连同卧离得到的悬浮固体一起进行干燥得到全鱼粉如( 图1 4 所示) ；通过厌氧方法处理； 大连理工大学硕士学位论文 通过过滤( 超滤法和纳滤法等) 的方法进行处理；还可以通过利用鱼粉废水中的营养物质 生产高附加值的产品。 1 5 3 1 厌氧一硝化处理 厌氧硝化池法是厌氧生物法原始经典的方法，d r i v s h o l m 掣删利用厌氧池硝化法处 理鱼粉废水，c o d 去除率达8 0 ；厌氧处理后的废水，其出水中仍有较高的c o d 残留， 进一步的硝化处理效果也不理想【4 】。后续的处理工艺有待进一步的探讨。 a s 西等瞄荆用海底沉积物和猪粪作为菌种，对鱼粉废水进行了厌氧生物处理，认为 直接接种海底沉积物作为菌种，对鱼粉废水进行了厌氧生物处理是可行的。处理废水中 产沼菌和硫还原菌比例较高，为0 0 0 2 5 ，在直接接种猪粪运转l o 天后，甲烷化作用完 全消失。 利用厌氧硝化池对鱼粉废水进行处理，必须先对鱼粉废水进行稀释，以降低废水的 c o d 值，蛋白质值和盐度。另外，厌氧硝化本身要求进水的c o d 值较低，所以处理效 率较低。 1 5 3 2 过滤法 过滤法中又有薄膜过滤、超滤法、加压浮出法等。 薄膜超滤法是目前使用的主要方法，其原理是利用不同孔径的过滤薄膜，经过加压 使废水流过薄膜，从而将大分子与小分子分开。l i n 等【删选用分子切割量( m w c o ) 为3 0 0 0 0 的膜对鱼粉废水进行超滤，超滤过程中的压力为3 0p a ，将溶液经过不断的循环过滤 直到溶液体积减小到原来的2 0 2 5 ，然后进行冷冻干燥。但在超滤过程中，随着时间 的延长，膜表面会沉积很多污垢，致使流量减小。如果对溶液进行前处理，或在膜表面 加固定水解酶可能会使这种现象得到改善。 通过纳米过滤可以在降低鱼粉废水有机负荷的同时，去除废水中的盐度以使其可以 重复使用。另一方面，浓缩后的蛋白质可以直接加入到鱼粉生产过程中来循环再利用， 从而改善鱼粉质量，提高经济效益。a f o n s o 等1 6 7 】对位于塔尔卡瓦诺( 智利中部港市) 一家 鱼粉厂家的废水进行了研究，首先对操作条件进行了优化，条件为横跨膜压为5b a r ，流 速为4m j s ，温度为室温，p h 自然。并通过微滤法对废水进行预处理，然后用多管道陶 瓷膜( m w c o = lr 4 ) a ) ，进行纳米过滤实验，结果表明纳米过滤是一个有效而且环保的 技术，但是此方法的缺点是膜污染比较严重。 加压浮出法目前主要应用于污水处理工程，在渔业加工废水回收处理中效率较低， 未能得到广泛应用。 米根霉利用鱼粉废水生产l - - l 酸的研究 1 5 3 3 生产高附加值产品 目前用于鱼粉加工废水处理的方法主要有以上的薄膜超滤法、纳米过滤法、絮凝法 和加压浮出法等。但是如何从浓缩后的污水中提取或利用有用的物质如蛋白质和脂肪， 这一工艺现在还没有成熟的技术可用。近期，国内有对鱼粉废水再利用进行研究的相关 报道。 于锋等【6 8 】对鱼粉废水蛋白干物质回收和废水厌氧发酵生产沼气的一、二级处理工艺 进行了研究，探讨了蛋白干物质回收的最佳条件、沼气产气率和c o d 去除率的影响因 素。结果表明：鱼粉废水一级处理可回收3 4 蛋白干物质，回收率为3 0 。鱼粉废 水二级处理的沼气产气率0 3 8m 3 k g c o d ，c o d 去除率8 6 。取得了理想的处理效果， 为开发鱼粉废水处理技术，提高鱼粉生产经济效益，解决环境污染问题做了有益探索。 另外，由于鱼粉废水中含有大量的蛋白质，通过水解的方法可以得到氨基酸，付晚涛等 咿】通过盐酸水解经过蒸发鱼粉废水得到的糊状物得到1 7 种氨基酸，并优化了水解条件， 制取氨基酸的工艺简单，成本低，具有明显的环境效益和经济效益。 童群义等【7 0 懈鱼粉生产的压榨工序所产生的废水浓缩后，添加适量酶以酶解鱼汁， 然后经吸附、干燥等工艺，生产出具有浓郁鱼腥味的动物诱食剂。并通过正交试验对酶 法水解、产品配方、干燥等工艺条件进行了详细的研究，获得了较好的生产工艺条件。 并进行了中试和工业化应用试验。该产品具有生产工艺简单，质量稳定性好，价格低廉 等优点。 另外，还可以利用鱼粉废水通过微生物来生产絮凝剂。周旭等【7 l 】利用从污水处理厂 分离得到的假单胞菌p s e u d o m o n a s s pg x 4 1 ，以一定浓度的鱼粉废水为替代培养基合成 微生物絮凝剂，并考察了絮凝剂的性能，通过实验证明利用鱼粉废水作为替代发酵培养 基来生产微生物絮凝剂是可行的，对高岭土的絮凝率可高达9 5 以上，且具有良好的稳 定性。徐斌等【_ 埘对p s e u d o m o n a s s pg x 4 1 菌利用鱼粉废水产生的絮凝剂净化无机和有 机废水进了试验。该絮凝剂对高岭土悬浊液、土壤悬浊液、活性炭悬浊液和电瓷厂废水 有很好的除浊性能；生活污水、重油催化污水和针织染纱水等几种有机废水亦有较好的 除浊能力和c o d 去除能力。 1 6 研究设想 鱼粉废水中富含蛋白质和脂肪，碳、氮、磷含量很高，而这些又是微生物生长的重 要营养元素，氮源也是决定微生物发酵成本的重要因素之一。如果用鱼粉废水发酵生产 乳酸，则有可能在降低乳酸生产成本的同时实现鱼粉废水的资源化。本研究就是基于以 上设想，利用两株产乳酸菌株，考察并优化了其利用鱼粉废水生产乳酸的条件。 大连理工大学硕士学位论文 2 实验材料和方法 2 1 菌株来源 米根霉僻o r y z a e ) a s3 2 5 4 和a s3 4 1 购自中国科学院微生物研究所菌种保藏中心， 黄曲霉( a s p e r g i l l u sf l a v u s ) 和米曲霉( a s p e r g i l l u so r y z a e ) 购自大连轻工业学院菌种保藏中 心。 2 2 鱼粉废水 取自大连龙源鱼粉有限公司，组成见表3 2 。 2 3 实验仪器 型号名称 y j 8 7 5 b 垂直净化工作台 电子分析天平 恒温空气浴振荡器 h c t p l l b 架盘药物天平 1 0 1 2 a b 电热鼓风干燥箱 u v 9 1 0 0 型分光光度计 台式离心机 电子万用炉 p h s 3 c 精密p h 计 显微镜 i x 7 1 荧光倒置显微镜 微型旋涡混合仪 微波密封消解c o d 快速测定仪 t d c r c 2 3 k 接触式调压器 不锈钢手提式压力蒸汽灭菌锅 冰箱 a m i n e xh p x 一8 7 h 生产厂家 上海阳光实验仪器有限公司 北京赛多利斯仪器系统有限公司 国华企业s h z 一8 2 北京医用天平厂 天津市泰斯特仪器有限公司 北京瑞利分析仪器公司 上海安亭科学仪器厂 天津市泰斯特仪器集团有限公司 上海精密科学仪器有限公司 麦克奥迪实业集团有限公司 奥林巴斯 上海沪西分析仪器有限公司 汕头市环海工程总公司 中国德力西集团电源有限公司 上海博讯实业有限公司医疗设备厂 新飞f r e s t e c hb c d - 2 0 1 e b i o r a d 公司 米根霉利用鱼粉废水生产l 4 l 酸的研究 2 4 实验药品 名称 葡萄糖 可溶性淀粉 碳酸钙 硫酸铵 磷酸二氢钠 m g s 0 4 7 h 2 0 酵母膏 蛋白胨 牛肉膏 尿素 乙二胺四乙酸二钠 氢氧化钠 铬蓝黑r 乙醇 碘 碘化钾 苯酚 3 ，5 一二硝基水杨酸 硫酸银 浓硫酸 硫酸亚铁铵 重铬酸钾 硫酸亚铁 氯化钠 硝酸铵 氯化铵 琼脂 浓盐酸 级别 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 生化试剂 生化试剂 分析纯 分析纯 分析纯 钙试剂 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 化学纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 生化试剂 分析纯 生产厂家 天津市大茂化学试剂厂 沈阳市新西试剂厂 天津市博迪化工有限公司 天津市津沽工商实业公司 天津石英钟厂霸州市化工分厂 沈阳市和平区北七马路八号 北京奥博星生物技术有限责任公司 北京奥博星生物技术有限责任公司 北京奥博星生物技术有限责任公司 沈阳化学试剂厂 沈阳沈一精细化学品有限公司 沈阳化学试剂 中国湘中地质实验研究所 沈阳市联邦试剂厂 广东汕头市西陇化工厂 广东汕头市西陇化工厂 沈阳市新西试剂厂 中国医药集团上海化学试剂公司 广东汕头市西陇化工厂 天津市科密欧化学试剂开发中心 天津市科密欧化学试剂开发中心 天津市天河化学试剂厂 天津市科密欧化学试剂开发中心 天津市博迪化工有限公司 沈阳新兴试剂厂 沈阳第一试剂厂 福建泉州市泉港化工厂 哈尔滨化工化学试剂厂 大连理工大学硕士学位论文 反丁烯二酸 丁二酸 2 5 培养基 分析纯北京金龙化学试剂有限公司 分析纯中国医药集团上海化学试剂公司 2 5 1 马铃薯培养基 组成：马铃薯2 0 0 9 ，葡萄糖2 0 9 ，水1 0 0 0 m l ，琼脂1 5 2 0 9 ，p n 自然。 制法：去皮马铃薯2 0 0g ，切成小块，加1 0 0 0m l 水，煮沸至马铃薯块能被玻璃棒 戳破。用4 - 5 层纱布过滤，滤液补足水分，加2 0g 葡萄糖，琼脂1 5 - 2 0g ，充分溶解， 加水补充因蒸发而减少的水份。培养基分装入试管中，在1 2 1o c 高压蒸汽灭菌2 0r a i n 后倾斜摆放，冷却即得。 2 5 2 种子培养基 种子培养基( l ) ：可溶性淀粉1 0g ，蛋白胨5g ，酵母膏5g ，k h 2 p 0 40 2g ， m g s 0 4 7 h 2 00 2g 。1 2 lo c 高压蒸汽灭菌2 0m i n l 7 3 。 2 5 3 发酵培养基 合成培养基( l ) ：葡萄糖1 0 0 - 1 5 0g ，( n h 4 ) 2 s 0 42g ，k h 2 p 0 4o 6 5g ，m g s 0 4 7 h 2 0o 2 5 g 。1 2 1 。c 高压蒸汽灭菌2 0m i n 。 鱼粉废水培养基：采用稀释一定倍数的鱼粉废水c o d 浓度50 0 0m g l 左右并加入 适量碳源。1 2 1o c 高压蒸汽灭菌2 0r a i n 。 2 6 培养方法 斜面培养：在3 0 0 c 条件下，培养5 7 天，待孢子成熟后放入冰箱4o c 保存备用。 种子培养：高温高压灭菌的种子培养基中接入培养好的孢子，保持种子培养基中的 孢子浓度在2 5 1 0 5 + h a ，以尽量减少因接种带来的误差。在3 0o c ，1 5 0r m i n 条件下 振荡培养1 0 h 。 生产培养：培养好的种子液以妒= 6 的接种量接入到装有5 0m l 生产培养基的锥形 瓶中，3 0o c 、1 5 0r m i n # j 件下培养。为控制发酵液p h ，摇床培养2 4h 后加入5 碳酸钙( 单 独灭菌) 。 米根霉利用鱼粉废水生产l 4 l 酸的研究 2 7 分析方法 用1 0 5f u n 的筛子过滤发酵液，过滤得到的发酵液于40 0 0r m i n 条件下离心分离， 取上清液测p h 值、c o d 、乳酸、还原糖或淀粉。 2 7 1 生物量的测