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文档简介

cDNA末端快速扩增技术(rapidamplificationofcDNAends,RACE),1,技术背景基本RACE原理和方法样品要求RACE产物的鉴定和全长cDNA的获得,基本RACE原理,2,技术背景,得到某基因的片段、全长或近全长cDNA的方法：建立和筛选cDNA和DNA文库。利用GenBank数据库中的表达序列标签(expresssequencetags,ESTs)拼接出全长或近全长cDNA。是多聚酶链式反应即PCR。cDNA末端快速扩增(RACE)技术。,3,基本RACE原理和方法,利用Oligo(dT)对mRNA进行反转录的同时在两头加上通用接头(引物)，从而可利用基因特异的引物(genespecificprimer，GSP)通过PCR反应快速获得目的序列的5端和3端。,4,RACE流程,5,5-RACE法原理图,（1）（2）（3）（4）,RNaseH,6,样品要求：提取TotalRNA的材料要新鲜，采样后立即放入液氮中速冻或加入样品稳定剂。TotalRNA无降解，OD260/280=1.82.0。提供尽量多的实验材料：3RACETotalRNA15g；5RACETotalRNA25g。如果基因的含量较低或者未知序列较长，样品量需相应增加。,7,RACE产物的鉴定和全长cDNA的获得,3或5双链cDNA,限制性内切酶酶切,Southernblot分析,克隆,3和5重叠序列的连接,RACE产物的3和5末端序列的分析,合成相应引物,PCR获得全长cDNA,8,SMARTRACEcDNAsynthesisKit,9,SMARTRACEcDNAsynthesisKit,碱基互补配对原则,AT之间形成两个氢键GC之间形成三个氢键,poly(C)替代poly(A)增加5接头与cDNA第一链的结合牢固性,增加模板中有效双链丰度,提高目的基因获取几率,10,SMARTRACEcDNAsynthesisKit原理,11,cDNA第一链的合成机制,12,SMARTerRACE流程,13,5RACE流程图,14,3RACE流程图,15,GSP与cDNA模板的关系,GSP要求：2328nt5070%GCTm65；降落式（touchdown）PCR，Tm70与通用引物的3-末端不互补,16,GSP与cDNA模板的关系,GSP1：5-RACEPCR的反义引物GSP2：3-RACEPCR的正义引物,合适的酶切位点,100200bp,注意：GSP1与GSP2的Tm值要相似,17,GSP与cDNA模板的关系,NGSP：槽式（Nested）PCR引物,18,扩增后的预期：,19,具体实验方法,cDNA第一链的合成阳性对照RACEPCR实验cDNA末端的快速扩增RACE产物鉴定试剂盒试剂,20,比较用GSPs和NGSPs引物获得的P
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