（生物化学与分子生物学专业论文）拟南芥动蛋白异型体atkp1基因功能的研究.pdf

摘要 动蛋白是一类依赖于微管的马达蛋白，有许多异型体，这个超家族在真核细胞中参与了众多 的生物学过程如细胞器运输、有丝分裂和减数分裂，微管的动态调节以及信号转导等。植物动 蛋白的研究主要集中在细胞极性生长和胞质分裂等方面。动蛋白的功能具有多样性研究拟南芥 动蛋白异型体基因的具体生物学功能，对于了解动蛋白超家族及揭示拟南芥发育的分子机理具有 重要的意义。本实验室从拟南芥中克隆了一个动蛋白基因定名为a t k p j 。本研究对动蛋白异型 体a t k p j 的表达部位以及生物学功能进行了如下研究： 首先利用半定量r t - p c r 的方法对拟南芥不同器官中a t k p l 的表达进行了分析，结果显示。 拟南芥动蛋白异型体爿t k p i 是一个在幼嫩器官广泛表达的基因。为了解a t k p l 在体内的具体表达 活性，我们克隆夏血艘，启动子区域，p l a c e 在线软件分析表明该区域具有t a t ab o x 和c a a t b o x 等基本元件，同时还具有生长素反应元件；将该启动子区域与g u s 基因融合( p r o k p l - g u s ) ， 转入拟南芥后对转基因植株进行了g u s 活性分析，结果显示，a t k j 基因主要在幼嫩中柱和幼 嫩叶毛中表达，表明a 于，可能参与了中柱和叶毛的发育过程。 对转p r o k p l - g u s 拟南芥植株进行逆境和生长素处理( 1 0 u m a b a ，1m m i a a ，3 0 0 m m n a c i ) ， 结果显示，a t k p i 基因的表达响应i a a 的诱导，但对a b a 和高盐处理没有明显反应：通过r t p c r 研究表明，野生型体内a t k p i 基因在i a a 诱导4 8h 表达量才增加，说明a t k p i 是响应i a a 反应 的晚期基因。为了进一步了解a t k p i 基因的功能，通过p c r 、s o u t l l e mb l o t t i n g 和n o r t h e r n b l o t t i n g 鉴定，筛选出拟南芥a t k p lt - d n a 插入突变纯合体。表型观察结果显示，突变体的种子萌发对 外源i a a 表现出一定抗性，说明a t k p i 介入了i a a 的生理反应过程，但a t k p i 基因敲除并未影 响i a a 卑期反应基因i a a 2 和i a a l 6 的变化：在正常生长条件下a t k p l 基因的缺失并未影响植 株的生长、发育，表明a t k p l 基因的功能可以被其它基因所替代。 k a t d 是一个和a t k p t 高度同源的拟南芥动蛋自异型体。为了解a t k p j 的功能是否被k a t d 替代，我们克隆了k a t d 的启动子区域，用g u s 作为报告基因，对k a t d 的表达进行了分析。结 果显示。k a t d 基因在花药中大量表达；但同时我们在幼嫩叶毛和幼嫩维管束中同样观察到k a t d 的大量表达，和a t k p l 基因的表达部位基本相似。 鉴定、筛选出拟南芥k a t d 的t - d n a 插入突变体，表型观察结果显示，k a t d 的突变不影响 植株的正常生长、发育，表明k a t d 基因的功能也可被其它基因所替代。将k a t d 与a t k p l 突变 体进行杂交，通过p c r 、半定量r t - p c r 的鉴定获得了双突变纯合体。对t 2 代双突变体植栋表 型初步观察显示，植株有明显矮化现象，但维管束和叶毛的发育基本正常。t 3 代植株的详细表 型有待进一步详细分析。 关键词：a t k p l k a t d ，基因表达。i a a ，单突变体。双突变体 a b s t r a c t k i n e s i ni sak i n do fm i c r o t u b u l e - d e p e n d e n tm o t o rp r o t e i n st h a tc o n s t i t u t eas u p a r f a m i l yw i t h m a n yi s o f o r m s m e m b e r so ft h ek i n e s i ns u p e r f a m i l yp e r f o r mm a n y d i v e r s ec e l l u l a rf u n c t i o n s , s u c ha s t r a n s p o r to f m e m b r a n eo r g a n e l l e s ，m i t o s i s , m e i o s i s , m i c r o t u b u l ed y n a m i c sa n ds i g n a lt r a n s d u c t i o ne r e t h es t u d yo nk i n e s i n si np l a n t si sf o c u so nc e l lp o l a rg r o w t ha n dc y t o k i n e s i s f u n c t i o n so fk i n e s i n i s o f o r m ss h e wd i v e r s i t y , s ot h es t u d yo ns p e c i a lf u n c t i o n so fk i n e s i ni s o f o r m si na r a b i d o p s i sw o u l d p r o v i d ev a l u a b l ei n f o r m a t i o nf u ru n d e r s t a n d i n gt h ef h n o t i o no ft h ek i n e s i ns u p e r f a m i l ya n dt h e d e v e l o p m e n t m e c h a n i s mo f t h e a r a b i d o p s i s r 咒p i sag e n e w i t hc h a r a c t e r i s t i c so f k i n e s i n w h i c hh a d b e e nc l o n e df r o mt h es t e mo f a r a b i d o p s i si no u rl a b o r a t o r y t h i ss t u d yi sf o c u so ne x p r e s s i o no f k i n e s i n i s o f o r i l la 髓，p 1a n di t sb i o l o g i c a lf u n c t i o n a n dt h er e s u l t sw e r ea sf o l l o w s ： e x p r e s s i o no fa t k p li nd i f f e r e n to r g a n so fa r a b i d o p s i sw a sa n a l y z e db ys e m i - q u a n t i t a t i v e r t - p c ra n dt h er e s u l td e m o n s t r a t e dt h a ta t k p lw a se x p r e s s e dw i d e l yi ny o u n go r g a n s i no r d e rt o k n o w t h e 。e x p r e s s i o n a c t i v i 妒o f 以f 触，i nr i v e ，t h ep r o m o t e rr e g i o no f 爿t w a sc l o n e d a n a l y s i sb y p l a c ew i t hi n t e m e ts o f t w a r ei n d i c a t e dt h a tt h ep r o m o t e rr e g i o nh a dn o to n l yb a s i ce l e m e n t s1 i k e t a t ab o xa n dc a a tb o x , b u ta l s oa u x i n r e s p o n s ee l e m e n t t h cp r o m o t e rr e g i o nw a sf u s e dt og u s ( p r o k p l - g u s ) ，a n d t r a n s f o r m e d i n t o a r a b l d o p s i s g u se x p r e s s i o np a t t e r n i n t r a n s g e n i c a r a b i d o p s i s w a sa n a l y z e d t h er e s u l t sd e m o n s t r a t e dt h a tg u sw a se x p r e s s e dm a i n l yi ny o u n gl e a ft r i c h o m e sa n d y o u n gs t e l e ，s u g g e s t i n gt h a ta t k p im a y b ei n v o l v e di nd e v e l o p m e n to f s t e l ea n dl e a f t r i c h o m e p r o k p l - g u st r a n s g e n i cp l a n tw e r ee x p o s e dt oe n v i r o n m e n ts t r e s sa n da u x i n ( 1 0p m a b a l m mi a a ，3 0 0m m n a c i ) e x p r e s s i o no f a t k p lo b v i o u s l yr e s p o n d e dt o1 a a ，b u tn o tt oa b a a n dh i g h s a l t b a s e do ns e m i q u a n t i t a t i v er t - p c ra n a l y s i s ，a t k p le x p r e s s i o nw a sr e s p o n d e do n l ya f t e ri n d u c e d f o r4 8hw i t hl a a i n d i c a t i n gt h a ta 肚? 1i sal a t er e s p o n s eg e n eo fi a a t o 如r t h e rr e v e a lt h ef u n c t i o n o fa t k p l ，m u t a n to fa t 肿t - d n ai n s e r t i o nw a sc o n f i r m e db yp c rs o u t h e r nb l o t t i n g ，n o r t b e m b l o t t i n g , a n di t sp h e n o t y p ew a so b s e r v e d n eg e r m i n a t i o no fm u t a n ts e e d ss h o w e dr e s i s t a n c et oi a a w h i c hs u g g e s t e dt h a ta t k p im a yb ei n v o l v e di ni a ap h y s i o l o g i c a lp r o f e s s ，b u td e l e t i o no fa t k p i d i d n ta f f e c tt h ec h a n g eo ft h ee a r l yr e s p o n s eg e n e a a 2 ，倒彳j 6 ；i nn o r m a lg r o w t hc o n d i t i o n s ，t h e d e l e t i o no fa f 尼p ，d i d n ta f f e c tt h en o r m a lg r o w t ha n dt h ed e v e l o p m e n to fa r a b i d o p s i sp l a n t s s u g g e s t i n gt h a tt h ef u n c t i o no f a t k b lm a y b es u b s t i t u t e db yo t h e rh o m o l o g o u sg e n e k a t di sa n o t h e rk i n e s i ni s o f o r mw i t hh i g hi d e n t i t yt oa t k p l t ok n o wi fk a t dc o u l ds u b s t i t u t e a t k p i ，w ec l o n e dt h ep r o m o t e r r e g i o no f k a t d w j 廿1g u sa sr e p o r i e rg e n e 。e x p r e s s i o np a t t e mo f k a t di n a r a b i d o p s i sw a sa n a l y z e d k a t dh a dh i g he x p r e s s i o ni na n t h e r i t ss t r o n ge x p r e s s i o nw a sa l s oo c c u r r e d i ny o u n g1 e a r t r i c h o m ea n dy o u n gv a s c u l a t u r e s i m i l a rt ot h a to f a t j c p j k a t dt - d n ai n s e r t i o nm u t a n tw a sc o n f i r m e db yt h em e t h o do fp c ra n ds e m i - q u a n t i t a t i v e r t p c r o b s e r v a t i o no fp h e n o t y p ed e m o n s t r a t e dt h a td e l e t i o no fk a t dd i d n ta f f e c tn o r m a l d e v e l o p m e n to f a r a b i d o p s i sp l a n t ，s u g g e s t i n gt h a tt h ef u n c t i o no f k a t dm a yb es u b s t i t u t e dw i t ht h a to f 1 i sh o m o l o g o u sg e n e k a t dm u t a n tw a sc r o s s e dw i t ha t 砭p im u t a n t a n dt h ed o u b l em u t a n tw a s o b t a i n e d p r i m a r yo b s e r v a t i o nt ot 2 - g e n e r a t i o ns h o w e dt h a td o u b l em u t a n tp l a n th a do b v i o u sd w a r f p h c n o t y p e ，b u th a dn od e f e c ti nl e a f t r i c h o m ea n dv a s c u l a t u r e t h et 3 一g e n e r a t i o nd o u b l em u t a n t sw e r e w a i t i n gt ob eo b s e r v e dj ad e t a i l k e y w o r d s ：a t k p l ，g e n ee x p r e s s i o n ，i a a ，k a t d , s i n g l em u t a n t ，d o u b l em u t a n t l l 英文缩写英文名称 瑟 a m p k a r t a t p i a a c d n a n p a d e p e n p a d n t p a b a e b h r k a n k b l b m m m s o d p c r r t p c r 缩略词 a m i n oa c i dr e s i d u e a m p i c i l l i n k a n a n _ l y c i n a d e n o s i n 5 - t r i p h o s p h a t e i n d o l e 一3 一a c e t i ca c i d c o m p l e m e n t a r yd n a n l - n a p h t h y l p h t h a l a m i ca c i d d i e t h y lp y r o c a r b o n a t e n l n a p h t h y l p h t h a l a m i ca c i d d c o x y n u c l e o t i d et r i p h o s p h a t e s a b s c i s i ca c i d e t h i d i u mb r o m i d e h o u r k a n a m y c i n k i l ob a s ep a i r l u r i a - b e r t a n im e d i a m i n u t e m u r a s h i g e s k o o gm e d i a o p t i c a ld e n s i t y p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n r e v e r s et r a n s c r i p l a s ep o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n 中文名称 氨基酸残基 氨苄青霉素 卡那霉素 腺苷三磷酸 3 吲哚乙酸 互补d n a a 萘基邻胺甲酰苯甲酸 焦碳酸二乙腊 a 萘基邻胺甲酰苯甲酸 脱氧核苷三磷酸 脱落酸 溴化乙锭 小时 卡那霉素 千碱基对 l b 培养基 分钟 m s 培养基 光密度 聚合酶链式反应 逆转录p c r 独创性声明 y - 7 7 3 7 7 4 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。 研究生签名 力锯参 时间： 孙y 年f 月i 1 3 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名：绔 茜意 时i n ：加x 年j 月i j 日 导师签名 易| f 蟛 时间：7 夕年，月，f 日 中国农业大学博士学位论文第一章文献综述 第一章文献综述 动蛋白是v a l e 和b r a d y 于1 9 8 5 年分别在鸡和鱿鱼的神经组织里发现的，并且证明它可以利 用水解a t p 产生的能量沿微管运动。以后。又在脊推动物的脑、海胆卵细胞、果蝇幼胚中分离到 多种动蛋白和类动蛋白，表明动蛋白属于多家族的马达蛋白。后来，人们利用动物动蛋白保守马 达域的抗体从植物中也鉴定到了动蛋白。随着分子生物学技术的发展，研究工作者从分子水平上 分离到了各种各样的动蛋白。 1 1 动蛋白的结构 早期对动蛋白结构研究发现，、天然动蛋白以多聚体形式存在，为由两条重链和两条轻链组成 的异源四聚体结构l ( b i o o me ta k ，1 9 8 8 ：k u z n e t s o ve ta l ，1 9 8 8 ) 。后来发现动蛋白全酶有 几种形式的结构特性( c a r o l y nj e ta k ，2 0 0 2 ) ( f i g u r e1 ，a ) ：一些动蛋白作为单个重链行 驶功能( o k a d aa n dh i r o k a w a ，1 9 9 9 ) ，一些聚集成同源二聚体或异源二聚体( b l o o me ta 1 ，1 9 8 8 ； c o l ee ta l ，1 9 9 3 ) 。另外，一些二聚体形式的动蛋白也可结合称作动蛋白结合蛋白的亚单位 ( m a n n i n ga n ds n y d e r ，2 0 0 0 ) 。动蛋白的重链包含具有a t p 酶活力的马达区、颈区和杆区。马 达区以a t p 依赖的方式结合微管( y e ne ta 1 ，1 9 8 9 ) ，大约3 5 0 个a a 。高度保守的序列是a t p 结合位点( f a y g q t g s g k t ) 和微管结台位点( s s r s h ，v d l a g s e a n dh i p y r ) 。由于催化域的保守 性，利用这段区域的氨基酸保守序列产生的抗体可以广泛识别来自不同物种的动蛋白。同时其中 高度保守的a t p 结合区和微管结合位点的氨基酸序列也是后来从不同物种中通过p c r 手段克隆动 蛋自基因的依据所在：当与徽管结合时，动蛋白运动的方向依赖于它的颈邦序列。动蛋白的抒区 由卷曲的卷曲的n 螺旋构成，在序列和长度上都是高度可变的，一些动蛋白杆区的终端区域被看 成是尾部区域，尾部区域结合动蛋白结合蛋白，这个结合或许参与了马达活力的调控和货物的结 合( r i c ee a 1 ，1 9 9 9 ；s e i l e re ta 1 ，2 0 0 0 ) 。根据马达区催化中心所在位置的不同，动蛋 白可分为兰大类( f i g u r e l ，b ) ：k i n n ( n 末端马达域类) ，k i n c ( c 末端马达域类) 和k i n l ( 中间 马达域类) 。大量的研究表明所有的k i n n 都是微管正端马达蛋白，而所有的k i n c 都向微管的 负端移动即负端：马达二k i n l ，是一类新型动蛋白家族，它不具有传统马达蛋向的运输功能。而是一 种依赖于a t p 的微管解聚性酶( p e s a ie ta j ，1 9 9 9 ) 。 除了上述3 个普通的结构域之外，一些动蛋白还有一些特殊的功能域。拟南芥中发现的k c b p ， 它有m y t h 4 和类踝蛋白域，这样的马达域或许参与了微管和肌动蛋白丝细胞骨架的交叉对话 ( r e d d ye ta 1 ，2 0 0 1 ) ，k c b p 还有c a m 结合域，在c 端马达域部分，大约有2 3 个氨基酸与c a m 具有高的亲和力( r e d d ya s ne ta 1 ，1 9 9 6 ) 。另外发现拟南芥动蛋白中的7 个有c hd o m a i n ( c a l p o n i nh o m o l o g yd o m a i n ) ，它是一个肌动蛋白结合域( b a n u e l o ss ，s a r a s t em ，c a r a g ok d ，1 9 9 8 ) 。c h d o m a i n 是一个在细胞骨架和信号转导中的蛋白调控部位大约1 1 0 个残基它或作 为一串联重复的两个域或者作为一个单独拷贝起作用。具有串联重复的c h d o m a i n 的蛋白交叉 连接纤维状的肌动蛋f 丝，i 束缚肌动蛋白或者连接中间丝到细胞骨架：具有单个拷贝的蛋白参与 信号转导。具有c hd o m a i n 的动蛋白或许会结合肌动蛋白，并且参与信号转导或微丝和微管的连 中图农业大学博士学位论文第一章文献综述 接。另外。一些参与蛋白一蛋白相互作用或蛋e i - d n a 作用的功能域己被鉴定( r e d d ya s n ，d a yi s ， 2 0 0 1 ) 。 1 2 蛋白的生化特性 1 2 1 动蛋白依赖于核苷酸的微管结合特性 动蛋自在a t p 的非水解类似物a m p - p n p 或无机三磷酸p p p i 存在时。可以稳定结合到微管上 当加入a t p 后动蛋白可以从微管上解离下来( v a l ee ta 1 9 8 5 a ；k u z e n t s o ve ta 1 ，1 9 8 6 ) 。 但在盘基网病菌( d i c t y o s t e l i u md i s c o i d e u m ) 中分离到的动蛋白在a m p p n p 存在时却与微管的 结合能力降低( m c c a f f r e y 1 9 8 9 ) ，可能是其中的特例。动蛋白依赖于核苷酸的微管结合特性， 被广泛用来通过微管。，垂钓磐的方法作为动蛋白分离纯化中的步骤之一( c o h n ，1 9 8 9 ) 。 垂 ；主 乒t a i l 、 j s t a l k 、rv r 、， r ( 】【】r】 口n e c k 缓物缪彩 缓m o t o r m o n o m e rh o m o d t m e rh e t e r o d i m e r b n h 2 c o o h n - t y p e院叨彩彩彩纪黝 l - t y p e le x 时l s i o n 髟彩彩么彭彩黝 e x t e n s i o n i c i t y p e 眩钐彩彩彰纪弘彩翻 图l 。动蛋白的结构。a 三种类型的动蛋白：单聚体，同源二聚体异源二聚体 b 马达区的位置n 端，中间的或c 端的 f i g i ，k i n c s i ns t r u c t u r eat h m ct y p e so f k i n c s i ne x i s t ：m o n o m c r i c ，h o m o d i m c r i c ，a n dh c t c t o d i m c d c bt h ek i n c s i nh e a v y - c h a i na r r a n g c m c i l tc a nb c n - t y p e ，i _ t y p e ，o r c l y p e 1 2 2 动蛋白具有被微管激活的a t p a s e 活性 a t p a s e 活性是动蛋白作为马达蛋白最重要的特性之一。动蛋白具有a t p a s e 活性的证据首先 来自于对鸡脑中含有动蛋白成分的蛋白质粗提物的研究( b r a d y ，1 9 8 5 ) 。后米对纯化的牛脑 中国农业大学博士学位论文 第一章文献综述 ( k u z e n t s o ve ta l ，1 9 8 6 ) 和海胆卵( c o h ne ta l ，1 9 8 7 ) 中的动蛋白的研究中发现其a t p a s e 活 性可被微管强烈激活。催化a t p 水解产生的能量是动蛋白产生基于微管运动的能量来源。动蛋白 a t p a s e 激活的机制与肌球蛋白和力蛋白不同。在肌球蛋白和力蛋白催化a t p 水解循环中的限速步 骤是水解产物h d p + p i 的解离，这一步可以通过与相应骨架纤维的结合而被加速( h a c k n e y ，1 9 8 8 ) 。 但是在动蛋白催化的a t p 水解反应中。p i 的释放在a t p 水解后立即发生。而a d p 的释放极其缓慢， 微管和动蛋白的结合则加速了a d p 的释放，因此在动蛋白催化的a t p 水解反应中，其限速步骤只 与a d p 的释放有关( h a c k n e y ，1 9 8 8 ) 。 i 2 3 动蛋白能产生沿着微管的定向运动 纯化的动蛋白吸附在乳胶小球上后能够驱动小球在微管上产生运动( v a l ee ta j ，1 9 8 5 a ) 。 最早发现的鱿鱼神经细胞和华脑中的动蛋白为正向马达即沿着微管快速聚合的方向运动，而力 蛋白为负向马达( p a s c h a l e ta j ，1 9 8 7 b ：s c h r o e re ta 1 ，1 9 8 9 ) 。如前所述，动蛋白运动的 动力来源为催化a t p 水解所释放的化学能，a t p 的水解和水解产物的释放在微管和动蛋白高度协 调的相互作用下完成并通过动蛋白的构象变化转化为机械能。后来发现，除了正向马达外，动 蛋白家族中还存在负向运动的马达类型，动蛋白运动的方向由其结构所决定( e n d o we t a l 1 9 9 0 ： m e l u hp ta 1 1 9 9 0 ) 。 1 3 动蛋白的功能 在动蛋白发现之初，根据体外重组实验结果，人们推测动蛋白与诸如囊泡、膜性细胞器以及 染色体等胞内物质的运动有关( v a l ee ta l ，1 9 8 5 a ) 。但是随后的研究结果发现，动蛋白在细 胞内所担负的功能远比此耍广泛的多。迄今为止，已经发现动蛋自在细胞内物质的转运、细胞分 裂、微管动态调节以及信号转导等方面发挥重要功自 ( l a w r e n c ee ta l ，1 9 9 9 ) 。 1 3 1 细胞内物质的转运 在长距离运输中i 、动蛋白和其所转运的囊泡或细胞器紧密结合沿着微管进行转运。其中对于 溶酶体( 1 y s o s o m e ) 、黑色素体( m e l a n o s o m e ) 、神经突触囊泡前体( s y n a p t i cv e s i c l ep r e c u r s o r ) 以及染色体的运动了解比较清楚。此外，细胞分泌和线粒体的运动、r n a ( c a r s o np a l 。1 9 9 7 ， b r e n d z ae ta l 2 0 0 0 ) 和过氧化物体( w i e m e re ta 1 ，1 9 9 7 ) 在胞内的运输与定位也与动蛋白 有关。 溶酶体从细胞中央向四周的转运与正向运动的传统动蛋白有关。将传统动蛋白抗体注入培养 的巨噬细胞后会引起溶酶体在细胞中央崩解( h o l l e n b e c ke ta 1 ，1 9 9 0 ) 。对培养的成纤维细 胞用突变了a t p 结合位点的k h c 嵌合载体进行转染后，能干扰溶酶体的正常转运( n a k a t ae ta 1 ， 1 9 9 5 ) 。此外还有实验表明，k i f 5 b 缺失的胚胎外膜细胞( e x t r a e m b r y o n i cm e m b r a n ec e l l ) 表现 出溶酶体转运的异常( t a n a k ae ta 1 ，1 9 9 8 ) 。 含有黑色素颗粒或黑色素体的细胞在受到刺激后会通过黑色素的转运来改变颜色或进行视 觉防护( o p t i cs h i e l d i n g ) 。黑色素或色素颗粒的运动在有些细胞中与肌动蛋白有关，如视网膜 色素上皮细胞( k i n g s m i t he ta 1 ，1 9 9 7 ) ；有的细胞中是微管和微丝共同作用的结果，如脊 中国农业大学博士学位论文第一章文献综述 椎动物的载黑色素细胞( b r o w n ，1 9 9 9 ) 在爪蟾中载黑色素细胞中黑色素体通过动蛋白- i i 马达 的驱动沿微管向四周进行辐射状转运( r o g e r s8 ta l ，1 9 9 7 ：t u m ae ta l 。1 9 9 8 ) 神经突触囊泡是一类特化的囊泡首先在细胞体中合成后以前体形式通过轴突微管运送到突 触后装配形成成熟的囊泡，当受到如动作电位( a c t i o np o t e n t i a l ) 等刺激时，将贮存的神经递质 释放到突触间隙产生神经反射。o n c 一1 0 4 动蛋白家族中来自线虫( c a e n o r h a b d i t i se l e g a n s ) 的 u n c 一1 0 4 和小鼠的k i f i a 与神经突触囊泡的运输有关。此类马达蛋白家族的成员在许多物种中都 有存在，构成了一个新的家族( h i r o k a w a ，1 9 9 8 ；v a l ee ta l ，1 9 9 7 ) 。线虫u n c 一1 0 4 突变体 表现为神经肌肉缺陷突触囊泡在神经细胞体中积累，突触前端则相应表现出突触囊泡缺乏( h a l l e a 1 ，1 9 9 1 ) 。在小鼠中的u n c 一1 0 4 的同源蛋白为k i f i a ( o k a d ae ta 上1 9 9 5 ) ，其天然蛋白 在体外为单体形式，但在体内活性状态下为二聚体形式( k 1 0 p f e f n s t e i ne f 8 上，2 0 0 2 ：t o m i s h i g e p ta 上，2 0 0 2 ) ，可能是该家族的特点之一。k i f i a 的缺失突变体表型与u n c 一1 0 4 突变体相类似。 总之，此类动蛋白基囚突变后的动物细胞申霄般表现为突触部位囊泡积累积累减少，神经细胞体 中类似突触囊泡样的成分增加( 神经细胞崩解。造成相应的神经肌肉缺陷。动物个体在出生后很 快天亡( y o n e k a w a ，e 日| 1 9 9 8 ) 。 对于囊泡从高尔基体向内质网的运输研究比较多，除酵母以外，细胞中这一过程一般由微管 来介导( b l o o me ta 1 ，1 9 9 8 ) 。在从高尔基体到内质网的囊泡转运中的功能由传统动蛋白来承担 的观点得到了生化和免疫学实验的支持( j o h n s o ne ta 1 。1 9 9 6 ：l e o p o l de ta 1 ，1 9 9 2 ： l i p p i n c o t t s c h w a r t ze ta 上1 9 9 5 ，m a r k se ta 上，1 9 9 4 ：s c h i m i t ze t8 上1 9 9 4 ) 。当然 也存在一些与之相反的实验结果( f e i g u i n ee fa 1 ，1 9 9 4 ：t a n a k ae ta 上，1 9 9 8 ) ，这可能是 与这一过程中存在多个动蛋白类型有关( n a k a g a w ae ta 1 ，1 9 9 7 ：r a h m a ne ta 1 ，1 9 9 8 ：x i ae t 8 l ，1 9 9 8 ) 。此外，在不同类型的细胞中承担上述功能的动蛋白家族也可能有所不同。因为已经 发现u n c 一1 0 4 家族的k i f t c ( d o r n e re t 日上，1 9 9 8 ) 和另外其它的一些动蛋白如r a bk i n e s i n - 6 ( e c h a r de ta l - ，1 9 9 8 b ) 对有些细胞中高尔基体向内质网的囊泡运输中也是必需的。- 通过免疫 定位和突变载体转染实验中也发现与k r p 8 5 相近的x k l p 3 可能与细胞分泌有关( l eb o tp t8 上， 1 9 9 8 ) 。因此，对于不同动蛋白在高尔基体到内质网的囊泡转运中所担负的功能还需要进一步的 工作来证实j 对于线粒体在细胞分裂期。细胞间期和神经轴突中的运动，可能至少与三类来自不同动蛋白 家族的成员( k i f ib 、k l p 6 7 a 、k i f 5 b ) 有关( n a n g a k ue t a l ，1 9 9 4 ：p e r e r i ae t a l ，1 9 9 7 ：t a n a k a p a l ，1 9 9 8 ) 。k i f l b 在线粒体运动中的功能证据来自小鼠细胞中生化实验和细胞中共分布实 验( n a g a n k ue ta 1 ，1 9 9 4 ) 。k l p 6 7 a 证据主要来自果蝇早期胚胎中的共分布实验( p e r e r i ae ta 1 ， 1 9 9 7 ) 。但上述二者缺乏体内实验结果，对于其在线粒体运动中的功能还没有直接证据。大鼠k i f 5 b 缺失突变体的外胚层细胞中线粒体的分布表现出明显的异常( t a n a n k ae ta ，1 9 9 8 ) 。但迄今 还没有在其它非神经细胞中发现k i f 5 b 与线粒体运动有关的生化和免疫定位实验证据。同时以前 的遗传乖| 反义抑制实验也不支持这一观点( f e i g u i n ，e t a l ，1 9 9 4 ：g i n d h a r te t a l ，1 9 9 8 ：h u r d p fa l 。1 9 9 6 ) 。因此k i f 5 b 与细胞内线粒体运动有关的说法是否具有普遍性还不十分明了。 1 3 2 细胞分裂 在细胞有丝分裂和减数分裂中染色体的运动，以及纺锤体的形成及其结构的维持等需要多个 动蛋白家族的成员来完成。动蛋白马达能够和染色体直接结合驱动其在有丝分裂或减数分裂纺锤 4 中国农业大学博士学位论文第一章文献综述 体微管上产生运动。来自多个动蛋白家族的成员在细胞减数分裂或有丝分裂时沿着染色体臂分 布因而将它们统称为染色体动蛋白( c h r o m o k i n e s i n s ) 。这些动蛋白包括k i f 4 家族成员( s e k i n e e f a 1 9 9 4 ) ，染色体动蛋白( 髓n ge t a l ，1 9 9 5 ) 和来自爪蟾的x k l p i ( v e r n o se t a l ，1 9 9 5 ) ) 、 果蝇的n o d ( a f s h a re ta l 。1 9 9 5 ) 和l c l p 3 8 b ( o h k u r ae ta 1 ，1 9 9 7 ；r u d e ne ts 1 ，1 9 9 7 ：a l p h e y e a l 。1 9 9 7 ) 以及人类的k i d ( t o k a ie ta 上，1 9 9 6 ) 。通过免疫定位、遗传分析、反义抑制及 抗体封闭实验，发现位于染色体臂上的动蛋白与从纺锤体微管相互作用产生正向运动，因此认为 这些动蛋白具有将染色体臂推离纺锤极的作用。k i f 4 动蛋白具有正向马达蛋白活性( s e k i n ee t a 1 。1 9 9 4 ) ，n o d 、k l p 3 8 b 和k i d 还没有类似证据支持。基因序列分析发现k l p 3 8 b 可能为u n c 一1 0 4 家族中的一个新的亚家族。o n c 一1 0 4 家族中许多成员为正向马达( n a n g a k up a 1 ，1 9 9 4 ：o k a d ae t a 1 ，1 9 9 5 ) 。另外被称为中心体蛋白一e ( c e n p e ) 的动蛋白在整个减数分裂或有丝分裂过程中结合 至着丝粒上，在有丝分裂后期分布于纺锤体中问区域( b r o w ne t a l ，1 9 9 6 ：c o o k eo t a l 。1 9 9 7 ； y a oe ta 1 ，1 9 9 7 ：i ；y e r ce t j a l ：，? 1 9 9 2 ) 。在抗体封闭实验以及培养细胞突变体载体转染实验中 c e n p - e 动蛋白对于染色体汇集和排列到中期板区域( m e t a p h a s ep l a t e ) 是必需的( b r o w ne ta 1 ， 1 9 9 6 x d u e s b e r ye t - a ，1 9 9 7 ：s c h a a ro ta l ，1 9 9 7 ：w o o de ta l ，1 9 9 7 ：y e ne fa l ，1 9 9 2 ) 。 c e n p e 的马达区原核表达产物具有负向运动特性( w o o de ta 上，1 9 9 7 ) 。但是含有全长序列的动蛋 白复合体却表现出正向运动特性( t h r o w e re ta 1 ，1 9 9 5 ) 。c e n p e 的正向运动与其在染色体会 集过程中所担负的功能相符有观点认为c e n p - e 在有丝分裂后期染色体运动中也发挥重要功能 ( b r o w ne ta 1 ，1 9 9 6 ：c o o k ee ta l ，1 9 9 7 ：l o m b i l l op 亡a l ，1 9 9 5 a ；t h r o w e re ta 上，1 9 9 5 ， 1 9 9 6 ：y e ne ta 1 ，1 9 9 2 ) ，因为在这一过程中需要负向运动马达的参与。 1 3 3 鞭毛中的物质运输 除了动蛋白马达与囊泡番| 细胞器紧密结合的长距离运动形式岁卜，在农藻等其它具有鞭毛的细 胞中，还存在一种另外的运动形式，细胞体内合成的膜性蛋白和可溶性结构成分通过鞭毛运输到 远在鞭毛顶端的装配部位。对这一运输过程中详细分析发现被运输的物质以复合体颗粒的形式与 呈现异三聚体结构特点的动蛋白( 通常也称为k i n e s i n i i ) 进行从细胞体向鞭毛顶端的运输( c o l e p fa l ，1