（食品科学专业论文）不同信号肽对脂肪酶A在枯草芽孢杆菌中分泌表达的影响.pdf

摘要 不同信号肽对脂肪酶a 在枯草芽孢杆菌中分泌表达的影响 学科、专业：工科、食品科学 硕士研究生姓名：曾伶俐 指导教师：陈卫教授 摘要 入学时间：2 0 0 7 年9 月1 日 答辩时间：2 0 0 9 年1 2 月1 3 日 授予学位时间： 脂肪酶( 1 i p a s e ，e c3 1 1 3 ) 是一类能在油水界面上催化三酯酰甘油水解为甘油和 长链脂肪酸的酶类，可以催化酯水解、酯交换、酯合成等多种反应，并被广泛应用于油 脂加工、食品、医药、日化等领域。来源于芽孢杆菌属的脂肪酶因其良好的耐热性和耐 碱性而具有较高的研究和应用价值。然而在短时间内应用传统的诱变野生菌的方法筛选 出具有某些特定性质的脂肪酶高产菌株是不现实的，所以用基因工程方法生产脂肪酶己 成为必然。 枯草芽孢杆菌作为传统的工业生产菌，具有极强的蛋白质分泌能力，是研究蛋白质 表达和分泌的良好系统。利用枯草芽孢杆菌信号肽引导外源蛋白质定位分泌到细胞特定 区间，可提高外源蛋白质的可溶性，避免因包涵体复性带来的产物纯化等困难。然而， 同一种蛋白质在不同信号肽的作用下，分泌效率往往相差甚远，有的甚至不能实现分泌。 因此，研究信号肽与目的蛋白质结构之间的关系，可用以指导外源蛋白质分泌表达中信 号肽的选择，进而为外源蛋白质的分泌表达研究奠定基础。 。 本文以bs u b t i l i s1 6 8 来源的脂肪酶a 作为研究对象，构建了高效分泌表达载体 p m a 5 a m c s 1 i p a ，并转化枯草芽孢杆菌w b 6 0 0 ，得到脂肪酶分泌表达重组菌株w b 6 0 0 ( p m a 5 x m c s 1 i p a ) 。经2 0h 摇瓶发酵培养，分泌到胞外的脂肪酶活力达到最高，为 7 6 4u m l ，是出发菌株w b 6 0 0 最高酶活( o 0 2u m l ) 的3 8 2 倍。对其生长特性和稳 定性研究发现，该重组菌株生长速度和生长量与出发菌株w b 6 0 0 相当；分离稳定性很 好，在无选择压力的情况下连续传1 0 0 代，细胞仍9 8 带有质粒；结构稳定性研究表明 重组菌株在无选择压力的情况下连续传6 0 代，可正确表达t i p a 基因的重组菌株占总菌 株数的7 6 5 ；传到1 0 0 代时，这一比值降到4 3 6 ，但仍可满足工业生产的需要。 为了研究不同信号肽对脂肪酶分泌效率的影响，本文还选取了a p r e ，l i p b ，w a p a ， w p r a 四种蛋白质的信号肽序列，替换p m a 5 x m c s 1 i p a 中l i p a 基因信号肽序列，构建 了一系列分泌表达载体。分别转化枯草芽孢杆菌w b 6 0 0 ，得到重组菌株w b 6 0 0 ( p m a a p r e - l i p a ) ，w b 6 0 0 ( p m a l i p b - t i p a ) ，w b 6 0 0 ( p m a w a p a l i p a ) ，w b 6 0 0 ( p m a w p r a z 训) 。各重组菌株发酵2 0h 后，脂肪酶分泌表达情况有显著差异。最高酶 活分别达到o 5 5u m l ，1 3 8u m l ，0 1 8u m l 和o 7 7u m l 。分别以w b 6 0 0 ( p m a 5 x m c s 1 i p a ) 和w b 6 0 0 作为阳性和阴性对照，结合各重组菌株胞内脂肪酶活 力和s d s p a g e 分析发现，胞内有明显的蛋白质特异性条带，但胞内脂肪酶活力较低， 由此推断更换信号肽后的重组菌株由于不能很好引导脂肪酶的分泌输出，使得目的蛋白 质前体物质积累在细胞内。结果表明，不同信号肽对脂肪酶a 在枯草芽孢杆菌中的分泌 摘要 表达有显著影响，为进一步揭示不同信号肽对同一种蛋白质分泌表达效率的影响关系奠 定了基础。 关键词：信号肽；脂肪酶；l i p a 基因：枯草芽孢杆菌；重组菌株；分泌表达 l l e f f e c t so fd i f f e r e n ts i g n a lp e p t i d e so nt h es e c r e t i o no fl i p a s eai n b a c i l l u ss u b t i l i s s u b j e c ta n ds p e c i a l i t y ：e n g i n e e r i n g ，f o o ds c i e n c e m a s t e rg r a d u a t es t u d e n t ：l i n g l iz e n g f a c u l t ya d v i s e r ：w e ic h e n ，p r o a b s t r a c t t i m eo fe n r o l l m e n t ：01 0 9 2 0 0 7 t i m eo f d e f e n s e ：1 3 1 2 2 0 0 9 t i m eo fc o n f e r r i n gd e g r e e ： l i p a s e s ( e c3 1 1 3 ) a r eac l a s so fe n z y m e sa c t i n go nt h ee s t e rb o n d so ft r i g l y c e r i d e s u b s t r a t e sa to i l w a t e ri n t e r f a c e st ol i b e r a t eg l y c e r o la n dl o n g c h a i nf a t t ya c i d t h e yc a l l c a t a l y z et h er e a c t i o n so fe s t e rh y d r o l y s i s ，t r a n s e s t e r i f i c a t i o n ，e s t e rs y n t h e s i sa n d c a i lb ew i d e l y u s e di nt h ep r o c e s s i n go ff a t sa n do i l s ，f o o d ，m e d i c i n e ，c o m m o d i t ya n dc h e m i c a l s l i p a s e s f r o mb a c i l l u sg e n u sh a v eg r e a tv a l u ef o rs t u d ya n da p p l i c a t i o nb e c a u s eo ft h e i rw e l l h e a t - r e s i s t a n c ea n da l k a l i n e r e s i s t a n c ep r o p e r t i e s h o w e v e r ，i t su n p r a c t i c a lt os c r e e ns t r a i n s t h a th i g h l yp r o d u c el i p a s e sw i t hs p e c i a lp r o p e r t i e st h r o u g ht r a d i t i o n a lb r e e d i n gb yi n d u c e d m u t a t i o n t h ep r o d u c t i o no fl i p a s e sb yd n ar e c o m b i n a n tt e c h n o l o g yt u l t i st ob eat r e n d a sat r a d i t i o n a li n d u s t r i a ls t r a i n ，b a c i l l u ss u b t i l i sh a sah i g hc a p a c i t yt os e c r e t ep r o t e i n s a n di ti su s e da st y p i c a ls y s t e mf o rs t u d i e so np r o t e i ne x p r e s s i o na n ds e c r e t i o n s i g n a l p e p t i d e so fb a c i l l u ss u b t i l i sd i r e c t i n ga n ds e c r e t i n gh e t e r o l o g o u sp r o t e i n si n t og i v e nd o m a i n i nc e l l sc o u l de n h a n c et h es o l u b i l i t ya n da v o i dt h er e n a t u r a t i o np r o c e s so fh e t e r o l o g o u s p r o t e i n s h o w e v e r ，t h ep r o t e i n sf u s e dt o d i f f e r e n ts i g n a lp e p t i d e sh a v ed i f f e r e n te x p o r t e f f i c i e n c y , e v e nc a n tb es e c r e t e d r e s e a r c ho nt h er e l a t i o nb e t w e e ns i g n a lp e p t i d e sa n d p r o t e i n s w i t hd i f f e r e n ts t r u c t u r e sh a si n s t r u c t i o n a ls i g n i f i c a n c e a n di th a sr e f e r e n c et o c h o o s i n gs u i t a b l es i g n a lp e p t i d e so nh e t e r o l o g o u sp r o t e i n se x p o r t l i p a s ea f r o m 矗s u b t i l i s1 6 8w a su s e dt og e n e r a t i n gs e c r e t i o nv e c t o rp m a 5 a m c s l p a t h r o u g ht r a n s f o r m a t i o n ，s e c r e t i o nr e c o m b i n a n tw b 6 0 0 ( p m a 5 a m c s l p a ) w a sg o t t e n a f t e rc u l t u r i n gf o r2 0 h ，t h eh i g h e s te n z y m ea c t i v i t yr e a c h e d7 6 4u m li nt h es u p e r n a t a n t ， w h i c hw a s38 2t i m e sh i g h e rt h a nw b 6 0 0 t h eg r o w t hs p e e da n db i o m a s so ft h er e c o m b i n a n t w e r es i m i l a rt ot h a to ft h eh o s t s e g r e g a t i o n a ls t a b i l i t ye x a m i n a t i o no ft h es t r a i ns h o w e di t w a s9 8 s t a b l ea f t e r10 0g e n e r a t i o n so fs u c c e s s i v ec u l t i v a t i o nw i t h o u ts e l e c t i o np r e s s u r e u n d e rt h es a m ec o n d i t i o n t h es t r u c t u r a ls t a b i l i t ye x a m i n a t i o np r o p o r t i o nw a s7 6 5 a f t e r6 0 g e n e r a t i o n sa n di td e c r e a s e dt o4 3 6 a f t e r10 0g e n e r a t i o n s b u tt h er e c o m b i n a n ts t i l lm e t i n d u s t r yn e e d a p r e ，l i p b ，w a p a ，w p r as i g n a lp e p t i d e sw e r ec h o s e nf o rf u r t h e rs t u d yo fs e c r e t i o n ， t h e nt h es i g n a lp e p t i d eo fl p aw a sr e p l a c e db yt h e s ef o u ri no r d e rt oc o n s t r u c tas e r i e so f s e c r e t i o nv e c t o r s f i n a l l y , t h e s ev e c t o r sw e r et r a n s f o r m e di n t ow b 6 0 0 ，g e t t i n gw b 6 0 0 ( p m a a p r e - l p a ) ，w b 6 0 0 ( p m a l i p b - l ? a ) ，w b 6 0 0 ( p m a w a p a - t p a ) a n dw b 6 0 0 ( p m a w p r a - 例) a l s oc u l t u r i n gf o r2 0h ，t h ee x t r a c e l l u l a rh i g h e s te n z y m ea c t i v i t ys h o w e d d i f f e r e n tr e s u l t s ，r e a c h i n go 5 5u m l ，1 3 8u m l ，0 18u m la n d0 7 7u m lr e s p e c t i v e l y w h e nw b 6 0 0 ( p m a 5a m c s - l i p a ) a n dw b 6 0 0w e r et a k e na st h ep o s i t i v ea n dn e g a t i v e i i i a b s t r a c t c o n t r 0 1 i n t r a c e l l u l a rl i p a s ea c t i v i t ya n ds d s - p a g ea n a l y s i ss h o w e dt h e r ew a sa no b v i o u s b a n dc o r r e s p o n d i n gd i f f e r e n t1 0 wi n t r a c e l l u l a rl i p aa c t i v i t yi nt h e s ef o u rr e c o m b i n a n t s b a s e do nt h e s ep h e n o m e n a , w es p e c u l a t e dt h a tr e c o m b i n a n t sw i t ht h e s ef o u rs i g n a lp e p t i d e s c o u l dn o tt o t a l l yg u i d et h ee x p r e s s e dl i p a s ed i r e c t l yi n t ot h ec u l t u r es u p e m a t a n tw h e r e a sa l a r g ea m o u n t so fp r e c u r s o rp r o t e i n sa c c u m u l a t e di nt h ec e l l t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h e r e w e r en o t a b l ee f f e c t so fd i f f e r e n ts i g n a lp e p t i d e so nt h es e c r e t i o no fl i p a s ei nb a c i l l u ss u b t i l i s ， w h i c hl a i daf o u n d a t i o nf o rf u r t h e rs t u d yo ft h es e c r e t i o na n de x p r e s s i o nc o n n e c t i o nb e t w e e n d i f f e r e n ts i g n a lp e p t i d e sa n do n et a r g e tp r o t e i n k e y w o r d s ：s i g n a lp e p t i d e ；l i p a s e ；l p ag e n e ；b a c i l l u ss u b t i l i s ；r e c o m b i n a n ts t r a i n ； e x p r e s s i o na n ds e c r e t i o n i v 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名： 望丝幽 导师签名： 日 期： 1 前言 1 前言 1 1 枯草芽孢杆菌研究概况 1 1 1 枯草芽孢杆菌简介 枯草芽孢杆菌( b a c i l l u ss u b t i l i s ，简称bs u b t i l i s ) 为芽孢杆菌属的一种，是一类好 氧型、内生抗逆性孢子的革兰氏阳性真细菌。其细胞呈直杆状，大小( 0 8 1 2 ) 岬 ( 1 5 - 4 0 ) 岬，广泛分布于土壤、湖泊、海洋及动植物的体表等，易在枯草浸汁中繁殖， 故名【1 1 。 丑s u b t i l i s 具有长期制备发酵食品的历史，很久以来在亚洲国家就被用于细菌型发酵 食品豆豉( d o u c h i ) 的生产，故与乳酸菌( l a c t i ca c i db a c t e r i a ，简称l a b ) 同样被公 认为食品安全菌种，属于一般公认安全( g e n e r a l l yr e c o g n i z e da ss a f e ，g r a s ) 微生物 范畴【2 ，3 j 。由于其公认的安全特性，使得丑s u b t i l i s 及同属多种芽孢杆菌，如地衣芽孢杆 菌( b a c i l l u sl i c h e n i f o r m i s ) 、解淀粉芽孢杆菌( b a c i l l u sa m y l o l i q u e f a c i e n s ) 等成为重要的 工业菌种，并在食品工业中得到广泛应用。据来自b b c 的统计数字，2 0 0 4 年，全球工 业酶制剂市场交易总额达到2 0 亿美元并继续保持增长趋势，而由芽孢杆菌生产的酶类 占到了整个酶市场的5 0 左右【4 】。bs u b t i l i s 生产的蛋白酶、淀粉酶是工业酶中应用最为 广泛的两种，其中淀粉酶的生产和应用处于整个酶制剂的首位。 1 1 2 枯草芽孢杆茵表达系统的研究进展 国内外关于丑s u b t i l i s 的研究与应用已有1 0 0 多年的历史，早期大部分工作主要集 中在形态观察、分类鉴定、生理机能、功能发掘及生物防治等方面。自1 9 5 8 年s p i z i z e n t 5 】 发现枯草芽孢杆菌16 8 株能摄取外源基因以后，随着d n a 重组技术的发明，特别是金 黄色葡萄球菌( s t a p h y l o c o c c u sa u r e u s ) 带抗性标志的质粒可作为其载体的发现，丑s u b t i l i s 作为基因工程表达系统的研究迅速发展，并展现出良好的应用前景。作为很有吸引力的 外源基因表达宿主，丑s u b t i l i s 具有以下一些优点【6 】： ( 1 ) 非致病的土壤微生物，不像大肠杆菌( e s c h e r i c h i ac o l i ，简称ec o l i ) 那样具 有热源性脂多糖，不会产生毒素和致热致敏蛋白质； ( 2 ) 遗传学特性清楚，很多噬菌体和质粒适合于用作克隆载体； ( 3 ) 蛋白质分泌能力强，当分泌蛋白质跨过细胞膜后，就被加工和直接释放到培 养基中，这使得回收和纯化目的蛋白质较为简单： ( 4 ) 良好的发酵基础和生产技术，丑s u b t i l i s 在工业上长期被用于生产蛋白酶、0 【 淀粉酶等，在相对简单的培养基中能生长到很高的密度，发酵工艺成熟。 经过几十年的努力，许多原核和真核基因在最s u b t i l i s 表达系统中被克隆和表达， 如m a u r i e l l o 7 等将抗原l t b 蛋白基因整合入最s u b t i l i s 染色体中，并在其c 末端融合了 c o t c 蛋白，成功表达了具有活性的l t b 抗原蛋白。我国学者也利用丑s u b t i l i s 表达系统 实现了外源基因的有效表达【黏1 0 】。表1 1 总结了在最s u b t i l i s 表达系统中克隆表达的若干 外源基因及其在工业中的应用。 江南大学硕士学位论文 表1 1 枯草芽孢杆菌中表达的外源基因及其工业应用 t a b l e1 - 1h e t e r o l o g o u sg e n e se x p r e s s e db yb s u b t i l i sa n dt h e i ri n d u s t r ya p p l i c a t i o n 1 1 3 枯草芽孢杆菌的蛋白质分泌机制 蛋白质分泌( p r o t e i ns e c r e t i o n ) 是指某些蛋白质在细胞内合成后，可以通过特定机 制输出到细胞外的过程。在过去的2 0 多年，细菌蛋白质分泌机制的研究主要集中在大 肠杆菌。近些年来，丑s u b t i l i s 已经成为研究革兰氏阳性菌蛋白质分泌机制的模式菌株【2 7 1 。 现己在丑s u b t i l i s 中发现了至少有四种蛋白质分泌途径，引导大约3 0 0 个蛋白质分泌输 出到细胞外，概括如下： ( 1 ) 一般分泌途径( t h eg e n e r a ls e c r e t i o np a t h w a y ，简称s e c 分泌途径) ，在丑s u b t i l i s 中，超过9 0 的胞外蛋白质是通过该途径实现分泌的； ( 2 ) 双精氨酸分泌途径( t w i n a r g i n i n et r a n s l o c a t i o np a t h w a y ，简称t a t 分泌途径) ， 是丑s u b t i l i s 中第二大分泌途径，其突出特点是可分泌在胞内已折叠形成正确构象的蛋 白质； ( 3 ) a t p 结合盒转运子途径( a t p b i n d i n gc a s s e t t et r a n s p o r t e r ，简称a b c 转运子途 径) ，主要用于细菌素等分子的输出； ( 4 ) 假菌丝蛋白输出途径( p s e u d o p h i l i np a t h w a y ，简称c o m 途径) ，与最s u b t i l i s 细胞感受态形成有关。 与大肠杆菌不同的是，丑s u b t i l i s 没有外膜，分泌蛋白质时只需要穿过一层细胞膜即 可直接释放到环境中。因此，芽孢杆菌是生产各种酶及外源蛋白质的理想宿主；然而有 时产量令人失望，这可能是由于分泌途径中的一个或几个瓶颈以及胞外蛋白酶的作用降 低了培养液中目标蛋白质的产量，因此深入研究蛋白质的分泌机制是提高芽孢杆菌外源 蛋白质分泌的关键。 2 1 前言 1 2 信号肽研究进展 1 2 1 信号肽概述 1 9 7 2 年，c m i l s t e i n l 2 8 j 等人首次发现了免疫球蛋白( i g g ) 轻链在合成时以前体形式存 在。它的n 末端比成熟的轻链多出一段肽，约由2 0 个氨基酸组成。他们猜测，这段肽 具有信号作用，使i g g 轻链通过内质网分泌输出到细胞之外。 1 9 7 5 年，美国洛克菲勒大学细胞生物学教授g u n t e rb l o b l e 2 9 】根据进一步实验依据， 提出了“信号假说( s i g n a lh y p o t h e i s ) ，用以解决蛋白质合成后的去向问题。他认为新 合成的蛋白质有一个内源信号，即信号肽( s i g n a lp e p t i d e ，简称s p ) 。信号肽类似于确 保信件到达正确地址的邮政编码，具有导航定位机能。它能引导新生多肽链穿越内质网 膜进行蛋白质的加工。随后2 0 多年的工作证实了该学说的正确性，并具有普遍性意义。 g u n t e rb l o b l e 因其在蛋白质信号转导领域的深入研究和发现而获得了1 9 9 9 年诺贝尔医 学和生理学樊3 0 1 。 信号肽的提出同样为蛋白质的研究开辟了新的领域：蛋白质的空间属性。这为进一 步研究蛋白质的结构和功能奠定了一定的基础。到目前为止，信号肽打破了最初“信号 假说”赋予其的概念和作用。位于c 端的信号肽相继被发现，其作用还与蛋白质或其 新生肽链在细胞内的全方位的定位有关。随着基因工程的飞速发展，作为引导蛋白质分 泌的信号肽也倍受关注。外源蛋白质在宿主菌，如大肠杆菌中的表达形式多为细胞内不 溶性表达( 包涵体) ，少数为细胞外分泌表达。利用信号肽的特性来引导外源蛋白质定位 分泌到细胞特定区间，提高可溶性，可避免因包涵体复性带来的困难。目前研究采用的 信号肽基本来自表达系统自身的信号序列或外源信号序列，或两者兼而有之。研究表明， 多种外源基因连上信号肽后，在原核表达系统，如大肠杆菌、l 型细菌、乳酸杆菌和芽 孢杆菌等中都得到了分泌表达【3 1 。3 5 1 ；信号肽也广泛应用于真核表达系统如巴斯德毕赤酵 母和昆虫杆状病毒表达系统中1 3 引。总之，信号肽因其特有的功能在外源基因的分泌表 达上被广泛应用。 1 2 2 枯草芽孢杆菌的信号肽 通过比较已知信号肽的结构发现，它们一般由三部分构成：n 端由1 5 个带正电荷 的氨基酸组成；中间部分为7 1 5 个疏水性氨基酸构成的核心区；c 端由3 7 个能被信号 肽酶识别并切割的亲水性氨基酸组成【4 1 1 ，基本结构示意见图1 1 。枯草芽孢杆菌的信号 肽同样具有这一共性。但是根据枯草芽孢杆菌蛋白质分泌机制的不同，可将其信号肽细 分为4 种类型，分别对应1 1 3 所述的4 种蛋白质分泌机制，如图1 2 所示。 他- 二二二二 夕 图1 1 信号肽基本结构示意图 f i g 1 1t h eb a s i cd e s i g no fs i g n a lp e p t i d e s 江南大学硕士学位论文 s e e y p el i p o p r o t i ns i g n a li 拍p t i c l d s s p p o i i 二二二二二二二 _ + 口 nhc+ 1 s e cp a t h w a y p r e p l l i n - l l k es i g n a lp e m i c l e s c 。m c 旺固宦二 二二二二二二二二二二二二工 c o r np 龇h w a y nc+1h “一”“一翟翟罗“一”。 _ _ _ _ _ 亡= 二二二= 二二= nc + t w i n _ a g i m a i p e p d 。 i 二二二二二二二二二二_ e a b ct r a n s p o r t e r t a tp 甜h w a y nhc r 1 圉1 2 枯草芽孢杆茵分泌蛋白质所具有的n 端切割信号肽类型 f 培i - 2 c l a s s i f i c a t i o n o f c l e a v a b l e n - t e r m i n a ls i g r l a 】p e p t i d c s i n b a c i l l u ss u b t i l i s 由于bs u b t i l i s 是传统的工业生产菌，能分泌大量的胞外蛋白质，因而是研究蛋白 质表达和分泌的良好系统。利用rs u b t i l i s 信引执特有的功能进行外源基因的分泌表达 不仅方便下游纯化操作，对于制各一些有特殊功用的基因工程产物( 药物抗体等) 更 显示了重要性i ”i 。鉴于此，利用枯草芽孢杆菌表达系统的优越性与其自身信号肽序列相 结台，构建分泌表达系统，实现了众多外源蛋白质的分泌表选。o h m u t a 等1 从一种大 量分泌卅淀粉酶的枯草芽孢杆菌菌株中分离出q 一淀粉酶基因( a m y e ) ，将其表达和分泌 元件克隆入衍生质粒p u b l1 0 上，并在信号序列后面加上多克隆位点，构建成分泌表达 载体，并用大肠杆菌的b 内酰胺酶结构基因作为报告基因在丑s u b t i l i s 的培养基中获 得5 0 1 0 0m 以活性的p 内酰胺酶，而在细胞内几乎没有检测到酶活性。以同样的方式， 利用且s u b t i l # 碱性和中性蛋白酶( a p r ，n p r ) 、且a m y l o l i q u e f a c i e n s 的廿淀粉酶和金黄色 葡萄球菌的链激酶等酶的表达和分泌信号构建了多个表达载体【4 ”，实现了外源基因的 有效分泌表达如且a m y l o l i q u e f a c i e n s 的淀粉酶的表达和分泌元件使百日咳毒索亚单 位s l 的分泌量达到5 0 0m g l t 4 ”。 然而，利用丑s u b d l 妇进行外源基因的分泌表达时，通常采用的策略是推测目标蛋 白质可能具有的分泌途径，再将该途径可识别的信号肽融合到目标蛋白质的n - 端以便 尝试其分泌表达水平。外源蛋白质的来源菌种与丑s u b h l 打在进化关系上可能具有很大 差别，蛋白质本身与分泌途径的相容性和相容度均为未知，因此这种策略带有较大程度 的盲目性。众多研究报道表明，同一种蛋白质在不同信号肽的作用下分泌效率相羞甚远， 有的甚至不能分泌。如n a g a r 画j a n l 4 7 1 选择了枯草芽孢杆葡蛋白酶、中性蛋白酶、芽孢杆 1 前言 菌r n a 酶( b a m a s e ) 和果聚糖蔗糖酶等4 种酶蛋白的信号肽，以芽孢杆菌b e l 5 1 0 为宿主 菌，分别表达重组链霉抗生物素蛋i 兰t ( s t r e p t a v i d i n ) ，结果中性蛋白酶信号肽的分泌效率 最高。b r o c k m e i e r t 4 8 】尝试了来源于枯草芽孢杆菌的1 7 3 种信号肽对角质酶分泌表达的影 响，其中有3 9 种信号肽不能实现角质酶的分泌。因此，针对不同的蛋白质应该选择合 适的信号肽来实现有效的分泌表达。 1 3 脂肪酶的研究和应用 1 3 1 脂肪酶简介 脂肪酶( 1 i p a s e ，e c3 1 1 3 ) 是一类能在油水界面上催化三酯酰甘油水解为甘油和 长链脂肪酸的酶类，广泛存在于动物、植物和微生物中【4 9 1 。自18 3 4 年被发现以来，已 有百多年的研究历史。它是生物体内一类重要的代谢酶，具有多种催化能力，最主要 的特征为其特有的水解催化活性，即该酶催化的水解反应是一种非均相体系，水溶性的 酶在底物( 水不溶性) 和水的界面上进行催化反应，对水溶性底物不起催化作用【5 0 l 。脂 肪酶可以催化长、短链，饱和、不饱和酯的水解，并且显示了一定的位置专一性，在食 品、皮革、医药和洗涤剂等许多工业领域中均有广泛应用【5 1 1 。 1 3 2 微生物脂肪酶的研究报道 微生物脂肪酶是2 0 世纪初被发现的。与动植物来源的脂肪酶相比，微生物脂肪酶 种类多，具有更广范围的反应p h 、反应温度以及对底物的反应专一性强等特点。而且， 制备周期短，易于培养，便于进行工业化生产和获得高纯度的酶制剂。同时微生物脂肪 酶多属分泌性的胞外酶，因而在酶的理论研究及实际生产中均有广泛应用并迅速发展。 目前绝大多数商业化脂肪酶都是微生物脂肪酶。 微生物脂肪酶属于彬p 水解酶超家蒯5 2 】，其催化活性主要依赖于s e r 、h i s 、a s p 这 3 个氨基酸组成的催化三联体s e r - a s p h i s 。s e r 残基通常位于一段保守序列 g l y x s e r - x g l y 中。杆菌属脂肪酶归类于一个不同的亚家族，其保守五肽的第一个g l y 通常都被a l a 替代形成a l a x s e r - x g l y l 5 3 】，因此杆菌属脂肪酶具有很好的耐热性和耐 碱性。丑s u b t i l i s 5 4 1 和短小芽孢杆菌( b a c i l l u s p u m i l u s ) 来源的脂肪酶在强碱的条件下( p h 9 5 ) 表现出极高的活力和稳定性，但热稳定性较差。而来源于嗜热脂肪芽孢杆菌 ( b a c i l l u ss t e a r o t h e r m o p h i l u s ) 1 5 5 j 、热链形芽孢杆菌( b a c i l l u st h e r m o c a t e n u l a t u s ) 1 5 6 j 、 高温烷烃芽孢杆菌( b a c i l l u st h e r m o l e o v o r a n s ) 【5 7 】的脂肪酶是耐热的，在温和的碱性条 件下( p h 7 9 5 ) 稳定性最高、活力最大【5 引。耐热和耐碱的脂肪酶因其巨大的应用潜力正逐 渐成为研究的热点。但是，由于脂肪酶的表达需要特殊的水不溶性底物作为诱导剂，从 而增加了脂肪酶纯化的难度 5 9 j ，因而杆菌属脂肪酶在生化性质及结构研究方面均发展缓 慢，还有待不断地探索研究。 1 4 课题研究意义和内容 1 4 1 本课题研究意义 丑s u b t i l & 作为基因工程受体菌，已表达了近2 0 0 种原核和真核生物来源的蛋白质基 因，并且无论是在生产上还是对基因组及物理图谱的研究上都处于中心位置，对它的研 究涉及各个方面。丑s u b t i l i s1 6 8 株更是其中研究最为广泛的野生型菌株之一。1 9 9 7 年， 5 江南大学硕士学位论文 k u n s tf 【删等人首次完成了其完整基因组序列测定，并将结果发表在( ( n a t u r e ) ) 杂志上。 如今，且s u b t i l i s1 6 8 株基因组信息可以从n c b i 上快速方便的搜索获得。因此，本研究 选取b s u b t i l i s1 6 8 株作为各基因来源的供体菌。 来源于杆菌属的脂肪酶以其良好的耐热性和耐碱性具有广泛的研究和应用价值。然 而在短时间内应用传统的诱变野生菌的方法筛选出具有某些特定性质的脂肪酶高产菌 株较为困难，而运用基因工程方法可高效快速的实现产量、酶活等方面的提高，满足实 际生产需要。分泌表达又是丑s u b t i l i s 工业应用的优势，因此在丑s u b t i l i s 中实现这一内 源酶的高效分泌表达具有很大的可行性。进一步为杆菌属脂肪酶结构、性质和应用的研 究提供了一个很好的平台。 b s u b t i l 括1 6 8 可以产生并分泌两种脂肪酶，一种为磷脂酶，即脂肪酶a ( 1 i p a s e a ， 简称l i p a ) ；另一种为酯酶，即脂肪酶b ( 1 i p a s eb ，简称l i p b ) 6 1 1 。1 9 9 2 年，d a r t o i s 2 j 等人成功克隆并测定了丑s u b t i l i s1 6 8 来源的t p a 基因序列，对其性质也做了一定研究。 t h o r s t e n 6 3 , 6 4 】等人对助b 基因及其蛋白质也进行了相关研究报道。众多研究表明，l i p a 对中等链长度的脂类底物展示了良好的水解特性。与此同时，l i p a 是已知的分子量最 小的脂肪酶之一，具有较广的碱性反应p h 范围，非常适用于去垢剂的生产、生物表面 活性剂的合成、制药工业等一些新型工业催化领域中【4 9 】。因而，本研究选取l i p a 作为 分泌研究对象，利用基因工程手段实现其高效分泌表达。 为实现分泌表达，最直接的方法就是将目的基因插入到宿主分泌蛋白质的表达元件 ( 启动子+ r b s ) 和分泌信号( 信号肽序列) 的后面。然而在进行外源蛋白质的分泌表达过程 中，信号肽的选择往往能明显地影响分泌表达水平，研究表明这与蛋白质本身的结构有 很大的关系。本研究在以脂肪酶的高效分泌表达作为内容的同时，探讨了若干信号肽对 其分泌表达效率的影响。尽管b s u b t i l i s1 6 8 来源的脂肪酶本身是一种可分泌蛋白，并具 有自身信号肽序列，研究不同信号肽对其分泌效率的影响可进一步揭示信号肽与目的蛋 白质结构之间的关系，并对具有相似结构的外源蛋白质进行分泌表达时提供信号肽选择 参考。 1 4 2 主要研究内容 ( 1 ) 基于丑s u b t i l i s1 6 8 来源的脂肪酶及其自身信号肽序列，构建一种通用的分泌 表达载体； ( 2 ) 以构建完好的分泌表达载体为基础，实现脂肪酶在丑s u b t i l & 中的高效分泌表 达； ( 3 ) 研究丑s u b t i l i s 中的其它4 种信号肽对脂肪酶分泌表达效率的影响。 6 2 材料与方法 2 材料与方法 2 1 实验材料 2 1 1 菌株与质粒 本论文所用菌株与质粒及其相关特性描述见表2 1 。 大肠杆菌d h 5 0 t 用于质粒的扩增和p c r 片段的克隆。枯草芽孢杆菌丑s u b t i l i s1 6 8 用作所需序列的供体菌，w b 6 0 0 用作目的基因表达的宿主菌。其余菌种和质粒由本研 究工作构建。 表2 - 1 茵株与质粒 t a b l e2 - 1s t r a i n sa n dp l a s m i d su s e di nt h i ss t u d y 4b g s c ：b a c i l l u sg e n e t i cs t o c kc e n t e r 2 1 2 工具酶与试剂 各种限制性内切酶、t 4d n a 连接酶、k l e n o wf r a g m e n t 酶、t a qd n a 聚合酶均购自 t a k a r a 公司；k o dp l u s 高保真d n a 聚合酶购自t o y o b o 公司；细菌基因组抽提试剂盒 购自上海s a n g o n 公司；d n a 琼脂糖凝胶电泳胶回收试剂盒购自北京索莱宝科技有限公 司；g e n e r u l e r1k bd n al a d d e r 相对分子质量标准、d p ni 酶购自f e r m e n t a s 公司；低分 子量蛋白质标准购自北京天根生化科技有限公司。 各种抗生素、琼脂糖、n ，n 一甲叉双丙烯酰胺、丙烯酰胺、t r i s 、t e m e d 、s d s 、 甘氨酸、e g t a 、溶菌酶等均购自上海s a n g o n 公司；胰蛋白胨、酵母膏为o x o i d 公司产 品；棕榈酸对硝基苯酯( p n p p ) 、阿拉伯胶和脱氧胆酸钠均购自s i g m a 公司；其余试剂 均为进口或国产分析纯。 2 1 3 培养基与培养条件 l b ( l u r i a - b e r t a n i ) 培养基( l ) ：1 0g 胰蛋白胨( t r y p t o n e ) ，5g 酵母膏( y e a s te x t r a ) ， 江南大学硕士学位论文 l ogn a c i ，1 2 1 0 c 灭菌2 0m i n ，用于大肠杆菌和枯草芽孢杆菌宿主菌的培养。 l b 琼脂培养基：l b 培养基中添加1 5g l 琼脂粉，用于菌落的划线分离、培养和筛 选。 中性红油脂培养基( l ) ：1 0g 胰蛋白胨，5g 牛肉膏，5g n a c l ，1 0g 香油或花生油， lm l1 6 中性红水溶液，1 5g 琼