（发酵工程专业论文）粪肠球菌制备乳酸氧化酶（lodⅡ）初探.pdf

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f a c t o r ，t h ef o l l o w i n gr e a c t i o n ： l o d l a c t a t e + 0 2 一p y r u v a t e + h 2 0 2 a c c o r d i n g t ot h ef o r m e rr e a c t i o n s o m e o n eh a v ep r o d u c e dc o m m e r c i a lr e a g e n tc a s e s a n d b i o s e n s o m t h e y c a nc a l c u l a t et h ec o n t e n to fl a c t a t eb y i n s p e c 血gt h ec o n t e n to fh 2 0 2 b e c a u s et h em e t h o di s c o n v e n i e n t , r a p i d a n dp r e c i s e i th a sb e e nw i d c l yu s e di nc l i n i c m e d i c i n ea n df e r m e n t a t i o ni n d u s t r yn o w i na d d i t i o n , t h i se n z y m ew o u l db ev e r yu s e f u lf o r t h ef o r m a t i o no f p y r u v a t e0 1 1ap r e p a r a t i v es c a l e t h ee n z y m eh a sb e e nf o u n di ns e v e r a l m i c r o b i a ls p e c i e s ，l i k es t r e p t o c o c c u s f a e c a l i s , m i c r o c c o c u sr a d i o d u r a n s , m i c r o c c o c u s 口“n e 淞 t h u sw ee , x p e c tt 0 p r o d u c t t h e e n z y m e t h i se x p e r i m e n t d i s c u s s e dt h e p r o b l e m o f e n t e r o c o c c u s f a e c a l i sp r o d u c i n g t h ee n z y m e t h em a i nc o n t e n t so ft h i st h e s i si n c l u d ea sf o l l o w s ：f i r s t , w es e tu dam e t h o dw h i c h c a nr a p i d l y i n s p e c tt h er e l a t i v e e n z y m ea c t i v i t y , a n di n s p e c t t h er e a l e n z y m ea c t i v i t y a c c o r d i n gt o t h ed e c r e a s i n gl a c t a t ec o n t e n t , a n df i n dt h e i rc o n n e c t i o nt h a t t h er e l a t i v e e n z y m ea c t i v i t y1 0 0e q u a lt o0 0 4 5 u r a g w ed i s c u s s e dt h ep r o b l e mo fs e l e c t i n gm i c r o b i a l s p e c i e sa n dt a k e re n t e r o c o c c u sf a e c a l i s a st h em i c r o b i a ls p e c i ew en e e d s e c o n d , w e d i s c u s s e dt h ea s p p e c t so f c u l t u r e s ，a n do p t i m i z e df e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n t h i r d ，w ei n t r o d u c e t h em e t h o do fp r o d u c t i n gl o d i li nd e t a i l ，a c c o r d i n gt ot h i s ，t h er e s u l t so ft h ee x p e r i m e n t s h o w st h a tt h eh i g hy i e l d ( 2 3 1 ) a n dt h eh i g hp u r i f i c a t i o nd e g r e e ( 3 0 9 ) ，b u tt h ee n z y m e a c t i v i t yp e rm i l l i g r a mi sv e r yl o w ( 1 o s u m g ) ，a n dw ed i s c u s s e ds o m ep r o p e r t i so ft h er a w e n z y m e f i n a l l y , w ei n d u c e dt h em i c r o b i a ls p e c i eb yu l t r a v i o l e tr a d i a t i o n ，a n d g o t am u t a n t i th a ss o m en e wo ：h l r a c t e r s c o m p a r e dw i t ht h ep r i m a r yb a c t e r i a ls r a m t h es i n g l ec e l l s v o l u m ei ss m a l l e r ，b u ti t sb r e e d i n g a b i l i t yi ss t r o n g e r t h a nt h e p r i m a r yb a c t e r i a ls t r a m ，a n d 4 i tc a nu s el a c t a t ea st h ei n d u c t e rt op r o d u c el o d i i f u r t h e r m o r e ，t h ee n z y m ea c t i v i t yo ft h e f e r m e n t a t i o nl i q u i di sh i g h e rt h a nb e f o r e , b u tt h ee n z y m e a c t i v i t yi ss t i l lv e r yl o wb yh p l c p u r i f i c a t i o n w e i n t r o d u c e d t h e p r o d u c i n g l o d i b y e n t e r o c o c c u s f a e c a l i s i n t h i s t h e s i s a n d l o d l lh a ss t i l lf 如l m co t h e r c h a 越c t c r sw eh a v en o tb e e nf o u n ds of a r t h e s h o r t a g eo f t h et h e s i si st h a tt h el o w a c t i v i t yc o m p a r e dw i t hl o d i ia b r o a d w e h o p e w cc o d d p r o d u c cl o d i ia n d c h a n g e t h es i t u a t i o no ft h e p r e s e n t k e y w o r d s ：l a c t a t eo x i d a s e ( l o d i i ) ；e n t e r o c o c c u s f a e c a l i s ；h 2 0 2 ；b i o s e n s o r 5 。l 。，。，_ 昌。型警窒薹鎏呈垄蓄二。，。，。，- * = s s t 综述 乳酸氧化酶是一种能催化乳酸氧化产生丙酮酸的生物催化剂。据报道能催化乳酸 氧化的酶有乳酸脱氢蘸、乳酸加单氧酶( l o di ) 、乳酸氧化酶( l o d i i ) 。乳酸氧 化酶( l o di i ) 能催化乳酸氧化产生丙酮酸和过氧化氢，它的催化反应如下： l - l a c t a t eo x i d a s e l - l a c t a t e ( 乳酸) + o ：p y r u v a t c ( 丙酮酸) + h 2 0 2 ( 1 ) 上世纪七、八十年代，国外一些公司据此配制了商品试剂盒，用于临床医学上 对乳酸的测定，生物传感器也正是利用这一反应原理，将乳酸氧化酶固定在渗透膜上， 通过快速检测过氧化氢的生成量，推算出乳酸的含量。许多微生物象粪链球菌 ( s t r e p t o c o c c u sf a e c a l i s ) 、耐辐射链球菌叫c 阳c c d c 淞r a d i o d u r a n s ) 、金黄色微球菌 ( m i c r o c c o c u s 口w e 淞1 等能够产生此酶，并在诱导物存在下，可提高酶产量，因此，通 过微生物发酵生产此酶成为可能。由于粪肠球菌( e n t e r o c o c c u s f a e c a l i s ) 与粪链球菌是 同一菌种的不同名称，且经试验产酶情况良好。本试验特用粪肠球菌f 代号1 1 3 1 ，来 自中国普通微生物菌种保藏管理中心1 做了制备l o d i i 的探讨。 l 、国内外研究状况 1 _ 1 、乳酸氧化酶的历史研究状况 乳酸氧化酶已有较长的研究历史，1 9 4 6 年美国哥伦比亚大学的b l a n c h a r d 等f l l 从 大鼠的肾脏中分离出的l 氨基酸氧化酶具有a 羟酸氧化酶的活性，它能催化乙醇酸和 乳酸氧化成乙醛酸和丙酮酸，从而揭开了乳酸氧化酶研究的序幕。 在5 0 年代，s u t t o n 等i 和y a m a m u r a 掣3 1 分别从草分支杆菌 眵妇蛔锄肋如i ) 和鸟分支杆菌( m y c o b a t e r i u ma v i o n ) 的细胞内发现了乳酸氧化酶，并认为其存在两种不 同形式：一种为乳酸加单氧酶，它催化的反应为： c h a c h o h c o o h + 0 2 + c h 3 c o o h + c 0 2 + h 2 0 ( 2 ) 一种为乳酸氧化酶，它催化的反应为： c h 3 c h o h c o o h + 1 2 0 2 _ _ _ _ + c h 3 c o c o o h + h 2 0 。 ( 3 ) 1 9 8 4 年c a n n o n 等1 4 】发现醋杆菌中的一菌株也能产生乳酸氧化酶，且不用添加任 6 。；。：，。，。型窖呈薹彗至窒垒圣，；。：，。；。= = 一 何的辅助因子。 1 9 9 0 年，m a t s u m o t o 等【5 】发现需氧酵母产生另一种乳酸氧化酶一l 一乳酸细胞色素c 或黄素细胞色素b 2 氧化还原酶，它能催化l 一乳酸转化为丙酮酸，但专一性不强。在 此期间，人们也发现片球菌( p e d i o c o c c u s ) 也能产生乳酸氧化酶，且催化产物为丙 酮酸与过氧化氢，非常适用于酶电极和试剂盒1 6 j 。 1 9 9 2 年，杨光礼等同用粪链球菌( s t r e p t o c o c c u s f a e c a l i s ) 做了提取乳酸氧化酶的 实践，其催化产物也为丙酮酸与过氧化氢。1 9 9 4 年，张元亮等吲用耻垢分支杆菌做 了提取乳酸氧化酶的实践，但他们提取的乳酸氧化酶是一加单氧酶，催化产物为乙酸、 二氧化碳和水。 1 9 9 6 年，德国的s z 匈卅在白地霉( g e o t r i c h u mc a n d i d i u m ) 细胞中发现了与l o d i 相类似的酶，该酶专一性地催化l - - 孚l 酸，酶的分子结构表现为八聚体形式，分子量 为3 4 5 3 5 0k d a ，单个亚基的分子量为4 3 6 5 5 - 4 7 0 0 0d a 。 x u 等 1 0 】人于1 9 9 6 年报道的爱德华氏菌( e d w a r d s i e l l a ) 能产乳酸氧化酶，其 催化产物为丙酮酸与水，此酶不需要辅助因子，其脱辅基形式需f m n 才能恢复活性， 是一种含f m n 的黄素蛋白，分子量为2 0 4k d a ，也为多亚基形式，等电点约在7 左 右。但由于此菌鉴定为接触酶阳性，因此不排除产生的过氧化氢被迅速分解的可能性。 此酶特异作用于d 乳酸。 2 0 0 2 年谷劲松等报道的腐生葡萄球菌( s t a p h y l o c o c c u ss a p r o p h y t i c u s ) 能产生 l o d i i ，但未做提纯的实践。 1 2 乳酸氧化酶的分子生物学研究状况 乳酸氧化酶的分子生物学研究是伴随着乳酸氧化酶的分离纯化进行的。谷劲松等 ”2 | 在其丙酮酸的酶法转化及乳酸氧化酶的研究进展中有较详尽的介绍。现总结 如下：1 9 8 9 年d u c a n 等从浅绿色气球菌似e r o c o c c u sv i r i d a n s ) 分离纯化出了一种乳酸氧 化酶，1 9 9 5 年m i n a g a w a 等通过随机突变从浅绿气球菌( a e r o c o c c u sv i r i d a n s ) 得到耐热 性的乳酸氧化酶，并将其基因克隆，测序，然后通过p c r 随机突变从产生的突变体中 得到一个突变的l o d ，其突变发生在它的氨基酸序列的2 1 2 位，使得天冬酰氨变成天 冬氨酸。d u c a n 等采用s a i i l b m o k 等( 1 9 8 9 ) 所描述的标准的重组d n a 技术，纯化出命名 j g ! = 目! = ! | 自自= 目= ! ! = = 窖呈薹鎏窑垄鎏；! = _ 晕l 自自! = ! ! ! 目目e _ _ 为口b r l o d 的质粒，并将p b r l o d 上的l o d 的结构基因，通过p c r ，分别作为5 和3 引物进行扩增。扩增的l o d 基因去磷酸化，平头钝化，连接至o p k k 2 2 3 - 3 的e c o r i 钝端 上，形成的重组体命名为p l o d 叭。l e t m g 等1 3 ) 采用稍加修薛j d u c a n 等( 1 9 8 9 ) 的方法， 用p l o d w t 转化的大肠杆菌纯化l o d ，研究结果表明y l o d 结构基因的核苷酸序列， 包括它的旁侧区。从最长的开放阅读框架推导而来的n 末端氨基酸序列符合于从转 化体纯化的l o d 的氨基酸序列。开放阅读框架的多肽的分子量为4 0 9 3 0d a ，利用凝胶 过滤计算的活性的l o d 的分子量为1 6 0 ，0 0 0d a ，从而支持d u c a n 等( 1 9 8 9 ) 的结果，他 们认为l o d 为一个具有相同的亚基的四聚体。l o d 的氨基酸序列类似于乙醇酸氧化 酶( g o x ) t 14 】和l i n d q v i s t ( 1 9 8 9 ) 所报道的三维结构。目前构建l o d 模式结构的工作也正 在进行之中【l ”。1 9 9 9 年，a g i b e l l o 等利用s o u t h e r nb l o t 杂交分析技术从s t r e p t o c o c c u s i n i a e 中也分离纯化到了乳酸氧化酶基因，命名为l c t o ，他们提取了细菌细胞内的 d n a ，然后用h i n d h i 进行酶切，杂交分析。结果表明，s t r e p t o c o c c u si n i a e 中的l c t o 和 a e r o c o c c u sv i r i d a n s 的乳酸氧化酶基因具有较大程度的同源性。g i b e u o 等从6 6 8 0 个氨 苄抗性的重组子中筛选到两个具有明显乳酸氧化酶活性的菌落，从这两个克隆中分 离的质粒相同，都含有4 k b 的d n a 外源片段，这个重组质粒被命名为p g r 0 0 2 。对 p g r 0 0 2 进行序列分析，并与g e n e b a n k q 6 a e r o c o c c u sv i r i d a n s 的l 碍l 酸氧化酶序列相 比较，发现具有很高的相似性( 2 0 0 个氨基酸残基完全一致，有3 4 个保守残基) ，同 黄素蛋白家族的其他酶序列比较也具有较大的同源性，与菠菜的乙醇酸氧化酶的同 源性达到5 9 ，并且f c r d 还含有黄素蛋白家族所特有的六个氨基酸保守残基。以上结 果表明，s t r e p t o c o c c u si n i a e 的乳酸氧化酶可以被认为是黄素蛋白酶家族中的一个新成 员as t r e p t o c o c c u si n i a e 的乳酸氧化酶在有氧条件下，可将乳酸代谢为丙酮酸和过氧化 氢，这和a e r o c o c c u sv i r i d a n s d f 的乳酸氧化酶也是一致的，毫无疑问这正是我们所要 制备的酶的类型，即l o di i 。 1 3l o d 及其相关酶的研究状况 能对乳酸起催化氧化作用的酶有乳酸脱氢酶、l o di 、l o d i i 。从上面的分子生 物学状况的叙述中，我们可知l o d i i 是一种黄素蛋白酶，作为黄素蛋白酶，e r a - 有 些明显的共性，根据共同的结构特征，它们似乎组成了一个蛋白家族。这类酶的特 点是：第一，催化反应为 r h 2 + 0 3 - r + h 2 0 2 ( 4 ) ， 。：，篁。，。，。：。尘垒彗茎雪垄耋圣。：。：，；。= 一 产物之一是过氧化氢。第二，需要黄素核苷酸( f m n 或f a d ) 为辅基，酶与黄素辅 基结合很紧 1 6 1 。属于这种类型的有葡萄糖氧化酶、谷氪酸氧化酶以及最近发现的长 链a 一羟酸氧化酶【1 7 j 。 乳酸脱氢酶需要n a d + 作为辅助因子，其催化如下反应： l a c t a t e + n a d + 一一p y n l v a t e + n a d h + h + ( 5 ) n a d + 与酶结合不紧密，只起受氢供氢的转氢作用，此类酶有磷酸丙糖脱氢酶、谷氨 酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶等。 而l o di 严格意义上应是氧合酶，它也需要黄素核苷酸( f m n 或f a d ) 为辅基， 但它与l o d i i 明显不同的是，它催化氧原子直接参入有机分子。其催化反应如下 l o di c h 3 c h o h c o o h + 0 2 - c h 3 c o o h + c 0 2 + h 2 0 ( 6 ) 催化的产物是乙酸，c 0 2 和h 2 0 。此类酶有胆固醇单氧合酶、邻氨基苯甲酸双氧合酶 等。 能催化乳酸氧化生成丙酮酸和过氧化氢的l o di i ，已经被提纯出来，s i g m a 等 几个少数公司自1 9 8 8 年以来就有商品化的l o d i i 出售，它的一些特性也已有报道。 通过描述该酶更多的特性，以及它与其它催化l 羟酸的氧化的酶的关系和快速反应 研究的结果，令人满意地解释了l o di 和l o d i i 在催化途径上的差别。二者均以分 子氧为第二个底物，只是催化的产物不同。二酶的特性的差别很大程度上归因于还原 态的酶和丙酮酸复合物这个中间物的不同的稳定性f 1 8 】。对此已有很多学者进行了研 究，结果表明：l o d i 催化反应时形成的中间复合体e f m n h 2 p y r u v a t e 很稳定，产生 的丙酮酸不与复合体分离，在氧的作用下，生成e f m n - p y r u v a t e h 2 0 2 中间体，丙酮 酸和过氧化氢的空间位置比较近，它们继续反应形成乙酸，c 0 2 和h 2 0 ：而l o d i i 形成的e f m n h 2 - p y r u v a t e 复合体不稳定，丙酮酸很快从复合体上分离下来，还原型 中间体e f m n h 2 被氧氧化，同时形成过氧化氢，因为酶反应时间比较短，在较短的 时间内和较低的浓度下，游离的过氧化氢对丙酮酸的氧化脱羧作用并不明显。所以说 l o d i 对丙酮酸的生产意义不大，因为在l o d i 催化的反应中形成了很稳定的中间复 合体e f m n - p y r u v a t e h 2 0 2 ，而乳酸脱氢酶需要n a d + 作为辅助因子，但n a d + 为小分 子化合物，很难固定，不易再生，而且价格昂贵，限制了乳酸脱氢酶在酶法生产丙酮 酸中的应用。因此，真正能够做到将乳酸转化为丙酮酸的酶只有l o d h 【l9 1 。 1 4 乳酸氧化酶催化机理的研究状况 l o d 是一种黄素蛋白酶，它基本符合此类氧化酶的特点，比如产物之一均为 h 2 0 2 ，但是它们怎样催化氧化“碳氢”底物的本质，至今仍然不太明了。l o d 由于具有稳定性，极好的光谱和荧光特性以及从l o d h 中得到的大量动力学数据， 因此成为研究此类酶机制的最佳选择刚。徐霞在其山东大学硕士论文细菌乳酸氧 化酶及丙酮酸酶法转化研究中就乳酸氧化酶催化机理的研究进展做了陈述，现总结 、如下： 对催化机理的研究，过去被认同度最大的要数由c o m f o r t h 提出的底物脱氢的所 谓负碳离子机制。所谓负碳离子机制是通过将底物a 氢看作一个质子形成过渡的负 碳离子，其氧化- 还原反应可能通过一个共价黄素加合物来加速进行【2 1 l 。然而，这个 负碳离子是一个高能量的类型，在水溶液里它只是以一种短暂的过渡态存在，从而使 目前的分析方法不能够直接显示其存在。这种负碳离子机制虽然在能量学上是可行 的，在化学上来说也很合理，但是它需要一个确定的实验检验方法进行证明。 现在人们发现，由此类酶催化的氧化还原反应，在被检测的底物中，羟乙酸有相 对小的转换数，它的使用将使动力学分析便捷并最终提供新机制瞄1 。对它的研究表 明酶将羟乙酸识别为一个前手性分子并与它形成两个黄素酶的非对应异构共价加合 物。底物羟乙酸的行为方式类似于消旋型底物，它被催化氧化，同时又是一个竞争性 抑制剂。另外，共价加合物确实直接从两个平行的米氏前手性复台物形成，其中一个 加合物位于催化反应途径中，或者至少与它在一个快速平衡中，而另一个加合物与催 化代谢中的抑制有关f 埘。 在研究此类酶与羟乙酸的反应过程中发现了几点重要的有关酶反应机制的东 西。首先，它显示羟乙酸是一种经过正常催化反应生成甲酸、c 0 2 和h 2 0 的底物。 另外也发生一个有限的解偶联的氧化脱羧途径，生成乙醛酸和h 2 0 2 。乙醛酸也是一 种底物，它遵从一个简单的氧化反应，生成草酸和h 2 0 2 。第二个要点是与羟乙酸的 反应包含与黄素共价加合物的形成，它能与还原型酶很轻易地区分，因为它们特异性 的强烈蓝色荧光在缅m 有最大吸收。牵连到催化荆中的黄素底物共价结合中间物 的最有力的证据来自p o r t e r 利用n 氨基酸氧化酶氧化人造底物( 预加工的稳定的负 碳离子) 的工作。在该实验里，通过伴随的酶反应的失活与氰化物反应得到5 氰甲 1 0 ：，：。：。当垒堑望譬耋耋。，。：。= 篁。s 詈篁兽 基1 ，5 一二氢黄素来捕获假定的黄素n ( 5 ) 一共价结合加合物 2 4 o 在底物是乙醇酸的氧化酶的催化反应中，迄今为止有两种未观察到物质a 根据 其光谱和化学特征，认为这些中间物可能是共价结合在还原态酶n ( 5 ) 位上的n ( 5 ) 乙醇加合物。它们形成的动力学，以及乙醇酸是含有极易被氧化的二个a 一氢的氧化 酶的唯一底物这个事实，暗示它们的不同的稳定性是由于它们的结构是非对映体。他 们利用选择性标记的乙醇酸，证明该假设是十分正确的。而且证明，这些加合物是从 乙醇酸形成的，因此也将为由乳酸氧化酶和其它类似的黄素酶催化的脱氢反应中负碳 离子的产生提供确切的证据。 1 5 乳酸氧化酶的现实状况 国外对此酶的研究较深入，s i g m a 等几个少数公司自1 9 8 8 年以来就有商品化的 乳酸氧化酶出售，且纯度及活性较好，达到3 8 u m g 乳酸氧化酶。但这方面公布的资 料较少。国内情况而言，尚未发现有国产商品化的乳酸氧化酶。国内研究机构对乳酸 氧化酶的研究也较少，就公布的资料看，且多停留在菌种的筛选、培养条件的优化等 上游技术的研究，提取及纯化工艺鲜有提及，产过氧化氢的乳酸氧化酶的提取就更少 了，只有陈统明、杨光礼等人用粪链球菌( s t r e p t o c o c c u s 盘e c a t i s ) 做了提取乳酸氧化 酶的实践，而谷劲松等报道的腐生葡萄球菌( s t r e p t o c o c c u s f a e c a l i s ) 能产生l o d i i ， 但未做提纯的实践。 2 、研究的目的意义 从以上叙述中我们可以看出，l o di i 是酶法生产丙酮酸最理想的酶，它的用途 主要有二：一是用于丙酮酸的生产，另一个用途是应用于传感器或酶试剂盒用来测定 乳酸的含量。另外，乳酸氧化酶还是一种重要的模式酶，在研究膜与蛋白质的相互关 系及氧化还原机理方面被广泛应用。对l o d i 、l o di i 、乳酸脱氢酶的不同作用机制 的研究，将会使我们对膜的运输及氧化还原过程中酶与呼吸链上个组分的关系有迸一 步的了解。1 2 6 2 1 用于生产丙酮酸 丙酮酸是一种代谢中间产物，在生物能量代谢中处于非常重要的地位，它也是 多种有用化合物的前体，许多氨基酸生物合成都需要丙酮酸为起始物质。 2 7 】因此， 。；。；。：。：童查薹蝥鐾鋈蚤。：篁。篁皇= = 一 它在化工、制药等方面有广泛用途。比如在制药工业中，以丙酮酸为底物，酶法合成 l 一色氨酸、l - 半胱氨酸、l - 亮氨酸等。在农用化学品上是合成乙烯系聚合物、氢化阿 托酸、谷物保护剂等多种农药的基本原料。在食品工业上可作为酸味添加剂，近年来 由于在减肥上有特效而受到西方消费者的青睐。在生化研究方面，用于伯醇及仲醇的 鉴定、转氨酶的测定，它还是脂肪族胺的显色剂。在细胞培养方面，它与乳酸组成抗 氧化剂，降低对细胞的伤害，是动物细胞培养的重要底物。在传感器应用上，与乳酸、 锂构成人工胰脏，作为体外传感器测定葡萄糖的含量。 28 】随着丙酮酸的应用越来越 广泛，需求量越来越大，丙酮酸产量也应相应增加，但实际情况是，它在世界上的生 产规模并没有有效的增加，1 9 9 1 年日本的武芷和东丽两公司的生产能力仅有6 5 0 吨， 我国除少量试剂级丙酮酸经化学合成生产外，绝大部分从日本进口，这就造成了目前 丙酮酸的价格非常昂贵，因此，丙酮酸的生产的研究成为目前化工和生物技术领域的 大热点。 丙酮酸的生产方法主要有三种：化学合成法，直接发酵法，酶转化法。目前，丙 酮酸的生产多采用发酵法，一是直接发酵法，即通过微生物的直接利用碳源积累丙酮 酸，二是休止细胞法，即微生物先生长，再转化底物为丙酮酸3 0 l 。发酵法制取丙酮 酸已有近十年的历史，它的优点是成本低廉，可以大规模应用于工业生产，但往往转 化率较低，这是由丙酮酸所处的代谢地位决定的，丙酮酸在糖代谢中处于最活跃的 中心节点，在细胞中很容易转化为其他化合物，使阻断丙酮酸的去路有些困难，因 此很难累积，而且，丙酮酸作为发酵产物混合物的一种成分，浓度往往很低，从复杂 的发酵液中分离提取丙酮酸，一般难以进行，且费用也较昂贵3 1j 。我国对直接发酵 法生产丙酮酸的研究起步较晚，只有无锡轻工业学院一直从事这方面的工作，根据 2 0 0 1 年资料，他们在5 m 3 规模发酵罐中试中，发酵6 0 h 丙酮酸产量达到5 5 8 卵，产 率( 糖酸转化率) 达到o 5 5 3g ，但是仍然没有产业化的报道。正是由于发酵法生产 丙酮酸存在着许多缺陷，这就使人们想到通过固定化酶直接转化底物生成丙酮酸。这 其中最合适的底物就是乳酸，乳酸脱氢酶和乳酸氧化酶都可转化乳酸一步生成丙酮 酸，而且乳酸和丙酮酸的价格相差很大( 约2 0 倍) ，这就使乳酸酶法生产丙酮酸成为 最具活力的研究热点之一。常规的酶法转化丙酮酸的生产是通过乳酸脱氢酶催化乳酸 氧化来实现的，但此酶需要n a d + n a d p h + 作为电子受体，n a d * n a d p h + 价格昂贵 且不易被重复利用，使乳酸脱氢酶不能广泛和大规模使用【3 2 】，乳酸氧化酶则克服了 。 。盲；。，：些耋窒翟彗鍪蚤。；。= = = = 寡s = 一 这一缺点，它不需要其它辅助因子即能催化乳酸氧化为丙酮酸，从而成为制备丙酮酸 理想的酶p ”。 2 2 用于测定乳酸含量 在发酵工业中，乳酸发酵仅次于酒精发酵，处于非常重要的地位删。发酵生产 风味乳制品过程中，对产物一乳酸的检测是必不可少的。另外，在谷氨酸发酵、啤 酒发酵工业，测定乳酸含量也具有重要意义，它从侧面可反映生产水平的高低。 乳酸是体内糖酵解的最终产物，当体内氧化不足时，过量的n 一划d h 积聚，机体 启动了糖酵解途径，乳酸即随之产生，因此，测定盘乳酸含量可评价运动员的无氧代 谢能力，这不仅可以了解运动员的训练强度高低，还有利于充分挖掘运动员的潜能。 在临床上，乳酸性酸中毒是一种常见的代谢性酸中毒，如呼吸系统疾病、糖尿病酮血 症可引起血中乳酸浓度增高，细菌性脑膜炎、脑外伤可引起脑脊液中乳酸浓度增高， 因此，测定乳酸含量对早期诊断和处理乳酸性酸中毒具有重要的临床意义。 3 5 】其次， 由于乳酸与冠心病、肺炎、癫痫发作、糖尿病休克等疾病有重要的关系，血液中乳酸 含量的检测也成为必需。在临床上对于血气分析中无法解释的代谢性酸中毒，即缺乏 明显的酸中毒原因( 如肾衰、高血糖酮中毒或败血症) 时，若阴离子升高，提示医生 有必要为病人检测乳酸，若乳酸水平增高表明此时的代谢性酸中毒可能是乳酸中毒。 还有，血液中乳酸的浓度取决于肌肉细胞与红细胞的产生率和肝细胞的代谢率， 过量生成或利用不足是造成乳酸中毒的主要原因。如：组织缺氧、严重脱水、糖尿病 酮中毒、恶性肿瘤、败血症等使氧的传送受阻或耗氧量增加的病理状态都可使乳酸水 平升高。与剧烈活动有关的组织缺氧也会使乳酸升高，可导致轻微的乳酸中毒，但运 动一停止就会消失，还可伴随肌肉疼痛和局部痉挛。若组织缺氧是由呼吸或低灌注引 起的( 如休克或循环衰竭) 即可危及生命。乳酸血症的严重程度可以提示潜在疾病的 严重性，血乳酸 1 0 5 m m o l l 的病人，其存活率( 3 0 ) i ：蜉- l 酸水平较低病人的存活 率( 6 5 ) 要低。 既然乳酸的影响如此之大，那么找到一种快速测量乳酸的方法就势在必行。过去 测定乳酸含量的方法很多，大多用液相色谱法、分光光度法，随着酶法测定乳酸的兴 起，它的方便快捷准确的优势便体现出来，现在它已在医学、生物化工、食品工业、 生态环境监测等领域得到了相对成熟的应用。以前的酶法测定多用乳酸脱氢酶进行检 测乳酸含量，随着l o d i i 纯品的问世，乳酸氧化酶系统测定方法的建立，这种方法不 但显得费时费力，还需要对样品进行预处理，检测结果不很精确的毛病便暴露出来。 1 9 7 8 年美畸提出乳酸氧化酶系统测定法，1 9 8 5 年浅见和子又对其进行了改进，协和 公司据此配制了商品试剂盒，l o d i i 的应用便显现出来，它现在已广泛应用于临床酶 诊断试剂盒或生物传感器中，效果非常理想。 山东省科学院生物研究所就是一家乳酸生物传感器研制单位，在1 9 9 0 年它们研制 的乳酸生物传感分析仪，为我国运动员在1 9 9 0 年北京亚运会上取得优异成绩立下汗 马功劳。目前他们研制的s b a - 7 0 型仪器能连续快速测定十几个血样，并己通过成果 认证，这将大大提高医院等单位的检测效率，处理大量的检测血样。但是，不论使用 临床酶诊断试剂盒检测乳酸，还是用生物传感器酶电极法检测乳酸，较高纯度的乳酸 氧化酶是关键所在。 2 3 、经济效益及现实意义 纵观进口l o d i i 的状况，其产量在大大提高的同时，价格也在节节攀升，近几 年l o d i i 的价格情况见下表： 表1 进口乳酸氧化酶的价格走势 从上表中明确看出进口乳酸氧化酶产品的价格，从1 9 8 8 年的每个包装( 1 0 0 u ) 4 1 美元升至2 0 0 2 年的1 1 3 美元，十四年间涨了近三倍，产量长价格升，由于他们生产 规模的扩大，其生产成本明显降低，显而易见，其利润明显激增，经济效益可见一斑。 而遍观我国的现状，目前市面上应用的都是s i g m a 公司的产品，国内尚无商品化的 乳酸氧化酶销售。因此，生产乳酸氧化酶就其现实性而言，还将打破进口酶的垄断， 结束此酶只有进口的历史。 1 4 ；，。，。；。：。尘窒坌羹翟鎏垄坌二：，。；。；= = 。= e 一 若通过本实验生产的乳酸氧化酶若在纯度及酶活方面与进口酶比较差异不大，那 么我们就有理由相信，我们完全有能力自己生产乳酸氧化酶，从而生产出商品化的乳 酸氧化酶，打破乳酸氧化酶只有依赖进口的历史，另外随着生物传感器及酶试剂盒的 快速发展，尤其在医学上可用于临床测定乳酸以判断糖尿病酸中毒、恶性肿瘤、败血 症等病症的病理状态，乳酸氧化酶的用量也将大大增长，因此，乳酸氧化酶的生产意 义也会逐步加大。 3 、实验背景及创新性 本论文的所有工作是在山东省科学院生物研究所进行的，它是国内首家生物传感 器研究开发实用化取得成功的单位。研制的s b a 系列生物传感器得到了较广泛的应 用，包括：在中国体育界普遍用于监控运动员有氧呼吸能力的乳酸传感器，列入中国 国家标准：“食品中葡萄糖分析”的葡萄糖传感器，在中国的谷氨酸行业中已成一条 龙配套普及用于监控生产过程的谷氨酸、乳酸和葡萄糖传感器，和酒精、蔗糖、尿素、 次黄嘌呤、肌苷、糖化酶、乳糖等生物传感器。这些传感器结合样品处理手段，可以 衍生出数十种物质的生物化学测定分析方法，可以广泛地应用于安全预警、临床诊断 监护、食品分析、工业控制和环境状态的监测。从九十年代至今，生物传感分析仪品 种不断得到更新换代，生物传感器酶膜获得了国家发明奖，并建立了相关的国家标准。 本实验测定乳酸、葡萄糖及检测l o di i 在发酵过程中的相对酶活均使用了s b a - 4 0 c 型双电极生物传感分析仪，本机1 9 9 2 年研制成功，用于谷氨酸和葡萄糖快速分析， 列为1 9 9 3 年国家级新产品并获得1 9 9 5 年山东省科技进步奖，被誉为谷氨酸发酵生 产中的眼睛，己普及应用于中国的味精工厂。 由于生物传感器需求的上升，卖出量的增加，势必与之相配套的酶膜的数量迅速 上升，从国外进口的酶量也就相应大增。由于进口酶l o d i i 上涨过快，因此制备此酶 已属当务之急。本所在制各葡萄糖氧化酶方面已经积累了很多经验，用液相色谱仪对 此酶进行了分离纯化，并且已取得成功，并成功运用到酶膜上，节约了许多外汇。我 们在此基础上做了制备l o d i i 的实践。本实验的创新之处主要在于用s b a 一4 0 c 型双电 极生物传感分析仪检测l o d i i 在发酵过程中的相对酶活，并创新用消耗底物( 乳酸) 法测定了l o d i i 的绝对酶活，并找出它们之间的线性关系，其次用液相色谱法对l o d i i 做了分离纯化。 第一章酶活性测定及其它测定方法的建立 引言 试验的结果是建立在好的测定方法之上的，有好的测定方法试验结果才会真实可 靠，才会起到事半功倍的效果。对于酶的制备来说，活性的测定贯穿整个实验的始终， 测定的好坏直接影响到结果的好坏。一直以来，酶活的测定以比色法最为常见，较为 费时，且不易随时检测到发酵过程中的酶活状况。为此，我们找到了几种测定酶活的 方式，对比了他们的优劣，确定了快速测定酶活的方法，即直接用生物传感分析仪测 相对酶活，并与测定绝对酶活的方法相对照，并找寻它们之间的关系 1 1 仪器与试剂 1 1 1 实验仪器及器材 u v 1 2 0 0 紫外分光光度计 日立牌高速冷冻离心机2 0 p r 5 2 0 型 y 9 9 2 d 超声波细胞破碎仪 y ) 6 0 2 型蒸汽消毒器 s b a - 4 0 c 型生物传感分析仪 4 5 2 0 型摇床 电热恒温培养箱 超净工作台 a e 1 0 0 电子天平 t n 1 0 0 b 型托盘扭力天平 干燥冷冻机 艾科浦纯水机 p h 酸度计 制备型液相色谱a k t af p l c l 1 2 主要试剂 丙酮酸钠 1 6 日本岛津 产白日本 宁波新芝科器研究