（应用化学专业论文）有机质谱技术在药物分析中的应用研究.pdf

中国科学技术大学博士学位论文摘要 摘要 质谱不仅能够提供大量可靠的样品结构信息和较高的检测灵敏度，也具有快 速定性和定量的能力。复杂样品的快速分析一直是质谱学家追求的目标之一，是 质谱技术发展的一个重要趋势。基于有机质谱快速、灵敏、准确以及能与其它检 测手段联合应用于物质分析等特点，其应用范畴得到不断拓展。本研究应用离子 阱质谱和三重四极杆质谱，结合高效液相色谱分离分析技术，探索、建立和发展 了四种不同类型药物的分离检测技术和方法，主要包括： l 、基于液相色谱离子阱质谱联用分析技术，建立了人血浆中阿奇霉素 的浓度测定方法。血浆样品的前处理采取简单的甲醇直接沉淀的方法，血浆中杂 质峰不干扰样品的测定。线性范围为4 6 9 6 0 0 叫m l ，回收率为8 7 4 1 9 9 9 7 。 该方法已成功的应用于2 0 个健康志愿者口服5 0 0 m g 阿奇霉素分散片的生物等效 性研究。 2 、建立了一种快速灵敏的液相色谱串联质谱联用检测人血浆中的曲克 芦丁的方法，血浆样品的前处理采取高氯酸直接沉淀的方法，血浆中杂质峰不干 扰样品的测定。由于曲克芦丁具有较强的极性，因此采用极性非常强的f u s i o n i 冲 柱进行色谱分离。定量下限为3 1 2 5 p g m l ，日内、日间r s d 均不大于1 2 2 8 ， 日内、日间i 也在士1 2 8 之内。应用该法成功的测定了1 8 个健康志愿者口服 3 0 0 m g 曲克芦丁滴丸的生物等效性研究的血浆样品。 3 、采用液相色谱串联质谱联用技术进行了人血浆中的左炔诺孕酮的检 测方法研究，血浆样品的前处理采取乙酸乙酯提取的方法。实验表明，左炔诺孕 酮在弱极性的c 1 8 柱具有非常强的保留；用乙腈作流动相能显著降低背景噪声。 线性范围为o 6 2 5 4 0 n g m l ，回收率为8 4 7 7 9 0 8 8 。该方法已成功的应用于 2 0 个健康女性志愿者口服1 5 m g 左炔诺孕酮片的生物等效性研究。 4 、建立了口服给药后人血浆中的氢氯噻嗪和缬沙坦的快速液相色谱串 联质谱检测方法。采用同时检测，大大节约了成本，节省了时间。该方法准确、 灵敏，已成功的应用于2 0 个健康志愿者口服复方缬沙坦氢氯噻嗪片的生物等效 性研究。 i i 中国科学技术大学博士学位论文摘要 关键词：高效液相色谱，质谱，阿奇霉素，曲克芦丁，左炔诺孕酮，氢氯噻嗪， 缬沙坦，生物等效性 i i i a b s t r a c t m a s ss p e c t r o m e 缸y ( m s ) c o u l dn o to n l yp r o v i d eh i 曲s e n s i t i v i t ) ra i l d r e l i a b l e d e t e c t i o nf o rv 撕o u ss 锄p l e s ，b u ta l s oo 位rm u c hi n f o m a t i o na b o u t t h es t i u c t u r ea 1 1 d i d e n t i t yo fa n a l y t e s r 印i da j l a l y s i so fc o m p l i c a t e ds a r n p l ei sa l w a y so n eo ft h eg o a l s o fm a s ss p e c t r o m e t r i cs c i e n t i s t sa i l da i li n l p o r t 2 m td e v e l o p m e mt r e n d e n c yo fm a s s s p e c t r o m e t r i ct e c l m i q u e b a s e do ni t sr a p i d ，s e n s i t i v e ，a c c u r a _ t e c h a r a c t e ra i l de a s y c o u p l i n g w i t ho m e r锄a 1 ) 吨i c a lt e c h n i q u e ， t h ed e v e l o p m e n to fo r g a n i cm a s s s p e c t r o m e t 搿s h o w st h ea d v 锄a g e si n 恤w i d e l ya p p l i e da r e a i nt h ep r e s e ms t u d y ， s e v e r a la p p l i c a t i o n s 、e r ed e v e l o p e da n dv 甜i i i a t e df o rt h ed e t e i m i n a t i o n o ff o u r d i f f e r e n td m gi nh u m a np l a s m ab yi o nt r 印m a s ss p e c t r o m e t e ro rt r i 。q u a d r u p o l e t a 】时e mm a s ss p e c t r o m e t e rc o u p l e dw i t hh i 曲一p e d o m a i l c el i q u i dc h r o m a t o 黟a p h y 1 b a s e do nl c l st e c h i l i q u e ，as i m p l ea n dr 印i dm e t h o df o r t h eq u a l l t i f i c a t i o n o fa z i t h r o l t l y c i ni nh u m a np l a s m ai sd e v e l o p e d h e r e i nas i m p l es a n l p l ep r e p a r a t i o n m e m o do fp r o t e i np r e c i p i t a t i o nw i t hm e t h a i l o lw a se m p l o y e d t h ec a l i b r a t i o nc u r v e s w e r el i n e a ro v e rt h ec o n c e n t r a t i o nr a n g e4 6 9 - 6 0 0 n g 加la i l dt h er e c o v e r yr a n g e d 行o m8 7 4lt o9 9 9 7 f o rt h ea 1 1 a l y t e t h i sm e t h o dw a s 印p l i e dt oab i o e q u i v a l e n c e s t u d ya r e ra d m i n i s t r a t i o no f5 0 0 m ga z i t h r o i n y c i n t o2 0h e a l t h yv o l u n t e e r s 2 as i m p l ea n ds e n s i t i v el c m s m sm e t h o df o r t h eq u 枷i 丘c a t i o no f t r o x e r u t i n i nh u m a np l a s m ai sd e v e l o p e da 1 1 l dv a l i d a t e d p e r c h l o r i ca c i dw 弱e m p l o y e df o r p r o t e i np r e c i p i t a t i o n d u et ot l l eh i 曲p o l 撕t y ，t r o x e m t i nc o u l d o n l ya c h i e v es u i 切b l e r e t e n t i o no nap h e n o m e n e xs y n e 唱if u s i o nr pc o l u n m t h el o w e r l i m i to f q 咖t i f i c a t i o nw a s31 2 5 p 咖l f o rt h ea i l a l y t e ，p r e c i s i o nb e l o wl2 2 8 a n dr e l a t i v e e m ) rw a sr l o tm o r et h a n 士1 2 8 1 1 1 i sm e t h o d 、a sa p p l i e dt oab i o e q u i v a l e n c es t u d y m e ra i la d m i n i s t r a - t i o no f3 0 0 m gt r o x e m t i nt 018h e a l t h yv 0 1 u n t e e r s 3 as e n s i t i v el c m s m sm e t h o df o rt h ed e t e m l i n a t i o no fl e v o n o 玛e s t l - e li n h 啪a np l a s m au s i n gl i q u i d 1 i q u i de x t r a c t i o n ( l l e ) w i t he t h y la c e t a t e ，、v a sd e v e l o p e d i tw a sf o u l l dm a t1 e v e n o 玛e s t r e ly i e l d e ds t r o n gr e t e m i o no nc 1 8c o l u r n n ，a n dh i g h e r s i g n a l t o - n o i s er a t i ow a so b s e n ，e du s i n ga c e t o n i t r i l ea st h em o b i l ep h a s et i mu s i n g m e t h a n o la st h em o b i l ep h a s e t h ep r o p o s e dm e t h o dw a sv a l i d a t e d o v e rt h e 中国科学技术大学博士学位论文 a b s t r a c t c o n c e n t r “o nr a n g e0 6 2 5 _ 4 0 n 咖la 1 1 d 印p l i e ds u c c e s s 如l l yt ot 1 1 ea 1 1 a l y s e so f s 锄p l e so b t a i n e df r o mab i o e q u i v a l e n c es t u d y 4 s i m u l t a n e o u sd e t e r i i l i n a t i o no fh y d r o c h l o r o t h i 砸d ea n dv a l s 砸a j li nh u m a n p l a s m ab yl c - m s m sm e t h o dw a sd e s c r i b e d ，v m i c hw a sp r o v e dt ob ee c o n o m i c a l a 1 1 de 街c i e n t t h em e t h o d 、a sf o u n dt ob es u i t a b l ef o ra p p l i c a t i o nt oab i o e q u i v a l e n c e s t u d y a f t e ro r a la d m i n i s t r a t i o no f d i s p e r s i b l e t a b l e t c o n t a i n i n g 12 5 m g h y d r o c h l o r o t h i a z i d ea n d8 0 m gv a l s a n a l lt o2 0h e a l t h yv o l u n t e e r s k e y w o r d s ： h p l c ， m a s ss p e c t r o m e t r y ， a z i t h r o m y c i n ，t r o x e m t i n ，l e v o n o 唱e s t r e l ， h y d r o c h l o r o m i a z i d e ，v a l s a n a n ，b i o e q u i v a l e n c e v 中国科学技术大学学位论文原创性和授权使用声明 本人声明所呈交的学位论文，是本人在导师指导下进行研究工作 所取得的成果。除已特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含任 何他人已经发表或撰写过的研究成果。与我一同工作的同志对本研究 所做的贡献均已在论文中作了明确的说明。 本人授权中国科学技术大学拥有学位论文的部分使用权，即：学 校有权按有关规定向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子 版，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文编入有关数据库进行检 索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 作者签名：趁阻 ) 0 0 眸6 月2 日 中国科学技术大学博士学位论文 第一章 第一章文献综述 1引言 自1 9 1 2 年第一台质谱仪雏形诞生以来，质谱( m a s ss p e c t r o m e t m s ) 技术的 发展已经历了近百年的历史。在这期间，先后六次有1 0 位从事质谱研究的科学 家荣获诺贝尔奖，这反映了质谱技术对科学发展的重要贡献且备受关注。 早在1 9 世纪末( 1 8 8 6 年) ，g o l d s t e i n 【l 】在低压放电试验中观察到正电荷粒子， 随后w w e i n 【2 】发现正电荷粒子束在磁场中发生偏转，这些观察结果为质谱的诞 生提供了准备。1 9 0 6 年，英国学者j j t h o m s o n 开展了正电荷粒子束的物理学研 究，从而发明了质谱。他因此被誉为现代质谱学之父，并获得了1 9 0 6 年的诺贝 尔物理学奖。到2 0 世纪2 0 年代，质谱逐渐成为一种分析手段，被化学家采用。 之后相当长的时期内，质谱工作者的注意力都集中在用质谱分析、分离同位素的 工作。 将质谱应用在有机化学方面的先驱者之一是r c o n r a d 【3 j ，他发表了许多有 机化合物的质谱图。2 0 世纪4 0 年代以来，质谱就被广泛地应用于有机化学中分 子结构的确定以及有机物离子的裂解机理探讨。质谱与核磁、红外、紫外被公认 为是有机结构鉴定的四大工具。与其他谱相比，质谱有两个突出的优点【4 】： 第一，质谱的灵敏度非常高，通常只需微克级甚至更少的样品便可得到一张 满意的质谱图； 第二，质谱是唯一一种可以确定分子式的方法，这对推测结构至关重要。 2 0 世纪8 0 年代发现了新的软电离技术，能用于分析高极性、难挥发和热不 稳定样品，使质谱分析研究跨入生物大分子研究领域，成为蛋白质组学及代谢组 学的主要研究手段。如今生物质谱已成为现代科学前沿的热点之一【5 一。 在2 0 世纪后期，无机质谱也得到了长足的发展和更广泛的应用。 目前，质谱已广泛用于原子能、有机合成、石油化工、地质、生物化学、医 药、天然产物、环境检测、食品科学、法医学、刑侦科学等十分宽广的领域中， 特别是气相色谱和液相色谱与质谱的联用，大大拓宽了质谱的应用范围，为有机 混合物的分离、鉴定提供了快速有效的分析手段。 中国科学技术大学博士学位论文第一章 2 有机质谱仪器 2 1 质谱仪的组成 质谱仪是机械、电子、真空、计算机及电子离子光学等多方面技术的综合， 主要由进样系统、真空系统、离子源、质量分析器、检测器以及数据处理系统组 成。质谱仪的核心是离子源和分析器，其他的部分一般根据离子源和分析器相应 地来配备。 2 2 质谱仪的主要指标 2 2 1 质量范围 质量范围指质谱仪所检测的离子的质荷比范围，对单电荷离子而言，也就是 离子的质量范围。 2 2 2 分辨率 分辨率( r ) 是质谱性能的一个重要指标，它表示仪器对质荷比相邻的两质谱 峰的分辨能力。 仪器的分辨率通常表示为：r = m m 式中：m 为可分辨的两个峰的平均质量，m 为可分辨的两个峰的质量差。 2 2 3 灵敏度 灵敏度表示仪器出峰的强度与所用样品量之间的关系，即在一定的分辨率情 况下，产生一定信噪比所需的样品量。 2 3 离子源 离子源是质谱仪的核心部分之一，根据电离方式的不同，将获得不同结果的 质谱图。电子轰击电离源属于硬电离源，而软电离源则包括化学电离源、快原子 轰击电离源、电喷雾电离源、大气压化学电离源、基质辅助激光解吸电离源等。 2 3 1电子轰击电离( e i ) 源 电子轰击电离( e l e c t r o ni m p a c ti o n i z a t i o n ) 源是应用最普遍、发展最成熟的电 2 中国科学技术大学博i ：学位论文 第一章 离源，它是在1 9 1 1 年首先由c f k n i p p 设计的。 在电子轰击电离中，样品分子m 受到7 0 e v 能量的电子束轰击后，失去一个 电子，生成分子离子： m + e 一广+ 2 e 电子在将样品分子离子化的同时，还将大量能量转移给分子离子。分子离子 进一步碎裂，产生不同质荷比的碎片离子，得到丰富的“指纹 信息，这对推测 结构十分有用。 2 3 2 化学电离( c i ) 源 化学电离( c h e m i c a ii o n i z a t i o r l ) 通过引入大量的反应气体，使样品分子与电离 电子不直接作用。反应气体分子被电子轰击电离后，因离子分子反应产生一 些活性反应离子，这些离子再与样品分子发生离子分子反应，使样品分子实 现电离【7 1 。 m u n s o n 和f i e l d 【8 1 于1 9 6 6 年正式提出化学电离技术，并根据实验中观察到 非经典的c h 5 + 离子，推导出离子分子反应如下： c h 4 + e _ c h ，+ 2 e c h 4 巾+ c h 4 - c h 5 十+ c h 3 c h 4 + 噜_ c h 3 + + h c h 3 + + c h 4 一c 2 h 5 + + h 2 m + c h 5 + 一m 矿+ c h 4 m + c 2 h 5 + _ m r + c 2 h 4 化学电离使用的反应气体通常是甲烷、丙烷、氨气等小分子，可以是多种不 同的单一气体，也可以是混合反应气体。与电子轰击电离相比，样品分子电离后 势能相对较低，碎裂反应减少。选择不同的反应气体可以改变电离反应的热效应， 这对一些热不稳定样品的电离很有意义。 e i 源和c i 源都是热源，只适用于易挥发，受热不分解的样品。 2 3 3 快原子轰击( f a b ) 源 1 9 8 1 年，英国科学家m b 抽e r 【9 1 发明快原子轰击( f a s ta t o mb o m b a r d m e n t ) 中国科学技术大学博上学位论文 第一章 电离技术，引入了快速和方便的实验方法，进而可以分析极性化合物和热不稳定 化合物，包括像肽和小蛋白这样的生化样品。 快原子轰击离子源如图1 1 所示。高动能的初级原子束由原子枪发射出来， 打击表面上涂布着样品的金属靶，把大量能量传递给样品外层表面的分子；电离 产生的样品离子被引入质量分析器中进行分析。 图1 1f a b 原理示意图 f 培1 一l s c h e m eo f f a b f a b 离子源特别适用于分析极性大的化合物，广泛用于生物大分子、酸性 染料、络合物以及热不稳定的难挥发的有机化合物的分析。 2 3 4 电喷雾电离( e s i ) 源 电喷雾电离( e l e c t r o s p r a yi o n i z a t i o n ) 是一种使用强静电场的电离技术【1 0 ，1 1 1 ， 其原理如图1 2 所示。 电喷雾 分析物 喷嘴 带电雾漓 离予蒸发 ；mm芷 珊ocmc丁芯删#啊一脚忙 叫ocq可c3d哪一_啊一哪比 中国科学技术大学博士学位论文 第二章 溶后进样。这个方法有两个缺点：一是固相萃取成本太高；二是萃取步骤较为繁 琐，不适合大批量做样。 试验过程中发现，采用沉淀法处理血浆样品，灵敏度也能达到要求。与文献 报道的方法相比，沉淀法简单、快捷、经济，更适宜高通量生物样品分析。将甲 醇和乙腈两种常用沉淀试剂进行了试验对比，结果表明两种沉淀剂处理后，线性 关系和定量下限都无明显差异。甲醇相比之下成本低，毒性小，所以本实验选甲 醇为沉淀剂。 3 4 方法学确证【2 0 ，2 1 】 3 4 1 特异性 分别取6 名受试者的空白血浆1 0 0 “l ，按“血浆样品处理 项下操作( 不加 内标溶液) ，进样1 0 止，得色谱图2 - 6 - a ；将4 6 9 n g m l 的阿奇霉素标准样品按 “血浆样品处理”项下操作，得色谱图2 6 b ；取某受试者口服给药4 h 后的血浆 样品，依同法操作，得色谱图2 6 c 。考察空白血浆中的内源性物质是否对检测 对象产生干扰。 0 d0 51d1 52 d2 53 03 54 04 5 t j m e ( m i n ) 3 9 ：b 怕 0 柏 扣 0 8u譬口un定竽重叱 中国科学技术犬学博上学位论文第二章 1 3 8 2 8 0 0 o0 51d1 52 02 53 03 54 d4 5 t i m e ( m i n ) 2 8 1 0 00 51 0152 02 53 d3 54 d4 5 t i m e ( m i n ) 图2 6阿奇霉素方法学特异性图谱：( a ) 空白血浆；( b ) 空白血浆加入阿奇霉素 ( 4 6 9 n g m l ) 和内标红霉素( 1 5 0 n 咖l ) ；( c ) 某受试者口服5 0 0 m g 阿奇霉素4 h 后的血浆样品。 柏 加 0 加 0 小石c叮廿cjn司o一苜一叱 0 0 小巧c哂dc3n冠m；一葛一叱 中国科学技术大学博士学位论文 第二章 f i g 2 6r e p r e s e n t a t i v es i mc h r o m a t o g r a i n s 点”a z i t h r o m y c i n ( i ) a n de r y t l 瑚m y c i n ( i s ，i i ) i nh 啪a np l a s m as 锄p l e s ：( a ) b l a n kp l a s m a ；( b ) p l a s m as 锄p l es p i k e dw i m a z i t h r o m y c i n ( 4 6 9 n m l ) a n dt h ei s ( 15 0 n 咖l ) ，l l o q ；( c ) av 0 1 u n t e e rp l a s m a s 锄p l e4 h 撕e ra no r a ld o s eo f5 0 0 m ga z i t h r o m y c i n 图2 6 表明，阿奇霉素和内标红霉素的保留时间分别为3 9 0 和2 8 0 m i n 左右， 而各自的内源物的峰分别为1 3 8 和1 4 9 m i n 左右，空白血浆中的内源性物质不干扰 阿奇霉素和内标红霉素的测定。 3 4 2 线性范围和定量下限 将阿奇霉素血浆浓度为4 6 9 ，9 3 8 ，1 8 7 5 ，3 7 5 ，7 5 ，1 5 0 ，3 0 0 和6 0 0 n m l 的样品，按“血浆样品处理 项下操作，每一浓度进行三样本分析，进样1 0 “l ， 记录色谱图。以阿奇霉素的浓度为横坐标，阿奇霉素与内标红霉素的峰面积比值 为纵坐标，用加权法( w _ 1 詹) 进行回归运算，求得的直线回归方程即为标准曲 线。三天方法学确证的标准曲线结果如图2 7 所示。 a z m o1 0 02 0 03 0 04 0 05 0 06 0 0 4 l 7 6 5 4 3 2 l o 中国科学技术大学博士学位论文 第二章 o1 0 02 0 03 0 04 0 05 0 06 0 0 ol o o2 0 03 0 04 0 05 0 06 0 0 图2 7 三天方法学的平均标准曲线 f i g 2 7 s t a n d a r dc u r v e so fv a l i d a t i o n 图2 7 表明，阿奇霉素在4 6 9 6 0 0 n g m l 的浓度范围内线性关系良好( 相关 系数 0 9 9 9 ) ，定量下限为4 6 9 n 咖l ( s n 芝1 0 ) 。 3 4 3 精密度与准确度 将阿奇霉素低、中、高三个浓度( 9 3 8 ，3 7 5 和5 0 0 n 咖l ) 的质控样品，按 “血浆样品处理”项下操作，每一浓度进行5 样本分析，根据当日的标准曲线， 计算质控样品的测得浓度。连续测定三天，根据质控样品结果计算本法的精密度 与准确度，包括日内精密度、准确度和日间精密度、准确度。质控样品结果见表 4 2 6 5 4 3 2 l o 8 7 6 5 4 3 2 l o 中国科学技术大学博士学位论文 第二章 表2 1 三天方法学的质控样品浓度 t 抽l e2 - 1 a c c u r a c ya n dp r e c i s i o nf o r t h ea s s a yo fa z i t l l r o m y c i ni nh u m a np l a s m a s d ：s t a n d a r dd e v i a t i o n ；r s d ：r e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o n ；r e ：r e l a t i v ee r r o l 4 3 中国科学技术大学博上学位论文第二章 2 1 。 结果表明，日内、日间相对标准差( r s d ) 8 2 4 ，日内、日间相对误 差( r e ) s 士1 1 9 。 3 4 i 基质效应与回收率【2 2 】 将阿奇霉素低、中、高三个浓度( 9 3 8 ，3 7 5 和5 0 0 n m l ) 的质控样品，按 “血浆样品处理”项下操作，每一浓度进行3 样本分析。进样分析，获得相应峰 面积a l 。 精确移取1 0 0 p l 空白血浆置于2 m l 离心管中，加入3 0 0 l 甲醇，涡旋混匀 3 m i n ，1 3 4 0 0 叩m 离心1 0 m i n ，取上清液3 8 0 l ，加入1 0 “l 相应的阿奇霉素标准 溶液和l o p l 内标红霉素标准溶液( 1 5 m l ) ，配制相当于阿奇霉素低、中、 高三个血浆浓度( 9 3 8 ，3 7 5 和5 0 0 n g m l ) 的样品，每一浓度进行3 样本分析。 进样分析，获得相应峰面积a 2 。 以相同浓度的两个样品的峰面积的比值( a l a 2 ) 来计算回收率，数据见表 2 2 。 表2 2 阿奇霉素的提取回收率 t a b l e2 - 2 r e c n ，e 拶o fa z i t h r o m y c i ni nh u m a np l a s m a c o n c e n t r a t i o n ( n m l ) 9 383 7 55 0 0 s d ：s t a l l d a r dd e v i a t i o n ：r s d ：r e l a t i v es t a i l d a r dd e v i a t i o n 结果表明，低、中、高三个浓度的提取回收率为8 7 4 l 9 9 9 7 。 取1 0 肛l 相应的阿奇霉素标准溶液和l o 肛l 内标红霉素标准溶液( 1 5 咖l ) ， 加入甲醇水溶液( 3 ：1 ，v v ) 3 8 0 “l ，配制相当于阿奇霉素低、中、高三个血浆浓度 ( 9 3 8 ，3 7 5 和5 0 0 n m l ) 的样品，每浓度进行3 样本分析。进样分析，获得 相应峰面积a 3 。 中国乖r 学技术大学博士学位论文 第二章 以相同浓度的两个样品的峰面积的比值( a 2 a 3 ) 来计算基质效应，数据见 表2 3 。 表2 3阿奇霉素和内标的基质效应 t a b l e2 - 3m a t r i xe 艉c to fa z i t h r o m y c i na n dt h ei si nh u m a np l a s m a 结果表明，阿奇霉素低、中、高三个浓度的基质效应为9 0 2 6 1 0 3 9 3 ，内 标红霉素的基质效应为8 7 4 5 9 1 5 2 。 3 4 5稳定性 将阿奇霉素低、中、高三个浓度( 9 3 8 ，3 7 5 和5 0 0 n 酌1 1 l ) 的质控样品， 室温下放置4 h 、1 2 h ，每一浓发进行3 样本分析。按“血浆样品处理 项下操作， 进样分析，考察样品在室温条件下放置的稳定性，结果见表2 4 。 表2 4 阿奇霉素的稳定性 t a b l e2 - 4 s t a b i l i t yd a t af o rt h ea s s a yo fa z i t m y c i n i nh u m a l lp l a s m a ( n 2 3 ) r s d ：r e l a t i v es t a i l d a r dd e v i a t i o n ；r e ：r e l a t i v ee r r o r ；r t ：r o o mt e m p e r a t u r e 结果表明，样品在室温下放置1 2 h 内较稳定。 3 5 分析应用 2 0 名健康男性受试者( 编号从1 到2 0 ) 按体重配对，随机分成两组，采用 4 5 中国科学技术大学博士学位论文 第二章 双交叉试验设计，一组先口服试验制剂( t ) ，后口服参比制剂( r ) ；另一组先口服 参比制剂，后口服试验制剂。志愿者服药前在住院观察情况下禁食1 0 h ，于次日 上午8 ：0 0 ，2 0 名受试者根据方案分别口服试验制剂阿奇霉素分散片( 广东彼迪药 业有限公司) 或参比制剂阿奇霉素分散片( 辉瑞制药有限公司) 5 0 0 m g ，温开水 2 0 0 m l 送服。服药后2 h 可饮水，4 h 后进统一清淡饮食。洗脱期为2 周，剂量均 为5 0 0 m g 。受试者在给药前及给药后o 5 、l 、1 5 、2 、3 、4 、6 、8 、1 2 、2 4 、4 8 、 7 2 、9 6 、1 2 0 h 从肘静脉采血3 m i 。血样经4 0 0 0 印m 离心1 0 m i n 分取血清，将血 清样本置于2 m l 塑料离心管中，置于2 0 冰箱中保存，用于测定血药浓度。用 l c m s 法测得阿奇霉素血药浓度时间数据见表2 5 及表2 6 ，血药浓度时间曲 线见图2 8 。 由于标准曲线的最高点浓度只有6 0 0 n m l ，对于浓度超过线性最高点的血 样，其浓度不能用外延法推算，必须先用空白血浆稀释，然后再按“血浆样品处 理项下操作，将得到的浓度数据乘上稀释的倍数即得到真正的浓度。 o2 01 06 08 0l o o1 2 0 i i l l 砖n o 图2 82 0 名健康志愿者单剂量口服5 0 0 m g 阿奇霉素分散片及参比制剂后的平均 血药浓度时间曲线。 f i g 2 - 8 m e a l lp l a s m ac o n c e m r a t i o n - t i m ec u n ，e so fa z i t h o m y c i na r e ra no r a ld o s e o f5 0 0 m gt e s tp r o d u c ta n dr e f e r e n c ep r o d u c tt o2 0h e a l t h yv o l u n t e e r s ( n = 2 0 ) 结果表明两制剂的血药浓度时间变化趋势相近。 o 6 5 4 3 2 l 一-ltllplo焉嚣篇uuc() 窨 。嚣稼趟求目建m皿嗳婪憔僻 式若-v 咖披燃献障醛卜删披竹肇幡秣pu。导林 n 冀nn - 6 价n 卜 价昏式_ o 吨 寸卜卜h a n o h 卜崎8 n o n “h n n 0 寸 价0 nh 心n h 价n n 小n o 寸 n 卜 d h n 寸h 仓h n n n n h h n n h 趴_ 【 n n n o 寸n 寸一 h 卜n 岭n n 小o h o n o n 卜a 卜卜 o o o q o n n 西n h 饥i 小h n n h 岔 ooo【o苫 勺i i “o 【 它口 寸o n 价 。卜n n _ ) u h 卜n h o 卜心n 小( ) n h 卜d 寸 旧h a 卜 寸h n h o o 岔n n h n 卜 n h 卜 n o 卜h n o n 寸o n 价n ”n n h h h 卜呐一一 寸_ n n 一岔卜n 小”卜n 叭h 0 h o 心6 n 吨卜h o n 8 n 价n c n 卜婚 寸n h ”n o 寸 h n n n 寸h 心 o n n 一 卜西寸n n 寸n a h h 寸 n h 寸 n 昏6 h 式n o h 6 h n 甙n 甙i n n o h n 寸n n a n o n 乱n o n n n n 口 o 小 n o 卜 a 卜卜 n n h n o ”n 西 n 卜o h h n n h n 卜吼h o n 卜卜o h n n h o 寸h n n n n n 寸甙n 一 d 卜小 _ 【n 岭h h n 岔n o o n 寸岔_ 一 夸n h h n n h 卜o 价n o n h 寸 心o小_，u 卜卜岣 n 寸h 峪岔一 寸价 岔寸 n n o h h a 卜h o 卜h n n n n h o寸卜廿，9岔 n 寸n h 寸价n o n 卜 卜n 田 寸n 小 n h 卜n a n 寸寸 n 岔价 卜岣 口小n h 西卜寸h 卜寸卜一 o 。岣旧 价o h h n 寸n o h 寸n 卜h n h 寸寸n h 西1 【 h 卜岔 卜h 卜n 【 h 寸寸h n n n 岭寸价 n 旧o 口 吼小n 卜h h n 寸n n n n 寸n n n n o n 也卜寸 n n o h o 卜o n n h 寸n n n 卜。岣 吼a “o h 也8 h h o n n n n 0 岣卜 n a 心n n 卜 寸n n n h o n 寸n h 筑n h n n岔hoh寸h婚nh甙小卜寸h岭寸吼n 水塔 h h h n n 寸卜 n 寸h 寸h h 【岔n n 价n n h n no寸卜寸aq 西岔价n h葛寸h n 虮卜n n h 仓 n 西h 【 n 小卜h h n 【o 卜h h h 卜h 卜h n 寸 h 卜啦 寸n 吼 饥h o 寸h n 均寸峪h 寸n 卜n 西寸 h 寸寸n 寸n n o h n n n a h n n 岭n 寸心h n n 卜 o o o q h n 峪n 卜n o n 寸寸 h h n 卜n h h n ”n h o n 吼n n n ”寸寸 h o 西卜 昏心n o h 岣n n 小h n 卜n o n n n n n 卜a 寸n o h 甙 卜n _ h h 卜仓卜n n 寸n 寸 岭n n d o 岣寸h h o o n 价h o 寸o n n 卜n n n o o n 企n o n o o n n n n 岔n n 寸寸 心心卜n 岭h 岭岭 卜心n o h n n 寸o n a 卜n 寸 旧n n n 峪西 n h 寸 卜n h 寸h h o h n o 价o n n 岣吼寸心n 小o n h o o n n n h 代 o o h 仓寸 卜n 崎 心寸h o a h 卜_ 岭寸 卜昏n 寸n 卜寸o t ， o n 卜小n o h 心h 卜n n 卜n n 一 水塔 n n h o 卜h 寸卜o n 西“n o h n 价 n 口i h o 口h h o o o n o 寸心寸寸 水塔nr6hh o n h 昏n 卜卜h 心n n n 一 寸”h o 寸h h n 卜n n o 婚寸n 蛤卜卜西n 寸n o n h a h 价n 寸n卜hn矶出姥 岣n o 一_ 寸nn”n寸h寸价寸 水塔 昏n 寸a h o _ _ 寸小n 卜n 卜n 婚n n h 卜h 寸 。岔o 寸h o o h 卜n n n n n n 小h o 价寸n n 哆寸n _ o 小 h 岭蚧n 甙n卜卜寸寸onn 一岔一n o q h 叭n o o 寸卜 。 卜 寸卜n n h 寸n n o h h n n n 卜n n n o 心心8 o 寸0 n 寸h o n o n h n n h 岔” o 卜卜n n n h o 寸 饥n n n n 均n _ oo寸。rn_ o n h o “c o n “n n ooc婚n寸0n o n 婚o 吼n o n n 一 心卜o 寸寸 o n n n o h o n h 心a n 卜 寸 寸n n h 寸 n 一 价_ h 吮o o 产i i ) o g i 工 杯鳝似 们-oo甚暑一o函专一四一on o_臼11它ohq苗d_龇_iioon-o oo乜h舀o qio弼ilqhgyk专一薅铀。爵苗勺d_ii一_。uo一甚】口矗qoiioo对_ii时一厶 价n dq_苗 (工v嘧蛋u)略暴星营谜蛏柢目昱f吕oon近冬惫般潞温高杀磊繇鳝苍枢筇似挥。n n - 乙群 褂轼 议秘犁扑书鞋扑k*辎扑凄匝廿 寸 。嚣辑燃限q辫n忸哩婪惰僻 水塔， 嘲披燃限瞎盛卜咖设*肇惰懈。勺u七b球 婚卜寸 寸西n 岣昏寸 n o n h h h 0 h h o h o n 一 心o n n n 一o nn 筑n h 9 崎h 寸口 n h n n n o 岭n n n o h h n 寸n h 卜h n o 寸岔o h n n n n n 吼吼n n 卜h 6 n n卜n 0 n n 寸寸n h 婚寸o n 寸卜n o o o q h o o h n 6 h o 卜口n oo0_品。乏 n o 寸一 小心9 n n 吮n h n 8 ”吨h h n 一a 寸心 一一一 。峪8n n “昏乜卜 o _ i h n 寸6 n 0 h 价_ o n 岔寸苯一 勺口 n o 8 h 9 卜一o n 一 岔n i h 卜寸8 n 卜h n 岔9 o c 卜一- 9n 寸k h c 口寸寸8 n 吨价ha h i h n a 寸 卜n “h o 乜婚 昏n o h 寸c 昏 h c o h n h 8 o n h n 寸n o n n 价 h 小 n 卜 n 寸n h o n 寸也价卜n n 价寸。寸 n n o n onn寸rhn 岭岔o h o o h 寸心h 卜o n 寸n n n o 崎 寸寸h h n 卜n o h n 卜d n n n n n h 寸 n n n n n h 岔寸n h o o o 昏h o o 心h n 心h n 心h 吼 卜n 吼心 h h n n h n o n h h 卜n n 卜h n 心寸 婚n o n 小小o n 口寸n n h 价n 卜 o h h n 寸h n 寸n n 寸寸n n n n 岭n n o n 卜吼h d n 卜o o h n n 寸n n 寸h h o n 卜n 价n h