探讨肠道微生态(厌氧菌为主)研究技术的应用情况

探讨肠道微生态（厌氧菌为主）研究技术的应用情况在人体的肠道内栖息着大约1014个约400500种细菌，是人体细胞总数的10-20倍。肠道内的细菌对人体肠道的生长发育、免疫功能、消化吸收等功能起着重要的作用。为了更好的研究肠道正常菌群的功能以及与机体的相互关系，对肠道内细菌的分离、鉴定和定量非常重要。到目前为止，人们对肠道正常菌群的了解是通过对粪便标本选择性培养计数菌落数而获得的。随着分子生物学的发展以及分子生物学技术在微生态领域的应用，人们对微生态学的研究取得了突破性的进展。国外已经开展这方面的研究，国内在这方面起步较晚，且研究缺乏整体性和连续性。往往只研究其中的某一方面，一旦完成了，就没有继续下去。目前对健康人的大便标本的研究中已知肠道内栖息着大约1014个细菌，是人体细胞总数的1020倍，约400500种。其中90%99.9是厌氧菌，肠杆菌、肠球菌等需氧菌仅占菌群极少的一部分。在这些细菌中主要包括类杆菌属、真杆菌属、双歧杆菌属、乳酸杆菌属等至少14个菌属。大量的研究结果表明，肠道内的细菌对人体的生长发育、免疫功能、营养、发病机制、健康等起着重要的作用。肠道内细菌的分离、鉴定和定量对于研究肠道内菌群的功能以及与机体的相互关系非常重要，同时它能提供结肠细菌代谢潜能的一个重要指标。虽然对这个方面不太了解，可还是要积极参与一下：微生态制剂在国外研究得比较早，在国内的话也有以前的三株口服液，以及常见的双歧杆菌和乳酸杆菌等相关产品；目前研究发现微生态与人类健康和寿命也有密切的关系，它的机理是微生态菌能分解和减少肠道中的有害物质，如胺、吲哚、硫化氢、亚硝酸盐等，这些物质是诱发大肠癌，引发人体衰老、患病的重要致病内因。在肠道微生态（厌氧菌为主）研究应用比较多的技术包括16Sr RNA/rDNA序列分析技术，我查到一篇文章与大家一起分享，也希望我们的讨论能够起到泼砖引玉的作用，欢迎大家继续探讨！ 16Sr RNArDNA序列分析技术在瘤胃细菌微生态系统研究中的应用.caj (103.85k)我也插两句微生物多样性中相当部分当属于厌氧菌的多样性，由于培养相对困难，厌氧菌的研究要远落后于好氧菌，分子生物学的手段也基本限于厌氧菌的检测，分类鉴定等，而真正利用基因工程技术改造厌氧菌的研究很少。近来有利用改造厌氧菌来提高纤维素降解的，在医学上也有采用厌氧菌为载体进行肿瘤治疗的报道。事实上，在自然界中大量难降解物质都可以由厌氧菌降解，特别是在一些极端环境中（比如油井中的石油微生物）。我比较看好以微生物多样性为理论基础的，以构建环境微生物DNA文库为平台，筛选获得新酶，新活性物质的研究。1、 微生物重量分布人体表面及与外界相通的腔道常栖居着种类繁多、数量庞大的微生物。一个健康人由1013个动物细胞组成，而定植的原核细胞达1014个，人体自身细胞只占栖居在体表和体内微生物细胞的10%。按重量计算：人体携带的微生物总重量约为1271g，其中肠道占1000g，肺：20g，口腔占20g，鼻占10g，眼1g，阴道29g，皮肤200g。人体携带的微生物细胞主要在肠道，胃肠的微生物量占人体总微生物量的78.67%，粪便重要的1/32/5是微生物。人体微生物总量相当于一个肝脏大小，产生的酶多于肝脏产生的酶量。2、 厌氧菌主要菌属在体分布的情况如下： 肠道菌群中各类细菌构成：在正常微生物群中，对许多高等动物和人类来说，厌氧菌占优势，其中在人的肠道内专性厌氧菌占总数的99%左右。专性厌氧菌：1011-12CFu/g肠内容兼性厌氧菌：108CFu/g肠内容真菌：103CFu/g肠内容部 位 主要微生物皮肤 表皮葡萄球菌、棒状杆菌、大肠埃希氏杆菌、痤疮丙酸杆菌等。 口腔及上呼吸道 葡萄球菌、卡他莫拉氏菌和链球菌、大肠埃希氏菌、嗜血杆菌、棒状杆菌、假丝酵母菌、梭形杆菌、类杆菌、消化链球菌、乳杆菌等。其中厌氧菌比需氧菌多肠道(空肠末段、回肠、结肠) 肠杆菌科细菌、假单胞菌、肠球菌、葡萄球菌、酵母菌、各种专性厌氧菌(双岐杆菌、类杆菌、真杆菌、消化(链)球菌、产气荚膜梭菌等)占绝大多数；还有腺病毒、埃可病毒等泌尿道 表皮 葡萄球菌、棒状杆菌、肠球菌、大肠埃希氏菌、类杆菌等阴道 乳杆菌、棒状杆菌、大肠埃希氏菌、肠球菌、类杆菌、厌氧球菌、假经酵母菌、支原体。微生态学家将肠道的细菌大致分为有益菌与有害菌二大部分，并对它们的作用作了一些研究。目前已明确双歧杆菌、乳杆菌是人体的有益生理菌。对它们的一些作用如生物拮抗(定植抗力)、免疫等方面做了较为深入的研究。(1)定植抗力作用。所谓定植抗力即包括双歧杆菌在内的内源性专性厌氧菌群限制肠道中潜在致病菌(外籍菌)数量的能力，也就是对潜在致病菌在肠道定植的阻抗力。起定植抗力作用的是内源性专性厌氧菌即原籍菌。定植抗力通过以下方式起作用：有机酸产生。原籍菌通过产生乙酸、丙酸、乳酸等有机酸，降低微生境的PH值与Eh，抑制外籍菌的生长、繁殖。有机酸主要是短链脂肪酸(SCFAs)，短链脂肪酸还可通过直接或间接的途径促进胃肠道的蠕动，使外籍菌尚未在粘膜表面粘附、定植前就被排出体外。体外研究还表明双歧杆菌产生的短链脂肪酸如乙酸、丙酸还个抗菌活性，对假单胞菌属、金葡菌有抗菌作用。甲醇-丙酮(M-A)抽提物。双歧杆菌还可通过产生一种具有广谱抗菌作用的称之为M-A抽提物的物质起抗菌作用。最近的一项研究表明，长双歧杆菌(SBT2928)可产生一种蛋白质，可抑制带有定植黏附因子的产肠毒素大肠杆菌(ETEC)黏附到神经节苷脂(GM1)上，对ETEC的肠细胞黏附具有节抗作用，25mg/mL浓度时，即可减少ETEC黏附量的50%。占位性保护作用。双歧杆菌等专性厌氧菌通过与粘膜上皮细胞紧密结合，形成一层生物膜印菌群，通过占据上皮细胞的空间，防止外籍菌的粘附定植，起占位性保护作用。营养争夺。专性厌氧菌数量大，在厌氧条件下它的生长速度超过兼性厌氧菌，因而在营养物质有限的情况下，专性厌氧菌可优势生长，而通常兼性厌氧的潜在致病菌处于劣势状态。增加肠道粘蛋白的合成。乳酸菌能诱导肠道上皮细胞粘蛋白(属糖蛋白)的表达与分泌，可防止细菌及病毒定植、感染。David等研究发现某些乳杆菌能通过增加肠上皮细胞MUC3 mRNA的表达及MUC3蛋白的翻译，可抑制肠致病性大肠杆菌(EPEC)的黏附。(2)免疫调节作用双歧杆菌、乳杆菌等细菌对宿主有免疫调节作用，它们可不同程度地增强自然免疫和获得性免疫功能。其免疫调节作用可分为全身性免疫调节作用和肠道局部免疫调节作用。全身性免疫调节作用。体外研究表明，双歧杆菌(B?bifidum)对小鼠脾脏B细胞具有丝裂原样作用，能使B细胞免疫球蛋白合成显著增加，此外，还可诱导脾脏B细胞对TGF-1和IL-5产生反应，增加sIgA(3倍)和总IgA(20倍以上)的产生。这在消化道感染的防御方面起重要作用。又如分离事先服用过双歧杆菌或乳杆菌(HN017)的小鼠脾细胞，经活丝裂原ConA作用后，-干扰素产生显著增加，而对照组增加不显著。此外，经悉生动物对照研究，发现肠道细菌可增强脾脏巨噬细胞IL-12的合成及分泌。IL-12可促进Th0细胞向Th1细胞方向分化，这对增强细胞免疫，加强宿主抗细胞内感染起重要作用。动物研究表明双歧杆菌和嗜酸乳杆菌还可增强小鼠的自然免疫功能，如服用双歧杆菌或嗜酸乳杆菌(HN017)后，其外周血白细胞和腹腔巨噬细胞的吞噬活性显著增强。老年人通常免疫功能低下，服用双歧杆菌制剂能显著增强老年人的免疫功能。一项双歧杆菌(B?lactis)制剂的随机双盲安慰剂对照临床试验表明，健康老年人(平均69岁)服用双歧杆菌制剂后，其外周血单核细胞经刺激后产生干扰素的量显著增加，中性粒细胞吞噬活性及吞噬介导的杀菌活性较对照组均显著增强。最近的研究表明：正常生理性菌群(专性厌氧菌)可释放出一些对人体的免疫反应起非常重要作用的小分子物质(分子量小于6500D)，它们可选择性地单核细胞的成熟、增殖、活化起作用。抗生素则通过抑制、杀灭肠道对生理菌，减少这些有免疫原性的小分子量物质的产生，对免疫功能产生抑制作用。相关的研究表明，在肿瘤细胞种植于BALB/C小鼠前用美罗西林，可增加肿瘤的生长速度，认为这与美罗西林杀灭肠道正常菌如类杆菌、乳酸菌、丙酸杆菌等专性厌氧菌后免疫功能受抑制有关(抑制了自然杀伤细胞和细胞毒性T细胞活性)。肠道局部免疫调节作用：肠道绒毛上皮内，特别是肠淋巴结(Peyers patches)内具有专门的抗原递呈机制，Tsuyuki等测定了长双岐杆菌单独定植的小鼠胆汁与小肠内容物中特异性IgA和总IgA，结果发现长双歧杆菌在小鼠肠粘膜定植12周以后，小鼠血清和胆汁中总IgA产生和分泌增强。乳杆菌对小鼠Peyers patches细胞有很强的丝裂原活性，可诱导其产生IgA，这在局部肠道感染防治中起非常重要的作用。研究还证实，双歧杆菌同样能增加人体肠道sIgA的水平。以双歧杆菌为代表的有益菌除了上述作用外，还有营养、防治肿瘤、抗衰老、降胆固醇等作用。微生态平衡与失平衡微生态平衡所谓微生态平衡即在长期历史进化过程中形成的正常微生物群与其宿主在不同发育阶段动态的生理性组合。由于正常菌群的生态平衡与否对人体的健康与疾病起重要作用。因此，微生态平衡就显得尤为重要。微生态平衡标准包括微生物和宿主二个方面。微生态平衡微生态失衡指正常微生物之间及正常微生物与宿主之间的微生态平衡，在外环境影响下，由生理性组合转变成病理性组合的状态。影响微生态平衡的因素(1)长期广谱扩生素的大量使用：抑制原籍菌，定植抗力下降，潜在致病菌，潜在致病菌、耐药菌如酵母菌、金葡菌、革兰氏阴性细菌等优势生长。(2)免疫功能低下：严重疾病、慢性消耗性疾病、肿瘤等。(3)医疗措施影响：手术损伤器械检查等使局部免疫力受损，潜在致病菌易于入侵。在微生态学中，感染是生态平衡与生态失调相互转化的重要内容。从生态动力学出发，引起感染的微生物不一定是致病菌或病原体，而是正常微生物群易位或易主的结果。大肠杆菌和肠球菌在人类肠道都存在一定数量，在正常情况下，对宿主非但无害，而且有益。在菌群失调时，如数量增加或消失会导致宿主发病，如大肠杆菌、肠球菌在大肠的数量一般控制在108CFu/g肠内容物，若超过此数量值，即有可能引起细菌易位，引起内源性感染。同样肠道内酵母菌数量一般在103CFu/g左右，广谱抗生素应用，杀灭其它专性厌氧菌及兼性厌氧菌后，酵母菌就得到优势生长繁殖，超过此值即可引起酵母菌的易位，引起深部真菌感染。大肠杆菌不在呼吸道定植，但如在抗生素作用，消灭了呼吸道的常住菌，出了突缺，大肠杆菌就可以定植，引起呼吸道感染。作为生物物种，他们并不是致病菌，但却表现了致病性，这与它的生态环境(定位)、数量(定量)发生了变化有关，因此，称之为条件致病菌。其微生态防治的有效性已得到证实。去除导致人体微生态失调的一切因素，积极治疗原发病，合理地选择使用抗生素。如对肠道兼性厌氧的革兰氏阴性杆菌选择性脱污染可降低肝大部切除大鼠内毒素血症的发生率、细菌易位程度，提高其生存率，同样选择性脱污染可降低肝硬化失代偿期病人自发性腹膜炎的发生率及ICU病人呼吸道的感染率。在此，尤其要强调抗生素的合理应用。虽然高效广谱抗生素大量应用临床，但临床感染的发生率及由此引起的病死率并没有得到有效的遏制，相反，一些难治的耐药细菌感染报道日益增多，滥用抗生素的弊端日益显现。其结果不但增加了患者的病痛、经济负担，而且也浪费了有限的宝贵资源，已成为一个社会公共问题。微生态防治-扶正扶正即在提高机体免疫力的同时用微生态调节剂扶植促进生理菌的生长、繁殖，促进维护微生态平衡，提高定植抗力，通过微生物生物拮抗的方式来抑制有害菌的生长、繁殖，减少有害菌的易位，降低自身或内源性感染的发生率及内毒素血症发生率，同时还可以减少需氧菌耐药因子的传递。正常菌群引起内源性感染时不可能消灭菌群，主要应限制其侵入其它部位和血液循环，这就需要微生态制剂调节菌群。有关微生态疗法的有效性与安全性已在一些动物实验及临床研究如肠道疾病、肝炎治疗、抑制真菌生物膜的形成等方面得到初步证实。1 肠道疾病的预防和与治疗(1)难辨梭菌引起的感染性腹泻：难辨梭菌是医院内肠道感染的主要原因，与抗生素的应用有关。通常甲硝唑疗效较好，但停药后部分病人易复发，据报道复发率达20%，且易慢性化，同时补充双歧杆菌或乳杆菌可显著改善腹痛、腹泻症状，提高其疗效、防止复发，其疗效优于单用抗生素。(2)肠道轮状病毒感染：泰国一项双歧杆菌降低轮状病毒感染的研究表明，婴儿服用双歧杆菌制剂，可预防轮状病毒感染。此外，双歧杆菌可通过增强IgA的产生，治疗轮状病毒感染。欧洲多中心临床试验表明：轮状病毒引起的腹泻用乳杆菌后，其病程及住院时间均缩短，而安慰剂则无此作用。(3)流感病毒感染：应用双歧杆菌，对流感病毒感染具有保护作用。日本的一项研究表明，给小鼠以，可增强其病毒抗原特异性IgG的产生，对流感病毒感染起保护作用。(4)霍乱：动物实验研究表明，给小鼠灌注乳酸杆菌(LA制剂，再投予霍乱肠毒素，结果发现，小鼠肠道及血清IgA抗体反应性增强，表明乳酸杆菌制剂可增强局部粘膜及全身性血液对霍乱毒素的免疫反应，对霍乱具有防治作用。(5)伤寒：悉生动物研究表明，双歧杆菌对小鼠伤寒感染有保护作用，如与对照组相比较，使用双歧杆菌可明显降低其病死率，且其组织病理损伤也较对照组轻。进一步的研究提示双歧杆菌是通过增强小鼠脾脏淋巴细胞的增生活性、血液腹腔巨噬细胞的吞噬活性及提高肠粘膜抗伤寒沙门氏菌抗体滴度水平等对小鼠伤寒感染起保护作用，即通过增强免疫来控制伤寒感染。肝炎肝炎病人，尤其是重型肝炎病人、肝硬化病人常有严重的肠道微生态失调现象。我们的研究发现慢性肝炎病人，尤其是慢性重型肝炎病人肠道双歧杆菌、类杆菌等专性厌氧菌数量显著减少，而肠杆菌科细菌、肠球菌、酵母菌等数量显著升高，肠道定植抗力显著下降。慢性重型肝炎病人肠道菌群失调在内毒素血症的形成及进一步肝脏病理损伤加重方面起重要作用。应用双歧杆菌制剂(丽珠肠乐)，则可显著降低慢性肝炎病人血内毒素水平。抑制生物膜(Biofilm)的形成细菌生物膜是临床面临的一个非常棘手的问题，细菌生物膜的形成常严重影响抗生素的疗效。生物膜是细菌的特殊存在形式，是细菌在生长过程中附着于固体表面形成的多细菌复合体，外观呈膜状。生物膜由细菌及它们产生的细胞外生物高分子(biopolymer)构成。任何细菌、真菌均可形成生物膜。喉切除术后病人放置的硅胶发音假体常由于假体食道面生物膜的形成而使其功能丧失。扫描电镜观察表明是由酵母菌生长形成生物膜所致。在所检酵母菌中，以白色念珠菌检出率最高，热带念珠菌等也有检出。硅胶发音假体上酵母菌生物膜的形成与喉切除术后口腔微生态失调有关。抗真菌治疗虽能延长此类假体的使用期限，但不能完全阻止生物膜的形成，且长期应用抗真菌治疗又有产生耐药之虞。乳杆菌、嗜热链球菌等有益菌制剂可显著减少生物膜上的酵母菌的量。其机理与这些生理菌能产生抗粘附生物表面活性物质抑制酵母菌粘附于假体有关。其它疾病的预防与治疗：双歧杆菌、乳杆菌等可降低呼吸道感染、腹腔感染的发生率。Gorbach最近报道服用乳杆菌制剂可显著减少儿童的肺部感染，如鼻窦炎、支气管炎、肺炎，并可减少抗生素的使用量。有关抗生素与微生态制剂联合应用抗生素应用是感染治疗的主要方面，但不全面考虑问题，一味地应用广谱抗生素，忽视人体正常菌群的正面作用与负面作用，势必会出现控制了甲病，出现乙病的情况，即抗生素应用后敏感菌杀灭，耐药菌得到优势生长，而引起菌交替症，因此必须在考量微生态学规律的基础上，合理使用抗生素，这是控制感染理性的选择。如何有效杀灭病原体，又尽量保护人体的微生态平衡，这是急需解决的问题。目前的研究认为活菌制剂对防治疾病，维护人类的健康起重要作用。但在临床，一个不能回避的问题是大部分伴感染的危重病人必须使用抗生素，而广谱抗生素必然对微生态活菌制剂产生影响，这似乎制约了微生态制剂的临床应用。从有限的研究资料结果看，抗生素与活菌制剂合用对某些感染的治疗效果优于单用抗生素的治疗效果。鉴于上述情况，我们认为，一般情况下宜先用抗生素治疗原发感染，再以微生态活菌制剂调整微生态，这是合理的选择，即先治后调；也有认为抗生素与微生态制剂分开使用，中间间隔若干小时，以避开抗生素药物的浓度高峰；在抗生素抗菌谱不覆盖微生态活菌制剂的情况下，两者可以同时合用；在有严重微生态失调表现的患者，原则上需要停用抗生素，给予微生态疗法，以扶持恢复微生态平衡。由于肠道微生态是人体最大最重的微生态系统，肠道微生态失衡、定植抗力下降、肠道细菌易位与医院内感染及耐药菌形成有着密切的关系。针对如何在应用抗生素的同时又能比较好地保护肠道专性厌氧菌，防止肠道定植抗力的下降，减少肠道内革兰阴性条件致病菌过度生长，减少肠道细菌易位，降低内源性感染的发生，除了以上方法外，有学者提出应用抗生素灭活分子(antibiotic-inactivating-molecules，AIMs)来灭活肠道内的抗生素，其目的在于：应用抗生素有效治疗肠道以外部位的感染同时，减少其对肠道微生态的干扰作用，抑制肠道内革兰阴性条件致病菌过度生长及易位，降低内源性感染的发生。搂主，斑竹以及各位战友们，大家好！我是研究瘤胃微生态的，对肠道微生物和 Probiotics很有兴趣，正在学习中。非常支持对此主体进行深入的讨论。请教大家以下几个问题1， 现在国内有哪些研究单位在搞肠道微生物或Probiotics的研究？进展如何？2， 现在国内上市的乳酸健康饮料有哪些？希望得知其详细情况。楼上Primers 战友,目前国内在微生态方面的研究情况(供你参考):1.北京解放军304医院已熊德鑫教授为首，主要研究分子生物学技术检测鉴定肠道菌群。2.大连医科大学的康白等，主要研究益生菌制剂，早期的促菌生、乳霉生等都是他们的研究成果。3.广州王立生、潘令嘉等主要研究双歧杆菌对机体的作用机制。4.浙江杭州浙一医院李兰娟等研究重症肝炎患者的肠道微生态变化，采用光冈氏厌氧培养法。还有其他单位亦在从事这方面的研究，这里仅供参考。各位如有其他信息，亦可以与大家一起分享。感谢loujingan楼主的答复。另外，楼主能否具体介绍一下自己的研究情况！还请教各位战友，现在国内上市的乳酸健康饮料的情况。本人正试图利用分子生物学方法对肠道中正常菌群进行定量分析,但目前进展缓慢,哪位战友如果有这方面的经验,可否与大家共享.The Normal Bacterial Flora of Animals2003 Kenneth Todar University of Wisconsin Department of Bacteriology目前肠道厌氧菌的研究存在的主要困难是：1.粪便标本中细菌DNA抽提存在困难，提取的量不稳定，且可能存在很多PCR反应抑制物，干扰PCR进行。2.目前分子生物学技术在细菌菌种鉴定和分型上发挥重要的作用，但对于定量目前尚处在研究阶段。分子生物学技术的应用使肠道微生态学的研究取得了突破性的发展。目前研究最多的是16S rDNA。近几年来国外学者采用不同的分子生物学方法对细菌的16SrRNA进行研究，得到了广泛的细菌16SrRNA序列库。使用该方法可以检测肠道中常规方法不能培养或生长缓慢的细菌。因此普遍存在的rDNA序列分析已经成为分类和检测细菌、评价种系关系的一个理想的工具。1 16SrDNA-PCR法 Suau A等用针对16SrRNA的细菌域通用引物采用PCR法对粪便标本的DNA进行特异性扩增，得到284个平均长度500bp的16SrDNA片段，对这些片段进行测序和种系分析发现284个16SrDNA片段对应于82个分子菌种，其中95%的片段对应于三类细菌：类杆菌、球形梭菌、柔嫩梭菌。只有24%的克隆与目前已知能培养的细菌相对应，而将近76%的扩增得到的rDNA序列与已知的细菌不一致，可能是肠道中迄今为止未知的细菌。因此，他认为，直接对粪便标本分析16S rDNA可以发现许多肠道中新的菌种，并且由此获得的肠道菌群的分子多态性为进一步分析不同年龄、饮食、胃肠道疾病和不同区域的人群的肠道菌群多样性提供了基础和比较框架。2 变性梯度凝胶电泳和温度梯度凝胶电泳（DGGE和TGGE）PCR-DGGE是一个研究复杂细菌群体组成的新的方法。首先从大便或胃肠道标本中提取DNA，再用通用引物通过PCR法扩增16SrDNA（通用引物是指根据16SrRNA基因保守区设计的能扩增所有细菌16SrDNA的引物，其中的一个引物有富含G+C的5端（GC夹）。一个标本的PCR产物包含了这个标本中存在的所有细菌的16SrDNA片段。不同类型的16SrDNA片段通过DGGE凝胶时，因为有GC夹，不同的双链16SrDNA片段在不同的尿素和甲酰胺浓度梯度的聚丙烯酰胺凝胶发生部分变性。当16SrDNA片段发生变性时，迁移速度明显下降，因此可以加以分离。不同细菌的16SrDNA序列不同，化学稳定性亦不同。因此含不同的16SrDNA的菌种可以通过这种电泳法加以区别。16SrDNA片段的分离产生了一个细菌群体的图谱，每一个DNA片段类型代表一个菌种。温度梯度凝胶电泳（TGGE）与变性梯度凝胶电泳机理相同，不同的是凝胶中所采用的不是尿素和甲酰胺浓度梯度而是温度梯度，它同样可以将不同类型的16SrDNA片段分离。DGGE是一个遗传指纹技术，根据PCR扩增16SrDNA片段的电泳，它能检测微生物的多样性。DGGE凝胶电泳与16SrRNA探针结合鉴定特异性的种、属、域。有用的PCR产物可以洗脱下来，再扩增进行序列分析4。3 DNA-RNA杂交DNA-RNA杂交法提供了一个判断肠道中特殊菌群比例的一个方法。这种方法从标本中提取细菌RNA，在膜上进行斑点杂交，这个膜用一系列的放射性标记的寡核苷酸探针的混合物进行杂交（每一个探针代表一个特殊的菌群）。用能杂交到大多数细菌的保守rRNA序列的通用探针（Bact338）作为参考，与其他探针的杂交结果相比较，这个方法提供了一个计算不同细菌占所有细菌中的比例的一个方法。Sghir A等的研究，在27个人的研究中，6个寡核苷酸探针可以检测占70%的通用探针检测到的16SrRNA，其中类杆菌-普氏杆菌-卟啉单胞菌(Bacteroides-Prevotella-Porphyromona)占37%，球形梭菌(C.coccoides)占16%，柔嫩梭菌(C.leptum)占14%，乳酸杆菌-链球菌-肠球菌(Lactobacillus-Streptococcus-Enterococcus) 、双歧杆菌、肠杆菌各占1%。在DNA-RNA杂交法的应用中，寡核苷酸探针只能从已知的细菌中获得，因此该方法首先应对细菌进行种系分析、16SrDNA序列（培养细菌中）等的仔细研究，或从DGGE凝胶上洗脱下来的DNA片段进行序列分析。 4寡核苷酸微距阵法（Oligonucleotide microarray）与以往的PCR方法必须对每一个细菌分别进行检测不同，寡核苷酸微距阵技术可以在一个载玻片上同时检测多个甚至数十个基因或目标DNA，它主要应用于基因的研究，也可以用于检测细菌和特殊病原菌的种系鉴定。Wang RF等将其应用于粪便标本中细菌的检测。他们根据20种肠道菌种的16S rDNA序列设计了60个探针，置于载玻片上的微距阵中，制备了寡核苷酸微距阵玻片。用2个通用引物Amp-F和Amp-R从粪便标本中扩增（CY）5标记的16SrDNA，不同的细菌经16SrDNA扩增产物与微距阵中的探针杂交后根据其杂交程度的不同，显示的颜色亦不同，没有杂交的距阵则不显示。据此可以检测细菌的种类及数量，通过该方法所得到的肠道菌群数据与以前通过其他方法得到的数据一致。但这个方法需要昂贵的微距阵和激光扫描仪，Wang RF等用同样的微距阵原理，使用膜距阵的方法来检测人肠道中的微生物。一张硝酸纤维素薄膜足够检测大量的细菌。通过这个方法所得到的结果与特异性PCR法的结果相一致。因此膜距阵法成为检测肠道微生态细菌检测的一种方法，其优点在于不需要昂贵的微距阵设备。 5 扩增核糖体DNA限制性分析（ARDAR）对扩增得到的核糖体DNA用限制性内切酶进行酶切，从而获得特异性限制性片段，通过对酶切后不同的片段进行分析，可以对不同的菌株进行鉴别。Veatura M等应用ARDAR方法用于不同双歧杆菌的不同的菌株进行鉴别。他们用两个限制性内切酶（Sau3AI和BamHI对16SrDNA进行酶切，对106株16种不同的双歧杆菌菌种进行鉴别，其结果与FISH方法和用种或属特异性引物进行PCR扩增方法取得的结果一致，认为ARDAR是一个快速、敏感、容易控制的鉴定双歧杆菌的有效的方法。6其他6.1 荧光原位杂交法（FISH）荧光原位杂交法（FISH），采用免疫荧光（如异硫氰酸荧光素，FITC）标记的的寡核苷酸探针与目标检测物进行原位杂交，计算杂交率来检测和鉴定细菌。这种方法可以快速原位定量检测细菌，而一般的PCR方法只能定性检测细菌。在FISH的研究中，寡核苷酸探针必须通过细胞壁进入到细菌内与靶目标序列结合，因此原位杂交方法优先检测活的有足够靶分子的细菌,尤其对数量上占优势的细菌最适合。椐Welling GW估计最低的检测水平为106/g。 此外与PCR方法相比FISH法不需要选择性纯化或扩增步骤，可以提供一个更详细的微生物图谱。 Delong于1989年首先用荧光标记寡核苷酸检测单一的微生物，与放射性探针相比，免疫荧光探针更安全，可以很好地解决问题，不需要额外的检测部位。Franks AH等应用FISH法来研究肠道菌群，他们设计了少部分能识别大部分种系免疫荧光标记的寡核苷酸探针，与16SrRNA序列相结合。椐估计，这些探针目前能检测到大约2/3的肠道大便标本中的细菌。在检测到的细菌中，类杆菌、梭菌、直肠真杆菌等占了将近一半。技术上的难度会影响结果的准确性。Moter A等总结FISH在微生态中的应用后认为FISH的结果很容易出现假阴性和假阳性结果。假阳性的结果主要可由于部分微生物可以发出自免疫荧光，干扰了结果的观察，同时，由于探针的特异性欠佳，使得结果失真。假阴性的结果带免疫荧光的探针进入到细菌内的不充足，靶目标或探针的空间结构复杂使得杂交效果欠佳。如果细菌中rRNA含量过低，则检出率下降。在结果的判断上，由于标准不明确，存在一定的局限性。此外在应用过程中，不同的细菌寡核苷酸探针通过其细胞壁的容易程度不一致，使结果会出现偏差。 6.2 脉冲场凝胶电泳技术（PFGE）脉冲场凝胶电泳技术可以分离大小为501000KB的DNA片段，甚至可以观察整个染色体，可用于分离细菌染色体等大分子DNA。PFGE已经成功的应用于分析不同细菌中的染色体构成，同时结合特异性的酶切技术用于菌种间或同一菌种不同菌株的鉴定，此外它还可以为判断基因组的大小和基因图谱的建立提供有用的资料。ORiordan K 等人应用脉冲场凝胶电泳技术（PFGE）结合限制性酶用于双歧杆菌种间及菌株间的鉴定，他认为尽管PFGE技术费时费力，但对很多菌属的菌株鉴别来讲它还是比核糖分型技术（Ribtyping）、SDS-PAGE、RAPD等更有效。6.3 Rep-PCR(Repetitive bacterial DNA)Rep-PCR应用于乳酸杆菌的分类（在种、亚种、菌株的水平）。Gevers D认为重复细菌DNA元件（repetitive bacterial DNA）的PCR扩增是一个以PCR为基础的简单技术，它有以下特点：有很高的识别力；成本低；适用于优势菌株；是一个应用于分类大量G-和G+细菌的一个可靠工具。它是一个快速易于操作可重复性好的工具，可以达到菌株的水平。PCR扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶电泳，然后用溴乙淀染色后，置于紫外线灯下观察并拍照分析。6.4 TAP-PCR传统的形态和生化鉴定方法在培养产物中很重要，但费力且不确定。这就需要一个更确定、费时少的鉴定方法。特异性探针、质粒图谱、PFGE等方法在菌株鉴定上提供了额外的灵活性和可信性，但他们并不宜常规应用。AP-PCR（RAPD）或DNA amplified fingerprinting-PCR，使用一单一的引物，重复性差，只要退火条件的一点小小改变，就会影响条带的产生。TAP-PCR，用三个不同的退火温度，同时应用于三步反应，使条带的鉴定对温度变化敏感。呵呵，好容易看见有同行了，我以前在搞微生态方面的东西，我们教研室是国家微生态保健品的评价单位，参加的工作比较多。但是在这儿还是第一次见到有同行的。现在研究的比较多的几个单位如楼上所述。另外，我们单位，还有预科院的因为微生态保健品做的比较多，还有一个是佳木斯医学院的中药与微生态。但是基本上没有精力深入研究。有机会可以共同探讨。楼上的战友可否介绍以下自己在微生态方面的研究情况？（续）2.16S23SrRNA基因区间由于16SrRNA的进化速度非常慢（即太保守），无法区分某些种系非常接近的菌种或同一菌种的不同菌株。而16S23SrDNA区间序列的进化速度是16SrRNA的10倍，再加上16SrRNA端及23SrRNA端的高度保守序列，使16S23SrDNA区间序列成为鉴别细菌的一个新的方法，它不但可以用于菌种间的鉴别，还可以用于分辨16SrRNA不能鉴别的非常接近的菌种和种内菌株之间的鉴别，取得了一定的结果。16S23SrRNA基因区间分析方法可用于检测肠道正常菌群。种特异性序列包含