（发酵工程专业论文）银杏外种皮银杏酚酸的分离提取及其抑菌活性的研究.pdf

摘要 摘要 题名：银杏外种皮银杏酚酸的分离提取及其抑菌活性的研究 硕士研究生姓名：尤文元 导师姓名：田亚平教授 学校名称：江南大学 近年来，随着银杏产业的发展，我国银杏种植面积不断扩大。每年在银杏加工过 程中，大量银杏外种皮被当作废弃物丢弃，这不但浪费了宝贵的资源，而且其中的银 杏酚酸等有毒成分还会对银杏种植和加工地域造成了环境污染，成为目前亟需解决的 问题。 本论文以此为出发点，根据对银杏外种皮主要成分的分析结果，探讨了利用银杏 外种皮中的可发酵性成分发酵生产酒精、从银杏外种皮中提取银杏酚酸的工艺条件以 及银杏酚酸的抑菌活性等问题，以达到充分利用资源、解决环境污染的目的。 银杏外种皮主要成分的分析结果表明：新鲜银杏外种皮中水分含量为6 5 左右， 总糖含量约为1 5 ，还原糖量约为1 2 ，蛋白质含量约为2 ，所含碳源、氮源比较 丰富，可以满足微生物发酵的需要。将银杏外种皮制成水提液培养基和半固态培养基， 接种活性于酵母发酵生产酒精，发酵4 0 h 酒精度可达7 8 ，半固态发酵周期较长为 7 0 h 左右，但也能达7 的较好水平。 根据银杏酚酸在紫外光激发下能产生荧光的性质，建立银杏酚酸的荧光分光光度 检测法。以白果酸为标样，激发波长3 4 5 1 1 i i l 、发射波长4 2 0 胁测定银杏酚酸。线性 回归方程y = 2 5 0 2 4 x + o 4 1 5 2 ，线性范围0 5 0 1 0 0 0 0 咖l ，相关系数f o 9 9 2 2 ，相 对标准偏差2 6 ，检出限0 1 1 4 “咖l 。考察了p h 和杂质组分对测定的影响。该法 检测结果与高效液相荧光检测法基本一致。 建立了乙醇浸提、大孔树脂和硅胶柱层析分离纯化银杏外种皮中银杏酚酸的工艺 路线。乙醇浸提溶液经大孔树脂l s a 2 1 和硅胶柱层析所得银杏酚酸的含量分别大于 6 0 和9 5 ；对分离出纯化所得的银杏酚酸样品进行h p l c m s 检测，结果与已知文 献一致，另有一种分子量为3 7 4 的银杏酚酸的同分异构体未见相关报导。 抑菌实验表明，银杏外种皮酚酸类物质对产气杆菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、 四联球菌等细菌的抑制作用较强，对酵母的抑菌效果不明显。银杏酚酸对产气杆菌、 枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、四联球菌和金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度分别6 9 “g m l 、1 2 3p g n 1 l 、6 0 2 肛g m l 、1 1 2 o 肛g m l 、和4 0 0 “g n l l 关键词：银杏外种皮；银杏酚酸；分离提取；检测；抑菌效果。 江南大学硕士学位论文 a b s t r a c t m o r ea i l dm o r eg i r l l ( 9 0b i l o b aw e r ep l 趾t e di nr e c e n ty e a r s b u t 眦f 0 r t l m a t e l ya l lo f t h eg i i l l ( g os a r c o t e s t a 、e r ea b a i l d o n e dd u 血gp r o c e s s i n go ft 1 1 eg i n k g o ，d l i c hi sn o to i l l y ? a 、v a s t i n go fr e s o u r c e sb u ta l s oap o l l u t i o nt o t l l ee n v i r o n m e n t a l c o h o lf e 肌e n t a t i o n u s i n g t l l en 嘶e n t c o m p o i l e n t s o fg i i l l 【g os a r c o t e s t a ， p u r i f i c a t i o no fg i i l l 【g o l i ca c i d s 舶mg i n k g os a r c o t e s t aa n dt l l e 锄t i i i l i c r o b i a le 毹c t so f g i n l 【g o l i c a c i d sw e r es t u d i e db 弱e do nt l l e 一r e s u n so f l em a i nc o m p o n e n t so fg i i l l 【g o s a r c o t e s t a t h e 舢t r i e n tc o n l p o s i t i o n s 锄a l y s i so fg i i l k g os a r c o t e s t as h o w e dt h a ti tw 嬲r i c hi n t o t a ls u g a r ( a b o u t15 ) ，r e d u c i n gs u g a r ( a b o u tl2 ) a 1 1 dp r o t e i n ( a b o u t2 ) a l c o h o l c o n c e i l 仃a t i o n 世e r4 0h o u r s f e m e n t a t i o nu s i n ga c t i v ed 巧y e a s t ( a d y ) w a sa r o u n d7 8 w i t ha q u e o u se x t r a c t so fa sl i q u i dm e d i u ma n d 、a sa r o u l l d7 o 谢t l ls m a s h e dg i l l l 【g o s a r c o t e s t aa ss e m i s o l i dm e d i u ma f t e r7 0h o u r s an u o r e s c e n c es p e c 们p h o t o m e t 叮f o rd e t e 肌i n a t i o no fg i i l l 【g o l i ca c i d sw 嬲 e s t a b l i s h e d t o t a lg i i l l ( g o l i ca c i d sw 嬲d e t e m i n e db ys p e c 仃o n u o r o m e t e r 诵t l lg i n k g o l i c a c i da ss t a n d a r dr e f e r e n c ea t 九e x 2 3 4 5 ma i l d 九e m _ 4 2 0 m t h e1 i n e 撕够r e l a t i o n s l 邱i sy = 2 5 0 2 4 x + o 415 2 ，w i t l lc o n e l a t i v ec o e f f i c i e n to fo 9 9 2 2 ，r e l a t i v es t a l l d a r dd e v i a t i o n ( r s d ) o f 2 6 a i l dd e t e c t i o nl i m i to f0 1 1 4 “g m l i n n u e n c e so fp ha n dt h ed i s s o l v e d i m p u r i t i e sw e r ed i s c u s s e d t h er e s u h so b t a i n e db yt l l i sm e t l l o da g r c e d 谢mt l l o s eb ym e h p l cw i t hf l u o r e s c e n c ed e t e c t o r ( f l d ) s o l v e n t e x t i - a c t i o n 、m a c r o p o r o u sr e s i na l l ds i l i c ag e lc o l u i 】【1 i lc h r o m a t o g r 印h yw e r e u s e dt oe x 仃a c ta i l ds e p a r a t eg i n k g o l i ca c i d s 矗o mg i i l l 【g os a r c o t e s t a t h eo b t a i n e d g i n k g o l i ca c i d sp r o d u c t sw e r eq u a n t i f i e da l 】i di d e n t i f i e db yn u o r e s c e n c es p e c t r o p h o t o m e t e r 踟1 dh p l c m s t h er e s u n ss h o w e dm a t ，g i i l k g o l i ca c i d sc a i lb ee m c i e n t l ys 印a r a t e d b yl s a 一2lr e s i l l a i l ds i l i c ag e lc o l l 】m nc h r o m a t o g 豫p h y an e wg i i l l 【g o l i ca c i d si s o m e r 谢廿lm w3 7 4 麟 d e t e c t e db yh p l c - m s g i m 【g o l i ca c i d sw e r ef o u n dt ob eb a c t e r i c i d a la g a i n s te a e r o g e n e s ，b s u b t i l i s ，e c o l i a n dm t e t r a g e n u s ，b u tn o tb 她t e r i c i d a l a g a i n s ts c e r e v i s i a e t h em i i l i m a li l l l l i b i t o 巧 。 c o n c e n t r a t i o n ( m i c ) o fg i n k g o l i ca c i d si s6 9 p g m lf o re 口p 懈口力甜，1 2 3 “g m lf o r b s u b t i l i s ，6 0 2 p g m lf o re c o l i ，1 1 2 o p 咖lf o rm t e t r a g e n u s ，a i l d4 0 0 p 咖lf o rs a u r e u s - k 哪v o r d s ：g i n k g os a r c o t e s 饥g i i l l 【g o l i ca c i d s ，p u r i f i c a t i o n ， d e t e n n i n a t i o n ， a n t i m i c r o b i a l i i 独创性声明 y 967962 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 本人为获得江南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 签名： 五三这丑日期：) 。占年厂月7 日 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规 定：江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和 磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、 汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 、 签名：盈銎么2导师签名： 日期：泗 第一章绪论 第一章绪论 1 1 研究背景 1 1 1 国内外银杏资源及其利用情况 银杏是我国特有的珍稀树种，素有裸子植物活化石之称。多年来，随着对银杏成 分和药理作用研究的深入，银杏所具有的药用、食用价值越来越受到人们的重视，银 杏产品的开发利用方兴未艾。 银杏的种核俗称白果，品味甘美，营养丰富，医、食俱佳，也作药膳或入药；银 杏的叶子、种皮和树根均含有多种化学成分可入中药。其药用作用早在李时珍的本 草纲目中已有较为详细的记载，认为银杏“生食引疗解酒，熟食益人”，“熟食温肺 益气、定喘嗽、缩小便、止白浊。生食降痰，俏毒杀虫”，“嚼浆涂鼻面手足，去能疤 脐期破皱，及疥癣疳匿阴虱”等。清代张璐璐的本经逢源中载银杏有降痰、清毒、 杀虫之功能。 近数十年来，各国药学界和化学界科学家对银杏叶做了深入的分析研究。银杏叶 提取物( e x t r a c to fg i n k g ob i l o b a ，e g b ) 的主要成分为黄酮和内酯类化合物，具有 抗氧化、抗血小板激活因子( 队f ) 作用。银杏叶提取物对冠心病、高血压、心绞痛、 动脉硬化、脑功能减退、老年性痴呆、老年性记忆减退、衰老等与心脑血管循环有关 的疾病都有显著的预防和治疗效果【l 川。德、法等国每年从进口中国大量银杏叶，作 为制药原料，成品销售全世界。 银杏酚酸( g i n k g o l i ca c i d s ) 属细胞毒素，能引起皮肤、粘膜等处的过敏性炎症反应， 皮肤接触它常引起漆毒样皮炎。由于银杏酚酸具有生物学毒性，也是e g b 中的关键 的限量指标。国际上规定e g b 中银杏酚酸的含量必须低于5 p p m 。我国是世界上最大 的e g b 生产地，由于提取和检测技术的不足，很多厂家无法达到这一标准，这在很 大程度上限制了我国e g b 产品的出口垆“。 随着国内外科学家对银杏叶提取物及其制剂的深入研究和国际上对银杏叶提取 物中银杏酚酸含量的严格控制，促进了对银杏酚酸类物质的研究兴趣。研究表明：银 杏酚酸具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤、抗过敏、抑菌、防治病虫害等作用，在化妆品、 生物农药和医药方面潜在的应用价值【7 “。 我国是全球最大银杏种植地，种植面积超过8 0 万亩，约2 亿株。上世纪9 0 年代 以来，随着国际市场对银杏叶提取制剂( e g b ) 的大量需求，在全国各地兴起了银杏 种植热潮，江苏省的栽培面积也迅速增长。苏北的邳州、苏中的泰兴、如皋、江都和 通州等地均大力发展银杏产业。目前，我省现有银杏成片林约5 0 万亩，境内银杏资 源约占全国总量的6 0 ，白果年产量1 2 万吨，占全国总产量的一半以上。2 0 0 4 年， 江南大学硕士学位论文 江苏省银杏产业总产值达2 4 亿元，出口创汇4 0 0 0 万美元。【1 m 2 】 表1 1 我国白果的主要产地及产量 t a b l e1 1y i e l da n dp r o d u c i n ga r e ao fg i n k g oi nc h i n a 然而，我国出口的主要是银杏叶及其半成品等初级产品，在全球每年近7 0 亿美 元的市场交易中，我国的银杏产品出口额仅占世界一小部分，不足5 。近年来银杏 价格逐年下降，已由几年前的每公斤8 0 元，下降到1 0 元左右，极需加强银杏产品综 合加工利用能力。 1 1 2 银杏外种皮开发利用的意义 银杏果主要由肉质外种皮和种仁两部分组成。银杏外种皮是种子硬壳外的肉质部 分，俗称白果“衣子”，味臭，不可食，有生物学毒性，在银杏产地一般作为白果加 工的废弃物。银杏外种皮与银杏果的质量比例大致是3 ：l ，初步估计在银杏开发利 用的同时，每年约有3 万吨以上的新鲜外种皮被废弃，若除去其中6 5 左右的水分， 干银杏外种皮每年约有1 2 万吨。 这些废弃的银杏外种皮长期露天堆放、自然腐烂降解，其中所含的酚酸等有毒成 分随雨水而排入河沟，不但影响堆放场所周边环境，气味难闻，造成资源浪费，更重 要的是对周围水域造成污染，毒死鱼虾，威胁到人畜饮用水的安全，破坏生态平衡， 这不符合我国当前的科学发展观和可持续发展战略。 随着人们环保意识的逐渐增强，银杏加工产业已围绕产品竞争、生态平衡、成本 控制和清洁生产等主题展开。要从根本上改变当前银杏加工产业高消耗、高污染的传 统粗放型增长方式，必须大力推动和发展银杏加工清洁生产技术，改造传统操作工艺， 利用现代生物技术综合利用银杏外种皮，实现变废为宝，增加收益的目标。 1 2 国内外研究现状 1 2 1 银杏酚酸的化学结构 银杏酚酸性成分按化学结构可分为白果酸( g i i l l ( g o l i ca c i dc 2 2 h 3 4 0 3 ) 、氢化白果 酸( h y d r o g i n k g o l i ca c i dc 2 2 h 3 6 0 3 ) 、氢化白果亚酸( h y d m g i n k g o l i n i ca c i dc 2 l h 3 4 0 3 ) 、 银杏酚( g i n k 9 0 1 ) 、银杏二酚( b i l o b 0 1 ) 等。根据分子中苯环上是否连接有羧基，又 可以将其分为烃基酚酸和烃基酚两大类。银杏酚酸是银杏种皮中具有重要生理活性的 第一章绪论 组分，它是6 一烷基或6 一烯基水杨酸的衍生物，六位上的侧链碳原子数可从1 3 至1 9 ， 侧链双键数可为0 至3 个，因此，银杏酸是一混合物，侧链r 为c 1 3 h 2 7 、c 1 5 h 2 9 、c 1 5 h 3 l 、 c 1 7 h 3 i 和c 1 7 h 3 3 ，对应的分子量分别为3 2 0 、3 4 6 、3 4 8 、3 7 2 、3 7 4 吣1 钔。结构见图1 1 。 h o h o h o c o o h o h r 银杏酸g i n k g o i i ca c i d s r = c 1 3 h 2 7 ( c 1 3 ：o ) r = c 1 5 h 3 1 ( c 1 5 ：o ) r _ c 1 5 h 2 9 ( c 1 5 = 1 ) r = c ”h 3 3 ( c 1 7 ：1 ) r = c 1 7 h 3 1 ( c 1 7 ：2 ) r 银杏酚 g i n k g o i ( c a r d a n o i s ) r = c 1 5 h 2 9 ( c 1 5 ：1 ) r _ c ”h 3 3 ( c 1 7 ：1 ) r 银杏二酚 b j i o b o i ，h y d b i i o b o i ( c a r d o i s r = c 1 5 h 2 9 ( c 1 5 ：1 ) r - c 1 7 h 3 3 ( c 1 7 ：1 ) 图1 1 银杏酚酸的结构 f i g1 1 s 仃u c t i l r eo f g i i l l ( g o l l ca c i d s j a g g yh 等报道【1 5 】，银杏叶中含有4 种银杏酸c 1 3 ：o ，c i5 ：l ，c 1 7 2 和c 1 7 ：i ，并测定9 出含量分别为0 1 9 ，3 1 0 ，0 0 3 和0 2 2 。 仰榴青等1 1 6 j 用r p h p l c 法测得银杏外种皮中银杏酸的含量为5 4 6 ，用l c - e s i m s 鉴定出5 种银杏酸成分( c 1 3 ：o ，c 1 5 ：o ，c 1 5 ：l ，c 1 7 ：l 和c 1 7 ：2 ) ，可其中以c 1 5 ：l 含量最高，其次是c 1 3 ：o 和c 1 7 ：l ，这3 种银杏酸占了总银杏酸的9 0 以上。可见，银 杏外种皮中银杏酸含量较高。 银杏酚酸是银杏外种皮中主要的活性成分，在外种皮的开发利用中常常作为主要 的选择对象。 1 2 2 银杏酚酸的分离提取 国内外主要采用正己烷、氯仿、乙醚等极性较低的有机溶剂浸提银杏酚酸，虽然 溶出的杂质少，但溶剂用量大，毒性大，成本高。近年来，随着提取技术的发展，一 些新开发的仪器和提取方法也被用来提取银杏酚酸。 1 9 8 6 年，n o k a w a 等采用柱层析分离方法将银杏酸和银杏酚类物质分离出来， 他们通过溶剂将脂溶性物质浸出，用c h c l 3 对其进行二次萃取，将萃取物分别用硅胶 柱和氧化铝柱及两种洗脱液洗脱，获银杏酸和银杏酚产物，再经0 d s 柱分离，即获得 江南大学硕士学位论文 各种银杏酚酸的纯样。 倪学文等【1 8 】报道了银杏酚酸分离纯化的工艺流程为：银杏外种皮采用l ：7 的料 液比，以8 0 乙醇为提取溶剂，在6 0 条件下回流提取3 次，每次4 h ，提取液经抽 滤浓缩后，经过d 4 0 2 0 吸附树脂纯化，浓缩后用s 溶剂萃取，再浓缩，冷冻干燥， 再经a b 一8 吸附树脂纯化冷冻干燥后得到淡黄色银杏酚酸，产物纯度为9 5 ，得率为 0 8 9 。 尹秀莲等l l9 】报道了超临界c 0 2 萃取法萃取银杏外种皮中的银杏酚酸，得到其最 佳工艺条件为：压力3 0 m p a ，温度4 5 ，萃取时间6 h ，c 0 2 流量为2 u m m 。 1 2 3 银杏酚酸的生物活性 1 2 3 1 抑菌作用 徐立春，顾维戎等【2 0 2 1 1 曾用银杏外种皮的粗总提取物，对1 3 种真菌进行生长抑制 试验，发现浓度为5 时抑菌有效率为9 2 ，并推算出1 5 9 银杏外种皮总提取物对真 菌的抑制效果与o 5 9 克霉陛粉的抑菌效果相当。将银杏外种皮的提取物进一步纯化， 获得了酸性成分的结晶，定名为银杏甲素，再用它对2 5 种致病真菌作抑菌试验，只要 o 1 的浓度，其抑菌有效率就达9 2 ，而0 5 的克霉陛的抑菌率仅为6 8 。 楼凤昌等【2 2 j 研究表明，白果酸对赤霉菌、镰孢霉菌、轮枝霉菌、根霉菌和疫霉菌 的活性优于多菌灵，而不同浓度的白果酸对镰孢霉菌和轮枝霉菌的抑制率高于8 0 ，多 菌灵却对它们无效。 吴向阳，仰榴青等因】分别测定了用n ，n 二甲基甲酰胺、乙醇、丙酮作溶剂时 银杏外种皮粗提物对小麦赤霉病菌、番茄叶霉病菌、花生黑斑病菌在的生长抑制率， 发现用乙醇溶解粗提物的效果最好，n ，n 二甲基甲酰胺次之，丙酮最差。表明乙醇 对粗提物中抗菌有效成分的溶解性最好。因此研究中均采用乙醇作为有机溶剂。还发 现在相同浓度下，粗提物和银杏酸混合物对同一种病原菌的抑制效果无明显差异，这 表明银杏酸是外种皮中抗菌活性成分之一，还存在其他活性成分。 赵肃清等【”】用银杏外种皮乙醇提取液进行了室内抑菌和盆栽抑菌试验。结果表 明，相当于0 2 m l 的银杏外种皮提取液对水稻纹枯病、黄瓜炭疽病菌和番茄青枯病 菌有明显的抑制生长作用，2 o m g m l 的银杏外种皮提取液能明显减少盆栽番茄因青 枯病而导致的死亡率。 倪学文等【2 5 j 研究了银杏酸对玉米大斑病、大麦条纹病和稻纹枯病的抑制作用， 其抑制率都在7 0 以上。 1 2 3 2 杀虫作用 王杰等【2 6 】用菜青虫对银杏外种皮提取6 个组分的抑制活性进行了筛选，其中水 溶性成分对菜青虫无抑制活性，而只占外种皮重量3 5 的脂溶性组分表现出更强的 抑制活性。结合生物测定进步萃取分离获得作用最为显著的组分，主要作用方式是 第一章绪论 拒食作用，触杀作用不明显，是否兼有胃毒作用尚需进一步研究确证。 赵肃清等【2 7 】为了探讨银杏外种皮对蔬菜害虫的室内毒力效果，采用非选择性拒 食和毒杀作用方法研究银杏外种皮乙醇提取液室内对蔬菜害虫的毒力。结果表明；银 杏外种皮乙醇提取液的稀释倍数与菜粉蝶5 龄幼虫的拒食率呈现较好的负相关性，菜 粉蝶5 龄幼虫5 0 拒食率所需的银杏外种皮乙醇提取液的质量浓度为o 6 3m g m l 。 l o o 倍稀释的银杏外种皮乙醇提取液对蔬菜菜粉蝶3 龄幼虫、黄曲条跳甲成虫和美洲 斑潜蝇幼虫毒杀作用的死亡率分别为2 5 o o 、3 2 5 0 和3 6 6 7 。说明银杏外种皮乙 醇提取液对菜粉蝶5 龄幼虫有很好的拒食作用，而对蔬菜害虫的毒杀作用效果不明 显。 石启田【2 8 1 报道了银杏酚酸类生物农药防治蚜虫、菜青虫、蓟马效果良好，与对 照的化学农药防治效果相似。经江苏省疾病预防控制中心做毒理试验，急性经口l d 5 0 4 1 6 4m g l ( g ，属低毒农药，经南京环境科学研究所检测，对蜂、鸟、鱼、蚕毒性 很低，对环境无影响。 1 2 3 3 抗炎和对免役功能的影响 许丽丽等2 卅研究表明银杏甲素2 0 4 0 m g ，l ( g 能显著抑制二甲苯所致的小鼠耳廓肿 ； 胀，角叉菜胶所致大鼠足肿胀以及乙酸所致小鼠腹腔毛细管通透性增高，对大鼠棉球罨 肉芽组织增生和完全福氏佐剂所致大鼠足肿胀亦有明显的抑制作用，与阳性对照组地 嚣 塞米松相似，对炎症早期的毛细管渗透性增高，炎性渗出和水肿有很好的抑制作用，i 对慢性炎症和免疫性炎症同样有效。零 金巧秀等3 0 1 研究发现银杏甲素对细胞免疫功能有抑制作用，作用性质与环磷酸蔷 胺和地塞米松相似。腹腔注射银杏甲素能明显减轻小鼠免疫器官重量，抑制小鼠碳粒 廓清速率 1 2 4 银杏酚酸开发利用方向 银杏酚酸是银杏外种皮中主要的脂溶性成分，它被证实具有良好的抑菌、杀菌和 杀虫活性，因此利用石油醚、乙醇等溶剂直接提取、分离银杏酚酸，纯化后开发成防 治害虫、植物病原菌的绿色植物农药，并且深入研究银杏外种皮中抗农业病虫害化学 成分及其构效关系，对寻找抗病虫害的先导化合物，研制绿色农药新品种具有重要的 意义。 1 3 立题意义 在前期实验的基础上，发现新鲜银杏外种皮中含有丰富的糖，脂肪，蛋白质，氨 基酸，果胶，粗纤维，多种无机离子等成分，银杏外种皮中还含有银杏酚酸、等生物 活性物质。 本研究对于促进特种植物种植业；促进深度利用地域性农业资源：与白果各种 江南大学硕士学位论文 深加工产品生产互济，实现收果去皮、生产、全利用配套；形成清洁生产示范；保护 环境的等具有重要的作用和意义。具体体现为： ( 1 ) 有助于银杏加工业的清洁化生产，消除了银杏加工过程中外种皮对环境的 污染，有助于提高人们的生存环境质量； ( 2 ) 利用生物转化技术把农业和林业废弃物外种皮中可发酵性组分转化为醇类 物质，属于自然资源的充分利用，是生物能源的研究方向之一： ( 3 ) 从银杏外种皮中提取的活性物质可作为生物农药的原料，进一步加工可作 为外用抗生素的替代品和日用化工原料，有利于绿色食品计划的推广，也为其他行业 开发了新的原料来源； 未来社会对加工产业的要求除了产品质量这个永恒的主题外，更加强调生态平衡 和环境友好。随着绿色环保意识和要求的不断增强，运用生物技术综合利用银杏外种 皮必将有更广阔的发展前景。 1 4 本项目研究任务和内容 银杏酚酸是一种天然的植物性抑菌杀虫活性物质，由于其独特的药理和毒理活性 日益受到人们的广泛关注，研究的深度也在加大，但与银杏叶相比，银杏外种皮中银 杏酚酸的研究不太深入。国际上最初是在研究银杏叶提取制剂( e g b ) 作为抗心脑血 管疾病药物时发现银杏酚酸具有生物学毒性，进而限制e g b 中的银杏酚酸含量。国 内的学者研究发现银杏外种皮中银杏酚酸含量比叶中更高，因而希望从中提取，考察 其特性以及可能的应用方向。由于提取原料和纯化方法的不同，导致所得到的银杏酚 酸在结构上的差异，进而影响其生物活性。另外，上述关于银杏酚酸活性研究的报道 多为粗提物的研究结果，由于样品的纯度不明确，对其可靠性难以作出评价。 基于以上讨论，本研究将对银杏外种皮原料的主要成分以及从中分离纯化银杏酚 酸的工艺条件进行系统的研究：利用现代光谱、色谱分离理论和分析鉴定技术对其结 构进行鉴定，建立银杏酚酸高效、方便、准确的定量和分析方法；初步探讨银杏酚酸 对细菌和酵母等的抑制作用。 本论文为江苏省2 0 0 4 农业科技攻关项目“生物技术综合利用银杏外种皮的产业 化研究”( 课题编号：n o b e 2 0 0 4 3 0 5 ) 的一部分。主要研究内容包括： 1 ) 银杏外种皮成分的分析及可发酵性成分发酵产酒精的初步研究； 2 ) 银杏酚酸常规灵敏分析方法的建立； 3 ) 银杏外种皮提取银杏酚酸工艺的研究； 4 ) 银杏酚酸抑菌特性的初步研究 第二章银杏外种皮成分的分析及其水溶性成分发酵产酒精的初步研究 第二章银杏外种皮成分的分析及其水溶性成分 发酵产酒精的初步研究 2 1 引言 银杏外种皮是银杏果的果肉部分，约占整个果实重量的7 5 。和大部分水果其中 果肉一样，银杏外种皮中含有丰富的营养成分，但由于其中还含有部分有毒有害的生 物活性成分，因而无法食用，在银杏产区都是作为废弃物丢弃，既浪费资源，又污染 环境。 为了深入开发银杏资源，充分利用银杏外种皮资源、变废为宝，本章主要研究内 容包括两个部分：一是对银杏外种皮中的主要营养成分进行了分析测定，希望从中的 到切实可行的利用路线：二是解决在银杏果去皮加工过程中如何最大程度地保持银杏 外种皮中的主要营养成分以及主要的生物活性物质一银杏酚酸。 为了解决这两大问题，我们对不同处理方法所得到银杏外种皮的成分进行了检测 分析。主要讨论了脱皮方式、处理方法不同对所得到的外种皮中的的主要营养成分总 糖、还原糖、脂肪、蛋白质等含量的影响及银杏酚酸含量的影响，初步研究了利用外 种皮中的营养成分发酵生产乙醇的可行性1 3 ”。 2 2 材料与方法 2 2 1 实验材料与试剂 银杏果实2 0 0 4 年9 月、2 0 0 5 年1 0 月采于江苏如皋，冷冻保藏； 梅山牌酒用活性干酵母，梅山一马利酵母有限公司产品； 安琪耐高温酒用活性干酵母，湖北安琪酵母股份有限公司 酵母s c e r e v i s i a ek j 菌株，本实验室保藏： 无水乙醇、酵母膏、蛋白胨、葡萄糖、氯化钠均为国产分析纯： 成分分析所用试剂均按方法要求纯度。 2 2 2 主要仪器与设备 t g 一3 2 8 a 电子分析天平，德国梅特勒托利多公司产品 电热干燥箱，上海跃进医疗器械厂产品： 恒温培养箱，上海跃进医疗器械厂产品： p h 计，德国梅特勒托利多公司产品； 高速组织捣碎机，上海标本模型厂产品。 j t * 竹 ，每 磷 鬻 譬 参 江南大学硕士学位论文 2 2 3 实验方法 样品成分分析均按文献方法测赳3 2 1 。 2 2 3 1 水分的测定 干燥法：用电子天平称取1 0 9 左右样品放入称量皿，烘箱1 0 5 干燥至恒重，根 据干燥减重计算水分含量。 2 2 3 2 还原糖的测定 直接滴定法：取l o g 样品于2 5 0 m l 容量瓶，加水浸提其中的可溶性成分( 液体 样品不需此操作) ，用澄清剂去干扰物质，定容、过滤后用清液滴定已标定的碱性酒 石酸铜溶液，根据消耗样品量计算还原糖含量。 2 2 3 3 总糖的测定 酸水解法：取1 0 9 样品加入3 0 m l 6 m o l l 盐酸，沸水浴中回流l 小时，用l o n a 0 h 调p h 至7 o ，再按还原糖测定方法滴定已标定的碱性酒石酸铜溶液，根据消耗样品 量计算得总糖含量。 2 2 3 4 蛋白质的测定 凯氏定氮法。 2 2 3 5 脂肪的测定 索氏提取法：将经处理干燥的样品用无水乙醚回流提取8 小时，使样品中的脂肪 进入溶剂，回收乙醚所得到的残留物， 1 0 5 干燥至恒重，称重即得脂肪含量。 2 2 3 6 果胶的测定 称重法：先用7 0 乙醇处理样品，使果胶沉淀，再依次用乙醇、乙醚洗涤沉淀， 以除去可溶性糖类、脂肪、色素等物质，残渣分别用酸或用水提取总果胶或水溶性果 胶。果胶经皂化生成果胶钠，再经醋酸化使之生成果胶酸，加入钙盐生成果胶酸钙沉 淀，烘干后称重。 2 2 3 7 酒精度的测定 采用酒精计法，取1 0 0 m l 经离心的发酵液上清，置于蒸馏装置中蒸馏，将其中酒 精充分馏出，再将馏出液定容到1 0 0 m l ，将酒精计放入量筒，读出酒精所占体积分数。 2 2 3 8p h 的测定 用p h 计测定。 2 2 3 9 银杏果的去皮方法 分别采用鲜果直接去皮和鲜果加水浸泡2 3 天沤熟后去皮两种方式。 第二章银杏外种皮成分的分析及其水溶性成分发酵产酒精的初步研究 2 2 3 1 0 培养基的制备 l 、银杏外种皮水提液培养基 将银杏外种皮按l ：l 的质量比加水用组织捣碎机匀浆，处理后的料液离心、过 滤，所得到的液体添加葡萄糖至还原糖1 5 即可作为液体培养基使用。 2 、银杏外种皮半固态培养基 将银杏外种皮用组织捣碎机匀浆处理后，所得到的悬浮液添加葡萄糖至还原糖 1 5 直接作为培养基使用。 3 、常规培养基 葡萄糖1 5 ，酵母膏o 5 ，n h 4 c 1 1 ，p h 4 5 。 2 2 3 1 l 活性干酵母的活化 按l ：2 5 质量比将活性干酵母用2 的糖水3 0 3 5 活化1 2 h ，即可作为发酵 菌株使用。 2 3 结果与讨论 2 3 1 银杏外种皮主要营养成分 分别测定了新鲜银杏外种皮、沤熟外种皮和鲜外种皮烘干粉碎所得干粉中的各种 营养成分，结果见表2 1 。 表2 1 银杏外种皮主要营养成分 t a b l e2 1t h em a i nc o m p o n e n to f g i n 蝇os a r c o t c s t a 从上表中可以看出在银杏外种皮中总糖和还原糖含量都很高。用稀碘液实验，检 测几种处理材料中仅有轻度的淀粉的呈色反应，说明淀粉含量较低，大部分为微生物 可直接利用的还原糖成分。 银杏外种皮中蛋白质含量较低，新鲜外种皮( 水分含量6 4 5 ) 为2 左右，沤 熟外种皮为2 左右( 水分6 9 3 ) ，而纤维素含量在2 0 左右。 根据银杏外种皮成分分析结果中总糖和还原糖含量较高的特点，在综合利用中 可以用其作为碳源，培养微生物，发酵生产附加值较高的产品。利用糖质原料发酵生 产酒精作为汽油的替代品日益受到重视，而且该方法在理论和实践上都非常可行，因 此本章初步研究了用活性干酵母利用其中的糖分发酵生产乙醇的工艺。 2 3 2 银杏外种皮不同处理工艺的选择 新鲜银杏果的外种皮很难去除，需要使用刀具将其剥离，在产区有专用机械利 江南大学硕士学位论文 用机械剪切力作用去皮，效率不高。另一种去皮方式是将采下的银杏果放入水槽内， 加水浸泡2 3 天，待其软化后用手工或机械去除。 据表2 1 ，银杏外种皮用不同方式处理后，从其还原糖的含量来看，沤熟后比新 鲜直接脱皮后要高。干粉的处理过程中颜色的变化很大，从青绿色变为深褐色，这对 后续的提取和发酵不利。显然从脱皮和水溶性成分发酵利用角度考虑，脱皮工艺应该 选择沤熟的方式。 2 3 3 银杏果后熟条件的选择 为了解加水量和时间对后熟过程中的主要成分是否有较大的影响，我们选择等 量新鲜的银杏果实分别在1 ：0 5 ，1 ：l ，l ：1 5 这三种加水比下放置不同天数，去皮， 然后对外种皮分别按一定的方法分析总糖，还原糖和银杏酚酸含量的变化。结果发现 三种不同加水比下，各组分的变化趋势基本一致，加水比l ：1 条件下的情况如图2 1 所示。 拿 捌 黎 缸 浸泡时i 司( 天) + 总糖+ 还原糖 图2 1 浸泡时间对外种皮中糖分的影响 f i g2 1e 彘c to f s o a k i n gt i m e0 ns u g a r 图2 1 两种成分的变化趋势结果显示，后熟过程中总糖浓度有所下降，还原糖浓 度有所增加，可能是种皮自身存在的少量的酶对糖类化合物的水解，使还原糖有所增 加，但幄度不大，后熟时间控制3 天左右较合适。 2 3 4 银杏外种皮水溶性成分发酵酒精的初步研究 为了充分利用利用银杏外种皮中的糖分成分发酵生产酒精，试验了两种工艺路 线： l 、将可发酵的成分用水抽提出来制成可供发酵用的液体培养基，并利用活性干 酵母对抽提液进行发酵。 2 、将银杏外种皮直接匀浆，接种活性干酵母进行半固态发酵。 对以上两种发酵工艺路线中发酵条件进行了研究，考察了培养方式、p h 、发酵 第二章银杏外种皮成分的分析及其水溶性成分发酵产酒精的初步研究 周期等因素的影响。 2 3 4 1 发酵菌株的选择 将三种菌种按8 的相同接种量分别接入基础发酵培养基、银杏外种皮水提液培 养基和银杏外种皮半固态培养基，3 0 厌氧培养，发酵结束后分别测定酒精含量。 安琪活性干酵母，口梅山牌活性干酵母，一酵母s c e r e v i s i a ek j 菌株 卜常规发酵培养基2 一银杏外种皮水提液培养基3 一银杏外种皮半固态培养基 图2 2 三种菌株在不同培养基中的酒精产量 f i g2 2 a l c o h o lp m d u c t i o no f m r e es 订a i n so nd i f f c r e mc u l t u r cm e d i u m 从图2 2 中可以看出，三种菌种在普通发酵培养基和银杏外种皮水提液及银杏外 种皮半固态培养基中酒精产量相差不大，在银杏外种皮水提液培养基中梅山牌活性干 酵母产量略高于其它两种。 由于活性干酵母具有使用方便，产量稳定，不需要添加种子培养罐等设备等优 点，因此在以后的实验中均以梅山牌活性干酵母作为银杏外种皮水提液酒精发酵菌 株。 从发酵水平来看，当银杏外种皮水提液及银杏外种皮半固态培养基自身的还原 糖在1 5 左右时，可不外加任何碳源，就可以达到和常规发酵培养基接近的酒精产量， 这也说明银杏外种皮中含有酵母发酵需要的各种营养物质。 由于银杏外种皮中银杏酚酸为水不溶性的化合物，水提液和半固态培养基经 h p l c 分析基本检测不出，因而酵母发酵生产酒精影响不大。 2 3 4 2 起始p h 对发酵的影响 酵母发酵的最适p h 为4 2 5 0 ，当p h 降到4 2 以下时，酵母仍能继续繁殖，但 速率受到一定影响。新鲜的外种皮原料的p h 为4 5 5 0 ，调节发酵液的初始p h 进 行发酵，4 0 小时发酵结束测定结果发现在4 5 5 5 之间酒精的产生量差别不大，所 以用外种皮原料发酵可以不调d h 。 江南大学硕士学位论文 2 3 4 3 发酵周期 在接种量和温度等条件一致的情况下，按方法所述对外种皮进行三种培养基的发 酵实验，了解梅山牌活性干酵母的酒精发酵周期。 ul uz u 3 04 05 06 07 0 时问( h ) o 一常规一一一液态o 卜半固态 图2 3 三种培养基发酵酒精产量变化曲线 f i g2 3c u r v e so f a l c o h o lp m d u c t i o no nt h r e ek i n d so f c u l t u r em e d i u m 图2 3 ，结果表明，常规培养基与外种皮水提液的发酵周期均为4 0 h 左右：外种 皮半固态培养基的发酵周期相对较长，达到7 0 h 以上。半固态培养基发酵周期最长， 因为酵母对半固态培养基中营养的利用较缓慢。三种培养基发酵结束时酒精含量均在 7 左右。 通过对外种皮的发酵实验，发现活性干酵母进行液态与半固态外种皮的发酵与常 规培养基相比，酒精度可以达到基本接近的水平，而且在所采用的糖浓度下，转化率 也相对较高，水提滤液的发酵周期也只要4 0 小时左右，半固态发酵尽管周期长，但 由于设备简单，能耗低，也不失为一种较好的选择方式。 2 3 4 3 外种皮水提滤液的发酵过程曲线 在前面的发酵条件基础上，按外种皮水提滤液的处理方法，进行了酒精发酵实验， 对还原糖，酒精度等进行了分析，做出发酵过程曲线，见图2 4 。 8 7 6 5 4 3 2 l o (96一趟霉露 第二章银杏外种皮成分的分析及其水溶性成分发酵产酒精的初步研究 ul uz u3 u4 ub u 时间( h ) 一一残糖十酒精 图2 4 酒精、残糖变化曲线 f i g2 4 c u r v e so fa l c o h o lp r o d u c t i o na n dr e s i d u a ls u g a r s 由图2 4 中可知，经过4 8 小时发酵，发酵液中的酒精含量达到了7 8 ，残糖为 1 1 。 2 4 本章小结 茬 1 ) 成分分析结果表明，新鲜银杏外种皮中水分含量为6 5 左右，总糖含量约为3 1 5 ，还原糖量约为1 2 ，蛋白质含量约为2 ，所含碳源、氮源完全可以满足酵母芳 酵生产酒精的需要。 “ 2 ) 从脱皮难易程度和水溶性成分发酵利用角度考虑，选择先将银杏果加水浸泡 沤熟2 3 天后脱皮的方式。 3 ) 考察三种酵母在常规发酵培养基、种皮水提液培养基、半固态培养基发酵生 产酒精的情况，最终选用梅山活性干酵母作为发酵菌株。 4 ) 将银杏外种皮制成水提液培养基和半固态培养基，接种活性干酵母发酵生产 酒精，发酵4 0 h 酒精度可达7 8 ，半固态发酵周期较长为7 0 h 以上，但也能达7 左 右的较好水平。 (aa1j6一趟婆疼 9 8 7 6 5 4 3 2 l o 6 4 2 0 8 6 4 2 0 一l j 6 一糖餐 江南大学硕士学位论文 第三章银杏酚酸荧光分光光度检测法的建立 3 1 引言 银杏酚酸( g i n k g o l i ca c i d s ，g a ) 广泛存在于银杏根、梗、叶、果和外种皮中，可 看作是6 烷基或6 烯基水杨酸的衍生物，是一类天然的植物性活性物质。研究表明其 具有抗炎、抗过敏、抑菌、防治病虫害等作用。根据银杏酚酸苯环上6 位取代基上碳 原子数目及单双键的不同主要有白果亚酸( c 1 3 0 ) 、白果酸( c 1 5 1 ) 、氢化白果酸( c 1 5 ：0 ) 等5 种，见图3 1 。 o h1 r = c 1 3 h 2 7i c l 3 ：0 ) c 0 0 h 2r 2 c 1 5 h 2 9 ( c 1 5 ：1 ) 3 r = c 1 7 h 3 1 ( c 1 7 ：2 ) 4r = c 1 5 h 3 1 ( c 1 5 ：0 ) r 5r = c 仃h 3 3 ( c 1 7 ：1 ) 图