（应用化学专业论文）诺氟沙星金属配合物的合成和生物活性研究.pdf

武汉理工大学硕士学位论文 摘要 诺氟沙星结构中的羧基和羰基能和金属形成双齿配位配合物。本文主要选 择具有重要生物功能的金属离子，通过合成不同的金属诺氟沙星配合物，研究 它们的合成及这些金属配合物的生物活性。 1 以诺氟沙星为配体，合成了以c u ( i i ) 、m n ( i i ) 、z n ( i i ) 、n i ( i i ) 、 c o ( i i ) 、m g ( i i ) 为中心离子的配合物，通过红外，差热，电导率等方法对 配合物的组成和性质进行分析。在以诺氟沙星为第一配体的基础上，加入邻菲 哕啉，引入n n 配体，合成不同的金属一诺氟沙星邻菲哕啉三元配合物并对其 进行分析。 2 用微量热法分别测定了在金属诺氟沙星、金属诺氟沙星邻菲哕啉等配 合物作用下大肠杆菌生长代谢的热谱。并根据热动力学模型h a p ，= i n p o + k t ， 计算了细菌生长速率k 、传代时间、半抑制浓度i c 5 d 等参数。定量地表明了 金属配合物的抗菌活性。生长速率常数k 和半抑制浓度，c 岛可以作为评价金属 配合物对细菌生长代谢的作用的定量标准。i c 5 d 越小，金属配合物对细菌的抑 制作用就越明显。结果表明，二元金属配合物和三元金属配合物对大肠杆菌的 抑制作用基本相当，在高浓度时均能使大肠杆菌停止生长，表现出很强的抑菌 作用。 3 用微量热法研究了不同金属配合物对四膜虫的毒性，得到四膜虫的生长 代谢曲线，并计算出生长速率常数k 、传代时间殆、半抑制浓度i c s o 等参数， 通过这些热动力学参数来比较各种金属配合物对四膜虫生长代谢作用。数据表 明，部分金属配合物在低浓度的时候对四膜虫的生长有刺激作用，但是在高浓 度时均表现出对四膜虫的抑制作用。 4 紫外光谱法研究金属配合物与d n a 的作用，通过计算金属配合物与 d n a 之间的结合常数来说明它们的作用模式。随着d n a 浓度的增大，紫外光 谱中出现减色效应，但红移现象基本不明显，说明这些金属配合物与d n a 有 部分的插入作用。 关键词：诺氟沙星金属配合物，微量热，细菌，四膜虫，紫外 武汉理工大学硕士学位论文 a b s t r a c t t h ec a r b o x y lg r o u pa n dc a r b o n y lg r o u pi nn o r f l o x a c i nc a nb i n dw i t hm e t a l i o n s i nt h i sp a p e r ，s o m eb i o l o g i c a lm e t a li o n s ，s u c ha sc u ( i i ) ，m n ( i i ) ，z n ( i i ) ， n i ( i i ) ，c o ( i i ) ，m g ( i i ) ，w e r es e l e c t e dt os y n t h e s i z en o r f l o x a c i n - m e t a lc o m p l e x e s t h e i r b i o l o g i c a la c t i v i t i e sw e r es t u d i e d 1 as e r i e so fn o r f l o x a c i n - m e t a lc o m p l e x e sw e r es y n t h e s i z e d m a n yt e c h n i q u e s w e r eu s e dt o a n a l y s i s t h es t r u c t u r a l p r o p e r t i e s s u c ha si n f r a r e d a b s o r p t i o n s p e c t r o s c o p y , d i f f e r e n t i a lt h e r m a la n a l y s i s ，c o n d u c t i v i t ym e a s u r e m e n t s ，e t c i no r d e r t oi n t r o d u c en n l i g a n d ，p h e n a n t h r o l i n e w a sa d d e dt oo b t a i nd i f f e r e n t m e t a l n o r f l o x a c i n - p h e nt e m a r yc o m p l e x e s 2 t h ea c t i o no fm e t a l - n o r f l o x a c i n ，m e t a l - n o r f l o x a c i n - p h e n a n t h r o l i n e c o m p o u n d so ne s c h e r i c h i ac o l iw a ss t u d i e db ym i c r o c a l o r i m e t r y a c c o r d i n gt o t h e r m o k i n e t i ce q u a t i o ni np t1 1i np 0 + h ，t h er a t ec o n s t a n tk ，t h et i m eo fg e n e r a t i o n s o fb a c t e r i u mt ga n dt h eh a l f - i n h i b i t o r yc o n c e n t r a t i o ni c s ow e r ec a l c u l a t e d b yt h e v a l u e s o fr a t ec o n s t a n tka n dh a l f - i n h i b i t o r yc o n c e n t r a t i o ni c 5 0 ，t h eb i o l o g i c a la c t i v i t y o fm e t a lc o m p l e x e sw e r ee s t i m a t e dq u a n t i t a t i v e l y t h es m a l l e rt h ei c 5 0w a s ，t h e g r e a t e rt h ea n t i b a c t e r i a la c t i o no fm e t a lc o m p l e x e sw a s t h er e s u l t ss h o w e dt h a t ， b o t ht h eb i n a r yc o m p l e x e sa n dt e r n a r yc o m p l e x e sh a v et h ea n t i b a c t e r i a la c t i v i t y a t h i g hc o n c e n t r a t i o n so fc o m p l e x e s ，e s c h e r i c h i a sg r o w t hc a nb ei n h i b i t e dc o m p l e t e l y ， s h o w i n gs t r o n ga n t i b a c t e r i a la c t i v i t i e s 3 t h et o x i c i t yo fm e t a lc o m p l e x e so nt e t r a h y ，m e n at h e r m o p h i l aw a ss t u d i e d b ym i c r o c a l o r i m e t r y t h er a t ec o n s t a n tk ，t h et i m eo fg e n e r a t i o n so fb a c t e r i u mt c a n dt h eh a l f - i n h i b i t o r yc o n c e n t r a t i o n c 5 0w e r ec a l c u l a t e df r o mt h eg r o w t hc u r v e s t h e s et h e r m a lk i n e t i cp a r a m e t e r sw e r eu s e dt oc o m p a r et h ed i f f e r e n ta c t i o n so fm e t a l c o m p l e x e so nt e t r a h y m e n at h e r m o p h i l a t h er e s u l t ss h o w e dt h a t ，s o m em e t a l c o m p l e x e s c a ns t i m u l u st h e g r o w t h o f t e t r a h ) 7 m e n at h e r m o p h i l a a tl o w c o n c e n t r a t i o n ，b u ta th i g hc o n c e n t r a t i o n ，t h e yc a ni n h i b i tt h eg r o w t ho ft e t r a h y m e n a t h e r m o p h i l a 4 u vs p e c t r o m e t e rw a su s e dt os t u d yt h ei n t e r a c t i o n so fm e t a lc o m p l e x e sw i t h i l 武汉理工大学硕士学位论文 d n a t h eb i n d i n gc o n s t a n t so fm e t a lc o m p l e x e sw i t hd n aw e r ec a l c u l a t e da n dt h e i n t e r a c t i o nm o d ew a sd i s c u s s e d i tw a sf o u n dt h a t ，a st h ed n ac o n c e n t r a t i o n i n c r e a s e s ，h y p oc h r o m i ce f f e c ti nu vs p e c t r o m e t e rc a l lb eo b s e r v e d ，b u tt h er e d - s h i f t i nn o to b v i o u s ，w h i c hi n d i c a t e st h a tn o r f l o x a c i n - m e t a lc o m p l e x e sp a r t l yi n s e r t e di n t o d n a k e yw o r d s ：n o f f l o x a x i n m e t a l c o m p l e x e s ；m i c r o c a l o r i m e t r y ；e s c h e r i c h i a ； t e t r a h y m e n at h e r m o p h i l a ；u vs p e c t r o m e t r y i i i 独创性声明 本人声明，所呈交的论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人 已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得武汉理工大学或其它教育机构的 学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已 在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 签名：鼋望蜒日期：迦缢：】 关于论文使用授权的说明 本人完全了解武汉理工大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅。本人 授权武汉理工大学可以将本学位论文的全部内容编入有关数据库进行检索，可以 采用影印、缩印或其他复制手段保存或汇编本学位论文。同时授权经武汉理工大 学认可的国家有关机构或论文数据库使用或收录本学位论文，并向社会公众提供 信息服务 ( 保密的论文在解密后应遵守此规定) 签名：莹敝导师签名：盥日 武汉理工大学硕士学位论文 第一章绪论 1 1 喹诺酮药物的研究进展 诺氟沙星是喹诺酮药物的一种，高效、低毒、抗菌范围广泛。1 9 7 8 年问世 的诺氟沙星是第三代的喹诺酮抗菌药物，其抗菌效果可与第三代头孢素类抗菌 药相媲美。喹诺酮的分类，按母环结构不同可分位喹啉类( 如诺氟沙星) 、1 ， 8 萘啶类( 如萘啶酸，伊诺沙星) 、吡啶并嘧啶类( 如毗派酸) 等。按喹诺酮骨 架中环的数量可分为二元环类，三元环类和多元环类。 诺氟沙星、伊诺沙星、培氟沙星、氧氟沙星、洛美沙星、环丙沙星、芦氟 沙星和氟罗沙星等均为第三代喹诺酮药物的代表。这些化合物的共同结构特点 是母环6 位为氟原子，7 位为哌嗪集，称之为氟喹诺酮( 结构如下图1 1 ) 。 oo h h oo h 萘啶酸( n a l i d i x i ca c i d ) 诺氟沙星( n o r f l o x a c i n ) 之 o oo h h oo h 西诺沙星( c i n o x a c i n )环丙沙星( c i p r o f l o x a c i n ) 图1 1 喹诺酮类化合物的结构 上世纪2 0 年代使用最早的用于治疗的人工合成抗菌药物是硫胺类药物， 从4 0 年代发现青霉素并应用于临床后的5 0 年中，天然产物和半合成的衍生物 武汉理t 大学硕士学位论文 在这一领域中起到重要的作用。氟喹诺酮药物是青霉素类药物的主要竞争对手， 喹诺酮药物从相对不重要的位置发展为重要的的一类抗生素。喹诺酮类药物的 抗菌谱也从革兰氏阴性菌发展到革兰氏阳性菌，抗菌活性也大大提高。随着研 究的日益深入，开发成本也日益提高，药物的侧链和尾链也越来越复杂。目前， 在开发新药时，更大的精力主要放在如何克服和减缓抗药性方面。 综合以上所述，我们需要进一步研究喹诺酮系列药物的作用机理和开法新 的应用领域。 1 2 喹诺酮药物的配位化学 t i m m e r s 口1 测定了萘啶酸的电离常数及其与部分阳离子的离解常数。在2 5 时萘啶酸的p k a 为6 1 。这表明了在水溶液中分子内氢键使得这些结合了二 价阳离子的化合物更加不容易电离。金属蛋白涉及到d n a 的复制，萘啶酸则与 金属蛋白中的二价阳离子形成配合物而发生作用，从而抑制细菌d n a 的复制。 c o l e 口1 等测定了萘啶酸与质子、c u ( i i ) 、m g ( i i ) 的络合常数，结合c a ， m n ( i i ) ，f e ( i i ) ，z n ( i i ) 与萘啶酸的结合常数，这些数据支持了药物作用 并非在细胞外作用这一假设。萘啶酸，金属离子与d n a 之间形成配合物对抗菌 活性有一点的影响。 b a r b a b e h r e n s h3 等报道了萘啶酸与c r ，m n ，f e ，n i ，c u ，z n ，m g ，c a ，h g 等形成一系列配合物的制备方法及光谱性质。通过元素分析确定萘啶酸与大部 分二价金属离子形成摩尔比为2 ：1 的配合物。与部分金属离子形成配位聚合物。 通过红外分析，其中c u ，f e ，p d ，c r 与萘啶酸以螯合形式结合，其他则以桥连 形式配位。 m e n d o z a d i a z 哺1 通过1 3 c n m r 研究发现，萘啶酸在水溶液中与c u ( ii ) 发生 螯合作用，成键的位置取决于溶液中其他配体的性质。在没有配体的情况下， c u 与萘啶酸3 位羧基氧原子结合，在有p h e n 的情况下，c u 与萘啶酸通过3 位 羧基氧原子和4 位酮基氧原子配位。 m a e n g 等1 通过紫外光谱法研究了萘啶酸与金属离子如c u ( i i ) ，t b ( i i i ) 等相结合的的金属药物。他们还研究了萘啶酸金属药物对大肠杆菌细菌生长的 影响。这砦配合物对细菌生长的影响比没有金属配离子的更加有效。金属配合 2 武汉理工人学硕士学位论文 物的抗菌作用也许涉及到抑制d n a 的合成。 d j u r d j e v i c 等口3 通过p h 测定和光谱法( 紫外和荧光法) 研究萘啶酸和c d 2 + 离 子之间的平衡。在0 i m k c i 介子中，在2 9 8 k 下，计算了配合物及其络合的稳定 常数。 m e n d o z a d i a z 眵1 报道了【z n ( n - n ) ( n a l ) ( x ) 】n h 2 0 系列混合配合物的合成和表 征。其中n - n 位p h e n 等配体，n a l 是萘啶酸阴离子，x 是硝基或者氯离子。由 c n m r 研究可以推出配合物具有五配位三角双锥形结构。其中萘啶酸阴离子通 过三位羧基氧原子和4 位酮基氧原子结合。 张秀利1 等研究报道了诺氟沙星与n i ( 1 i ) ，c u ( i i ) ，z n ( i i ) 硝酸盐的配位情况， 通过元素分析，红外分析，热重分析表明n i ( i i ) ，z n ( i i ) 的硝酸盐与诺氟沙星的配 位化合物是 n i ( n f a ) e ( n 0 3 ) n 0 3 2 h 2 0 ， z n ( n f a ) 2 ( n 0 3 ) n 0 3 2 h 2 0 ，配位数是6 ， 内界的n 0 3 以双齿形式配位，c u ( u ) 石o 酸盐与诺氟沙星形成的配合物的化学式 为 c u ( n f a ) 2 】( n 0 3 ) 2 h 2 0 ，配位数是4 。诺氟沙星分子均以内盐形式用c o o 一和 金属离子进行双齿配位。 陈亮n 们等人通过1 h n m r 研究过度金属与诺氟沙星形成配合物的配位点的 情况，通过测定加入过渡金属离子前后，诺氟沙星不同位1 h 的t 1 值的变化， 来确定配合物的结构。研究表明，加入过渡金属离子后不同位的1 h 的t 1 值均 有不同程度的减小，但是2 h ，5 h 的t 1 值减小的最为明显，而加入m n ( i i ) ，f e ( i i i ) 比加入c r ( 1 l i ) 离子时对t 1 的影响值更大。这是因为m n ( i i ) 和f e ( i i i ) 有五个 成单电子( 3 d 5 ) ，具有很强的顺磁性，而c r ( i l i ) 有三个成单电子( 3 d 3 ) ，所以 顺磁性相对m n ( i i ) 和f e ( i i i ) 来说要小。根据驰豫理论知，在过渡金属顺磁离 子溶液中，对驰豫的影响主要为偶极作用，而在某些离域体系中( 如自由基) ， 才主要受接触作用控制。这样就加速了能量传递过程，缩短了磁化强度矢量向 平衡位置恢复的时间，所以t 1 减小。 由分光光度法测定配合物配合比的摩尔比率法知，这几种金属离子与诺氟 沙星可形成两种配合物，在过渡金属离子浓度低时配合比为1 ：3 ，即形成六配 位配合物。在过渡金属离子浓度增加是，配合比位l ：2 ，即形成四配位的配合 物。这是因为过渡金属具有部分填入电子的次外层d 轨道，而第一列过渡金属 可以用来键合的原子轨道是3 d 4 s 和4 p ，所以六配体是过渡金属常见的配位数， 而八面体是过渡金属常见的立体构型。c r ( ii i ) 离子的组合态是3d 3 ，因而容易形 成3 d 1 4 s 4 p 3 杂化轨道，所以常形成六配体的八面体构型的内轨型配合物。而 3 武汉理t 大学硕士学位论文 f e ( i i i ) 和m n ( i i ) 的组合态均为3d 5 ，因而它们容易形成4 s 4 p 3 4 d 2 杂化轨道，可能 形成六配体的八面体构型的外轨型配合物。除了六配位的化合物外，四配位的 化合物也很常见，它既可以是平面正方形也可以是四面体立体化学构型，所以 c r ( i i i ) ，m n ( i i ) 和f e ( i i i ) 离子还形成4 s 4 p 3 杂化轨道，故还能形成四配位的配 合物，这也与光度法测定的结果一致。 由于2 - h ，5 - h 的1 h 的t 1 在加入过渡金属离子前后的变化值最为明显，这 就证明了过渡金属离子可能和3 位羧基氧原子和4 位酮基氧原子结合。 1 3 喹诺酮金属配合物的生物活性研究 在研究喹诺酮的配位化学的同时，也报道了对喹诺酮的金属配合物的生物 活性进行了研究。 杨频q 2 1 等用纸片扩散法对两个诺氟沙星稀土( n d ，e r ) 配合物和两个过渡 金属z n ( i i ) 和f e ( i i i ) 配合物的抗g 一( 大肠杆菌，痢疾杆菌) 和g + ( 金黄色葡萄球 菌) 活性进行了研究，发现稀土配合物的抗菌活性比诺氟沙星的要强，而两个过 渡金属配合物则在抗g 上强于诺氟沙星。 1 4 金属配合物与d n a 作用的研究 配位化合物在科学实验和生产实践中有着广泛的应用。许多金属配合物可 以有效地用作抗癌药物、杀菌剂和抗生素。研究表明，含杂环的药物与d n a 作用时，平面芳香配体部分嵌入到d n a 相邻碱基对之间。这一插入作用是药 物与d n a 结合的一个重要模式。而且有实验证明金属插入试剂是这种结合模 式极有用的探针。无机金属离子配合物，尤其是具有八面体结构的过渡金属配 合物与d n a 相互作用的研究也一直受到人们的重视降2 7 。，过渡会属离子配合物 构成了d n a 靶向化合物的一大类。八十年代初期，研究发现配合物z n ( p h e n ) 3 2 + 的不同异构体与d n a 作用时存在选择性，由此在生物无机化学方面开辟了用 金属配合物作为d n a 结构探针的新的研究领域。近年来会属配合物与d n a 的 相互作用同益引起了人们的重视，是因为这类化合物具有以下诱人的应用前景 ( 1 ) 用作核酸的光裂解试剂和示踪试剂，从而实现对d n a 的某些位点的特异性 剪切，即化学核酸酶。( 2 ) 作为核酸非放射性的发光或电化学发光标记物。( 3 ) 4 武汉理工大学硕士学位论文 可望帮助人们了解d n a 损伤和修复的机理，从而合成出对某些与基因突变有 关疾病的治疗药物。( 4 ) 用作核酸二级或三级结构的探针。b a r t o n 在研究金属配 合物与d n a 作用时发现z n 2 + ，c 0 3 + ，r u 3 + 等配位饱和的八面体手性配合物探针具 有识别d n a 二级结构的能力，从而发展了能识别a 、b 和z 型d n a 的手性配 合物探针，其识别机理在于当具有稳定构型手性配合物与不同构型的d n a 作 用时，由于手性匹配或微环境的差异，配合物的光谱特征及其它性质会出现不 同程度的扰动，据此判断其识别情况。 1 5 金属配合物与d n a 作用的基本形式 共价结合是较强的一种结合方式，非共价结合作用相对较弱，包括插入作 用、沟区结合、静电作用等模式。小分子与d n a 的结合是通过一系列的弱相 互作用进行的，如在碱基对之间芳环杂环基团的插入可产生兀堆积作用从而使 d n a 稳定，以及通过形成氢键和范德华力与d n a 的双螺旋沟结合n3 1 。金属配合 物与d n a 的作用通常是通过插入和表面结合沟两种方式进行。 ( 1 ) 配位结合 小分子配合物与核酸的配位结合方式是配合物所特有的。软金属离子如 p t ( i i ) ，p b ( i i ) ，r u ( i i ) ，r h ( i i ) 等和核酸的碱基的亲合性原子之间可以产生配位结合。 随着软度减小，过渡金属离子还能与磷酸根的氧原子配位结合。通常，与碱基作 用会降低双螺旋的稳定性，而与磷酸根结合则会增加双螺旋的稳定性。 ( 2 ) 插入结合 插入结合方式是配合物和许多小分子与核酸都会发生的结合方式n 4 。15 1 ，配 位饱和的配合物一般是通过平面芳香杂环配体插入d n a 的，并且与d n a 中的 碱基对重叠，通过p p 堆积作用及疏水作用而稳定。插入结合的作用力来自芳环 的离域p 体系与碱基的p 体系间的p p 相互作用及疏水相互作用，这是配合物分 子与d n a 发生作用最重要的形式之一。化合物具有平面构型将有利于插入作 用的发生，如具有蔡环及蔡杂环结构的化合物与双螺旋结构可较好匹配n6 j ，易于 发生插入作用。 配合物与d n a 的插入作用是一种比较重要的结合方式，配合物插入d n a 后，d n a 的稳定性增加，其物化性质表现特征是熔点升高，粘度增加，配合物的 吸收光谱强度减弱，最大吸收峰红移，荧光强度增强等。这些是检验配合物分子 武汉理工大学硕士学位论文 是否插入的重要手段。由于合成配合物的金属离子、配体可以改变，因而对金属 插入剂的结构设计具有广泛的灵活性，且配合物具有有机小分子所不具备的庞 大体积和特殊构型，插入时比有机小分子具有更好的序列选择性。 影响药物嵌插方式的因素具体而言有以下几点n7 1 ：( 1 ) d n a 的结构：不同构 型的d n a 与同一化合物作用时其键合方式可能会有所不同。( 2 ) 化合物的形 状：化合物的形状与d n a 的匹配程度决定了药物与d n a 的作用方式。采取刚 柔结合的设计思路，即有嵌入d n a 碱基对之间的刚性平面为插入点，又有与 d n a 特异结合的柔性侧链作为导向连接结构，且末端具有能断裂d n a 的生物 活性部位的不同系列化合物，有利于嵌插作用。( 3 ) 插入基团：化合物以嵌插方 式与d n a 结合要求药物的插入基团要有较好的平面性、适中的平面面积和疏 水性。药物插入配体的平面面积与插入强度成正比，但当增大的面积与插入基团 不在同一平面内而使空间位阻增大时，药物与d n a 的作用反而会减弱。当插入 基团相同，适当增加辅助支链的疏水作用，也可增强药物与d n a 的结合。( 4 ) 取代基的差异：当药物嵌入d n a 时，取代基空间位阻过大就会减弱这种作用。 虽然大的取代基不利于嵌入剂与d n a 相互作用的动力学因素但却有利于其与 d n a 碱基之间的堆积作用。一些非融合型链状芳环系统的嵌入剂分子的末端带 有正电荷而与d n a 之间也有嵌入作用，这很像小分子与沟槽结合的模式。同一 取代基，据不同的位置时，生物活性不一样，而且取代基不同，药物的生物活性也 会发生很大的变化。但是与未取代的化合物相比，无论是亲电子基团还是斥电子 基团的取代都会增强小分子与d n a 的结合强度。 ( 3 ) 沟区结合 靶向配合物分子与d n a 的大沟或小沟的碱基对边缘直接作用。大沟区、 小沟区在电势能、氢键特征、立体效应、水合作用上都有很大差别。很多大分 子蛋白质与d n a 特异性的结合是通过d n a 大沟区作用。而分子量小的靶向配 合物分子则是在小沟区作用。典型的小沟区结合的靶向配合物分子都含有几种 简单的芳香杂环结构如呋喃、吡咯或苯环，这些芳环由扭转自由的键来连接，由 此产生合适的扭转力来配合小沟区内的螺旋曲线，取代沟区中的水分子并与双 螺旋链中沟区的碱基对边缘通过范德华引力形成接触，从而导致靶向配合物分 子在小沟区结合的特异性。小沟区是a t 富集区，不像g c 富集区比较宽，在宽的 区域靶向配合物分子缺少明显的结合部位，比较松散，特异性不明显。而在a t 富 集区，靶向配合物分子通过与胸腺嘧啶碱基c - 2 上的羰基氧或腺嘌呤碱基n 一3 上 6 武汉理工大学硕士学位论文 的氮形成氢键与a t 碱基结合。虽然同样的基团在g c 碱基对上也存在，但是鸟嘌 呤上的氨基在氢键形成时有立体障碍，对于靶向配合物分子进入g c 富集区有一 定的抑制。总之，小沟区结合的靶向配合物分子就这样选择性地作用于d n a 双 螺旋结构中a t 较丰富的片段，通过氢键、范德华引力等作用，非嵌入性地捆缚住 d n a ，从而阻止d n a 的模板复制，起到抗病毒、抗肿瘤的作用。小分子化合物 一般在小沟区与结合，主要依靠氢键和碱基的疏水性起稳定作用。科学家早期对 于一些小分子药物与d n a 的结合研究表明，许多酞胺类的小分子药物是以氢键 等作用方式结合在的小沟中。这些小分子的共同特征是具有柔韧的一维链状多 酞胺结构，这些特征决定了它们能与小沟中的碱基进行多点的氢键结合。 ( 4 ) 静电结合 d n a 是一个高度带电的聚合电解质，它的阴离子磷酸根骨架强烈地影响 d n a 的构象及其反应。这种带电的高聚物的构象需要在以靶向配合物分子作为 抗衡离子的协同作用中达到完全稳定。这种沿着螺旋外部静电相互作用都是非 特异性的。因此认为，静电结合没有选择性，作用于磷酸骨架。大多数金属阳离 子与d n a 间都存在静电作用，但这种静电结合力非常弱。c o ( b p y ) 3 3 + ( b p y ：2 ，2 联吡啶) 与d n a 的作用目前普遍认为属于静电作用模式n 引，以及文献报道的 r u ( p h c n ) 3 】z + 也是通过静电作用与d n a 结合n 9 1 。 1 6 金属配合物的研究方法 1 6 1 紫外光谱法 紫外、可见吸收光谱法啪瑚3 是研究小分子与核酸相互作用机理的最常用、 方便的方法。含有碱基生色团的双螺旋结构d n a 分子，其紫外、可见吸收光 谱在2 6 0 n m 附近有一强的吸收峰，某些小分子如金属配合物亦有吸收谱带，可 根据相互作用前后d n a 或其它分子的吸收带的变化对二者相互作用模式进行 判断。( 1 ) 对d n a 的吸收光谱来说，增色和减色效应口是d n a 特有的与其双 螺旋结构密切相关的光谱性质。如导致分子的轴向变化即其构象变化，则产生 减色效应及红移现象，这是由于配合物可能替代了d n a 周围的内层和弥散外 层阳离子，与d n a 的磷酸基团作用而稳定了d n a 的双螺旋结构，致使d n a 双螺旋结构中堆积的碱基间的电子相互作用增强，从而降低了嘌呤碱及嘧啶碱 7 武汉理工大学硕士学位论文 对紫外光的吸收。增色效应的出现，说明d n a 双螺旋结构被破坏。( 2 ) 对于 金属配合物等小分子的特征吸收谱带，加入d n a 后，若配合物的吸收强度减 小，波长红移，可认为是配合物插入d n a 的证据之口引，且作用越强减色效应 越明显n 3 i ，如该分子与d n a 发生静电作用或沟槽作用，紫外可见吸收光谱峰 将出现较小的红移，且其减色效应不明显。 1 6 2 电化学方法 自b a r d 等人最先用电化学方法对溶液中的电活性金属配合物与d n a 相互 作用进行研究后m 3 ，电化学研究方法迅猛发展，现在电化学方法己成为研究金 属配合物与d n a 相互作用的一种重要的方法。电化学方法研究核酸与金属配 合物的相互作用是基于核酸分子存在与否时体系电化学特性的差别，包括由于 嵌插反应引起的体系式电位的变化和当金属配合物与核酸分子结合后其扩散系 数值大幅度的下降而导致扩散电流的减小等电化学行为的差别。b a r d 等朝提出， 当金属配合物与d n a 发生作用时，如果式电位e 。向负方向偏移，则金属配合 物与d n a 发生静电作用：如果e 。向正方向偏移，则发生嵌插作用。常用的电化学 方法有循环伏安法、线性扫描伏安法、方波伏安法、微分脉冲伏安法、电位溶 出分析法和电致化学发光法。r o d r i g u z e 等m 1 利用循环伏安法和电化学发光法研 - j o s ( b p y ) 3 2 + 】与小牛胸腺d n a 之间的作用，发现其氧化形式【o s ( b p y ) 3 2 + 】与 d n a 的作用更强烈。李红等b 7 3 采用电化学方法( 循环伏安法和微分脉冲伏安法) 研究了铜( i i ) 邻菲咯琳蛋氨酸配合物与小牛胸腺d n a 的相互作用，发现铜( i i ) 邻菲咯琳蛋氨酸配合物与d n a 的作用较强，作用模式为部分插入作用。t h o r p 等。硌圳用微分脉冲伏安法测定了钴、锇和钉的p h e n 、b p y 配合物与d n a 结合的 结合常数，并利用循环伏安法对d n a 与金属配合物的结合和氧化以及电子转 移的动力学过程进行了报道。t h o r p 等渺拍1 对r u ( b p y ) 3 2 + 电催化氧化d n a 的机 理及其溶剂效应等进行了详细的研究。电化学方法还用于手性分子与核酸的相 互作用h 引。基于d n a 修饰电极发展起来的表面电化学方法h 7 1 ，具有简便、可 靠、d n a 用量少等优点，仅用3 1 5 u g 的d n a 即可获得相互作用的热力学及 动力学参数。 武汉理工人学硕士学位论文 1 6 3 等温微量热法 量热法用于微生物研究已经有9 0 年的历史，但是由于实验技术的限制，只 是到了二十世纪六十年代末期，高精度、微量化的量热计问世以后，人们开展 对微量热的研究，并取得了很大的进展，微生物的量热研究应用主要有以下几 个方面： ( 1 ) 微生物生长热谱的测定 因为不同种类的微生物，它们的生长代谢不一样，热谱也会各不相同。1 9 7 3 年b o l i n g h 鲫等用多通道量热计对大肠杆菌的1 0 个属1 7 种不同的细菌进行量热 实验，发现可以获得重现型较好的特征热谱图，因此他们提出，以细菌的产热 曲线可以作为细菌的“指纹图谱 对细菌进行种的鉴定是可行的。但是必须严 格控制实验条件，比如测定方法，培养基，温度等等，才有良好的重现性。 细菌接种到均匀的液体培养基后以二分裂法繁殖，分裂后的子细胞都具有 生活能力。在有充足营养物、保持整个培养基体积不变的条件下，以时间为横 坐标，以细菌数为纵坐标，根据不同培养时间罩细菌数量的变化，可以作出一 条反映细菌在整个培养细菌变化规律的曲线。传统的细菌计数方法有显微镜直 接计数法、平板菌落计数法和光电比浊计数法。假设一个细菌代谢放热功率为 w ，则n 个细菌放热的功率pa 厅w 。如果能测量出每个时刻的放热功率，那么 就能绘出细菌的生长产热曲线。屈松生等h 玑驯，在国内首次用微量热法对细菌 生长产热曲线进行了研究，测得了完整的细菌生长产热曲线。 它们的停滞期、指数生长期、稳定期和衰亡期等均十分完整，并与培养过 程的各个阶段能很好的吻合。在相同的实验条件下，其生长曲线具有良好的重 现性，可利用它作为“指纹图 对细菌进行鉴别。微量热法可用鉴别细菌的变 异株啼1 | ，还可用来研究l 型细菌的生长及其返祖现象凸刳。在这些细菌生长曲线 中还包含有丰富的热力学和动力学信息，已引起了微生物学、医学和热化学工 作者的高度重视。 微量热法研究微生物生长代谢的动力学性质就是利用化学动力学原理对微 生物生长代谢热谱进行研究，可以得到速率常数等动力学参数。通过化学动力 学的处理方法，对微生物生长代谢的热谱进行研究，得到一系列微生物生长代 谢过程的热动力学方程3 刮。 在细菌的生长的指数生长期，细菌数量呈指数增加，如果在初始时刻( t = 0 ) 9 武汉理工大学硕士学位论文 细菌的数目为n o ，t 时刻细菌的数目位n 。，则 尢f = r t0 e i k 是生长速率常数，如果每个细菌的发热功率为w ，那么 i z t w n o w e 缸 p o = n o w ，p n t w ，即 p f = p o e 。b l i l p t = i n p o + k t 其中，p 。就是热谱曲线上t 时刻的热输出功率，因此从热谱曲线上取一系 列的t 时刻的热输出功率p 。，以上面数学公式进行拟合，可以求出细菌的生长速 率常数k 畸3 。 死= i n 2 k 根据所得的生长速率常数k ，可以计算传代时间t 。 根据细胞在不同条件下的生长特征，可以得到一系列规律性的热动力学模 型。如：指数式生长模型聆引、算术级数式生长模型嘲1 、有限生长模型脚、限制 性生长模型呦1 、产物抑制生长模型、非理想式生长模型呻1 、细菌生长温度敏 感性障朝等模型。从而进一步揭示了微生物生长代谢过程的热动力学规律。 ( 2 ) 微量热法研究药物对微生物生长代谢的作用 微量热法研究细菌的生长代谢主要基于细菌生长代谢过程中代谢热的释 放。当细菌生长代谢过程受到药物作用时，其代谢热会发生改变，代谢热的变 化反映了药物对细菌代谢过程的作用。因此，可用微量热法来研究药物对细菌 的作用。 早期用微量热法研究药物对微生物的作用主要停留在定性方面，m a r d h e 畔3 等人研究了不同的1 3 一内酰胺抗菌素对金黄色葡萄球菌的作用，结果发现加入 青霉素g 和氨比西林后细菌生长代谢的热谱发生了变化，而且各不相同。 b e e z e r 州1 等在微量热法研究药物对微生物作用的定量方面作了大量的工作，他 们研究了烷基苯酚同系物对大肠杆菌的作用，发现药物剂量的对数与量热响应 之间存在线性关系，且发现该线性关系的截距与烷基侧链的碳原子数目有关。 它将化学结构直接与作用联系在一起。他们以酿酒酵母为实验对象，广泛研究 了抗菌素的抗菌作用，并建立了定向构效关系( q s a r q u a n t i t a t i v es t r u c t u r e a c t i v i t yr e l a t i o n s h i p ) 。 1 0 武汉理工大学硬士学位论文 ( 3 ) 微量热仪器 3 1 3 4 3 2 3 6 t a m a i r i s o t h e r m a l c a l o r i m e t e r 圈1 2微量热仪 本实验所用仪器是一种热导式热量计，即根据热流原理。使样品困物理变 化或化学反应所产生的热迅速地流向恒温的环境。每一个通道包括两个测量筒 ( a 为样品池，b 为参比池) ，其中有两个赛贝克热传感器，一个在样品池下面， 一个在参比池下面。样品和它的环境之间温差所引起的热交换主要通过热流传 感器。相应地在该传感器中形成一个正比于热流速度的电势信号。参比中装有 与样品热容相同的物质，两者实行孪生式对接，这样就消除了因外界温度波动 产生的背景噪音，大大提高了仪器的检测灵敏度。 与传统热导式量热仪用水浴来控温所不同的是，t a ma i r 通过循环恒温空 气来控制体系温度，如图1 2 所示。其外面是一个绝热层，用来维持系统内部 的稳定，其内部的温度控制是通过一个连接了温度传感器的铂耳模块来实现的。 铂耳模块的作用是根据来自温度传感器的信息加热或制冷( 其制冷是半导体制 冷，这一点与传统量热仪也不一样) 。当温度传感嚣检测的温度低于设定的温度 时，铂耳模块就开始加热，反之则开始制冷。量热单元用一个矩形钢制盒子装 着，它和铂耳模块之间有一个风扇，用来使体系内的空气不断循环以维持整个 体系的温度均一和恒定。 专萱 武汉理工大学硕士学位论文 1 7 选题思路 通过对喹诺酮药物的发展，喹诺酮和金属配位的作用，喹诺酮和金属配和 物与d n a 的相互作用，喹诺酮配合物的生物活性等方面的综述，我们可以看 到，随着抗生素类药物的发展，其结构也越来越复杂，开发成本也同趋提高， 生物的抗药性也变得更强，如何发展新的药物是一个值得进一步研究的课题。 本文主要以金属离子的生物功能为依据选择金属离子旧1 ，以诺氟沙星为金 属配体，合成一定数量的诺氟沙星金属配合物，并合成相对应的诺氟沙星一金属 一邻菲哕啉三元配合物，对配合物的结构和配体间的弱相互作用进行探讨，并通 过紫外光谱法研究诺氟沙星金属配合物与d n a 的相互作用。 表1 1金属离子的生物功能 金属 生物功能 铜 镁 钴 镍 锌 锰 氧化酶，双氧运输，电子转移 结构，水解酶，异构酶 氧化酶，烃基转移 加氢酶，水解转移 结构，水解酶 结构，光合作用，氧化酶 通过微量热法研究诺氟沙星金属配合物，诺氟沙星一金属一邻菲哕啉三元配 合物与大肠杆菌，四膜虫的作用，计算大肠杆菌，四膜虫在这些配合物作用下 的生长速率常数，从量热学的角度探讨它们相互作用的机理，这对研究诺氟沙 星配合物的生物功能有重要的意义。选择大肠杆菌为生物模型，是因为不论是 高等动植物，还是微生物，它们之间有高度的生物化学同一性，生物体内的代 谢等一系列变化基本相同。选择四膜虫是因为它作为一种外面覆盖有类似头发 的纤毛的单细胞生物，虽然并非是最为耀眼的真核生物，但它除了可作为功能 强大的模式生物外，在真核生物蚩白的过度表达这一生物技术领域它也具有应 用前景，而这些蛋白表达还无法在目前的大肠杆菌这类粗糙的模式系统中得以 实现。大肠杆菌和四膜虫还均具有材料易得，容易培养等优点。 1 2 武汉理工大学硕士学位论文 第二章金属离子与诺氟沙星配合物的合成、表征 2 1 引言 配位化合物简称配合物，又称络合物，是一类非常广泛和重要的化合物随 着科学技术的发展，它在科学研究和生产实践中显示出越来越重要的意义，配 合物不仅在化学领域里得到广泛的应用，并且对生命现象也具有重要的意义。 金属离子在很多生物活动过程中都有重要的用途，因此，这些金属离子与 很多有生物活性的配体的作用，比如说药物，成为一个很有研究意义的课题。 喹诺酮药物如诺氟沙星，环丙沙星等，对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均 有抗菌作用，喹诺酮类药物3 位羧基和4 位羰基的氧原子均有很强的配位作用， 容易与金属离子相结合。因而，有报道认为，金属离子的存在对这些药物的吸 收有伤害，比如一份研究表明旧1 ，志愿者服用5 0 0 m g 环丙沙星后，同时服用z n ( 2 3 9 m g ) ，c u ( 4 m g ) 和维生素片剂后，环丙沙星在血液中的浓度降低。为此有人 提出，造成生物活性降低的原因是药物在胃液系统中形成了配合物。 研究喹诺酮分子与金属离子的配位化学，对生物学和药物化学而言，有很 重要的意义，因此，本章在根据现有文献研究报道的基础上，选择诺氟沙星作 为喹诺酮药物分子的基础配合物，合成了铜，锰，锌，镍，钴，镁金属离子的 6 个诺氟沙星一金属离子配合物，同时引进含有n - n 配体的邻菲哕啉，合成诺氟 沙星一铜一邻菲哕啉三元配合物。 2 2 实验部分 2 2 1 主要原材料 本实验以诺氟沙星药物为基本配体，加入不同的金属盐与之相配合，合成了 诺氟沙星一会属配合物。同时用邻菲哕啉为第三配体，