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对棉花降解的微生物群落基因组学进行生物勘探：新型糖苷水解酶的挖掘Guoxiu Zhang, Pei Liu, Lei Zhang, Wei Wei, Xuedong Wang, Dongzhi Wei, Wei Wang*生物反应器国家重点实验室，新世界生物技术研究所，华东理工大学，上海200237，中国摘要高效表达的糖苷水解酶（GHases）急需用于工业生产过程中将植物生物量有效降解成可发酵性糖。目前的研究表明涉及粗棉生物降解的没谱的功能特征。细菌与底物的物理接触对于纤维素的高效水解是必须的。噬纤维菌目通过16S rRNA分析鉴定为普遍存在的菌落，在棉花生物降解中扮演重要的角色。从宏基因组数据中确定了2058中糖苷水解酶同工酶，其中16个在大肠杆菌中成功表达。其中四种酶对对硝基苯基-D-吡喃木糖苷有活性，四种对对硝基苯基-D-吡喃葡萄糖苷有活性，两种具有对硝基苯基-D-葡糖苷酸抗性，一种对昆布素有活性，三种具有对硝基苯基-D-氨基葡糖苷抗性，一种对羧甲基纤维素有活性，一种对对硝基苯基-D-甘露糖苷有活性。宏基因组为新型生物降解酶的挖掘提供良好的资源。被克隆的16种糖苷水解酶在生物转化和生物产品的生产方面有潜在的应用。棉花生物降解的酶谱的功能特征和糖苷水解酶的分析为酶的合成与分解提供见解及植物生物降解的途径。文章信息文章历史：2016年3月30日发送2016年7月20日修订2016年7月22日接受2016年7月25日网上发布关键词：糖苷水解酶微生物群落宏基因组学天然棉花表达1.引言组成高等植物细胞壁主要成分的纤维素和半纤维素是地球上最丰富的可再生碳源(Kobayashi et al., 2016)。自然环境中，植物体被微生物菌落产生的纤维素酶降解。糖苷水解酶是分布广泛的能够水解糖苷键的酶，主要参与植物体的降解 (Davies and Henrissat, 1995)。纤维素是水不溶性的线性聚合物，由重复的-D-吡喃葡萄糖单元组成。纤维素的微生物降解涉及纤维素水解酶之间的复杂协同作用。普遍知道有三种类型的纤维素酶，包括内切葡聚糖酶，外切葡聚糖酶和-葡糖苷酶协同涉及纤维素的完全水解(Lynd et al.,2002)。植物细胞壁中含量仅次于纤维素的半纤维素，是包含木聚糖、阿拉伯木聚糖、甘露聚糖、半乳甘露聚糖、葡糖甘露聚糖等的异质体(Girio et al., 2010)。半纤维素酶如木聚糖酶、甘露聚糖酶、-木糖聚美、-甘露聚糖酶、-阿拉伯呋喃糖苷酶和-半乳糖苷酶，也在纤维素解聚过程中扮演着水解去除半纤维素成分的角色。在过去十年的纸浆制造，食品和饲料加工以及生物燃料生产中，对纤维素酶和半纤维素酶的应用越来越感兴趣(Juturu and Wu, 2014)。纤维素酶和木聚糖酶已被用作纤维性能的生物修饰，从而改善纸浆制造的排水和透气性(Dienes et al., 2004)。苹果酸酶（纤维素酶、木聚糖酶、果胶酶）已被用作果汁蔬菜汁的提取和澄清(de Carvalho et al.,2008)。当前，对使用含高水平纤维素酶和半纤维素酶的酶来改善青贮饲料的利用、谷物脱壳和更好的饲料乳化是极其有意义的(Juturu and Wu, 2014)。使用纤维素酶来水解木质纤维材料中的纤维素是很吸引人的，因为酶解聚作用是生态友好的。将木质纤维素分解为简单糖类吸引了越来越多的生物能源工业。然而，廉价纤维素酶和半纤维素酶的大规模生产仍是一大瓶颈。为了满足工业过程中纤维素酶和半纤维素酶的新兴需求，立即需要具有更好性能的微生物纤维素酶和半纤维素酶来降低工业生产成本(Himmel et al., 2007; Juturu and Wu, 2014, 2013, 2014)。在自然界中，植物体被复杂的微生物过程分解。植物细胞壁-降解装置在好氧和厌氧微生物体有明显区别(Shallom and Shoham, 2003) 。已经报道了以游离酶或多蛋白复合物的形式分泌这些装置的微生物。有趣的是，某些好氧滑动细菌有很强的纤维素降解能力，如噬纤维菌、生孢嗜纤维菌表现独特的纤维素降解活性，它能在低营养条件下迅速水解结晶纤维素，但是胞外纤维素降解活性十分低(Zhu et al., 2010)。直到现在我们对于基因的组分、协同相互作用以及微生物菌落的植物体降解途径的认识仍是肤浅的。我们需要更深入的研究去更好的理解酶解、微生物解以及植物细胞壁相关的发酵过程。据估计，大约有4-61030原核生物栖息在地球上，每克土壤约有4000种(Curtis et al., 2002; Curtis and Sloan, 2004)。虽然土壤微生物群落非常复杂，但它们被证明是探索新型植物生物降解生物体和酶类的有吸引力的来源。然而，大约95%-99.9%的微生物还未用标准实验室技术培养出来(Amann et al., 1990)。作为绕过基于培养方法的限制，宏基因组学正在成为直接研究微生物群落物种多样性、探索新型生物催化剂、从环境样品中分析其生物化学活性的有力途径(Lorenz and Eck, 2005; Li et al., 2009)。为了探索新型生物降解酶，Illumina Hiseq 2000 (Illumina Inc., San Diego, USA)常常调查土壤微生物群体降解天然棉花的能力，尤其着力于研究纤维素酶和半纤维素酶。为获得优势社区成员分布的代表性估计，使用Illumina MiSeq平台进行16S rRNA测序。对CAZy（/）数据库进行BLASTX检索，并鉴定了含有2058个候选基因的优势糖苷水解酶（GH）家族，并进一步研究了基因克隆、蛋白表达和粗酶表征。对土壤微生物群体的测序来挖掘新型生物降解酶会提高生物量转化和生物产物生产的技术。2.方法2.1. 土壤采样及加工从中国山东临沂棉花地收集到的土壤样品储存在冰箱中运送至实验室，大约100克亚样品储存在-80。为了增加生物量降解物的丰度并加快发现新的糖苷水解酶基因的过程，将样品悬浮液的稀释液在含有粗棉作为主要碳源的Mandels培养基（pH5.5）中的振荡烧瓶中在30下培养(Mandels and Andreotti, 1987)。悬浮液每7天传代培养一次，不含微生物悬浮液的培养基作为对照。从棉田传播土壤样品42次后，使用数码相机进行棉花分解的数字成像。微生物悬浮液和上清液的糖苷水解酶活性可通过p-硝基苯基底物或者多糖底物测定。2.2 基因组DNA分离通过富集培养的发酵液体培养基在10000g、4下离心10min。Sediments were collected for DNA extraction using the FastDNA SPIN Kit for soil(MP Biomed-icals, Solon, OH, USA)。用0.8%的凝胶电泳观察单体DNA提取物，DNA的浓度和提取物的纯度是由显微分光光度法所确定的(NanoDrop-1000, Thermo Scientific, Willmington, DE, USA)。最后，已经质检的DNA样品用于霰弹枪配对端库构建和随后的高通量测序。2.3 MiSeq 焦磷酸测序与16S 数据分析从基因组DNA中扩增得到的细菌16S rRNA基因的V4不变区用通用引物Y1和Y2.对真菌来说，引物ITS1和ITS2对ITS1进行扩增。PCR过程依据于先前的报道(Zhao et al., 2014)。成功扩增后，PCR产物在Personalbio（上海，中国）使用Illumina MiSeq（USA）进行末端焦磷酸序列测序。使用分割库中的默认参数对序列进行质量控制(Caporaso et al., 2010)。在除去条形码和引物序列后，剩下的序列以97序列同一性的级别聚类成操作分类单位（OTU）。使用RDP分类器对OTU代表序列进行分类(Wang et al., 2007) (补充材料 S1)。所得到的OTU表用于确定分类学相对丰度和随后的-多样性的统计分析2.4 HiSeq焦磷酸测序宏基因组测序是在中国上海的Personalbio用Illumina Hiseq 2000完成的(Illumina Inc., San Diego, CA, USA)。已经质检的DNA任意断裂成300-400bp的小片段。然后将含有标记的接头的小片段构建到DNA文库中，然后直接进行配对末端测序。测序策略是PE101 + 8 + 101周期的指标（配对末端测序，8bp指标序列对应可读101bp）。大约可从样品中产生3.3Gb的宏基因组数据。原始数据由FastQC进行初步评估（用于高通量序列数据的质量控制工具）。2.5 宏基因组分析根据原始数据的质量，通过Dynamic Trim.pl过滤序列，过滤低质量碱基，然后通过质量过滤筛选序列(Cox et al., 2010)。然后，除去小于75bp的序列，并将天鹅绒1.2.10用于拼接序列以获得的最终重叠群(Zerbino and Birney, 2008)。最终组装的重叠群体已提交给MG-RAST(http:/metagenomics.anl. gov/, accession number: 4557667.3)来完成基因功能注释（与GenBank比对）和注释分类（由NOG和SEED亚系统注释）（最大值是10-5，最小值是70%）。将糖苷水解酶序列的重叠群进一步提取并上载到MG-RAST(accession number: 4560530.3)。最后，糖苷水解酶序列的全长由ORFfinder工具(http:/www.ncbi. /projects/gorf/)、BLASTX(/ Blast.cgi)和NNPP(/seq tools/promoter. html)获得(补充材料 S2)。2.6 克隆并表达全长糖苷水解酶基因总共24个全长候选基因使用引物从宏基因组DNA进行PCR扩增，并根据每个候选序列进行设计。扩增片段随后用pEASY-Uni无缝克隆和装配套件（中国北京感受态细胞）根据制造商的协议克隆到表达载体pET22b中。通过DNA测序确认每个质粒，并将其导入大肠杆菌宿主BL21（DE3）或Transetta（DE3）（Trans-Gen，Beijing，China）用于蛋白质表达，大肠杆菌重组子在有50g/mL的氨苄青霉素的TB培养基中37下培养直到OD600nm=0.5-0.6，然后培养物用异丙基-D-硫代半乳糖苷（IPTG；0.05M最终浓度）18下诱导8h。细菌收获后，重悬于1/6培养基体积的裂解平衡洗涤(LEW)缓冲液(50 mM sodium phosphate, pH 7.0, 300 mM NaCl, 10 mM 2- mercaptoethanol, 10% Triton X-100),中，然后用超声波破胞。细胞裂解物离心并且用SDS-PAGE检测上清液与沉淀物。2.7 酶活性检测诱导细胞在100mM NaCl的50mM磷酸缓冲液（pH 4 to pH 10)）中收获和重悬。超声波破碎后，在37下，在40l含有100mM NaCl的50mM磷酸盐缓冲液（pH4至pH10）和50l0.5特异性底物（一式三份）中测试10l细胞裂解物。培养合适的一段时间后，加入100L的二硝基水杨酸并在99下加热10min是反应终止(Miller, 1959)。水解产物测540nm处的吸光值。用pNP进行的酶测试如下进行一式三份：10L的细胞裂解物在10L的5 mMNP底物和30L的50 mM 磷酸缓冲液 (pH 4pH 10)中培养。加入100L的1M 碳酸钠停止试验。水解产物对硝基苯基在405nm处测吸光值。候选蛋白的最适pH在最适pH范围中确定。纯葡萄糖、木糖、半乳糖醛酸和pNP用于制作标准曲线。底物从Sigma Aldrich公司(St, Louis, MO, USA)购买得到。3. 结果与讨论3.1 天然棉花降解和酶活性检测为了寻找相对不足的基因，富集可以增加其克隆的可能性，并加快发现新基因的过程。 在原始土壤样品悬浮液的作用下，棉花完全降解需要2个月。 从棉田传播土壤样品42次后，粗棉的降解速度越来越快。 7天内，絮状棉完全降解，液体培养基颜色从光线变为棕褐色（Figure 1）。对于控制变量，絮状棉花没有显着变化。此外，为了分析腐解过程，用对硝基苯基底物和多糖底物来检测微生物裂解物和沉淀物的糖苷水解酶的活性。即使活性很低，微生物裂解物仍能水解pNP-吡喃葡糖、pNP-吡喃木聚糖、pNP-氨基葡糖酸、pNP-吡喃甘露糖苷、pNP-纤维二糖糖苷和pNP-葡糖苷酸(Fig. 2A)。酶在广泛的pH(from pH 5 to pH 8).具有高活性。水解pNP-葡糖苷酸的最适pH在8；而对于pNP派生物最适pH是6.微生物裂解物对羧甲基纤维素和昆布素、，-1-3:1-6葡萄糖连接的多糖也展现活性(Fig. 2B)。然而，活性很低。类似的是，CMCNa仅被微生物裂解物水解并且对昆布素无反应。3.2 土壤微生物群落组成分析去除条形码和引物序列后，产生57883可阅读序列。典型的序列在分类学上用RDP分析，鉴定了97%序列相似的214操作分类单元。！16S 序列分析表明土壤微生物群体的多样性。阿尔法多样性由赵，ACE，辛普森，香农和Coverage五个指标估计（补充材料S3）,99.89%被完全覆盖。正如我们在宏基因组分析中发现的，Proteobacteria和Bacteroidetes代表了最丰富的微生物门（分别为72和17），其次是Firmicutes（10）(Fig. 3)。Proteobacteria占全社区的72，由-变形杆菌和-变形杆菌占主导地位（分别为41和26.1）。Gamma-Proteobacteria和-Proteobacteria主要由Burkholderiales（26），Pseudomonadales（19.7）和Xanthomonadales（14.2）的成员组成。伯氏假单胞菌，假单胞菌属和黄单胞菌属主要以大麦科植物（22.3），不动杆菌（11）和嗜麦芽窄食单胞菌（11.4）为主。细菌类主要由细胞吞噬体（14.3）主导，主要由Dy属（Dyadobacter）（14.2）表示。占总社区10的Firmicutes以芽孢杆菌属为主（9.99）。最后，还观察到一群仅占社区0.4的真核生物，表明真菌在粗棉分解中不起主要作用。3.3序列分析通常来说，使用其间隔为10bp的酶和该反应相容的缓冲液，否则双酶切应该顺序表达。当前研究表明，OM-6和OK-5碱性蛋白酶基因的扩增产物和pET21a用BamH1和Sal I双酶切(Fig. 2)3.2.3 限制性分析的克隆确认阳性菌株的确认基于质粒载体的氨苄青霉素抗性的参照特性。而且，含有蛋白酶基因的阳性克隆子的选择基于插入物的释放，并且我们观察到在琼脂糖凝胶上OM-6和OK-5的位置分别显示为大约1.2kb和0.5kb处。在克隆的每一步过程中基于生物信息学的工具CLC Workbench被用来预测结果以及规范化方案。在克隆到大肠杆菌BL21之前，选择大肠杆菌DH5菌株用于转化，因为对于目标DNA的起始克隆它是一个方便的宿主，因其具有高转化效率以及高质量DNA的产生。DH5不包含T7 RNA聚合酶的基因；这就使得在非表达条件下构建重组质粒显得不合理。当我们使用包含T7乳糖操纵子的质粒来表达时，宿主菌株中不包含用来目的基因表达的pLysS。宿主菌株蛋白酶不足对于我们近期研究时满意的，以保证菌株不仅促进功能性产物的形成，而且确保没有假阳性结果的几率。3.3 重组蛋白酶的表达将组装的重叠群体提交给MG-RAST（/）。 由于人造重复读取（ADR）未被检测到，只有一个序列未通过QC流水线。 共406,305个序列（包括190,880,944个基数对平均长度为469bps的对象）通过质量控制。约98.3（399,443）序列共产生461,990个预测蛋白质编码区，其中321,789个（69.7的特征）被使用至少一个蛋白质数据库 （M5NR），其余的140,201（30.3的特征）与蛋白质数据库（孤儿）没有显着的相似性。其余251,195个功能（321,789个注释功能的78.1）被分配到功能类别。 分析结果显示在MG-RAST网站上（登录号：4557667.3）。 如图1所示。 S1（补充材料S4），功能类别的百分比通过采集组装的重叠群构建。 结果表明，最丰富的类别是基于聚类的子系统，其中包括没有特定/已知任务的功能耦合证据的基因。 高度丰富的类别遵循碳水化合物，氨基酸，蛋白质和DNA / RNA代谢的预期顺序，也在MG-RAST服务器中的其他可比较的基因组中也类似地观察到。 另一方面，几种蛋白质与光合作用，次生代谢，休眠和孢子形成有关。致谢 S.D.Gohel 非常感谢印度新德里UGC的一等奖学金，这项工作是由印度拉杰果德Saurashtra大学赞助。参考文献1 M.S. 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