（发酵工程专业论文）耐低温、耐盐螺旋藻的选育.pdf

中文摘要 本文利用超声波处理方法制备钝顶螺旋藻( s p i r u l i n ap l a t e n s i 0 单细胞， 通过观察藻丝体的破碎程度以及藻丝段的平板再生情况，确定了超声波的最佳处 理时间：探索了出发藻株s p l 对高盐度和低温的敏感性；分别采用驯化和诱变 ( 紫外线、微波和5 e m s 与超声波的复合诱变) 处理方法，对螺旋藻s p l 进 行处理，通过低温驯化筛选到了l 株耐低温品系，通过诱变筛选到了5 株耐低 温突变株、1 株耐高浓度n a c l 突变株和l 株耐低温海水螺旋藻突变株，并对 这8 株耐性藻株的生化组分和生物学特性进行了研究，还利用r a p d 分子标 记分析了它们的遗传多态性，并与其形态学特征进行了比较，为进一步的遗传学 研究提供了理论依据。研究主要结果如下： 1 超声波最佳处理时间的研究 螺旋藻s p l 在经过超声波处理3 0 s 后，单细胞形成比例达6 8 3 3 ，藻丝 段基本控制在3 个细胞以内，且再生能力较好，适于进行诱变研究。 2 突变株生长特性和化学组分研究 与出发藻株s p l 相比，螺旋诱变株不仅在低温、高盐度条件下能正常生长， 在自然条件下也较出发菌株生长速度快。 突变藻种s p 2 、s p 4 、s p 5 、s p 6 、s p 8 、s p 9 和s p 7 的蛋白质含量比原始藻 种分别提高了2 0 8 、1 4 2 、1 0 7 、1 2 2 、3 3 1 、2 7 8 和3 0 9 ，而藻种s p 3 、 s p 5 、s p 9 、s p 7 的多糖含量也有明显升高，比出发藻种提高了3 7 8 、2 9 4 、 4 1 6 t d2 9 2 。另外s p 2 、s p 3 、s p 5 、s p 6 、s p 7 、s p 8 和s p 9 的胡萝卜素的含 量分别增加了4 0 o 、4 6 8 、4 6 、8 6 8 、5 0 4 、7 7 9 、1 2 3 6 、4 3 9 。并 大量积累了某些氨基酸。 3 突变株形态及基因组d n a 的r a p d 分析 对s p l 、s p 2 、s p 3 、s p 4 、s p 5 、s p 6 、s p 7 、s p 8 和s p 9 等9 株螺旋藻的藻 丝体的形态学特征进行了研究。结果表明，它们的形态具有一定差异。并利用若 干条随机引物对9 株螺旋藻的基因组d n a 进行r a p d 扩增，从中筛选出1 0 条 扩增多态性良好的引物。用s p s s 软件对扩增结果进行聚类与亲缘关系分析，结 果表明：9 个藻株在d n a 水平上存在着较大的差异，它们之间的基因组d n a 扩 增多态性片段同源性仅为3 3 - 5 6 ，可将这9 株供试菌株基因型划分为五大类， 这一结果与藻丝体显微形态特征的分类结果有较大出入。因此，仅依据形态特征 对螺旋藻进行分类是不合理的。当然，要对8 株未知菌鉴定到种的水平，还需 运用其他分子生物学技术再次进行分析，并结合形态观察才可能给出准确的鉴 定。 关键词：螺旋藻；驯化；诱变；低温；耐盐；r a p d a b s t r a e t i nt h i st h e s i s ，t h ee f f e c t so fu l t r a s o n i c so ns p i r u l i n ap l a t e n s i ss p ls t r a i nw e r e s t u d i e d ，t h eo p t i m u mt i m ep a r a m e t e r so ft ob r e a k d o w nt h ef i l a m e n t so fs pls t r a i nb y u l t r a s o n i c sw e r eo b t a i n e d t h es e n s i t i v i t yo fs pls t r a i nt oh i g hs a l i n i t ya n dl o w t e m p e r a t u r ew a si n v e s t i g a t e d d o m e s t i c a t i o na n du l t r a v i o l e t v ) ，m i c r o w a v e ，a n d 5 e t h y lm e t h a n es u l p h o n a t e ( e m s ) w e r eu s e dt od e a lw i t hs p ls t r a i n o n es t r a i n b e a r i n gl o wt e m p e r a t u r ew a so b t a i n e db yd o m e s t i c a t e di nl o wt e m p e r a t u r e ，a n d5 s t r a i n s b e a r i n gl o wt e m p e r a t u r e ，o n es t r a i nb e a r i n gs a l ta n do n es e a w a t e rs t r a i n e n d u r i n gl o wt e m p e r a t u r ew e r eo b t a i n e db yi n d u c e dm u t a t i o n s t h ep h y s i o l o g i c a l ， b i o c h e m i c a la n db i o l o g i cc h a r a c t e r i s t i c so ft h em u t a n t sw e r es t u d i e d ，a n dg e n e t i c d i v e r s i t yo fv a r i o u ss t r a i n so fs p i r u l i n ai sa n a l y z e dw i t hr a p dm o l e c u l a rm a r k e r ， t h e nt h er e s u l t sa r ec o m p a r e dw i t ht h e i rm o r p h o l o g i cc h a r a c t e r s w h i c hc a l lo f f e r v a l u a b l et h i n g sf o rf u r t h e rg e n e t i cs t u d y t h em a i nr e s u l t sa r ea sf o l l o w s ： 1s t u d i e so ns e l e c t i n gt h eo p t i m a lc o n d i t i o nf o rp r e p a r a t i o n so fs p s i n g l ec e l l s t h ef i l a m e n t sc a nb eb r o k e ni n t od i s i r e da v e r a g el e n g t hf r a g m e n t sc o n t a i n i n g1 - 3 c e l l s ，t h er a t eo fs i n g l ec e l l sw a su pt o6 8 3 3 a f t e r3 0 s p r e t r e a t e db yu l t r a s o n i c s ， a n dt h e s ef r a g m e n t ss t i l lh a dap e r f e c tr e g e n e r a t i o na b i l i t y ，s oi tw a sas u i t a b l e m a t e r i a l st om u t a t i o ns t u d y 2s t u d i e so ng r o w i n gc h a r a c t e r i s t i c sa n db i o c h e m i s t r yi n g r e d i e n tc o n t e n t so fm u t a n t s c o m p a r e dt ow i l ds p ls t r a i n ，t h ef i l a m e n t sp a t e mo ft h em u t a n t sh a v ec h a n g e d ， t h e i rg r o w t hr a t i o sw e r ef a s t e rn o to n l yi nl o w t e m p e r a t u r eo rh i g hs a l i n i t yb u ta l s oi n n a t u r a lc o n d i t i o n t h ep r o t e i nc o n t e n t so fm u t a n t sw e r eg r e a t l yi n c r e a s e s ，a n dt h e c o n t e n t so f p o l y s a c c h a r i d ei ns p 3 、s p 5 、s p 9 、s p 7s t r a i n si n c r e a s e db y3 7 8 、2 9 4 、 41 6 a n d2 9 2 ，a l s ot h e i rc o n t e n t so fc a r o t e n ew e r em o r e ，a n dc o r r e s p o n d i n ga m i n o a c i d sw e r ea c u u m u l a t e dt o o 3s t u d i e so nt h es p i r u l i n am o r p h o l o g ya n di t sr a p dm o l e c u l a rm a r k e ra n a l y s i s m o r p h o l o g i cc h a r a c t e r so f f i l a m e n t sa b o u t9s t r a i n so f s p i r u l i n a ( s p l ，s p 2 ，s p 3 ， s p 4 ，s p 5 ，s p 6 ，s p 7 ，s p 8 ，s p 9 ) a l es t a t i s t i c a l l ya n a l y z e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h e y h a v es o m em o r p h o l o g i ed i f f e r e n c e t h eh i g hq u a l i t yg e n o m ed n ao f9s t r a i n sw a si s o l a t e d 、析t hc t a bb u f f e r a n d t h eg e n o m ed n aa r ea n a l y z e dw i t hm u c hr a n d o mp r i m e r su s i n gr a n d o ma m p l i f i e d p o l y m o r p h i cd n a ( r a p d ) t e e h n i q u e w i t ht h em u c hr a n d o mp r i m e r s ，17p r i m e r s r e v e a l e dt h e i ro b v i o u sp o l y m o r p h i s m s c a l c u l a t e dw i n ls p s s t h er e s u l ts h o w st h a t t h e r ew e r eo b v i o u sd i f f e r e n c e si nt h em o l e c u l a rl e v e lb e t w e e nt h e9s t r a i n so f s p i r u l i n a ，a n dt h eh o m o l o g yo fd n a i nt h ea m p l i f i e dp o l y m o r p h i s mo ft h es t r a i n s o n l yr e a c h e s3 3 - 5 6 ，t h e yw e r ed e f i n e di n t o5c l u s t e r s t h ec l a s s i f i c a t i o no fr a p d a n a l y s i si sd i s c o n s i s t e n tw i t ht h ec l a s s i f i c a t i o no fm o r p h o l o g i cc h a r a c t e r i s t i c s s ot h e s p i r u l i n ac l a s s i f i c a t i o ne s t a b l i s h e dw i t hm o r p h o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c si su n r e a s o n a b l e am o r es c i e n t i f i ca n dr e a s o n a b l ec r i t e r i o nf o rt h es p i r u l i n ac l a s s i f i e a t i o nc a nb e e s t a b l i s h e d 谢t hr a p d t e c h n i q u e ，o t h e r m o l e c u l a r b i o l o g yt e c h n i q u e sa n d m o r p h o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c s k e yw o r d s ：s p i r u l i n a ，d o m e s t i c a t i o n ，i n d u c e ，l o wt e m p e r a t u r e ，b e a r i n gs a l t ，r a p d 论文、参加科研情况说明以及学位论文使用授权说明 论文、参加科研情况说明以及学位论文使用授权声明 一、发表论文 1 王妮，王素英，师德强螺旋藻诱变育种的研究进展叨食品研究与开 发2 0 0 9 ，3 2 ( 2 ) ：1 3 9 1 4 1 2 王妮，王素英，师德强耐低温螺旋藻的诱变选育 j 】安徽农业科 学2 0 0 8 ，3 6 ( 2 9 ) ：1 2 5 5 2 1 2 5 5 3 3 王妮，王素英，师德强钝顶螺旋藻单细胞的制备与再生研究 j 】食品工业科技( 已 接收) 二、参加科研情况 天津市重大科技攻关项目( n o 0 6 y f g z n c 0 4 2 0 0 ) “天津滨海地区适生螺旋藻藻种 选育中试研究及其生理活性物质研发”。 三、学位论文使用授权声明 学位论文作者同意授权天津商业大学将学位论文的全部内容或部分内容编入有 关数据库进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅或借 阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 第一章前言 第一章前言 螺旋藻( s p i r u l i n a ) 是一种主要分布于热带、亚热带地区淡水及盐碱性湖泊中 的多细胞丝状蓝藻( b l u eg r e e na l g a e ) ，又称蓝细菌( c y a n o b a c t e r i a ) ，属蓝藻门 ( c y a n o p h y t a ) ，颤藻目( o s c i l l a t o r i a l e s ) ，颤藻科( o s c i a l l a t o r i a c e a e ) ，螺旋藻属 ( s p i r u l i n a ) 。螺旋藻藻体蓝绿色，呈不分枝的螺旋形。目前在世界上共有3 6 - 3 8 个种n 3 ，其中多数为淡水种类，分布于海洋或碱性湖泊中的仅有4 种。迄今为止， 国内外工厂化大规模养殖的种类主要是钝项螺旋藻和极大螺旋藻瞳3 1 两种。 螺旋藻在地球上已生存了3 5 亿年之久h 1 。就其生长特性而言螺旋藻喜光， 喜高温( 2 6 - 3 5 ) ，耐碱( p h9 - 11 ) ，分布很广，主要生长在热带、亚热带的盐碱 湖中，在土壤、沼泽、淡水、海水和温泉中都有发现陆1 。 螺旋藻富含多种蛋白质、多种维生素、矿物质及多种生物活性物质，被认为 是人类未来最为理想的食品。也正因为螺旋藻的细胞壁薄、纤维素含量低，容易 消化吸收，各种营养全面等特点，螺旋藻在医药和保健食品领域的应用发展很快， 大量的实验证明螺旋藻能降低血液中的胆固醇含量，防癌抗癌、增强免疫功能及 增加肠道乳酸菌群，降低重金属和药物的肾毒性以及放射性防护作用。近年来， 螺旋藻以其极高的营养价值和独特的医疗保健功能，逐渐受到世界许多国家和国 际组织的重视。联合国粮农组织( f a o ) 誉之为“明天最理想的食品”，世界卫生组 织( w h o ) 称螺旋藻为“2 1 世纪最理想保健品”。 螺旋藻的开发利用具有广阔的前景，它潜在的巨大开发价值己越来越引起人 们的关注。近l o 年来，已有不少学者进行了以螺旋藻作为蛋白质饲料来源这个 项目的研究，而且取得可喜的成就，从实验室试验生产，现已发展工厂化生产。 在研究方法上，从生产方式、原料配方、不同温度、光照条件下的培养以至到干 燥、粉碎、无菌处理等技术方面去探讨和研究，从低投资到高效益方面去研究螺 旋藻的食品加工技术7 1 。 1 1螺旋藻形态学研究进展 螺旋藻为原核生物，结构简单，其细胞中没有真正的细胞核，也没有高等植 物所具有的叶绿体、线粒体和高尔基体等细胞器。在显微镜下，细胞近似方形， 第一章前言 横壁常不明显，不收缢或收缢，细胞外壁多不增厚( a n a g n o s t i d i s 和k o m a r e d ， 1 9 8 8 ) 引。 螺旋藻藻丝体( f i l a m e n t ) 是由许多圆柱状细胞连结而成的单列丝状体，呈疏 松或紧密的有规则的螺旋形( h e l i c i t y ) 或波浪形( u n d u l a t i o n ) ，长约5 0 5 0 0um ， 直径约1 - 1 2um ，两端顶部细胞钝圆，无分枝，无异形细胞，一般无粘性鞘覆盖； 偶尔在成熟的藻丝体或自然断裂的短的藻丝体中可见到褪色的老化细胞，这是其 裂殖的现象( g e i t l e r ，1 9 5 2 ) 。生长良好时，藻丝体呈墨绿色( o r i o ，1 9 8 3 ) 。 螺旋藻分布很广，因生长环境不同其形态也不尽相同。其中多数藻丝体的螺 旋比较规律、均匀，但也有中间紧凑而两端稀疏的；有些藻丝体的螺距短而紧密， 有些则很松驰，整条藻丝体不过2 - 4 个螺旋；有些甚至呈直线状。藻丝体大小 也有差别，如钝顶螺旋藻的细胞直径可从3 5 到1 1l am ，螺旋宽度可从2 0 到 1 0 0l am ( 胡鸿钧，1 9 9 7 ，i 吴开国，1 9 9 8 ) 。 有时在同一水体中的同一种螺旋藻形态也会有所不同，如f l o r e n c er i c h ( 1 9 3 1 ) 在观察肯尼亚一个盐湖中的钝顶螺旋藻时，可见到多种形态同时存在，这 表明螺旋藻形态具有多形性( p o l y m o r p h o l o g y ) 。早在1 9 5 2 年，g e i t l e r 1 在对 螺旋藻的分类报告中就提到钝顶螺旋藻有多种形态的变化。b a i & s e s h a c l r i ( 1 9 8 0 ) 曾描述了三种典型的螺旋藻形态，并进一步指出，这三种形态不是孤立存在的， 它们会因光照强度和营养浓度的改变从一种形态转变为另一种形态。v a n ( 1 9 7 7 ) 曾对接种于固体培养基上的钝顶螺旋藻的形态变异作了较详细的研究，发现藻丝 体在固体培养基上螺旋度易变小，但当滴加水后又能逐渐恢复其正常的螺旋度。 另据报道，当培养温度和光照强度增高时，螺距可以变小；而在光密度很低情况 下，螺距可以很长，超过1 0 0um ( a v i g a d ，1 9 8 7 ) 。吴开国( 1 9 9 8 ) 曾在无意中发现， 有一组钝顶螺旋藻纯种放在库房中，经数周后表层结成很厚的藻膜，取出镜检发 现全部变成直线形，但其细胞的形态和大小与原种则无明显差异。汪志平( 2 0 0 0 ) 也发现螺旋藻长时间静置培养比不时摇动、连续搅拌或通气培养时更易发生形态 变异，如钝顶螺旋藻s p f 在弱光下长时间静置培养后螺旋度会明显变小，藻丝 体可变得长达1 c m ；而s p z 会从有规则的螺旋形变异成不规则的螺旋形、长波 浪形、短波浪形和直线形等多种形态。彭卫民( 2 0 0 0 ) 等甚至从正常培养的藻液中 第一章前言 分离得到了颜色、长短、粗细均与螺旋形藻丝体相同的直线形变异藻株。此外， 张学成等( 1 9 9 0 ) 和崔海瑞等( 1 9 9 7 ) 采用不同浓度的化学诱变剂甲基磺酸乙酯来 处理钝顶螺旋藻，发现藻丝体和螺旋的长度加长，螺旋数增多，同时出现了多种 形态的藻丝体。而胡天赐( 1 9 9 0 ) 、汪志平等( 1 9 9 7 ，1 9 9 5 ) 、周光正( 1 9 9 4 ) 、陈必 链和陈荣( 2 0 0 0 ) 发现，c oy 一射线、红外线、紫外线、激光等辐射也均可导致 螺旋藻的正常形态发生较大的变异。这些研究结果表明，螺旋藻的螺旋形或波浪 形的特征形态，在自发或诱发条件下均会发生变异，形成藻丝长度和螺旋度不等 的弯曲形、甚至直线形( s t r a i g h t s h a p e ) 等多种形态。不仅许多实验研究报道过螺 旋藻形态变异的现象，在国内外的大规模工厂化养殖实践中，随着培育条件的变 化，藻丝体形态也呈多种变化( 陈峰等，1 9 9 9 ) 。因此，螺旋藻形态的多形性是一 种普遍现象，这给当前以形态特征为主要依据的螺旋藻分类造成了很大困难。有 些学者认为变直的螺旋藻藻丝体是颤藻的一个亚种，而不属于螺旋藻，在螺旋藻 分类学上产生了争议( 徐虹等，2 0 0 1 ) 。n u e b e l ( 2 0 0 0 ) 等认为，形态相似的螺旋藻 品系实际上在耐盐性、色素组成及1 6 sr n a 基因等方面存在明显的多样性，因 而仅依据形态学特征进行分类具有很大的局限性。这l e w i n ( 1 9 8 0 ) 及崔海瑞等 ( 1 9 9 7 ) 的观点相一致。 目前，螺旋藻多形性变异的产生机制尚不清楚。但近年来，已有学者在生理 生化及分子遗传水平对此进行了初步探索。v a ne 等( 1 9 8 0 ) 通过研究弯曲形藻丝 体间的相互变异，认为藻丝体的不同形态变化可能是由于细胞表面失水或复水引 起细胞壁肽聚糖层中寡肽( o l i g o p e p t i d e ) 的水合或脱水作用，使细胞刚性( r i g i d i t y ) 发生改变的结果。但这一假设显然不能合理解释螺旋藻一旦变直便难以再回变为 正常形态的现象。v l a d e a n u 等( 1 9 9 4 ) 、陈必链等( 2 0 0 0 ) 和r a j a g o p a l 等( 2 0 0 0 ) 的研 究表明，用舯c oy 一射线、激光及u v b 等照射螺旋藻导致其形态的变化，可能 与照射后螺旋藻细胞内光合色素蛋白的表达及活性改变有关，但均未对其机制做 更深入的研究。 有学者认为( 汪志平，2 0 0 0 ) ，因螺旋度改变而发生不同程度形态变异的藻丝 体，其变异可能由生理生化水平的某些因素改变所引起。而藻丝体发生的直线形 变异，则实际上是d n a 水平发生变化的结果。k o j i m ah 等( 1 9 9 8 ) 进一步从钝顶螺 旋藻中分离出了具有转座子结构特征的d n a 片段，并通过其编码蛋白的同源性分 第一章前言 析发现，此d n a 片段可能在螺旋藻由螺旋形变为直线形的藻丝体形态变异过程 中起调控作用。在此基础上，汪志平( 2 0 0 0 ) 通过对一组分别为正常形态、变为直 线形及回复正常形态的钝顶螺旋藻藻丝体的研究，提出了螺旋藻形态建成的转座 子调控模型，即转座子插入形态相关基因时，可导致该基因失活，其与形态相关 的编码产物不能合成，藻丝体变为直线形；而当某些因子的作用激活转座子，使 之从形态相关基因上割离后，该基因又可恢复正常表达，从而使藻丝体回复正常 形态。 由上述结果可见，螺旋藻形态的多形性变异是一个非常复杂的过程。对这一 过程产生机制及其调控机理的阐明，不仅要在生理生化及d n a 水平上进行深入 分析，更需要借助于现代分子生物学技术手段对螺旋藻细胞和分子遗传背景作出 进一步的研究。 1 2 螺旋藻的遗传学研究进展 近年来，植物基因工程和诱变技术有了很大发展，并在改良植物品种，创建 新型种质和发展育种新技术等方面发挥了重要的作用，产生了巨大的经济和社会 效益。相比之下，有关螺旋藻等经济微藻的分子遗传学和育种学一直缺乏系统而 深入的研究。随着螺旋藻应用领域的不断扩大和开发层次的逐渐深入，目前国内 外许多学者都投身于有关螺旋藻分子遗传学和育种学及相关领域的研究。 1 2 1 基因工程研究进展 螺旋藻基因工程研究，目的是为了通过重组d n a 技术构建螺旋藻新品种， 如将外源目的基因( 如s o d 基因、植物的不饱和脂肪酸基因、谷氨酸脱氢酶基 因等) 引入螺旋藻，对培育优质高产适应性强的新品系与开发食品资源及发展海 洋药物都具有十分重要的意义。其次实现螺旋藻天然产物基因工程生产，如螺旋 藻中藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白基因在微生物中的表达等。有关螺旋藻的基因识别和 克隆研究方面已取得了不少有意义的结果。茅云翔n 0 1 等报道了用氯霉素作为筛选 标记，利用整合平台电击转化螺旋藻单细胞，初步建立了螺旋藻的转基因体系， 并表达了报告基因萤火虫荧光素酶基因。光合作用过程中固定c o ：的关键酶一核 酮糖一1 ，5 二磷酸( r i b u l o s e l ，5 一b i s p h o s p h a t ec a r b o x y l a s e ) 大亚单位和小亚单 第一章前言 位的基因已成功地从& p l a t e n s i s 中克隆出来，并在ec o l i 中获得表达：秦松 等已从螺旋藻中分离出别藻蓝蛋白基因，并实现了其在ec o l i 中的高效表达。 同时，在螺旋藻质粒研究方面也取得了一些进展，秦松等已分别从p l a t e n s i ss 6 和f 3 藻株中分离到2 4 k b 和1 7 8 k b 的c c c ( 共价闭合环状) 质粒。他还与日 本工业技术院大阪国立研究所合作，开展螺旋藻基因工程研究，一方面期望引入 分解污染物的外源基因，以处理工业废水并降低养殖成本；另一方面期望引入 d e s a 基因，以增强螺旋藻对低温的适应性，培育北方寒冷地区能够养殖的品种。 然而，至今还不能像高等植物那样，将基因工程这一先进技术应用于螺旋藻的品 种改良，是因为利用基因工程技术创建螺旋藻生物技术良种的基础研究工作不够 深入，造成目前尚不能解决的困难：( 1 ) 螺旋藻完整的基因图谱尚未构建，对其 整个基因组尚缺乏系统认识；( 2 ) 还没有找到合适的限制性内切酶来对所发现的 c c c 质粒进行深入研究，也未发现该质粒的功能( 隐秘型质粒) ，更未构建出理想 的转基因载体；( 3 ) 虽然在外源d n a 导入螺旋藻细胞方法上已取得了一些有意 义的结果，但尚不能制备出外源d n a 易导入且具再生能力的原生质球。 由于困难重重，一些小组纷纷改变研究方向，转而进行螺旋藻的基因克隆与 功能鉴定工作。到目前为止，已有三十余种螺旋藻的结构基因被鉴定、克隆和测 序n h 5 1 ( 见表1 1 ) 表1 1 螺旋藻s p i r a l i n ap l a t e n s i s 已克隆的部分基因及其功能 t a b l e1c o i n e dg e n e sa n df u n c t i o n so fs p i r a l i n ap l a t e n s i s 第一章前言 1 2 2 原生质体育种 1 2 2 1 原生质体( p r o t o p l a s t ) 的制备与再生 螺旋藻原生质体制备的研究为诱变育种、融合育种及基因转移系统创造条 件。因此，制备高质量且具再生能力的螺旋藻原生质体，对开展螺旋藻的分子遗 传学和育种研究都是至关重要的。螺旋藻细胞外被有内壁、外壁和胶质鞘多层结 构，其中内层的肽聚糖是溶菌酶作用的对象，而外壁含有的脂蛋白和脂多糖以及 胶质鞘，是溶菌酶不能起作用的结构嘶1 ，因此，在制备螺旋藻的原生质球时常常 采用改进了的酶法。 1 9 8 2 年r o b i n s o n 首先提出了酶解制备钝顶螺旋藻( & p i a t e n s e s ) 原生质 体的方法，1 9 8 9 年l a n f a l o n i 1 等详细研究了sp a t e n s e s 原生质体形成、纯 化和再生的条件。他们认为幼年细胞较易用来制备原生质体，处理前要用 1 5 m o l ln a c l 洗涤藻丝，已去掉藻丝外鞘套，再用溶菌酶处理，可获得大量原 生质体。另一重要措施是用牛血清蛋白梯度离心来纯化酶解样品，可获得高纯度 原生质体。样品中活性原生质体可达4 - 1 2 ，由幼年细胞制得的活性原生质体 再生率为4 0 一7 0 ，老年细胞为1 0 - 4 0 。1 9 9 4 年p s e t h u 乜羽等以甘露醇为 渗透稳定剂，在p h6 8 的磷酸缓冲液中用溶菌酶酶解藻丝2 8 h ，再用蔗糖密度 梯度离心获得了8 0 的原生质球。但该方法酶解时间过长，极有可能对细胞产 生毒害作用。该文对这种原生质球的再生率也未作报道。彭国宏等( 1 9 9 6 年) 啪1 做了多次实验未在上述条件下分离出原生质球，而对上述有关螺旋藻原生质球的 分离报道产生了怀疑，此后利用改进后的分离方法( 溶菌酶+ 果胶酶) ：先用机 械法将藻丝打断，用酸性溶液洗去藻丝外鞘套，在稳定剂为o 8m o l lk c i 的 磷酸缓冲液中，用溶菌酶和果胶酶协同处理2 - 6 h 获得大量原生质体，活性率为 第一章前言 9 8 ，但该文没有报道再生率。李捷津等( 1 9 9 3 年) 跚1 用n a c l 和t r i s - e d t a 溶 液、t r i s h c l 溶液分别处理钝顶螺旋藻藻丝，去除角质鞘，再用0 0 1 的溶菌 酶，3 5 。c 水浴1 2 0 - 1 5 0 分钟，制得了有活性的原生质球，但未报道得率。王明 兹口妇( 1 9 9 9 年) 用果胶酶+ 溶菌酶制备钝顶螺旋藻、钝顶螺旋藻突变株f b l ， 极大螺旋藻原生质体，经一定时间一定条件分离的原生质体( 球) 分别为6 6 1 0 5 、7 9 1 0 5 、6 8 1 0 5 个m g ，也都未报到再生率。秦松等( 1 9 9 5 年) n 2 1 利用超声波法制备钝顶螺旋藻大量单细胞和部分原生质体并再生成功，但因此法 原生质体的得率太低而难以应用于遗传育种研究。郭厚良等( 2 0 0 0 年) 利用超 声处理螺旋藻藻丝，再用青霉素对处理后的单胞和短片段进行预处理，进一步结 合溶菌酶制备出有活性的钝顶螺旋藻原生质球，但未报道得率。银红梅等( 2 0 0 7 年) 泓1 用改进的超声波一溶菌酶法：螺旋藻培养液经超声破碎2m i n ，用1 5m o l ln a c l 的z a r r o u k 培养基洗去细胞外壁的胶质鞘，然后溶菌酶酶解6h ，可获 得4 0 以上有活力的钝顶螺旋藻原生质球，为螺旋藻的进一步遗传转化以及基 因工程研究提供了实验基础。但该文也没有报道此原生质体的再生率。他们认为， 超声波不能有效的去除细胞外壁的胶质鞘，在酶解前经超声波打断藻丝，再用高 浓度盐洗脱，胶质鞘会逐渐脱去，暴露出细胞壁，溶菌酶才能更好的发挥作用。 经研究还发现果胶酶的加入并没有有效地提高原生质体得率。果胶酶的加入是为 了去胶质鞘，而在酶解前，已用高盐溶液洗掉了大部分胶质鞘；而且果胶酶的最 适作用p h 值介于3 5 4 o 之间，在p h 值为7 2 的磷酸钾缓冲液中果胶酶也 难以发挥作用。总之，国内外在螺旋藻原生质球的制备和再生方面虽然作了一些 工作，但到目前为止，尚不能可靠地制备出质量高且具再生能力的螺旋藻原生质 球，供育种所需。 1 2 2 2 原生质体诱变 原生质体由于缺乏坚韧的、具有保护功能的细胞壁而对环境条件尤其是渗透 压特别敏感。因此用原生质体诱变育种，简单可行，且可以提高正变株的变异幅 度，是育种工作不错的选择。然而，由于不能可靠地制备出质量高且具再生能力 的螺旋藻原生质球，到目前为止，国内外对螺旋藻原生质体诱变育种的研究还未 见报道。 第一章前言 1 2 3 螺旋藻的突变研究 诱变育种是人为地利用理化等因素诱发生物体产生遗传变异，通过对突变体 的选择和鉴定，直接或间接地培育成在理论研究或生产实践中有利用价值的新品 种或新的种质资源。 1 2 3 1 物理诱变 物理诱变剂应用于螺旋藻育种的有c o - t 射线、h e - n e 激光、y a g 激光、 半导体激光等。c 0 1 射线是常用的诱变辐射源，由它引起的遗传效应有码组移 动a ：t - g ：c 及d n a 巨大损伤( 重复、缺失、异位、倒位) 。目前鼬c 0 1 射线作 为物理诱变剂在螺旋藻育种中应用最广。v l a d e a n u 等( 1 9 9 4 ) 胡用c 0 1 射线处 理钝顶螺旋藻，处理剂量为l 1 0 。2 、3 1 0 。2 、5 l o 屯和7 1 0 g y ，结果证明：3 1 0 。2 g y 和5 1 0 吨g y 的剂量可促进藻丝生长，增强光合作用，增加核酸的合成， 使叶绿素a 和类胡萝卜素的含量增加；5 1 0 吨g y 的剂量使光合器和 c a r b o x i s o m e 更加发达。龚小敏等( 1 9 9 6 ) 脚3 用不同剂量的c o _ 丫射线诱变钝顶 螺旋藻筛选获得2 株抗高光抑制突变株，与出发株相比，2 个突变株藻丝体显 著变短，螺旋数目减少，生长速率加快，代时短；出发株与突变株的蛋白质含量、 氨基酸组成差别不大，但可溶性多糖却发生较大的变化。胡天赐等( 1 9 9 0 ) 口刀用 y 一射线照射钝顶螺旋藻，形态上产生较大的变异，经照射后长成的藻细胞出现一 定的抗逆性。汪志平等( 1 9 9 7 ) 啪3 对钝顶螺旋藻s p - d 中3 种形态( 螺旋形，正弦 波形和长直形) 的藻丝体进行了分离和培养，在培养过程中，弯曲形( 螺旋形或 正弦波形) 的藻丝体可生长繁殖或转变成与s p - d 一样具有3 种形态的藻丝群 体，而长直形的藻丝体则只能生长繁殖成长直形的藻丝群体；o 3k g y 的y 一 射线可使长直形藻丝体生长繁殖或转变成弯曲形藻丝体，产量也相应提高。汪志 平等( 1 9 9 8 ) 用c 0 1 射线照射不同品系和形态的螺旋藻丝状体，结果表明：低剂 量可刺激生长，筛选得到的细胞宽大，低温下能良好生长的突变品系；不同品系 和形态时螺旋藻对辐射敏感性存在显著差异。汪志平等( 2 0 0 3 ) 啪3 用组织匀浆法 制备螺旋藻单细胞或原生质球，经0 6 的( e m s ) 和2 4 k g y 的c 0 1 射线 复合诱变处理，培养成藻丝体后再逐步以高剂量的y 一射线为选择压力，育出了 l 株高产多糖的钝顶螺旋藻优良新品系。 8 第一章前言 紫外线的诱变作用是由于它引起d n a 分子结构变化而造成的。这种变化 包括d n a 链的断裂，d n a 分子内和分子间的交连，核酸与蛋白质的交联， 嘧啶水合物和嘧啶二聚体的产生等，特别是嘧啶二聚体的产生对于d n a 的变 化起主要作用。l a n f a l o n i 等( 1 9 9 1 ) 呻1 用紫外线和亚硝基胍诱变钝顶螺旋藻， 获得8 一氮鸟嘌呤和抗一( 2 一噻嗯基) - d l 氨基丙酸的抗性突变株。l i j i a n h o n g 等 ( 1 9 9 7 ) h 用紫外诱变螺旋藻获得了富含藻蓝蛋白的突变体。李建宏等( 2 0 0 0 ) “2 1 用超声波破碎仪将螺旋藻破碎成单细胞后，采用紫外诱变的方法筛选获得了 两株优良的稳定钝顶螺旋藻突变株m 1 - 3 和m 5 1 ，与出发菌株相比，菌丝形 态发生了变化，生长速度和光合放氧速率均有显著提高，m 1 - 3 的藻蓝蛋白含 量高于出发藻株2 0 2 ；突变株的不饱和脂肪酸含量高于出发藻株，总脂中 m 1 - 3 含花生四烯酸的含量有较高的积累，同时也检出有少量的e p a 。m 5 - 1 中 油酸和e p a 的含量均有明显的增加。韩岚等( 2 0 0 8 ) h 3 1 采用紫外诱变的方法 筛选获得了耐低温诱变株，综合生长特性和营养价值考虑，y b 0 2 是一株较优良 的诱变株。陈新美等( 2 0 0 4 ) h 4 3 结合自然分离筛选和紫外诱变育种两种方法初 步筛选获得优良钝顶螺旋藻藻种，与出发株( 螺旋数一般5 7 个) 相比：藻丝 长度明显变长，螺旋数超过4 0 个，形体较大，易于采收，且其藻胆蛋白含量 高于出发藻株6 0 ，生长速度较快，上浮性较好，值得进一步研究利用。从u v 诱变处理中分离得到氯酸盐抗性突变株。曹媛媛等( 2 0 0 5 ) h 5 1 用超声波对钝顶 螺旋藻进行4 0 s 预处理破碎成2 - 4 个细胞大小的片断后，分别用不同剂量的 紫外线( u v ) 和c oy 射线处理，获得了抗氨基酸类似物的突变菌株。 激光辐射可以通过光、热、压力和电磁效应的综合作用，直接或间接地影响 生物体，引起细胞d n a 或r n a 、质粒、染色体畸变效应、酶的激活和钝化， 以及细胞分裂和细胞代谢活动的改变为激光诱变提供了有利条件。激光作为一种 育种手段，具有简单、方便和安全等优点，在工业微生物育种中已取得不少进展 ，而在微藻育种中的应用则刚刚起步。赵炎生等( 1 9 9 7 ) h 7 3 用不同剂量的h e n e 激光照射钝顶螺旋藻，与出发藻种相比，藻体在形态、干重、含氮量和胞外多糖 等方面都有不同程度的变化，其中胞外多糖的含量提高1 9 3 。赵炎生等( 1 9 9 9 ) h 踟用倍频n d ：y a g 脉冲激光诱变钝顶螺旋藻，与出发株相比，诱变后的螺旋藻 体干重略下降，藻体蛋白质含量增加1 2 ，胞外多糖分泌量提高2 4 6 。陈必链 第一章前言 等( 1 9 9 9 ) h 们用n d ：y a g 激光( 波长5 3 2n m ，功率密度1 6 0m w c m 2 ) 诱变钝顶 螺旋藻，从中分离出藻丝形态变直的突变株f b l 与出发株相比该突变株具有生长 速率快、耐低温、b 一胡萝b 素和多糖含量提高，细胞壁易被酶水解等特点。陈 必链还用半导体激光( 波长6 5 0n m ，功率密度1 3m w c m 2 ) 诱变钝顶螺旋藻， 结果为一定时间剂量的半导体激光可促进藻丝生长，使藻丝形态发生变化，螺旋 变松弛。赵萌萌等( 2 0 0 4 呦1 利用h e - n e 激光( 波长6 3 2n m ，功率1 0m w ) 辐照钝 顶螺旋藻i s ( s p 护u l i n ap 肠胞，2 s 括i s ) ，诱变后通过逐级稀释法和静置培养分层分离 法相结合的方法筛选出生长速度快、高产蛋白质等有效成分的优良藻种。 1 2 3 2 化学诱变 在螺旋藻育种中得以使用的化学诱变剂有亚硝基胍( n t g ) 和甲基磺酸乙酯 ( e m s ) ，它们都属于烷化剂。烷化剂能与藻丝体的许多部位发生作用，结果使d n a 分子增加了烷基侧链，从而改变d n a 分子的内部结构，d n a 复制时导致碱基 配对错误而引起突变。r i c c a r d i 等( 1 9 8 1 ) 晦1 1 用卜甲基- 3 - 硝基- 1 - 亚硝基胍 ( m n n g ) 对藻丝体进行诱变处理，获得了抗氨基酸类似物的突变体。张学成等 ( 1 9 9 4 ) 晦2 3 用甲基磺酸乙酯诱变处理钝顶螺旋藻，螺旋藻在形态及生长速度方面均 产生可遗传的变异，筛选得n 2 株耐低温的藻种。s i n g h 等( 1 9 9 4 年) 删用亚硝基 胍处理极大螺旋藻，获得氯酸盐抗性突变株s m l1 和s m 2 5 。s i n g h 等( 1 9 9 7 年) 嘲1 用n t g 处理钝顶螺旋藻并分离出耐甲硝基羟乙唑和d c m u ( 3 ，4 - - - 氯 苯一l ，卜二甲脲) 较野生型细胞高3 倍的突变细胞。崔海瑞等( 1 9 9 7 ) 5 3 用不同浓 度的甲基磺酸乙酯对钝项螺旋藻的藻丝体进行处理，藻丝体形态参数的变异性增 大，藻丝体和螺旋的长度加大，螺旋数增多，出现了多种形态的藻丝体，该诱变 剂对钝顶螺旋藻的生长有抑制作用，生长率与处理浓度呈极显著的负相关。殷春 涛等( 1 9 9 7 ) 嘞1 利用超声波处理钝顶螺旋藻，获得单细胞螺旋藻，然后利用n t g 诱变筛选获得突变品系，该突变品系藻丝体显著变短，螺旋数目减少，是一株能 忍受低温的中温品系藻种，该突变品系的蛋白质含最比出发品系高。此外c o h e n 等( 1 9 9 3 年) 陌刀用除草剂s a n - 9 7 8 5 作为生长抑制剂，从钝顶螺旋藻和紫球藻中 筛选获得突变株，其生长速度及糖脂含量均高于出发株，且钝顶螺旋藻突变株富 含y 一亚麻酸。 第一章前言 总之，虽然诱发突变技术对遗传物质d n a 的操作不具有基因工程那么强 的针对性，但诱变育种具有所需仪器设备简单、操