（应用化学专业论文）微波耦合酶催化反应中酶的光谱特性研究——微波辐射下脂肪酶和蛋白酶的酶活与其光谱特性.pdf

摘要 摘要 微波辐射可以用来消解蛋白质，也可以用来加速酶催化反应，而后者是在不损伤酶 的级结构的低功率辐射下进行的。过度的微波辐射可以用来消解，也会使酶蛋白失活或 消解。将微波辐射适度应用于酶催化反应中，会产生单独使用这两种方法所不能达到的 效果。本文以脂肪酶催化辛酸和丁醇、辛酸和甘油的酯化反应体系为研究对象，将反应 体系中各组分分别在低功率( 2 0 0w ) 微波辐射和常规加热下对l r i 、n o v o z y m4 3 5 作用 后，用荧光发射光谱分级逐步地研究l r i 、n o v o z y m4 3 5 的光谱变化。另外，研究了微 波辐射对洗涤剂用脂肪酶和蛋白酶活力的影响以及两者的光谱变化。主要内容和结果如 下： 1 以溶剂相脂肪酶l r i 催化辛酸和丁醇的酯化反应体系为对象，将反应体系中各 组分分别在低功率微波辐射和常规加热下对l r i 作用后，用荧光发射光谱和紫外吸收光 谱分级逐步地研究l r i 在有机溶剂和水环境中的光谱变化。 实验发现，微波辐射和常规加热在所有实验条件下均增强l r i 的荧光强度而没有导 致最大发射波长位移。在微波辐射能够提高反应初速度的范围内，当l r i 与有机分子共 热后，微波辐射更有利于l r i 蛋白质分子在水中的裸露。不同l o gp 溶剂的反应体系对 酶构象的影响主要表现为溶剂对其的影响。反应初速度对l o gp 的变化规律与水相l r i 蛋白质的荧光强度对l o gp 的变化接近，而与溶剂相l r i 蛋白质的荧光强度对l o gp 的 变化规律之间基本无共同之处。 2 以脂肪酶n o v o z y m4 3 5 催化辛酸和甘油的酯化反应体系为对象，将反应体系中 各组分分别在低功率微波辐射和常规加热下对n o v o z y m4 3 5 作用后，用荧光发射光谱和 紫外吸收光谱分级逐步地研究n o v o z y m4 3 5 在水环境中的光谱变化。 实验结果表明，微波辐射较常规加热在所有实验条件下更能增强n o v o z y m4 3 5 的荧 光强度而没有导致最大发射波长位移。同时，n o v o z y m4 3 5 在水相中的荧光强度分别对 应不同温度、加水量以及底物配比的变化规律与反应初速度对应上述条件的变化基本一 致。 此外，考察了在不同底物配比或加水量反应条件下的辛酸与甘油酯化反应( 辛酸转 化率为4 0 ) 时的n o v o z y m4 3 5 在水环境中的光谱变化。水相n o v o z y m4 3 5 的荧光强 度对上述条件的变化规律与1 - m g 2 m g 及l ，3 d g 1 ，2 d g 对上述条件的变化基本一致。 3 研究了1 0 0 0w 微波辐射洗涤用脂肪酶( l i p e x1 0 0t 、l i p o l a s e1 0 0t ) 、蛋白酶 ( p r o p e r a s e1 0 0 0e 、p u r a f e c t2 0 0 0e ) 后，其酶活随辐射时间的变化规律；并且利用荧 光发射、紫外吸收光谱研究其光谱变化。经微波处理后，上述两类酶的酶活均随辐射时 江南人学硕：l ：学位论文 间延长呈先提高后降低的趋势。微波辐射并未改变上述两类酶的荧光发射峰位置与紫外 吸收峰位置，峰强均随辐射时间的延长呈先增强后降低。此外，放置两个月后的脂肪酶 的荧光强度、紫外吸收峰强度随辐射时间的变化规律与刚辐射后的一致，但放置后的荧 光强度及紫外吸收峰强度均强于刚辐射后的。 关键词：微波；脂肪酶；蛋白酶；构象；荧光；非热效应；溶剂；紫外 a b s t r a c t a b s t r a c t m i c r o w a v er a d i a t i o nc a nb eu s e dt od i s p e lp r o t e i n ，a n da l s oc a nb eu s e dt oa c c e l e r a t e e n z y m a t i cc a t a l y s i sr e a c t i o n s t h ep r o p e rm i c r o w a v ei r r a d i a t i o nd o e s n td a m a g et h ep r i m a r y s t r u c t u r eo fp r o t e i n ，w h i l ee x c e s s i v em i c r o w a v er a d i a t i o nw o u l dd i s p e l ，o rd e a c t i v ep r o t e i n a p p l y i n gm i c r o w a v ei r r a d i a t i o n e n z y m ec o u p l i n gc a t a l y s i s ( m i e c c ) c a nr e s u l t i nm a n y u n i q u ef i n d i n g s w h i c hw e r eq u i t ed i f f e r e n tf r o mt h o s eo b s e r v e df r o mc o n v e n t i o n a lh e a t e d e n z y m a t i cr e a c t i o n s i nt h i sp a p e r ，t h ee n z y m a t i ce s t e r i f i c a t i o no fc a p r y l i ca c i da n db u t a n 0 1 c a p r y l i ca c i da n dg l y c e r o lw e r es t u d i e d t h ef l u o r e s c e n c ec h a n g eo fl i ua n dn o v o z y m4 35 w e r er e c o r d e dt oi n v e s t i g a t et h ef o r m a t i o nc h a n g eo ft h ee n z y m ep r o t e i nd u r i n gt h er e a c t i o n s i na d d i t i o n ，t h ee f f e c to fm i c r o w a v ei r r a d i a t i o nt i m eo nt h ea c t i v i t yo ft h el i p a s ea n d p r o t e i n a s e a l o n gw i t ht h e i ru va n df l u o r e s c e n c es p e c t r u mc h a n g ew e r ei n v e s t i g a t e d t h e m a i nc o n t e n t sa n dr e s u l t sa r ea sf o l l o w s ： 1 w es t u d i e dt h ef l u o r e s c e n c ea n du l t r a v i o l e ts p e c t r u mc h a n g eo fi m m o b i l i z e dl i p a s e f r o mm u c o rm i e h e ii nt h em i c r o w a v ea s s i s t e de n z y m a t i ce s t e r i f i c a t i o no fc a p r y l i ca c i da n d b u t a n o li no r g a n i cm e d i u m ，b yi n v e s t i g a t i n gt h ef l u o r e s c e n c es p e c t r ai ns o l v e n to ra q u e o u s b u f f e ra f t e ri n c u b a t e dt h el i p a s ew i t ht h es o l v e n t c a p r y l i ca c i da n db u t a n o lu n d e rm i c r o w a v e i r r a d i a t i o n r e s p e c t i v e l y t h ec o m p a r i s o nw a sm a d ew i t ht h ec o n v e n t i o n a lh e a t e de n z y m a t i c e s t e r i f i c a t i o ni nt h es o l v e n t s i tw a sf o u n dt h a tb o t h o ft h e h e a t i n gm o d e s t h e m i c r o w a v ei r r a d i a t i o na n d c o n v e n t i o n a lh e a t i n g c a ne n h a n c et h ef l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yw i t h o u ts h i f l i n go ft h ee m i s s i o n w a v e l e n g t ho ft h el i p a s e a tt h ec i r c u m s t a n c et h a tt h ei r r a d i a t i o nc a na c c e l e r a t e t h e e s t e r i f i c a t i o n t h ei r r a d i a t i o ne n h a n c e dt h ee x p o s u r eo ft h el i p a s ep r o t e i nm o l e c u l e si nt h e a q u e o u se n v i r o n m e n ta f t e ri n c u b a t i n gt h el i p a s ew i t hs o l v e n t so rt h es u b s t r a t e s t h ee f f e c to f t h er e a c t i o nm i x t u r eo nt h ef l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yw a sd r i v e nb yt h es o l v e n t s t h et r e n do ft i l e p l o to fl o gp v e r s u st h ei n i t i a lr e a c t i o nr a t ew a ss i m i l a rw i mt h a to ft h el o gpv e r s u st h e f l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yo fl i p a s ei na q u e o u sb u f f e ra f t e rt h ee s t e r i f i c a t i o n ；b u td i f f e r e n tw i t l l t h a to ft h el o gpv e r s u st h ef l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yo f1 i p a s ei no r g a n i cm e d i u m 2 w es t u d i e dt h ef l u o r e s c e n c ea n du l t r a v i o l e ts p e c t r u mc h a n g eo fn o v o z y m4 35i nt h e m i c r o w a v ea s s i s t e de n z y m a t i ce s t e r i f i c a t i o no fc a p r y l i ca c i da n dg l y c e r o l ，b yi n v e s t i g a t i n gt h e f l u o r e s c e n c es p e c t r ai na q u e o u sb u f f e ra f t e ri n c u b a t e dt h el i p a s ew i t ht h ec a p r y l i ca c i da n d g l y c e r o lu n d e rm i c r o w a v ei r r a d i a t i o n ，r e s p e c t i v e l y t h ec o m p a r i s o nb e t w e e nt h em i c r o w a v ei r r a d i a t e da n dc o n v e n t i o n a lh e a t e dr e a c t i o n s w a sm a d e t h em i c r o w a v ei r r a d i a t i o nc a ne n h a n c et h ef l u o r e s c e n c ei n t e n s i t ym o r ew i t h o u t s h i f t i n go ft h ee m i s s i o nw a v e l e n g t ho ft h el i p a s ep r o t e i n t h et r e n do ft h ep l o to ft e m p e r a t u r e ， o rt h er a t i oc a p r y l i ca c i dt og l y c e r o l ，o rt h ew a t e rd o s a g ev e r s u st h ei n i t i a lr e a c t i o nr a t e ，a l lo f t h e mw e r es i m i l a rw i t ht h a to ft h et e m p e r a t u r e ，o rt h er a t i oc a p r y l i ca c i dt og l y c e r o l ，o rw a t e r d o s a g ev e r s u st h ef l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yo fl i p a s ei na q u e o u sb u f f e ra f t e rt h ee s t e r i f i c a t i o n ， r e s p e c t i v e l y i i i 江南大学硕l ：学位论文 a d d i t i o n a l l y t h ef l u o r e s c e n c es p e c t r u mc h a n g eo fn o v o z y m4 35i nt h em i c r o w a v e a s s i s t e de n z y m a t i ce s t e r i f i c a t i o no fc a p r y l i ca c i da n dg l y c e r o lu n d e rd i f f e r e n tr e a c t i o n c o n d i t i o n sw a ss t u d i e d t h ef l u o r e s c e n c es p e c t r ai na q u e o u sb u f 俺rw e r er e c o r d e da f t e r i n c u b a t i n gt h el i p a s ew i t ht h ec a p r y l i ca c i do rg l y c e r o lo rt h er e a c t i o nm i x t u r ea tt h e4 0 c a p r y l i ca c i dc o n v e r s i o n t h et r e n do ft h ep l o to fr e a c t i o np a r a m e t e r sv e r s u st h er a t i ol m o n o g l y c e r i d et o2 - m o n o g l y c e r i d ea n dt h er a t i o1 , 3 - d i g l y c e r i d et o1 , 2 d i g l y c e r i d ew a s s i m i l a rw i t ht h a to fd i f f e r e n tr e a c t i o nc o n d i t o nv e r s u st h ef l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yo fl i p a s ei n a q u e o u sb u f f e ra f t e rt h ee s t e r i f i c a t i o n , r e s p e c t i v e l y 3 t h ea c t i v i t yc h a n g eo fl i p a s e ( l i p e x10 0t 、l i p o l a s e10 0t ) a n dp r o t e i n a s e ( p r o p e r a s e 10 0 0e 、p u r a f e c t2 0 0 0e 1i n d u c e db ym i c r o w a v ei r r a d i a t i o nw e r ei n v e s t i g a t e d w ea l s o s t u d i e dt h ef l u o r e s c e n c eo ru l t r a v i o l e ts p e c t r u mw i t hd i f f e r e n ti r r a d i a t i o nt i m e t h ea c t i v i t yo f l i p a s ea n dp r o t e i n a s ei n c r e a s e df i r s t l ya n dt h e nd e c r e a s e dw i t hr i s em i c r o w a v ei r r a d i a t i o n t h e f l u o r e s c e n c ea n du l t r a v i o l e ti n t e n s i t ye n h a n c e df i r s t l y a n dr e d u c e dw i t ht h er i s ei r r a d i a t i o n t i m el a t e rw i t h o u ts h i f t i n go ft h ee m i s s i o nw a v e l e n g t ho ft h el i p a s ea n dp r o t e i n a s e t h et r e n d o ft h ep l o to fi r r a d i a t i o nt i m ev e r s u st h ef l u o r e s c e n c eo ru l t r a v i o l e ti n t e n s i t yo ft h el i p a s ea f t e r s t o r a g e dt h el i p a s ef o rt w om o n t h sw a sc o i n c i d e n tw i t ht h a to fi r r a d i a t i o nt i m ev e r s u st h e f l u o r e s c e n c eo ru l t r a v i o l e ti n t e n s i t yo fl i p a s ei r r a d i a t e da f t e r3 0 s b u tt h ef l u o r e s c e n c eo r u l t r a v i o l e ti n t e n s i t yo fl i p a s ea f t e rs t o r g e dt w om o n t h ss t r o n g e rt h a nt h a to fl i p a s ei r r a d i m e d a f t e r3 0 s k e y w o r d s ：m i c r o w a v e ；l i p a s e ；p r o t e i n a s e ；c o n f o r m a t i o n ；f l u o r e s c e n c e ；n o n e f f e c t ； s o l v e n t ；u l t r o v i o l e t i v 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是苯人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 期：w 6 1 2 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签 名： ! 虱盥 导师签名： l 百予妈 第一章绪论 第一章绪论 1 1 引言 自1 9 8 6 年g e d y e 等1 l j 利用微波辐射有效地加速有机反应以来，微波促进有机化学 反应的研究已逐渐深入。微波辐射不仅能加快反应速度，减少催化剂用量，有时而且还 改变反应选择性1 2 圳。九十年代以来，微波辐射被应用于生物催化反应尤其是非水相酶 催化反应中。微波辐射和酶催化作为现代有机合成化学中两种强有力的催化手段已被接 受认可。在这一方面的研究工作主要集中在研究微波的加热特性1 5 - 1 3 1 及其对酶的影响 1 1 4 - 2 0 、微波辐射对酶催化反应动力学的影响2 1 之8 1 及微波辐射对酶催化反应选择性的影响 2 9 - 3 3 】等方面。酶的结构与功能关系对于解释酶催化活性有着重要的意义。目前，人们主 要采用紫外可见吸收光谱、荧光光谱、红外光谱、圆二色性谱等光谱方法来研究抑制 剂、溶剂、电磁场及金属离子对酶构象的影响。 另一方面，1 9 8 0 年以后，洗涤剂用酶正在以惊人的速度增长，随着消费者对合成洗 涤剂的要求不断上升，酶制剂已是洗涤剂中不可缺少的一部分。目前全世界工业用酶制 剂中，洗涤剂酶约占1 3 。在我国合成洗涤剂市场上，加酶洗涤剂占总量的4 0 ，一些 发达国家的洗涤剂产品基本上都是加酶产品【3 4 】。实践证明洗涤剂中加入酶以后具有如下 特点：提高产品的去污能力，保护被洗衣物的原有色彩；减少了洗涤剂中表面活性剂和 某些助剂的用量：增加了节水、节能和环保的效益。目前，由于消费者的需求、社会环 境和洗涤环境的变化等因素对洗涤剂的性能要求同益提高。如何提高加酶洗衣粉的洗涤 效果成为了众多酶制剂公司目前面临的首要问题，除了将蛋白质工程应用于酶的改性， 也可通过外加电磁场来提高酶的活性，但目前尚在起步阶段。 1 2 微波耦合酶催化( m i e c c ) 反应的非热效应 微波是频率大约在3 0 0 m h z - - 3 0 0 g h z ，即波长在10 0c m 至l m m 范围内的电磁波。 它位于电磁波谱的红外辐射( 光波) 和无线电波之间。目前用于微波反应研究的微波主 要是民用微波，频率一般固定在2 4 5g h z ( 波长为1 2 2c m ) 。 微波辐射对化学反应的影响可以主要归结为致热效应和非热效应【3 引。致热效应是指 微波辐射使反应物温度升高，从而改变反应速度的现象【6 j 。微波加热主要有极化和传导 两种机带l j t m 。非热效应是指微波辐射具有增大反应速度、提高平衡转化率、减少副产 物、改变立体选择性等无法用单纯的致热效应来解释的其它效剧引m 。微波非热效应影 响化学反应的可能性可以归结为：( 1 ) 微波电磁场对极性( 非极性) 分子的作用，即极化现 象；非极性分子被极化后，其性质应有所变化。( 2 ) 电磁波与分子振动( 或转动) 的关系； 即微波可引起分子的振动或转动，就可对化学键的断裂做出贡献。( 3 ) 微波对物质的选择 性加热而使部分物质的活性增加。 1 3 光谱方法在酶构象研究中的应用 酶的结构与功能关系一直是分子酶学工程研究的核心问题之一。在b o o kh a v e n 江南大学硕i ：学位论文 p r o t e i nd a t ab a n k 中，已有的酶结构数据大部分是晶体结构数据。毫无疑问，x 射线和 多维n m r 仍是目前直接研究酶结构问题最有效的方法。紫外可见吸收光谱、荧光光谱、 红外光谱、圆二色性谱等光谱学方法主要用于研究生理状态下酶构象与功能关系，探讨 酶的局部构象特点及研究辅酶、辅因子的作用。 1 3 1 紫外可见吸收光谱1 4 2 l 酶作为一类特殊的蛋白质，在光谱上具有普通蛋白的共性。蛋白质的紫外吸收光谱 实际上是蛋白质分子中各种紫外生色团加和的结果，但蛋白质中的色氨酸、酪氨酸和苯 丙氨酸残基由于其生色团不同，因而有不同的紫外吸收光谱。色氨酸和酪氨酸在波长2 8 0 n l n 附近有一个吸收峰；苯丙氨酸在波长2 6 0n l t l 左右有吸收峰。大多数蛋白质在2 8 0n l t l 附近有一个吸收峰，主要由色氨酸残基的吲哚坏和酪氨酸残基的酚基所贡献。 目前，利用紫外可见吸收光谱主要研究蛋白质分子的构象和构型变化m 舶】。如， 柯惟中等【4 3 j 研究发现牛血清白蛋白( b s a ) 水溶液有两个吸收峰分别在2 7 6n n l 和1 9 3n l i l 处。前者主要是蛋白质中酪氨酸、色氨酸的吸收，后者主要是由肽基团的吸收。由紫外 吸收光谱的性质知，1 9 3n l t l 附近的吸收峰是肽链0 【螺旋和无规卷曲构象的主要识别峰， 而p 一折叠的吸收峰应在波长1 9 8n l t l 处，故推测此b s a 溶液中没有b 折叠或极少。 1 3 2 红外光谱 f t - i r 是检测水溶液和固态中多肽和蛋白质构象的一种实用而灵敏的工具。红外光 谱是分子振动的一种吸收光谱，分子中化学键具有多种振动模式，得到的光谱反映所有 二级结构总体信息。 蛋白质在红外区有若干特征吸收带，其中酰胺i 带( 1 6 0 0 1 7 0 0c m 以) 对于研究其 二级结构最有价值。影响酰胺i 带准确定量的一个重要因素是溶剂水在1 6 4 0c m _ 附近 的干扰吸收。根据朗伯比耳定律，吸光度具有加和性，因而理论上可以从溶液的红外 吸收中减去溶剂的吸收得到纯样品的红外谱图。随着计算机的发展，现在的傅立叶红外 光谱已经是数字化的光谱，使得这种差谱成为现实。 对于酰胺i 带谱峰拟合后各子峰与二级结构的对应关系，目前研究的比较成熟。通 常认为：1 6 0 0 1 6 4 0c m 。1 为b 折叠；1 6 4 0 1 6 5 0c m 1 为无规卷曲；1 6 5 0 1 6 5 8c m d 为0 【螺 旋；1 6 6 0 1 6 9 5c m d 为p 转角1 8 5 j 。 虽然差谱技术可以扣除溶剂水的吸收，但是环境中的水蒸气是在不断变化的，它对 谱图的干扰不能用单纯的差减来解决。为了彻底避免水峰的干扰，蛋白质的红外酰胺i 带越来越受到人们的重视。酰胺i i i 带位于1 3 3 0 1 2 2 0c m d 附近，主要是蛋白质分子中n h 的面内弯曲振动和c - n 的伸缩振动。虽然酰胺i i i 带的吸收信号相对较弱，但是它所处饿 位置不受水汽的干扰，而且不同二级结构在酰胺i i i 带的光谱性质更加特征，拟合过程中 易于将它们分开【4 。因此，酰胺i 带成为定量分析蛋白质二级结构的有效工具之一，许 多研究工作中用来直接定量反映蛋白质构象的变化1 4 引。 红外光谱应用于多肽和蛋白质的结构分析大致经历了定性、半定量和定量研究三个 发展阶段。目前此方法对于蛋白质二级结构的定性、定量分析已经有效应用于蛋白质的 2 第一章绪论 热变性【5 0 - 5 2 1 、p h 值的影响【5 3 1 、溶剂变性【5 4 1 、化学变性陬5 6 1 、化学修饰剐、表面乳化作 用影响8 6 1 、配基结合1 5 8 1 、光抑制作用【5 9 1 、强声波作用【6 0 1 和个别氨基酸残基替换所引起 的微小变化，成为揭示蛋白质溶液构象变化的重要工具。如：邓一兵1 87 j 等考察超氧化物 歧化酶经不同强度的电场处理，利用红外光谱法研究电场对超氧化物歧化酶二级结构的 影响。结果表明，经不同电场强度处理的超氧化物歧化酶( s o d ) ，其二级结构单元百分 含量有不同程度的变化。a 一螺旋和d 一折叠结构单元在电场处理后，均为减少；p 转角结 构单元均为增加；无规卷曲结构单元除4 0 k v c m d 电场处理条件减少外，其余电场处理 条件均为增加。电场处理具有使超氧化物歧化酶的0 【螺旋、b 一折叠、p 转角和无轨卷曲 结构转化的作用，且不同电场条件下其转化情况不同。研究结果还表明，电场的作用使 s o d 活性发生改变，s o d 活性变化与p 折叠含量变化相关。另外，f t - i r 光谱学方法在 测定酶的作用机理、蛋白与蛋白的相互作用【6 2 , 6 3 】、蛋白质的侧链基团及其相互作用【删 等发面也有一定的优势。 1 3 3 圆二色性谱 蛋白质是由氨基酸通过肽链连接而成的具有特定结构的生物大分子。蛋白质一般有 一级结构、二级结构、超二级结构、结构域、三级结构和四级结构几个结构层次。在蛋 白质或多肽中，主要的光活性基团是肽链骨架中的肽键、芳香氨基酸残基及二硫桥键。 蛋白质的圆二色性是指当平面圆偏振光通过这些光活性的生色基团时，光活性中心对平 面圆偏振光中的左、右圆偏振光的吸收不同，产生的吸收差值，由于这种吸收差的存在， 造成了偏振光矢量的振幅差，圆偏振光变成了椭圆偏振光。圆二色性的大小常用摩尔消 光系数差( m - 1 c m 。1 ) 来度量，圆二色性也可用摩尔椭圆度【。】来度量。 蛋白质的圆二色性( c d ) 光谱一般分为两个波长范围，即1 7 8 2 5 0n n l 为远紫外区 c d 光谱，2 5 0 3 2 0n l r l 为近紫外区c d 光谱。远紫外区c d 光谱反映肽链的圆二色性。 一般认为，a 螺旋结构在靠近1 9 2n l t l 有一正谱带，在2 2 2 和2 0 8n n l 处表现出两个负的 特征肩峰谱带；p 折叠的c d 谱在2 1 6n i n 有一负谱带，在1 8 5 2 0 0n n l 有一j 下谱带；p 一 转角在2 0 6n r n 附近有一正c d 谱带，而左手螺旋p 2 结构在相应的位置有负的c d 谱带。 处于不对称微环境的芳香氨基酸残基、二硫键的c d 信号出现在2 5 0 3 2 0n n l 近紫外区， 这些信息可作为光谱探针研究它们不对称微环境的扰动。 1 3 3 2 圆二色性谱在测定蛋白质构象方面应用 自从1 9 6 9 年g r e e n f i e l d 用c d 光谱研究蛋白质构象以来，圆二色谱已广泛地应用于 研究抑制剂、溶剂、电磁场及金属离子等对酶构象的影响。如：v u k o v a 等1 8 8 】研究了微 波辐射对乙酰胆碱酯酶( a c e t y l c h o l i n e s t e r a s e ) 活性和对肌肉蛋白质结构的影响。发现微波 辐射导致蛋白质二级结构发生变化，其中b 折叠的含量增加，仿螺旋结构亦变得混乱， 使蛋白质的有序结构无序化。范寰1 8 9 j 等运用c d 光谱研究研究了c e 4 + 对过氧化氢酶 ( c a t ) 构象的影响。实验发现c a t 的构象与c e 4 + 浓度相关，c e 4 + 的浓度很低时，c a t 的仅螺旋含量增加，b 折叠含量减少；c e 4 + 的浓度很高时，结果正好相反。结果表明， 不同浓度的c e 4 + 对c a t 构象的影响不同。此外，研究人员还发现在蛋白质中芳香氨基 酸残基，如色氨酸( t r p ) 、酪氨酸( t y r ) 、苯丙氨酸( p h e ) 及二硫键处于不对称微环境 江南大学硕+ i ：学位论文 时，在近紫外区( 2 5 0 3 2 0n m ) 表现出c d 信号。c a r t e r 9 1 1 等用近紫外c d 光谱探针较好 地揭示了人血清白蛋白( h s a ) 及其3 个结构域中的芳香氨基酸残基、二硫键在不同p h 条件下的所处微环境的改变。 1 3 4 荧光光谱 在蛋白质分子中，能发射荧光的氨基酸有色氨酸( t r p ) 、酪氨酸( t y r ) 以及苯丙氨 酸( p h e ) 。个别蛋白质分子含有的黄素腺嘌呤二核苷酸( f a d ) 也能发射荧光。t r p 、 t y r 及p h e 荧光强弱顺序依次为：t r p 的荧光强度最大，t y r 次之，p h e 最小。通常，蛋 白质的荧光在2 8 0n l n 或更长的波长被激发，因此p h e 在绝大多数实验条件下不被激发。 蛋白质的内源荧光主要来自t r p 和t y r 残基。t r p 残基对微环境的变化很敏感，因而常 作为内源荧光探针来研究溶液状态下蛋白质的构象。除测定蛋白质分子的自身荧光外， 还可以利用荧光探针。荧光探针又可分为稀土离子荧光探针和有机荧光探针。 目前，对于荧光光谱的研究主要在猝灭剂【_ 7 0 。7 2 】、溶剂、电磁场及会属离子等对酶构 象方面。 d o b r y s z y c k i t 7 0 】等研究表明丙烯酰胺( a c r ) 对醛缩酶内的t r p 残基的荧光猝灭是依 赖时间的函数。在醛缩酶中加入a c r 的第1 0 0 秒内猝灭常数k o 从1 1 3 2 m 。1 增加到 2 0 1 0 m 一；在a c r 和醛缩酶作用1 0 0 秒后，醛缩酶每个亚基中的两个t r p 残基可被a c r 猝灭。王守业r 7 1 】等研究了a c r 对蛇毒纤溶组分( f p ) 内源荧光的影响，每个f p 分子含 有多个t r p 残基，这些t r p 残基约有8 3 可被a c r 所猝灭。荧光猝灭剂碘离子i 可以猝 灭蛋白质表面的t r p 残基百分比。陈真龙1 7 2 】等研究结果表明i 。对蛇毒出血毒素i i i 中t r p 残基的猝灭常数为4 2 7l m o l 时，i 可以猝灭蛇毒出血毒素i 中几乎全部t r p 残基的荧 光，表明蛇毒出血毒素i 中的t r p 残基较大程度位于分子表面的亲水区。 蛋白质荧光光谱技术研究的方法主要有： ( 1 ) 同步荧光光谱法 同步荧光技术是在同时扫描激发和发射波长的情况下来测绘荧光光谱图。由于测得 的荧光强度信号对发射或激发波长作图，即为同步荧光。它包括固定波长和固定能量的 同步荧光两种光谱。固定波长的同步荧光光谱是指在同步扫描中，使激发波长和发射波 长保持固定的波长间距，即在k = k m k 戗= 常数的情况下进行扫描，以同步荧光信号( 相 对强度) 对发射或激发波长测绘荧光光谱图。固定能量的同步荧光光谱是指在同步扫描 过程中，使激发波长与发射波长之间保持着固定的能量差。固定能量的同步荧光发与固 定波长的同步荧光法相比较，后者能消除瑞利散射，但不能消除拉曼散射，反而使拉曼 散射加宽。固定能量的同步荧光法既能消除瑞利散射，又可消除拉曼散射，这有利于分 析方法灵敏度和精密度的提高，故一般选用前一种方法。固定波长的同步荧光光谱首先 由l l o y d t 7 4 j 提出，固定能量的同步荧光光谱则随后由i m m a n 等人提出。 自从1 9 7 9 年m i l l e r l 7 5 】用同步荧光光谱法分别获得t r p 和t y r 的特征光谱以来，应用 同步荧光光谱技术研究蛋白质的报道还很有限。c h o u l 7 6 1 等研究了细胞色素c 溶液的同 步荧光光谱，发现细胞色素c 分子中的t r p 和t y r 残基的同步荧光光谱可采用不同的波 长差来分丌，细胞色素c 溶液的同步荧光光谱随溶液p h 不同而变化，反映了p h 诱导 4 第一章绪论 的细胞色素c 构象变化。秦身钧【8 9 j 等运用同步荧光法并辅以普通荧光法对不同浓度稀土 离子及p h 诱导的牛血清白蛋i 兰i ( b s a ) 构象变化进行了详细研究，发现稀土离子使色氨 酸( t r p ) 残基的荧光蓝移，荧光强度降低；酪氨酸( t y r ) 残基荧光峰位置不变，稀土离子浓 度较低时，荧光峰强度降低，而当浓度较高时，t y r 残基荧光峰强度反而增强。据此推 断了稀土离子与b s a 结合反应中t r p 残基微环境和t y r 残基微环境及构象的变化并与 p h 引起的变化进行了比较。 ( 2 ) 三维荧光光谱法 三维荧光光谱发是近2 0 年来提出的一种荧光分析新方法，尤其是最近提出的三维 荧光偏振光谱在研究溶液中荧光体分子的行为特征方面具有较大的优越性。 三维荧光光谱是激发波长( y 轴) 、发射波长( x 轴) 、荧光强度( z 轴) 三维坐标 所表征的矩阵光谱。由于三维荧光光谱所含的光谱信息非常丰富，有效地克服了常规荧 光光谱特征性差的缺陷，其光谱的指纹信息、荧光峰位置和荧光强度能够较好地反映荧 光体分子状态的变化，因而在荧光探针性质的研究方面具有较大的优越性。 三维荧光偏振光谱反映的是荧光体分子同时随激发波长、发射波长变化的偏振光 谱。偏振光谱反映了荧光体分子对偏振光激发的取向、光选择性及激发矩的共线等特征， 光谱形状和偏振度的变化与荧光体的转动速度、分子的形状等有关，因此常应用于生化 领域，如研究蛋白质的变性、缔合和转动速度等。 1 0 余年前，三维荧光光谱法开始应用于生物医药领域。鄢远i ”j 等首次将三维荧光 光谱法用于测定溶液状态下蛋白质的构象。结果表明：三维荧光光谱法是一种研究蛋白 质溶液构象的很有效的分析方法。该方法能够较直观地表明t r p 残基在蛋白质分子中的 微环境及其在不同条件下的构象变化，因而有望得到广泛的应用。c h e n t 7 8 j 等利用三维荧 光光谱法研究了a a h ，在不同介质中的构象变化。用e d t a 脱去a a h 中的金属离子后， 尽管s t o k e 位移保持不变，用等高线表示的a p 0 2 a a h 的三维荧光光谱发生了显著的变化， 同时a p 0 2 a a h 的荧光强度降至只有天然的2 6 ，结合其它实验结果证明了a a h 中的金 属离子对于保持活性和维持其构象稳定都具有重要作用。 1 4 酶在洗涤剂中的应用概况及酶在洗涤剂中活性的主要因素 早在1 9 1 3 年，西德r o h m 在配入含有胰蛋白酶的动物胰脏分泌液洗涤剂专利中， 率先提出了加酶洗涤剂的概念。但这种酶遇到洗涤剂中碱时，活性大大降低，洗涤效果 并不理想。 2 0 世纪6 0 年代出现了能在碱性条件下具有高活性的蛋白酶。于是洗涤剂酶在欧洲 各国得到普及。然而在2 0 世纪6 0 年代末，人们对酶的有效性及安全性产生了质疑，尤 其指责酶粉飞扬而导致生产工人和消费者皮肤及呼吸道的疾病。因此加酶洗涤剂的发展 受到了很大的阻碍。特别是在美国和同本，加酶洗涤剂的生产完全中止，产品也在市场 上完全消失。 2 0 世纪7 0 年代，酶制剂的s u j n 化技术迸一步确立。1 9 7 1 年美国食品管理局公布美 国科学院的报告，证明加酶洗涤剂无害。加酶洗涤剂的市场又一次扩大，加酶洗涤剂的 技术不断完善。 江南人学硕：j ：学位论文 从2 0 世纪8 0 年代以来，洗涤剂用酶的单位活力明显提高，酶的包裹技术不断更新， 克服了酶粉飞扬的现象，并且降低了酶储存过程中的失活率。如今，由于生物技术的迅 猛发展，人们除了对碱性蛋白酶及碱性脂肪酶不断优化以外，还相继开发出碱性淀粉酶 和碱性纤维素酶等多种洗涤剂用酶，从而扩大了洗涤剂用酶的市场 4 】。 1 4 1 洗涤剂用酶制剂的种类和特征 洗涤剂用酶制剂是洗涤剂的辅助成分，利用其触媒的功效能基本去除各种污垢，从 而便于表面活性剂等洗涤成分能够更容易、更有效地将污垢去除。但是，酶制剂对污垢 的触媒作用有特定的选择性，不同的污垢应选择不同的酶制剂。此外，酶制剂还必须与 洗涤剂的主成分( 表面活性剂、碱和硬水软化剂) 有良好的配伍性。作为一个最重要的基 本性质就是配入洗涤剂中，必须具有良好的保存稳定性。 现在使用的洗涤剂用酶制剂几乎都是运用遗传因子转换技术制成的，代表性的品种 有如下4 种：蛋白质分解酶( p r o t e a s e ) 、脂肪分解酶( 1 i p a s e ) 、淀粉分解酶( a m y l a s e ) 和 纤维分解酶c e l l u l a s e ) 。最近新开发的酶制剂有：甘露聚糖酶( m a n n a s e ) 、过氧化物酶 ( p e r o x i d a s e ) 、虫漆酶( 1 a c c a s e ) 和虫胶酶( p e c t i n a s e )