（发酵工程专业论文）红曲霉产降血压活性物质的研究.pdf

红曲霉产降血压活性物质的研究 摘要 丫一氨基丁酸( g a b a ) 具有降血压功能。本论文的主要研究内 容包括：筛选较高产g a b a 的红曲霉与乳酸菌菌株；优化红曲霉与 乳酸菌发酵生产g a b a 的工艺条件；初步研究红曲霉谷氨酸脱羧酶 ( g a d ) 酶学特性；初步探讨适合红曲霉与乳酸菌产g a b a 的混合 培养方式。 对h p l c e l s d 分析g a b a 的方法进行了研究，确定了较佳的 色谱条件。 筛选到了相对高产g a b a 的菌株g m 0 1 6 与乳酸菌5 撑，并对其特 性进行了研究，得出：红曲霉菌丝最适生长温度为3 0 。c ，最适p h 值 为5 0 ，能耐酒精浓度为1 4 ( v v ) ；乳酸菌5 撑产乳酸，与过氧化氢 酶( 接触酶) 反应不产气体为阴性反应，与精氨酸水解反应不产氨， 发酵乳糖、半乳糖、麦芽糖、蔗糖、葡萄糖，不发酵核糖、鼠李糖、 木糖，初步鉴定出此乳酸菌可能为嗜酸乳杆菌。 对红曲霉g m 0 1 6 与乳酸菌5 群液态发酵生产g a b a 的发酵工艺进 行了优化。红曲霉g m 0 1 6 的较佳培养条件：大米粉5 ，葡萄糖7 ， 黄豆粉1 o ，酵母粉1 5 ，l 谷氨酸o 8 ，n a n 0 3o 5 ，k h 2 p 0 4 o 1 5 ，m g s 0 4 7 h 2 0o 1 ，c a c l 2o 1 5 ，v b 6o 1 5 ，p h 4 2 ，种子 浙江工业大学硕士学位论文摘要 液菌龄4 0 h ，接种量1 0 ，摇瓶装液量10 0 m l 5 0 0 m l ，3 0 、18 0 r m i n 转速培养1 2 d ，在此条件下g a b a 含量达到0 3 9 5 9 l ；乳酸菌5 拌的较 佳培养条件：蛋白胨0 5 ，酵母膏o 5 ，乳糖1 o ，丁二酸钠o 5 ， l 谷氨酸1 o ，p h 7 0 ，培养温度3 3 c ，培养时间4 8 h ，接种量4 ， 三角瓶装液量15 0 m l 2 5 0 m l 。在此条件下g a b a 含量达到0 4 6 9 l 以 上。 对红曲霉g m 0 1 6 谷氨酸脱羧酶( g a d ) 酶学特性进行了初步研 究，g a d 最适温度为3 0 ，在最适温度左右，酶的稳定性较好；最 适p h 为4 5 ，在p h 4 5 5 5 酶活较高，也较为稳定。 对红曲霉g m 0 1 6 与乳酸菌5 撑混合培养产g a b a 的培养方式进行 了初探，将红曲霉g m 0 1 6 的种子液接入到培养3 d 的乳酸菌5 撑发酵 液中，培养1 2 d 后，g a b a 含量高达0 6 0 9 l 以上。 关键词：y 氨基丁酸( g a b a ) ，红曲霉，谷氨酸脱羧酶( g a d ) ， 乳酸菌，混合培养 浙江工业大学硕士学位论文 a b s t r a c t r e s e a c ho fh y p o t e n s i s u b s t a n c e s p r o d u c e db ya 必肌搿 5 t c 【靥卿 a bs t r a c t 7 - a m i n o b u t y r i ca c i d ( g a b a ) i sa nh y p o t e n s i v es u b s t a n c e t h em a i n c o n t e n t so ft h i st h e s i sw e r e ：t os c r e e nm o n a s c u ss p p a n dl a c t i ca c i d b a c t e r i as t r a i n sp r o d u c i n gg a b a h i g h l y ；t oo p t i m i z et h ef e r m e n t a t i o n c u l t i v a t i o np r o c e s s e so fm o n a s c u ss p p a n dl a c t i ca c i db a c t e r i a ；t os t u d y t h ec h a r a c t e r so fm o n a s c u ss p p g l u t a m a t ed e c a r b o x y l a s e ( g a d ) ；t o d i s c u s st h ec o c u l t u r eo fm o n a s c u ss p p a n dl a c t i ca c i db a c t e r i a t h em e t h o do fh p l c - e l s da n a l y z i n gg a b aw a ss t u d i e d ，a n d c o n f i r m e dt h eo p t i m a lc h r o m a t o g r a p h yc o n d i t i o n s m o n a s c u sp i l o s u sg m 016a n dl a c t i ca c i db a c t e r i a5 捍p r o d u c i n g g a b aw e r es c r e e n e d ，a n dt h e i rc h a r a c t e r sw e r er e s e a c h e d t h eo p t i m a l t e m p e r a t u r ea n dp h o fm o n a s c u s p i l o s u sg m 0 16w e r e30 。ca n d5 0 ，a n d c o u l de n d u r e14 ( v v ) e t h a n 0 1 l a c t i ca c i db a c t e r i a5 群r e a c t e dw i t h c a t a l a s e ，a n di td i d n tp r o d u c eh 2 ，s oi tw a saf e m i n i n er e a c t i o n ；i tr e a c t e d w i t ha r g i n i n ea n dd i d n tp r o d u c en h 3 ；i tc o u l db ef e r m e n t e db yl a c t o s e ， g a l a c t o s e ，m a l t o s e ，s u c r o s ea n dg l u c o s e ，a n di tc o u l d n tb ef e r m e n t e db y r i b o s ea n dx y l o s e s ol a c t i ca c i db a c t e r i a5 群w a sp r i m a r i l yi d e n t i f i e dt ob e l a c t o b a c i l l u sa c i d o p h i l u s 浙江工业大学硕士学位论文 t h el i q u i df e r m e n t a t i o np r o c e s so fm o n a s c u s p i l o s u sg m 0 16a n d l a c t i ca c i db a c t e r i a5 撑w e r eo p t i m i z e d t h eo p t i m a lc u l t i v a t i o nc o n d i t i o n o fm o n a s c u sp i l o s u sg m 016w a s - r i c ep o w e r5 ，g l u c o s e7 ，s o y b e a n p o w e r1 o ，y e a s tp o w e r1 5 ，l g i uo 8 ，n a n 0 3o 5 ，k h 2 p 0 4 0 15 ，m g s 0 4 。7 i - i ：oo 1 ，c a c l 2o 15 ，v b 6o 15 ，p h 4 2 ，s e e da g e 4 0h o u r s ，10 i n o c u l u m ，10 0 m l 5 0 0 m l ( v v ) e n c a s e df e r m e n t a t i o nl i q u i d v o l u m e ，30 。c ，18 0 r m i n ，c u l t i v a t e df o r12d a y s ，a n di nt h i sc o n d i t i o nt h e c o n t e n to fg a b aw a s0 3 9 5 9 l t h eo p t i m a lc u l t i v a t i o nc o n d i t i o no f l a c t i ca c i db a c t e r i a 5 撑w a s ：p e p t o n eo 5 ，y e a s te x t r a c to 5 ，l a c t o s e 1 o ，l - g l u1 o ，p h 7 0 ，4 i n o c u l u m ，15 0 m l 2 5 0 m l ( v v ) e n c a s e d f e r m e n t a t i o nl i q u i dv o l u m e ，3 3 c ，c u l t i v a t e df o r4 8h o u r s ，a n di nt h i s c o n d i t i o nt h ec o n t e n to fg a b aw a so v e r0 4 6 9 l t h ec h a r a c t e r so fg l u t a m a t ed e c a r b o x y l a s e ( g a d ) f r o mm o n a s c u s p i l o s u sg m 0 16w e r es t u d i e d t h eo p t i m a lt e m p e r a t u r eo fg a dw a s 3 0 。c ，a n da b o u t3 0 ci tw a ss t e a d y t h eo p t i m a lp ho f g a dw a s4 5 ，a n d t h eg a d a b i l i t yb e t w e e np h 4 5t op h5 5w a sh i 曲a n d s t e a d y t h ec o c u l t u r em o d eo fm o n a s c u s p i l o s u sg m 0 16a n dl a c t i ca c i db a - c t e r i a5 撑w a sd i s c u s s e d ，m o n a s c u sp i l o s u sg m 016i n o c u l u mw a s p u ti n t o l a c t i ca c i db a c t e r i a5 撑b yf e r m e n t e df o r3d a y s ，a n dt h e nc o c u l t u r e df o r12 d a y s t h ec o n t e n to f g a b a w a st o0 6 0 9 l k e yw o r d s ：丫- a m i n o b u t y r i ca c i d ( g a b a ) ，m o n a s c u ss p p ，g l u t a m a t e d e c a r b o x y l a s e ( g a d ) ，l a c t i ca c i db a c t e r i a ，c o c u l t u r e i v 浙江工业大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师的指导下，独立进行研究工 作所取得的研究成果。除文中已经加以标注引用的内容外，本论文不包含其他个 人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不含为获得浙江工业大学或其它教育 机构的学位证书而使用过的材料。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均 已在文中以明确方式标明。本人承担本声明的法律责任。 作者签名：锋毒立 日期：为。辞月3 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借 阅。本人授权浙江工业大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于 1 、保密吖在窆年解密后适用本授权书。 2 、不保密口。 ( 请在以上相应方框内打“”) 作者签名：侔牟去 导师签名： 日期：弘彳，年f 月日 日期：扣：缍6 月舌日 浙江工业大学硕士学位论文第一章绪论 第一章绪论 1 1 红曲霉概述 红曲霉是单子囊菌属( m o n a s c u s ) 的腐生真菌。在菌物学中，对小型真菌具 有有性世代称为菌，所以我们又称其为红曲霉菌。红曲是以大米为主要原料，经 红曲霉( m o n a s c u ss p p ) 发酵而制成的一种红色米曲，其色赤红，故又名赤曲、 红米l 1 1 。 红曲霉在我国的应用历史悠久，早在1 0 0 0 多年以前，我们的先祖就己经培制 红曲，利用红曲烹调食物的记载，最早见于北宋太祖时代，陶谷【2 1 ( 约在9 6 0 - 9 7 0 年间) 编写的清异录：“有赐绊羊，其法以红曲煮肉，紧卷，石镇，深 入酒骨腌透，切如纸薄袄，乃进 ，这也是红曲色素应用于食品方面的最早记录。 元代吴瑞( 1 3 9 2 年) 在其食疗专著日用本草中记载：“红曲酿酒，破血行药 势，杀山岚瘴气，治打扑伤损 。明代先后由李时珍和宋应星编著的本草纲目 和天工开物中明确的记载了红曲在中医学和食品防腐、着色上的应用，而且 对红曲的培制，如控温、控湿、通风等，都有较详细的说明。清代王如鉴在本 草约编中有记载：“气味甘温曲是红，亦能消食与调中，健脾燥胃和营血，产 后伤科并建功 ，“红曲作酒则带热辛，能动痰疾，脚气之病并发痔疹肠风之患 。 近些年来，海内外学人在红曲霉研究、应用领域的交流亦十分活跃。红曲及 红曲霉因其各种用途越来越受到人们的重视。红曲及红曲霉因含有大量的功能性 成分，大多具有重要的生理功能活性，所以在医药、化工、食品等方面具有广泛 的应用前景。 中国台湾省食品工业研究所所长刘廷英教授指出，目前红曲产品在全球市场 中包括“红曲色素 、“食品原料、“健康食品 的产值，保守估计在3 0 - 5 0 亿 美元左右，未来这一市场潜力可能为数百亿、甚至上千亿美元。 古老的传统技术融入现代科学正体现出现代生物技术蕴含的巨大发展潜力， 源于自然的红曲产品走向大众，更平添了红曲的神奇魅力。红曲霉菌( m o n a s c u s s p p ) ，神奇的自然界赐予人类的菌物，必将成为生物科技的“明日之星”。 浙江工业大学硕士学位论文第一章绪论 1 1 1 红曲霉的分类 红曲霉( m o n a s c u s ) 属于真菌界( e u s s c o m y e t e s ) 子囊菌门( a s c o m y c a ) 真 子囊菌纲( e u a s c o m y d e t e s ) 散子囊菌日( e u r o t i a l e s ) 红曲菌科( m o n a s c u s ) 红 曲菌属( m o n a s c u s ) p 】。自18 8 4 年v a nt i e g h e m 建红曲菌属以来至今百余年间， 文献中已经有2 0 种红曲霉菌【4 1 2 1 ，见表1 1 。1 9 8 3 年，h a w k s w o r t h 和p i t t 1 3 】对模式 菌种和许多分离物进行调查研究，根据菌落大小，色素的色泽，被子器和分生孢 子是否无色透明或着色等特性，将之归为以下三类：丛毛红曲菌( m p i l o s u ss a t o ) 、 红色红曲菌( m r u b e rv a i lt i e g h e m ) 和紫色红曲菌( m p u r p u r e u sw e n t ) ；将2 0 种红曲 霉菌分别归并在这三种中。19 8 5 年，b r i d g e 和h a w s w o r t h 进一步用生化测定验证 了该分类方法，至今已分离到的主要红曲霉菌株均可包括在以上三类之内。1 9 8 7 年，b 锄a r d 与c a l l n o n 发表了 知，z 鲫c 淞加r i d a n u s 翥a 种【1 4 】。1 9 9 5 年c a n n o n 等发表两 种新种：m o n a s c u s p a l l e n s 、m o n a s c u ss a n g u i n e u s ，并依有性世代之形态加以分类 【”】。中国科学院微生物研究所李钟庆等通过对模式菌种和可靠菌株的调查研究， 利用培养特征对红曲霉属进行分类后重新确认了8 个种【1 6 1 ，即发白红曲菌 ( m a l b i d u s ) 、红曲红曲菌( m a n k a ) 、橙色红曲菌( m a u r a n t i a c u s ) 、巴克红曲菌 ( m b a r k e r o 、烟色红曲霉( m f u l i g i n o s u s ) 、丛毛红曲霉( m p i l o s u s ) 、紫色红曲霉 ( m p u r p u r e u s ) 和红色红曲霉( m r u b e r ) 。 表1 1红曲霉属真菌分类表 浙江工业大学硕士学位论文第一章绪论 1 1 2 红曲霉的培养特性及生理生化特性 红曲霉是腐生真菌通常出现在乳酸自然发酵的基质中，大曲、制曲作坊、酿 酒醪液、青贮饲料、泡菜、淀粉厂等都是它们适于繁殖的场所【17 1 。红曲霉在麦 芽汁琼脂培养基上生长良好，茵落初为白色，老熟后变为淡粉色、紫红色或灰黑 色等，因种而异，菌落的结构呈绒毡状或皮膜状，呈皮膜状的菌落少褶皱或具有 辐射纹。红曲霉菌多能形成红曲色素，甚至分泌到培养基中。菌丝具有横隔，多 核，分枝甚繁，且不规则。细胞幼时含有颗粒，老后含空泡及油滴。分生孢子着 生在菌丝及其分枝的顶端，单生或以向基式生出，2 - - - 6 个成链状。闭囊壳呈球形， 有柄，柄长短不一。闭囊壳内散生十多个子囊，子囊呈球形，含8 个子囊抱子， 成熟予囊壁解体，孢子留在薄壁的闭囊壳内。红曲霉的生活史如图l l 所示。 3 浙汀i 太学颤i 学位论i* 一绪镕 融 秽 圈卜1 烟色红曲霉菌的生活史 摘自常见常用真茁 ( i ) 无性生殖：i - - 苗”和菌的阿结联骨现雾2 3 分生抱r 梗_ 1 分生孢子4 分生孢子萌艟 ( 2 ) 有性生殖5 雄器和产囊器6 一受精丝的形成7 一形成不茸菌丝将产囊器、雄 器包8 原始闭盎先9 一原始闭囊壳剖面 l 旺成熟闭囊壳剖面 1 1 r 囊孢予 1 2 _ 子囊孢子萌发 红曲霉嗜醴，特别喜乳酸，耐高温，耐1 0 乙醇，生长温度为2 6 一- 、- 4 2 0 ， 最适温度为3 2 3 5 = c ，最适p h 为35 50 ，可以糖类、有机酸、醇类为碳源， 能利用硝基氮、氨基氮和有机氮，能合成多种维生素，可在无维生素的合成培养 基中生i f 。表1 - 2 列出了常用自曲霉的生物学性质m 1 。 表i - 2 常用红曲霉的生物学性质 v线，气 掺哆薹 固 掣蚕 、毋 i 泣差 国嚼 、弗瑟 尹；萎一 浙江工业大学硕士学位论文第一章绪论 1 2 红曲霉产生的降血压物质y 一氨基丁酸( g a b a ) 目前已发现多种微生物能产生y 一氨基丁酸( g a b a ) ，其中以红曲霉和乳酸菌 更为引人瞩目。日本国立健康研究所进行饲料添加“红曲培养物 的动物试验中， 发现添加0 1 2 , - - - 0 1 3 “红曲培养物”的饲料可使患有先天性高血压症老鼠的 血压由超过2 0 0 m m h g 降至1 8 0 m m h g 以下，其有效成分为y 一氨基丁酸及 g l u c o s a m i n e 或红曲霉的其它细胞壁成分【1 9 1 。2 0 世纪9 0 年代，日本研制的“群 势”红曲有很强的降压功能，因而获得高血压改善剂的专利。此外，日本还开发 了用m a n k a 的提取物制备保健饮料用于治疗高血压的技术。在国内，也陆续开 展了降压作用的研究。毛宁，黄谚谚【2 0 】在对红曲霉菌丝体的营养价值的分析后 发现具有高k 低n a 的特点，这对于降低血压有重要的生理意义。早在1 9 9 8 年 时已有降压、降脂、降糖的红曲药物的专利公开发表，用于治疗高血压的鑫康延 平胶囊也已上市。此外，也有根据红曲的降压功效来开发低盐食品的研究，比如 日本研制成功的低盐大豆酱油即为一例。 1 2 1g a b a 的结构和理化性质 浙江工业大学硕士学位论文第一章绪论 丫一氨基丁酸( t - - a m i n o b u t a n o i ea c i d ，g a b a ) 是一种白色或近白色结晶性 粉末，分子量为1 0 3 2 ，熔点为2 0 3 1 2 ( 分解) 。其化学结构式如图1 - 2 。 g a b a 极易溶于水，微溶于热乙醇，不溶于冷乙醇、苯和乙醚。熔化时，其 分解成吡咯烷酮和水，化学反应式如图1 3 。故g a b a 可由吡咯烷酮水解开环而 得。 h l n c h - c h 一广c 叩h 监监一一y y _ g ：a ：t l l l t 2 0 托2 一i 毗咯烷酮i 1 2 2g a b a 的生理活性 1 9 5 0 年，f l o r y 和r o b e r t 的研究小组在哺乳类动物脑萃取液中首次发现 g a b a ，如今，医学家已经证明g a b a 是中枢神经系统的抑制性传递物质，它 是脑组织中最重要的神经递质之一【2 卜2 3 1 。其作用是降低神经元活性，防止神经 细胞过热。g a b a 能结合抗焦虑的脑受体并使之激活，然后与另外一些物质协同 作用，阻止与焦虑相关的信息抵达脑指示中枢，因此，g a b a 可从根本上镇静神 经，从而起到抗焦虑的效果【2 4 】。g a b a 作为药品可用于改善大脑血液循环，增 加氧气供给，改善大脑细胞代谢，还有助于治疗因脑中风、头部外伤和脑动脉硬 化后遗症等产生的头疼、耳鸣和意识模糊等后遗症【2 5 1 。 1 2 2 1 降血压作用 g a b a 能系统地对脑血管进行调节，是目前研究的重要课题之一。已有实验 证明，在几种动物( 猫、犬和大鼠等) 的脑血管中有g a b a 能神经支配系统，而且 g a b a 能系统还参与脑循环的调节。g a b a 能使脑部血液流畅，氧供给增加， 脑细胞功能亢进。因此临床上常作为脑血栓后遗症、脑动脉硬化症等造成的头痛、 耳鸣、记忆障碍、情绪冷漠等症状的改善药使用。另一方面，它作用于延髓的血 管运动中枢，使血压降低，同时抑制抗利尿激素后叶加压素的分泌，扩张血管， 降低血压。而且g a b a 还有肾功能活化功能，高血压病人往往肾功能降，使肾 6 浙江工业大学硕士学位论文第一章绪论 功能活化后，即使盐分摄取量增多，也可因为利尿作用激活，过剩盐分可从尿中 排出，使血压降低，从而可预防高血压【2 6 1 。 1 2 2 2 调节心律失常 g a b a 能系统参与心血管功能的调节【2 刀。g a b a 可抑制心律失常的发生。 李荣藏等，首次发现外源性的丫一氨基丁酸具有抗心律失常的活性，可对抗多种 实验性心律失常。孟娟好等，进一步发现g a b a 主要通过对心脏的直接作用而 对抗乌头碱性心律失常，与神经调节无关。 1 2 2 3 调节激素分泌 近年来发现，g a b a 参与了对垂体促进性腺激素分泌的调节，并有实验证实 是通过下丘脑l h r h 细胞近旁g a b a 激导性传递的减少来实现的。葛仁勇等研 究证实，g a b a 能促进腺量体分泌黄体生成素( p 0 0 5 ) ，并且是双向性的。 1 2 2 4 其他生理功能 g a b a 还具有健脑作用，由于丫一氨基丁酸为谷氨酸的三羧酸循环提供了另 外的一种途径( g a b a s h u n t ) ，所以能有效地改善脑血流通，促进脑的代谢功 能；改善脂质代谢，防止动脉硬化的功能，在临床上可作为改善动脉硬化所引起 的各种症状的药物使用；增强风味之功能，其具有类似于谷氨酸的甜昧；防皮肤 老化功能口8 】；醒酒功能等。 1 2 3g a b a 的生物合成机理 g a 出a 是广泛分布于动植物中的一种非蛋i 兰t ( n o n p r o t e i n ) 氨基酸，是一种神 经传递物质。它由谷氨酸经谷氨酸脱羧酶( g l u t a m i ea c i dd e c a r b o x y l a s e ，g a d ) 催 化而来，是存在于哺乳动物脑、脊髓中的抑制性神经传递物质，在人或动物体内 参与脑循环生理活动。除脑和脊髓外，已在多种哺乳动物的近3 0 种外周组织中 发现g a b a 的存在。 l 谷氨酸脱羧酶催化l 谷氨酸经0 【脱羧产生g a b a 。g a b a 再在g a b a a 氧戊二酸转氨酶( g a b at r a n s a m i n a s e ，g a b a t ) 的作用下与a 酮戊二酸发生转氨 作用，形成谷氨酸和琥珀酸半醛( s u e c i n i cs e m i a l d e h y d e ，s s a ) ，s s a 经琥珀酸半 7 浙江工业大学硕士学位论文 第一章绪论 醛脱氢酶( s u e e i n i cs e m i a l d e h y d ed e h y d r o g e n a s e ，s s a d i - i ) 脱氢氧化形成琥珀酸 ( s u c c i n i ca c i d ，s a ) ，然后进入三羧酸循环( k r e b sc i r c l e ) 。这些反应和- 酮戊二酸 氧化成s a 的反应一起构成g a b a 支路【2 3 1 。g a b a 支路中的3 种酶分别为g a d 、 g a b a t 和s s a d h t 2 9 1 ，其代谢途径如图1 _ 4 所示。 图1 - 4g a b a 支路及其与其它代谢途径的关系 1 2 4g a b a 代谢途径中的关键酶 谷氨酸脱羧酶( g a d ，e c 4 1 1 1 5 ) 是一种磷酸吡哆醛( p l p ) 类酶，是催 化谷氨酸脱羧形成抑制性神经递质g a b a 的关键限速酶。它广泛存在于脊椎动 物中枢神经系统的神经元中，非神经组织如睾丸、输卵管中亦存在g a d 。g a d 在哺乳动物神经系统中起调节g a b a 合成的作用。目前。g a d 可能具有的其它 生理功能也已成为科学家们关注的热点【3 0 l 。 红曲霉菌体经超声波破壁处理后，经硫酸铵盐析，胶体过滤液经管柱层析 ( s e p h a r o s ec l 6 b ) 及阴离子交换树j 旨( d e a e - s e p h a r o s ec l 6 b ) 等纯化步骤之后， 可得到g a d 粗酶液。该酶对g l u 底物专一性最高，k m = 1 1 5 m m 。1 9 7 3 年，人 们首次从鼠脑中纯化到鼠脑g a d ，此后人们又从哺乳动物脑中纯化到了g a d ， 并进一步发现g a d 存在于胞浆中，其是由磷酸吡哆醛与脱辅基酶蛋i 兰t ( a p o g a d ) 8 浙江工业大学硕士学位论文第一章绪论 构成的，g a d 通过p l p 与a p o g a d 的解离和聚合调节其自身的活性【3 。 g a b a t ( e c2 6 1 1 9 ) 存在于胞浆中，其最适p h 范围为8 1 0 ，为p l p 依赖 型。g a b a t 是以g a b a 一丙酮酸转氨酶和g a b a n 酮戊二酸转氨酶2 种形式 存在的1 3 2 】，但前者活性高于后者。研究发现不同来源的g a b a t 对底物的特异 性不同，细菌、酵母和高等植物的g a b a t 只能以g a b a 为底物，而放线菌、 真菌和哺乳动物的g a b a t 也可以以b 丙氨酸为底物。不同来源的g a b a t 对 氨基受体的要求也不同，细菌、酵母、真菌和哺乳动物的q 心a t 只能以a 酮 戊二酸为氨基受体，而植物中的g a b a t 也可以以丙酮酸为氨基受体。 s s a d h ( e c1 2 1 1 6 ) 是n a d + 氧化还原酶，存在于线粒体中，哺乳动物和一 些植物的s s a d h ，分子量为1 4 - - 2 2 0 k d ，催化反应的最适p h 为9 0 - - - 9 5 t 3 3 1 ，该 酶以n a d + 为辅助因子，n a d h 对酶有抑制性作用。当n a d h n a d + - l 时，s s a d h 的活性下降1 0 ，当n a d h n a d + = 2 时，酶活性完全被抑制。保持其最高活性 需添加硫醇，其对底物的特异性很高，对s s a 的k m 值为5 1 0 p m ，被重金属离 子抑制。 1 2 5g a b a 的应用 利用副产品加工制备g a b a ，日本目前已有5 家公司生产销售富含g a b a 的发芽糙米，据其中一家公司的业绩报告，2 0 0 0 年1 3 月份，销售额达到2 亿 日元。发芽糙米保留了优良营养素，将成为2 l 世纪引人注目的新的粮食资源。 2 0 世纪9 0 年代中期，日本o r y z a 石油化学公司曾开发出种名为g a b a r i c e g e r m 的保健食品添加剂1 3 引，日本食品科学技术学会确认了该产品在改善失眠、 抑郁症和更年期综合症等方面具有显著效果，并将它作为一种功能性食品。目前 我国米胚的开发利用还不充分，米胚芽营养全面，但分离难度较高，所以许多米 厂未作分离而留在米糠中作饲料用。除o r y z a 外，日本f u j i c c o 、大洋香料、 y a e g a k i 发酵研究所、f a m a f u t s u 研究所等机构都在积极开发富含g a b a 的食品素材，涉及领域相当广泛。利用生物技术，通过筛选优良高产的安全菌种， 发酵生产g a b a 制剂。酵母菌、红曲霉菌、乳酸菌等被公认是食品安全性微生 物。利用微生物发酵生产g a b a ，产品具有成本低、含量高和安全性高的优点。 所以g a b a 以及富含g a b a 的功能性食品的开发和生产，具有广阔的应用前景。 9 浙江工业大学硕士学位论文第一章绪论 1 3 红曲霉产生的其他生理活性代谢产物 1 3 1 酶类活性物质 红曲霉能产生多种酶类物质，主要有淀粉酶、糖化酶、蛋白酶、羧肽酶、麦 芽糖酶、果胶酶等。不同种类菌株产酶的类型及产量都有所差异。某些红曲霉菌 株具有很强的糖化酶活力，几乎可将淀粉完全水解成葡萄糖，工业上利用红曲这 一特性代替了酸水解法生产葡萄糖。由于有些红曲霉菌株的蛋白酶活性较高，可 用于腌渍鱼、肉、豆腐等高蛋白产品，使制品组织细腻、口感滑爽、香味浓郁、 色泽红润。某些红曲菌种能分泌可催化有机酸和乙醇进行反应的胞外酶。这些都 是对红曲代谢过程中产生的酶类物质的具体应用。 1 3 2 降胆固醇类活性物质 红曲霉所产生的降胆固醇物质主要是m o n a c o l i n s 类物质。1 9 7 9 年由日本远 藤章教授从烟色红曲霉( m o n a s c u sr u b e r ) 发酵液中分离得到一种可抑制体内胆 固醇合成的物质，被命名为m o n a c o l i n k 。在胆固醇生物合成途径1 3 5 j 中，h m g c o a 是一种还原酶，也称限速酶，是控制胆固醇合成的关键酶。它可以有效减少或阻 断内源性胆固醇的合成，其中以m o n a c o l i nk 的抑制活性最为显著。莫纳可林类 物质正是能特异性对抗抑制h m g c o a 还原酶的活性，并通过增高载脂蛋白 ( a p o b e ) 受体活性，而降低含有低密度脂蛋白( l d l ) 、中密度脂蛋白( d l ) 及极低密度脂蛋白( v l d l ) 的血浆脂蛋白浓度，代偿性的增高l d l 受体，的 活性，促进血浆中l d l 的清除，从而达到降低血胆固醇浓度的目的p 6 】。 现已有人提出，红曲中的真正降脂物质m e v i n o l i n i ca c i d ( 被称为“酸式莫 奈可林k ) ，它无需人体内的羟基酸酯酶参与水解，即能直接发挥降脂作用。而 l o v a s t a t i n 是美国默克公司开发出来的处方药物，它是六氢萘酯，即内酯结构的 前体药物，其本身无活性，需经人体产生的羟基酯酶水解，改变结构后才能产生 活性，发挥降脂功效。两者的分子式、分子结构和分子量不同。结果发现，这种 酸式莫奈可林k 存在于发酵的红曲米中。从科学的角度讲，它们是来源不同，结 构不同，性质也不同的两种物质。由于l o v a s t a t i n 是一种前体药物，本身没有降 脂作用，所以需经人体产生的羟基酯酶参与水解，发挥功效。但是，人体产生的 1 0 浙江工业大学硕士学位论文第一章绪论 羟基酯酶至少有三种，且产生羟基酯酶的能力存在着较大的个体差异，有的人甚 至完全没有。这就决定了l o v a s t a t i n 的降脂作用在不同病人身上差距悬殊。产生 羟基酯酶多的病人降脂效果好，产生少的病人降脂效果差，毒副作用大，个别病 人则完全无效。而传统发酵的红曲米中的降脂物质，由于绝大部分为酸式结构即 酸式m o n a c o l i nk ，不再需要人体内的羟基酯酶参与水解，因而不增加肝、肾负 担，直接起到降低胆固醇的作用，因此，降脂效果好于l o v a s t a t i n ，毒副作用小 于l o v a s t a t i n 3 7 1 。 h l o v a s t a t i n 结构式 m o n a c o l i nk 结构式( 酸式) 1 3 3 红曲色素 红曲色素是红曲霉在生长代谢过程中产生的所有天然色素的总称，是迄今为 止唯一由微生物代谢生成的天然色素。红曲色素是一种优良的食用色素，它性能 稳定，耐热性强，加热至1 0 0 - - 一2 0 0 0 依然稳定，对紫外射线相当稳定，不易褪色， 只是在太阳光的直射下，色度才有所降低，红曲色素几乎不受氧化剂、还原剂的 影响。同时安全性毒性实验、慢性毒性实验以及致突变性试验表明，均无毒性，且 无致突变作用【3 8 1 。因此，红曲色素是值得大力推广的食用天然色素。 红曲霉所产生的色素已被确定出化学结构且广为人知的有6 种，可分为3 即红色素m o n a s c o r u b r a m i n e 与r u b r o p u n c t a m i n e ，橙色素m o n a s c o r u b i n 与 r o p u n c t a t i n 及黄色素a n k a f l a v i n 与m o n a s c i n ，它们是属于a z a p h i l o n e s 类菌代谢 物，构造极为类似。除已知的6 种色素成分外，日本广井忠夫等还有5 一种色 素成分存在于红曲色素中。1 9 9 3 年郭东川等分离得到的两曲色素与己知的6 种 红曲色素不同，确定为新的红曲色素，它们的分子式为：c 2 5 h 3 l o s n 和c 2 3 h 2 7 0 5 n ， 浙江工业大学硕士学位论文第一章绪论 分子量分别为4 2 5 和3 9 7 。 红曲色素有水溶性色素和脂溶性色素两类。水溶性色素有一部分可溶于有机 溶剂中，而脂溶性色素则不易溶于水。谢珍珍等 3 9 1 对红曲色素的稳定性做了研 究，p h 值对红曲色素有影响，偏酸性或偏碱性影响都较大，而在p h 5 确7 时， 对色素的最大吸收波长和色调的影响都较小。红曲色素在乙醇和醋酸中的溶解性 好，在8 2 的乙醇溶液、7 8 的醋酸溶液中，溶解度最高。红曲色素的乙醇溶液， 在2 5 室温下，避光存放两个月，1 0 0 加热1 5 h 或1 2 0 加热o 5 h 的保存率均 在9 2 以上。这对于天然色素来说，可算是热稳定较好的一种了。 红曲色素可以通过固体和液体发酵两种方法培养红曲霉而得到，从而可以在 生产中大量提取。红曲色素可应用于各种肉制品、水产品、配制酒、冰棍、饼干、 果冻、膨化食品、调味类罐头、奶制品、植物蛋白、果品等【删。目前国内大略 有两类红曲色素产品：红曲米和红曲米提取物或深层发酵红曲霉提取物红曲红。 1 3 4 抗菌活性物质 早在天工开物下卷就有这样的记载：“世间的鱼肉是最容易腐败的，但 薄涂红曲，即使在盛夏也不变质，近l o 天蛆蝇不近，色味不减，盖奇药也 ，这 段记述说明我们的祖先早就利用红f h j 霉来防止食品腐败。董明盛等用红曲霉固体 培养物和液体发酵液对十四种微生物进行抑菌试验，结果证明，红曲霉发酵物对 蜡状芽抱杆菌、霉状杆菌、枯草杆菌、金黄色葡萄球菌、荧光假单抱杆菌有较强 的抑制作用，对绿脓杆菌、鸡白痢杆菌、大肠杆菌、变形杆菌也有抑菌作用，而 对八叠球菌不具有抑制作用；对啤酒酵母、产黄青霉不具有抑制作用，但能强烈 地抑制黑曲霉分生孢子的形成。丁前盛等对引起人和动物疾病的十六种微生物分 别进行试验，结果发现，红曲霉发酵液对部分引起人和动物疾病的细菌有较强的 抑菌和杀菌作用。王柏琴等的研究报道认为，利用红曲色素抑制肉毒芽孢杆菌并 应用于发酵香肠中是可行的。董明盛、丁前盛、王柏琴等人的研究肯定了红曲霉 在生长代谢过程中能产生某些杀菌抑菌的活性物质，但具体是什么物质还不十分 明确。远藤章等人认为活性成分中一部分是色素物质。1 9 7 7 年，w o n g 和b a u 发 现粗萃取的红曲霉色素具抗菌活性，并把抗菌活性物质命名为m o n a s c i d i na ，此 物质是一种对神经有毒性的代谢产物，对b a c i l l u s ，s t r e p t o c o c c u s 、p s e u d o m o n a s 1 2 浙江工业大学硕士学位论文第一章绪论 等食品腐败菌有抑制作用。现在的研究已证实此物质与p e n i c i l l i u mc i t r i n u m 所产 生的c i t r i n i n 为同种物质，在n m r 、m s 及吸收光谱分析等具有相同性质，因此 有人认为是m o n a s c i d i na 在起抑菌作用。但是，在一项对红曲米在肉类中的防 腐效果的研究中，使用紫色红曲霉d s m1 3 7 菌株的提取物，它虽然不含c i t r i n i n ， 但却具有抑菌效果，可能这些提取物中含其它抑菌物质而不是m o n a s c i d i na 。 1 9 9 1 年日本曾在m a n k a 的培养滤液中分离出种能抑制g + 、g 一菌的化合物， 并测定了它的化学结构，同时命名为a n k a l a c t o n e 【4 1 】；1 9 9 6 年捷克斯洛伐克1 4 2 也同样分离出了这种物质。此外，日本还发现了红曲提取物与己二酸、衣康酸等 其它抑菌剂的协同抑菌作用。随着对红曲抑菌物质的逐渐明确，红曲在食品的保 鲜上会发挥更大的作用。 1 3 5 麦角固醇 麦角固醇( e r g o s t e r 0 1 ) 又称麦角甾醇，是一种重要的医药化工原料，如用于“可 的松”、“激素黄体酮 的生产。麦角固醇是维生素d 2 的前体，经紫外线照射得 到维生素d 2 ，维生素d 2 可防治婴幼儿佝偻病，促进孕妇和老年人对钙、磷的吸 收，对矿工和长期从事夜间工作的人员有重要的保健作用。 目前，国内外生产麦角固醇的方法有两种：一种是采用微生物发酵法来生产 麦角固醇，所用的菌种有酵母茵、曲霉和青霉；另一种是从青霉菌丝体中提取麦 角固醇。陈松生等【4 3 1 发现红曲霉属中的许多菌株都能不同程度地产生麦角固醇。 麦角固醇的含量与色素的形成量不成正比，且有的菌株产量高达2 以上，接近 目前工业用酵母生产的水平。 1 3 6 其它生理活性物质 远藤章通过对m o n a c o l i nk 的酯构型弱碱化，形成了它的碱金属盐、土族金 属盐等，发现它们分别具有预防和治疗胆结石、前列腺肥大和肿瘤的作用，能够 使胆石形成指数下降，改善前列腺肥大程度，使排尿正常，还能使肿瘤增殖率降 低，延长寿命。 红曲霉可产生具增强肝脏功能和防癌功能的强力天然抗氧化剂如黄酮酚 ( f l a v o n o i d s ) ，是最具潜力的防癌和抗癌药物。林赞峰认为】。红曲橙色素具有 浙江工业大学硕士学位论文第一章绪论 活泼的羰基，很容易与胺基起作用，因此不但能治疗胺血症( a m m o n i e m i a ) ，也 可能是一种优良的防癌物质。 红曲霉所产生的单胺氧化酶阻遏物可用于对抑郁症、帕金森氏综合症及其它 相关的精神病的治疗【4 5 l 。 玉田英吲蜘发现红曲能促进人体对铁的吸收，对防治贫血有一定的作用。 黄谚谚等 4 7 1 发现红曲霉的菌丝体及发酵液可抑n 4 , 鼠过度肥胖，并能提高 小鼠游泳的耐受能力，缺氧耐受力。 日本在培养淡色红曲霉、丛毛红曲霉、红色红曲霉等时，将发酵液用酶水解 后，可以提出一种具有细胞活化作用的物质，它具有防止皮肤粗糙，延缓衰老之 功效。目前已在化妆品中使用这种物质，在每1 0 0 克化