（材料学专业论文）磷酸钙骨水泥明胶壳聚糖多孔复合支架的研究.pdf

中文摘要 以明胶壳聚糖( g e l c s ) 多孔嘲络结构增强磷酸钙骨水泥( c p c ) 多孔支 架，仿生构建多级孔结构形成具有“支架中的支架”型结构的三维复合材料 c p c o e l c s 多孔复合支架是制备骨组织工程材料的一种有益探索。 首先考察了磷酸钙( t c p ) 体系c p c 的固化机理与烧结特性。结果表 明该c p c 在1 0 0 湿度、3 t c 环境中固化3 天即水化完全，x 射线衍射谱图( ) 和扫描电镜( s e m ) 分析证实，水化产物为结晶不完善的缺钙羟基磷灰石 ( c d h a ) 。选定不同温度对其烧结特性进行考察，x r d 、差示扫描量热( d s c ) 分析表明低温煅烧相( 7 0 0 以下) 主要由c d h a 和b 。焦磷酸钙( 1 j - c a 2 p 2 0 7 ) 组成；而高温烧结相( 7 0 0 以上) 由日磷酸三钙( p - t c p ) 或p t c p h a 组成。 5 0 0 。c 煅烧和1 0 5 0 烧结相具有较好的抗压缩性能和较稳定的相态。c s 致孔剂 的填充对c p c 水化进程的影响较小，对其烧结性能基本也不产生影响在5 0 0 以下即可被烧除，是一类优良的致孔剂。 以c s 微球( 3 0 0 4 5 0 , t t m ) 作为致孔剂，采用烧结成孔法制备了大孔c p c 支架。对比研究了低温煅烧( 5 0 0 ) 和高温烧结( 1 0 5 0 c ) 大孔支架的性能。 s e m 观察表明，c s 微球重量分数在3 0 以上时，形成的孔开始部分相连或只有 一薄壁相隔，高温烧结支架孔的连通性更好支架的孔隙率均在8 0 以上。采用 c s 小微球( 7 6 1 0 8 i j t m ) 和c s 短纤维( 直径4 5 0 p r o 左右、长度5 8 m m ) 以 提高c p c 支架的孔连通性，结果证实短纤维的效果较为优良。压缩性能测试结 果显示短纤维和c s 大微球的配比适宜时，支架的力学强度有明显改善。 采用减压法将不同浓度g e l - c s 溶液灌入c p c 多孔支架中，通过冷冻干燥相 分离技术制各出c p c c r e l c s 复合多孔支架，构建具备多级孔结构的三维支架， 同时实现对脆性c p c 多孔材料的增强。通过改变预冻温度调控g e l c s 增强海绵 体的孔结构。s e m 观察、力学性能和孔隙率测试结果表明，复合支架内形成了 多级孔( 1 1 0 1 t m 、8 0 - 15 0 岫和3 0 0 - - - 5 0 0 1 t i n ) 相互嵌套的微结构，经复合多孔支 架的压缩强度和压缩模量均提高了6 1 0 倍，而孔隙率有所下降，但均保持在 6 5 以上。在模拟体液( s b f ) 中浸泡5 天后c p c g e l c s 支架的g e l c s 膜表面 沉积了大量磷酸钙盐颗粒。 关键词：磷酸钙骨水泥大孔结构，明胶壳聚糖网络，增强，复合支架 a b s t r a c t i nt h i sw o r k ，h o v e lt h r e e - d i m e n s i o n a lm a c r o p o r o u sc a l c i u mp h o s p h a t ec e m e n t ( c p c ) s c a f f o l d se m h e d d e dw i t hp o r o u sg e l a t i n - c h i t o s a n ( g e l c s ) n e t w o r ks p o n g e s w e r es y n t h e s i z et o p r o d u c ec o m p o s i t es c a f f o l d sw i t l lr e l a t i v e l yh i g hm e c h a n i c a l s t r e n g t hf o rb o n et i s s u ee n g i n e e r i n g f o r m e dc o m p o s i t es c a f f o l d sh a dm u l t i l e v e l p o r o u sa r c h i t e c t u r ea n dp a n i c u l a r “s c a f f o l di ns c a f f o l d ”s t r u c t u r e t h es e t t i n gm e c h a n i s ma n dc a l c i n a t i o n s s i n t e r i n gc h a r a c t e r i s t i c so f - t r i c a l c i u m p h o s p h a t e ( - t c p ) c p cw e r ei n v e s t i g a t e d 1 1 ”c p c sc o m p l e t e l yh a r d e n e da f t e r3 d a y s a t10 0 h u m i d i t ya n d3 7 x r da n ds e ma n a l y s i sr e v e a l e dt h a tt h e e n d - p r o d u c t o fc p cw a sc a l c i u md e f i c i e n th y d r o x y a p a f i t e ( c d h a ) w i t hl o w c r y s t a l l i n i t y b yh e a t i n ga td i f f e r e n tt e m p e r a t u r ei na i r , t h eh a r d e n e dc p c sw e r e r e m a i n e d o r i g 西a lc d h ap h a s e ( b e l o w7 0 0 ) o rc o n v e n e d i n t o 9 - t r i c a l c i u m p h o s p h a t e ( p t c p ) o r9 - t c p ，h a ( a b o v e7 0 0 ) t h ec e r a m i c sc a l c i n a t e da t5 0 0 a n ds i n t e r e da t1 0 5 0 ch a d r e l a t i v e l ys t a b l ep h a s e sa n dh i g hc o m p r e s s i v es 订e n g t ha s ag o o dp o r o g e n ，c h i t o s a nm i c r o s p h e r e sh a dl e s si n f l u e n c eo ns e t t i n ga n dh e a t i n g p r o c e s s e s w h i c hb u m e do u te a s i l yb e l o w5 0 0 t h em a c r o p o r o u sc p cs c a f f o l d sw e r ef a b r i c a t e dt h r o u 吐b u m o u tc sm i c r o s p h e r e ( 3 0 0 4 5 0 m ) t h ec h a r a c t e r i s t i e so f5 0 0 c a l c i n a t e ds e a f r o l da n d1 0 5 0 s i n t e r e d s c a f f o l dw e r e i n v e s t i g a t e dc o m p a r a t i v e l y s e mo b s e r v a t i o na n d p o r o s i t y m e a s u r e m e n tr e v e a l e dt h a to n l yp a r t i a lm a o r o p o r e so fs c a f f o l d sw e r ei n t e r c o n n e c t e d 谢t ha b o v e3 0 o fm a s sf r a c t i o no fc sm i c r o s p h e r e s t og a i nb e t t e ri n t e r c o n n e c t e d s t r u c t u r e ，s m a l l e rc sm i c r o s p h e r e ( 7 6 1 0 8 p m ) o rc sf i b e r ( d i a m e t e r4 5 0 肛r n ，l e n g t h 5 - 8 m m ) w e r ei n c o r p o r a t e dt oc p c s ，t o o a sar e s u l t ，c sf i b e rh a db e t t e rc o n t r i b u t i o n t o i n t e r c o n n e c t i v i t yo ft h em a c r o p o r o u ss c a f f o l dc o m p a r e dt o t h es m a l l e rc s m i c r o s p h e r e s w i 也t h ep r o p e rr a t i oo fc s m i c r o s p h e r e sa n dc s f i b e r s t h e m a c r o p o r o u sc p c ss c a f f o l d se x h i b i t e dr e l a t i v e l yh i 曲m e c h a n i c a ls t r e n g t h t h em a c r o 口o r o u sc p cs c a f f o l d sa so b t a i n e dw e r ei m m e r s e di nt h ed i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o no fg e l - c ss o l u t i o nt r a d e rv a c u u ma n dt h ec p c g e l - c sc o m p o s i t e m a c r o p o r o u ss c a f f o l d sw e r ef o r m e db yf r e e z e - d r y i n gp r o c e s sw i t hs o l i d - l i q u i dp h a s e s e p a r a t i o n s e mr e s u l t ss h o w e dt h a tt h es c a f f o l dh a dm u l t i l e v e lp o r o u ss t r u c t u r e ( 1 l o “r a ，8 0 1 5 0 p ma n d3 0 0 5 0 0 r t m ) t h ec o m p r e s s i v es t r e n g t ha n dy i e l dm o d u l u s o ft h ec o m p o s i t es c a f f o l d sw e r e6 41 0t i m e st h a to fc p cs c a f f o l d s a p a t i t el i k e c a l c i u md h o s p h a t ep a r t i c l e sw e r ef o r m e do nt h ew a l lo fg e l - c si n s i d ec o m p o s i t e s c a f f o l d sa f t e ri m m e r s e di ns i m u l a t e db o a yf l u i d ( s b f ) f o r5d a y s k e yw o r d s ：c a l c i u mp h o s p h a t ec e m e n t ，m a e r o p o r o u ss t r u c t u r e ，g e l a t i n - c h i t o s a n n e t w o r k ，r e i n f o r c e m e n t ，c o m p o s i t es c a f f o l d s 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的 研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得墨盗盘鲎或其他教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中 作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名：炅缸签字日期：w 年，月一广日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解苤盗盘堂有关保留、使用学位论文的规定。 特授权盘盗盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 学位论文作者签名：天，莘事 导师签名 牟强跫 签字日期：埘年月7 广日签字日期：b 年【月i 日 1 1 引言 第一章绪论 目前组织和器官的衰竭、损伤是最主要的临床医学问题。骨骼是人体重要的 组织，也是一个重要的器官，作为人体的支架，担负着支持、保持、承重、造血、 贮钙、代谢等功能，它的损伤给病人带来了极大的困扰。骨虽然具有再生和自修 复能力，但对于由肿瘤、外伤、骨疾及骨异常生长所造成的骨缺损，在单纯依靠 骨的自修复无法愈合的情况下，则需采用外科手术治疗。但是，目前对于骨组织 的缺损修复不是很理想，特别是对于长干骨的缺损修复至今还没有实现。对于骨 组织的缺损修复通常采用骨移植的方法。移植方式主要有自体移植和异体移植， 自体组织移植是以牺牲健康组织为代价的“以伤治伤”方法，虽然临床效果令人 满意，但供区极为有限，且取骨区有一定的并发症f l , 2 l ，又因骨吸收的不可预测 性，有新骨组织再生尚不完全而移植物己被全部吸收的可能性1 3 _ i 。此外，自体 移植需进行两次手术，且成本高。而异体骨移植虽不需两次手术，且具有与自体 骨类似的优点，但移植骨再经消毒处理后会失去强度，部分或完全损失骨诱导因 子，并具有感染h l v 和肝炎等病毒的可能，而且制样、处理存贮的成本高，所以 其应用受到很大限制。 为了克服这些局限，人们开始研究可用作骨替代物的人工材料，要求他们具 有稳定的力学性质和骨传导、骨诱导作用。在生物骨组织移植、修复方面除传统 的金属、高分子替代材料外，研究接近或类似于自然骨成份的无机生物医学材料 极其活跃。目前，采用具有磷钙成份结构的材料，如生物活性玻璃、玻璃陶瓷、 磷灰石陶瓷等生物材料的研究进展较快，这些材料与人体骨的结构和成份类似， 新骨性好，新生骨细胞活跃，骨生长明显材料与骨组织阊很快形成稳定的骨结 合界面。其中特别值得重视的是，与骨组织生物相容性较好的羟基磷灰石( h a ) 生物活性材料的研究非常引人注目。 近年来发展起来的新型的磷酸钙骨水泥( c p c ) 材料，因为其可自固化、任 意塑形、具有良好的生物相容性和较好的降解性更是成为科研人员研究的热点 5 - q oc p c 可预先调制成膏状体，能够按洞型缺损的要求准确塑形，固化后也可 以做缺损外形的修整，同时也可以结合多孔支架的制备技术，制备各种结构与形 状的支架材料克服了h a 成型难、塑模难的缺点，运用前景十分广阔。 随着细胞生物学和生物材料学的发展，骨组织工程学的出现和发展亦为治疗 骨缺损、制各具有更好力学性能的新型骨修复材料提供了一种新的思路和方法。 自从8 0 年代后期v a e a n t i 等【”1 利用组织工程学修复骨组织缺损以来，骨组织的缺 损修复得到了长足的发展。 1 2 骨组织工程材料 1 2 1 骨组织工程的基本原理和方法 2 0 世纪8 0 年代美国学者l a n g e r 和v a c a n t i 提出了组织工程( t i s s u e e n g i n e e r i n g ) 的再生医学新概念，现在已形成组织工程学这门新学科。组织工程 是指应用生命科学与工程的原理及方法构建一个生物装置来维护、增进人体细胞 和组织的生长，以恢复、维持或提高受损组织或器官的功能【1 “。它是一个新兴的 交叉学科，融合了生物化学、细胞生物学、分子生物学、移植免疫学、临床医学、 材料科学、生物化工及生物力学等学科知识。它起源于生物材料学，是在材料同 生物活性物质相结合，通过与机体相互作用而促进组织修复的基础上产生的。随 着组织工程学的不断发展，组织工程的含义逐渐发展为联合使用细胞、支架材料 和生物活性因子，以促进组织的修复和再生方面的研究。 而骨组织工程学作为组织工程研究领域中专门从事研究组织工程化新生骨 组织的一个研究分支，是其原理和方法在骨组织方面的具体应用，用以再生新的 骨组织，修复和替代病变或缺损骨组织，或增进其功能的技术，被认为是最具有 前途和可行性的一个分支。 单纯骨髓或骨髓基质细胞植人体内成骨能力较低，主要原因是由于缺乏细胞 载体骨髓易流失，不能在植入部位形成有效的细胞浓度。细胞本身的功能的表 达不仅取决于细胞内在的基因序列，还在很大程度上受到外界环境因素的影响， 包括细胞与细胞外基质( e c m ) 的相互作用。e c m 不仅为细胞生长提供支持和 保护，更重要的是细胞与e c m 的相互作用调节细胞的形态发生过程，影响细胞 生存、迁移、增殖和功能代谢。 组织工程学基本方法是将体外培养的高浓度组织细胞，扩增后吸附于一种生 物相容性良好、并可被人体逐步降解吸收的e c m 上。该材料可为细胞提供生存 以做缺损外形的修整，同时也可以结合多孔支架的制备技术，制备各种结构与形 状的支架材料，克服了h a 成型难、塑模难的缺点，运用前景十分广阔a 随着细胞生物学和生物材料学的发展，骨组织工程学的出现和发展亦为治疗 骨缺损、制备具有更好力学性能的新型骨修复材料提供了一种新的思路和方法。 自从8 0 年代后期v a c a 埘等【”】利用组织工程学修复骨组织缺损以来，骨组织的缺 损修复得到了长足的发展。 1 2 骨组织工程材料 1 21 骨组织工程的基本原理和方法 2 0 世纪8 0 年代美国学者la _ n g c r 和v a c a n t l 提出了组织工程( t i s s u e e n g i n e e r i n g ) 的再生医学新概念，现在已形成组织工程学这门新学科。组织工程 是指应用生命科学与工程的原理及方法构建一个生物装置来维护、增进人体细胞 和组织的生长，以恢复、维持或提高受损组织或器官的功能j 。它是一个新兴的 交叉学科，融合了生物化学、细胞生物学、分子生物学、移植免疫学、临床医学、 材料科学、生物化工及生物力学等学科知识。它起源于生物材料学，是在材料同 生物活性物质相结合，通过与机体相互作用而促进组织修复的基础上产生的。随 着组织工程学的不断发展，组织工程的含义逐渐发展为联合使用细胞、支架材料 和生物活性因子，以促进组织的修复和再生方面的研究。 而骨组织工程学作为组织工程研究领域中专门从事研究组织工程化新生骨 组织的一个研究分支，是其原理和方法在骨组织方面的具体应用，用以再生新的 骨组织，修复和替代病变或缺损骨组织，或增进其功能的技术，被认为是最具有 前途和可行性的一个分支。 单纯骨髓或骨髓基质细胞植人体内成骨能力较低，主要原因是由于缺乏细胞 载体，骨髓易流失，不能在植入部位形成有效的细胞浓度。细胞本身的功能的表 达不仅取决于细胞内在的基因序列，还在很大程度上受到外界环境因素的影响 包括细胞与细胞外基质( e c m ) 的相互作用。e c m 不仅为细胞生长提供支持和 保护，更重要的是细胞与e c m 的相互作用调节细胞的形态发生过程，影响细胞 生存、迁移、增殖和功能代谢。 组织工程学基本方法是将体外培养的高浓度组织细胞，扩增后吸附于一种生 物相容性良好、并可被人体逐步降解吸收的e c m 上。该材料可为细胞提供生存 物相容性良好、并可被人体逐步降解吸收的e c m 上。该材料可为细胞提供生存 以做缺损外形的修整，同时也可以结合多孔支架的制备技术，制备各种结构与形 状的支架材料克服了h a 成型难、塑模难的缺点，运用前景十分广阔。 随着细胞生物学和生物材料学的发展，骨组织工程学的出现和发展亦为治疗 骨缺损、制各具有更好力学性能的新型骨修复材料提供了一种新的思路和方法。 自从8 0 年代后期v a e a n t i 等【”1 利用组织工程学修复骨组织缺损以来，骨组织的缺 损修复得到了长足的发展。 1 2 骨组织工程材料 1 2 1 骨组织工程的基本原理和方法 2 0 世纪8 0 年代美国学者l a n g e r 和v a c a n t i 提出了组织工程( t i s s u e e n g i n e e r i n g ) 的再生医学新概念，现在已形成组织工程学这门新学科。组织工程 是指应用生命科学与工程的原理及方法构建一个生物装置来维护、增进人体细胞 和组织的生长，以恢复、维持或提高受损组织或器官的功能【1 “。它是一个新兴的 交叉学科，融合了生物化学、细胞生物学、分子生物学、移植免疫学、临床医学、 材料科学、生物化工及生物力学等学科知识。它起源于生物材料学，是在材料同 生物活性物质相结合，通过与机体相互作用而促进组织修复的基础上产生的。随 着组织工程学的不断发展，组织工程的含义逐渐发展为联合使用细胞、支架材料 和生物活性因子，以促进组织的修复和再生方面的研究。 而骨组织工程学作为组织工程研究领域中专门从事研究组织工程化新生骨 组织的一个研究分支，是其原理和方法在骨组织方面的具体应用，用以再生新的 骨组织，修复和替代病变或缺损骨组织，或增进其功能的技术，被认为是最具有 前途和可行性的一个分支。 单纯骨髓或骨髓基质细胞植人体内成骨能力较低，主要原因是由于缺乏细胞 载体骨髓易流失，不能在植入部位形成有效的细胞浓度。细胞本身的功能的表 达不仅取决于细胞内在的基因序列，还在很大程度上受到外界环境因素的影响， 包括细胞与细胞外基质( e c m ) 的相互作用。e c m 不仅为细胞生长提供支持和 保护，更重要的是细胞与e c m 的相互作用调节细胞的形态发生过程，影响细胞 生存、迁移、增殖和功能代谢。 组织工程学基本方法是将体外培养的高浓度组织细胞，扩增后吸附于一种生 物相容性良好、并可被人体逐步降解吸收的e c m 上。该材料可为细胞提供生存 的三维空间，使细胞按预制形态的三维支架生长。然后将这种细胞生物材料复合 体植入机体病损部位，在生物支架逐步降解吸收过程中，种植的细胞继续增生繁 殖，形成了新的具有其原来特殊功能和形态的相应组织和器官，达到修复创伤和 重建功能的目的。组织工程学修复骨损伤较现行诸多方法有着明显的优点i l o ”j ： 不受供体来源的限制；可避免免疫排斥反应；已初步证实合成组织具有功 能，能替代被修复组织；材料可根据不同需要而改变。 采用组织工程的方法构建新的骨组织，或恢复病变骨组织的功能，通常有三 条以下途径： ( 1 ) 在生物材料支架上种植细胞，在体内或体外培养活体组织，随后将它 们植入缺损或者病变部位，以修复缺损或病变骨组织。 图卜1 生物陶瓷支架培养骨示意图 ( 2 ) 将骨生长生物化学信号分子( 生长因子) 与控制释放载体材料复合， 植入体内后，诱导间充质细胞或骨细胞分化，进而再生新骨。 ( 3 ) 将骨组织细胞及其它生物活性物质植入或者移植至病变或骨缺损部位， 以恢复病变组织功能，或再生新骨。 工程化骨就是利用培养细胞使骨组织再生。此行既可采用从组织片分离的分 化细胞，亦可采用多功能的干细胞，如骨髓基质干细胞( m s c s ) ，诱导其分化。 常采用多孔陶瓷( 孔径2 0 0 - 4 0 0 t m ) 作为支架，在体外培养细胞，使其扩增，形 星二至 堑 丝 成骨组织，再植入体内( 见图卜1 ) 。 骨组织工程的发展与两个因素有关：首先，需优化和发展作为骨组织再生依 托的支架材料和模板，使其能粘附和容纳骨原细胞、成骨细胞等骨组织细胞及微 血管，调控成骨细胞的功能，释放骨生长因子，提供活体细胞生存必须的营养通 道，最终在体内形成组织工程化的有生命的再生骨。第二，体外培养干细胞，骨 组织细胞，分离或合成骨生长生物化学信号分子( 如骨生长因子) ，并确保细胞 及生长因子在体内存活或保持活性。 1 2 2 骨组织工程对支架材料的要求 在骨组织工程领域的研究主要在以下几个方面：选择细胞来源，在一定 细胞因子的调控下增殖，体外培养表达成骨细胞的显型。选择具有三维空间结 构的细胞外基质，即细胞载体i l 。其三个关键因素是：靶细胞、信号分子( 骨生 长因子、骨诱导因子) 和支架材料。 在组织工程中，支架材料占据着非常重要的地位。它不仅起支撑作用，保持 原有组织的形状，而且还起到模板作用，为细胞提供赖以寄宿、生长、分化和增 殖的场所，从而引导受损组织的再生和控制再生组织的结构。支架的具体作用如 下：( 1 ) 支架植人体内后可以把细胞传送到人体所需的部位，为工程化的组织 提供了一个赖以存在的空间，可引导组织的再生和成长。( 2 ) 太多数哺乳动物的 细胞都是固着型细胞，如果不给它们提供一个附着的基质，它们就难以存活，支 架具有高负载性和高效性，可以作为模板，使细胞到达并固着于特定部位。( 3 ) 支架还起到机械支撑作用，可抵抗外来的压力，并维持组织原有的形状和组织的 完整性。( 4 ) 支架可以作为宿主免疫系统分子或细胞的物理屏障，从而避免了人 体的免疫反应。( 5 ) 理想的支架能诱导特定的细胞功能，引导和调节细胞间的相 互作用。( 6 ) 支架的结构和形貌能控制再生组织的结构、尺寸和形貌，还能促使 再生组织中血管的形成。( 7 ) 支架还可作为活性因子的载体，有些改性的高分子 支架载有一些生物活性物质如生长因子，为细胞的生长、分化和增殖提供了养 分。 可见，支架在骨组织工程中扮演着极为重要的角色。支架不仅对细胞、组织 起物理连接和支持作用，而且还调节细胞的各种功能活动。了解不同功能的骨相 关细胞在支架表面的培养增殖情况，可以在分子水平明确支架对细胞行为的影 响，而细胞在支架表面的生物学行为又为支架的设计制作提供依据。 材料科学在骨组织工程学研究中举足轻重，能否设计出理想的骨组织工程支 架材料，对于骨组织缺损修复的成功与否具有重要影响。骨组织工程支架材料是 与生命体相容的，能够参与生命体代谢，在一定时间内逐渐降解的特种材料，采 用这种材料可制成细胞载体框架结构。这种结构能够创造一种微环境，有利于细 胞的粘附、生长、增殖和功能发挥。它是一种极其复杂的非均质多孔结构，是一 种充满生机的利于蛋白质和种子细胞活动、繁衍的环境。传统的骨植入材料在生 物体中始终是一种异物，而骨组织工程材料在新的骨组织生长完毕后，会随机体 的代谢而降解、消失，成为机体的活的一部分。 b u r g 等认为支架材料的骨传导性、生物相容性与生物降解性、孔隙大小与孔 隙率、表面拓扑结构等因素对细胞的黏附与生长产生重要影响，并最终决定对骨 缺损部位的修复效果，据此提出十二条骨组织工程支架材料应具备的条件( 见表 1 1 ) 。 表l - 1 骨组织工程支架材料应具备的条件 1 临床上容易手术操作 2 支架材料的吸收速率与骨生长速率相互匹配 3 可用于形状不规则的骨缺损部位 4 具有骨传导性或骨诱导性 5 保证精确的力学性能 6 促进骨质沉积 7 促进骨生长 8 可防止软组织向移植物骨组织界面生长 9 平均孔径在2 0 0 4 0 0 p a n 之间 1 0 对周围组织无不良影响 l 】 消毒过程不影响支架材料的性能 1 2 降解产物无毒性 组织工程的发展对相关生物材料提出了新的挑战，理想的骨组织工程支架材 料应该是“”j ：具有良好的生物相容性：包括组织相容性和细胞相容性。除满 足生物材料的一般要求，如无毒、不致畸形等外：还应利于种子细胞黏附、增殖， 其降解产物对细胞无毒害作用，不引起炎症反应，甚至利于细胞生长和分化。 具有良好的生物降解性：材料在完成支架作用后应能降解，降解速率应与组织细 胞生长率相适应，降解时间应能根据组织的生长特性可人为调控。具有三维多 孔结构：材料需具有合适的孔径、高的孔隙率( 最好达9 0 以上) 、较高的比表 面积；多孔结构可提供宽大的表面积和空间，有利于细胞黏附生长，细胞外基质 第一章绪 论 沉积，营养和氧气进入，代谢产物排出，也有利于血管和神经长入。具有良好 的可塑性：材料可预先制作成一定形状。具有一定的机械强度：为新生组织提 供支撑，并保持一定时间直至新生组织具有自身生物力学特性。具有良好的材 料一细胞界面：材料应能提供良好的细胞界面，利于细胞黏附、增殖，更重要的 是能激活细胞特异基因表达，维持细胞正常表型表达。但迄今为止尚缺一种理想 的支架材料，成为限制骨组织工程l 临床应用的瓶颈之一。 1 2 3 组织工程对生物材料的挑战 工程化组织常将种子细胞种植在具有生物活性的可降解生物材料构筑的三 维支架内，期望三维支架能提供细胞所需的力学和化学信号，指导细胞的粘连、 增殖与分化，并最终组装成三维组织。细胞组装形成组织的过程涵盖了许多内容， 要求它们的组合犹如“交响乐”般和谐。它所经历的时间从数秒到数十周，空间 尺度跨越纳米、微米到厘米。因此要将组织工程的科技成果转化为能治疗数百万 患者疾病的产品，正面临许多技术挑战。首先大规模生产工程化组织需要适宜、 健康并能扩增的种子细胞，这是生物学挑战。而工程学上的挑战包括性能优异的 三维支架材料的制备、仿生并能规模化培养细胞的生物反应器、细胞支架结构 物的冻存、建立防止组织排异的方法等【”】。 生物材料植入体内后，其表面诱发的一系列宿主反应，包括蛋白质的优先吸 附、补体激活、细胞的征集或粘连等，而这些过程是更广意义上的炎症和纤维化 反应的一部分。从材料表面所发生的蛋白质吸附、免疫反应、细胞因子和生长因 子的释放、目标细胞的反应着手，诱发期望的愈合途径，使组织重建，是第三代 生物材料所要达到的目标【1 w 。 1 9 9 8 年1 1 月在美国召开的“当代生物材料相关会议”上，与会各国科学家 达到共识：以往生物材料的研究与开发大多从材料的化学、物理与力学性能、加 工性能构思，并没有从植入生物材料的细胞水平和分子水平设计，而这一点必须 加于重视j 。 相关细胞在很多生物材料中能很好地生长，但组织在体内重建时 还涉及神经、骨和血管的引导再生。修复和重建损伤组织时，细胞将受到宿主损 伤部位及其周围健康组织产生的信号分子的调控。因此，用于组织工程的理想生 物材料应和目标细胞表达的特异粘连因子和生长因子受体产生特异相互作用，支 架材料要使目标细胞迁移至损伤部位，刺激它们生长和分化，且随着组织的修复 被细胞释放的相关酶完全降解【1 8 】。人们期望第三代生物材料植入体内后能促进组 织的自愈合，而这有待从分子水平设计和制各出刺激特异细胞反应的、具有生物 活性的可吸收生物材料。 12 4 常用骨组织工程支架材料 在组织工程学中，种子细胞依赖于细胞外基质的存在才能发挥功能。因此， e c m 替代物( 即种子细胞的支架材料) 的选择十分重要。骨组织工程支架材料 不仅影响种子细胞的生物学特性和培养效率，而且决定移植后能否与受体很好地 适应并结合在一起，从而发挥其修复骨缺损的作用。因而在目前骨组织工程的研 究中，寻找理想的支架材料是一大热点。 组织工程支架材料是指能与组织活体细胞结合并能植入生物体的材料，它是 构建组织工程的最基本构架。支架材料在体内组织再生过程中发挥极其重要的作 用，对于骨组织工程支架材料来说，应该具有一定强度、耐力学约束和疲劳，可 以应力成型，可进行细胞特异表面修饰，生物和组织相容性良好，与骨和肌肉整 合性好，易加工，可根据使用要求注射或原位模塑。 支架材料以结构可分为封闭式和开放式；以形态可分为纤维状、海绵状、凝 胶状等；以来源可分为天然生物材料和人工合成的生物材料两大类。目前的研究 主要有以下几个方面：合成高分子材料、天然生物材料、无机非金属材料：各种 材料都有其优缺点，但这些枋料在骨组织工程的应用中却起着不可替代的作用。 1 241 合成高分子材料 用做组织工程支架的合成高分子材料按性质可分为非生物降解型和可生物 降解型。 1 ) 非生物降鳃烈高分子材料 非生物降解型高分子材料包括聚乙烯、聚丙烯、聚丙烯酸酯、聚硅氧烷、聚 氨酯及聚四氟乙烯等，要求在生物环境中能长期保持稳定，不发生分解、交联或 物理磨损等，并且有赵好的机械性能。材料本身对机体不产生明显的毒副作用， 同时材料不致发生灾难性的破坏，主要用于制作组织工程化软、硬组织，人工器 官，人造血管等的支架材料。这类材料的主要缺点就是不能自行降解。 2 ) 生物降解型高分子材料 生物降解型高分子材料也称生物可吸收型高分子材料，在体温下可以在一定 的时间内分解为小分子化合物，由体内代谢排出体外。这类高分子材料的特点是 在体内不断降解，因此常被用做暂时支架材料。 目前用于支架材料的可降解合成高分子材料主要是已被美国食品与药物管 理局( f o o da n dd r u ga d m i n i s t r a t i o n ，f d a ) 批准使用的聚d 羟基酸，常见的是聚 第一章绪论 乳酸( p l a ) 、聚乙醇酸( p g a ) 及其共聚物( p l g a ) 等。这些材料的突出优点是生物 降解支架材料与细胞复合植入人体内后，提供了可控植入细胞的环境，在理论上 可以调节降解时间和降解速率，使基质材料在完成支持结构功能后能完全降解吸 收由自身的骨组织完全修复骨缺损。但存在细胞亲和性差，缺乏细胞识别信号 等缺点 17 , 2 1 】，需要对其进行进一步的加工处理，提高亲水性以及细胞黏附性；对 材料降解时间和降解速率的控制尚有待进一步的研究，其中存在着孔隙率、孔径 与材料本身机械强度和可塑性之间的矛盾。此外，材料的降解产物可能对组织细 胞产生的影响，引起无菌性炎症反应等。 1 2 4 2 天然生物材料 天然生物材料包括天然高分子材料及其衍生材料，如脱钙骨基质( d b m ) 、 胶原、明胶( g e l ) 、甲壳素、壳聚糖( c s ) 、透明质酸、藻酸盐和聚氨基酸等。材 料生物相容性好，具有细胞识别信号( 如某些氨基酸序列等) ，利于细胞黏附、 增殖和分化，可被人体分解吸收，分解产物无副作用，但也存在许多缺点 1 7 , 2 1 l ， 如大规模生产的限制、不同批号制成品的差异、材料本身因素控制的困难f 如机 械强度、降解速率等1 。 124 3 无机非金属材料 生物陶瓷是指用于人体器官替补、修补及外科矫形手术的陶瓷材料。这类材 料主要有羟基磷灰石、磷酸钙骨水泥、氧化铝、生物活性玻璃等，能与人体骨生 长在一起，形成化学结合。 ( 1 ) 磷酸钙类陶瓷 磷酸钙类陶瓷是骨代用材料中相当重要的一类。其中研究最多的为h a 和磷 酸三钙( t c p ) 陶瓷。它们在组成、结构上与天然骨盐大体一致。有极好的生物相 容性、骨传导性和与骨结合的能力，加上无毒副作用，被广泛用作硬组织修复材 料和骨填充材料的生理支架。纯的h a 或t c p 陶瓷是一种生物惰性材料，般认 为在体内不降解或降解速度极慢。t c p 类可被缓慢降解，体内存留时间长达1 5 个 月之久。 h a 是哺乳动物体内硬组织的主要无机成份，分子式为c a l o ( p 0 4 ) 6 ( o h ) 2 。2 0 世纪7 0 年代初，日本的青木秀希和美国的j a r c h o 成功地人工合成羟基磷灰石以来， 以人工合成的h a 材料作为硬组织的修复体或置换材料成了近3 0 年来生物材科研 究领域的热门课题。人工合成的h a 具有优良的生物相容性，能与骨组织紧密接 触，具有良好的骨传导性，植入人体后能与骨形成化学键合的骨性结合。陶瓷类 h a 人工骨材料有块状和粒状两种形式，块状h a 陶瓷需要预先成型烧结，存在与 骨缺陷外形适应性的问题；而粒状h a 陶瓷很难限制在被修复的面积范围内维持 所需要的形状，并且只有当纤维组织长入之后结构才稳定。 1 9 7 7 年d eg r o o t 等人首次报道了8 磷酸三钙( c a 3 ( p 0 4 ) 2 ，1 3 - t c p ) 的烧结。 m o n m a 年 1 k a r a z a w a 曾经指出t c p 水合生成自固化h a 状化合物。t c p 是可吸收 性生物陶瓷，它的结构可分为高温型a 相即a t c p i 低温相( 低于1 1 8 0 c ) 的 p - t c p 。* 相和b 相的转变温度为1 1 2 0 1 1 8 0 。o 【一相是单斜晶，晶格常数 a = 1 2 8 9 n m 、b = 2 7 2 8 n m 、 3 = 1 2 6 6 。1 3 - 相是菱面体，晶格常数a = 1 0 3 2 n m 、c 一36 9 n m 。 影响t c p 类生物陶瓷降解性的主要因素有：( 1 ) 陶瓷材料的烧结成型温度：烧 结温度高时，形成的陶瓷结构紧密，降解性能差。温度较低时，t c p 类陶瓷处于 半晶态，降解性能较好。( 2 ) 材料的多孔性：孔隙度越大，降解速度越快。( 3 ) 陶 瓷颗粒的大小：t c p 颗粒越小，降解速度越快。 磷酸钙陶瓷的稳定性与温度、水的p h 等密切相关。体液条件下，当p h 4 2 时稳定相是h a 。而在较高温度下， 会存在p - t c p s d 磷酸四钙( c a 4 p 2 0 9 ) 相。未水合的高温磷酸钙相在3 76 c 下与水或体 液相互作用形成h a 。 c a p 比决定磷酸钙陶瓷的溶解度及其在体内的吸收性。使用磷酸钙陶瓷相关 生物材料时既要考虑稳定性，也要考虑吸收性，这两种特性要达到适宜平衡。将 较稳定的h a 和较易吸收的t c p 相结合就得到双相磷酸钙j ( b c p ) 。 此外，磷酸钙陶瓷还存在强度不够、操作性差、新骨可被再吸收等问题。 ( 2 1 磷酸钙骨水泥 1 9 8 6 年b r o w n 与c h o w l 2 2 1 开发的自体硬化的磷酸钙骨水泥( c p c ) ，被认为是骨 缺损重建材料的一个突破。这种水泥通过等摩尔的磷酸四钙( t t c p ) 和无水磷酸二 钙( d c p a ) 或二水合磷酸二钙( d c p d ) 与水混合，形成单一的固体相h a ，p h 呈中 性，具有很高的生物相容性及骨传导性。此外还有制备简便、塑型容易和缓慢降 解等优点，适合于非负重或低负重部位骨缺损的修复。c p c 的缺点是：它需要近 3 0 m i n 成型，且在体液中成型前，会由于外部作用力而脱落和移动。 c p c 的特殊功能在于，能在骨修复的初始阶段提供一个中间层，然后逐渐被 降解、吸收，代之以新生骨组织结构，适用于长入式假体或骨折的暂时固定，尤 其在不宜使用骨夹板或骨质疏松的情况下。因此，作为理想的骨水泥，除具备良 好的生物相容性、降解性、机械性及诱导性外，还要有可塑性。即能象普通水泥 一样原位成型、浇铸或注射，以适合骨骼内部空穴的填充和新生组织成型的需要。 c p c 系生长支架，还可通过其它形式的磷酸钙，如磷酸八钙、双水磷酸钙、 单水磷酸一钙，添加一些辅佐剂，如具骨传导活性的甲壳素( c n 或壳聚糖( c s 、 及其衍生物、增加机械强度的碳酸钙与碳酸钠、抗腐蚀性的海藻酸钠、粘合用的 纤维素及玻璃、金属、生长激素、蛋白质、聚乙烯醇、延胡索酸、透明质酸、柠 檬酸等，利用别的方法如热水热压法、双轴转动鼓膜及双螺旋挤压法、电子柬照 射法、粘合法等来合成。 己知磷酸钙骨水泥的材料性能( 凝结时间、机械强度、孔隙率和溶解度等) 受 许多因素的影响。其中包括：( 1 ) 粉末中使用d c p a 或d c p d ；( 2 ) 粉末颗粒大小： ( 3 ) 使用可溶性氮化物或不溶性氟化钙；( 4 ) h a 晶种( 颗粒大小、比表面积) ；( 5 ) k + 、 n a _ 等电解质或其它添加剂。 c p c 的强度与反应物组成、h a 晶种大小含量、固化时所施外力等密切相关。 材料孔隙率的降低可明显提高其机械强度。 目前使用的c p c ，体外凝结时间一般为1 5 3 0 m i n ，温度3 7 ，湿度9 0 一1 0 0 。在体内，因血浆中某些离子( 如m 9 2 + ) 及大多数有机物均有阻止或延迟h a 形 成的作用，凝结时间相对延长，且易产生脱粒现象。为了克服这些缺点，快速凝 固型c p c 及抗水冲型骨水泥相继问世。 此外，c p c 还可以做为松质骨螺钉周围填充物，以增强螺钉的固定作用；作 为牙根周围填料促进牙齿发育。 c p c 不仅与h a 陶瓷一样具有极高的生物相容性，而且具有可降解性、操作 方便、可塑性强等优点。因此，c p c 是一种很有前途的新一代的人工骨材料。但 这类材料脆性大，制各的多孔结构支架，韧性、弹性模量等机械性能多不高，目 前制备的骨组织工程支架材料大都只能用于非承力部位1 8 。”。 1 3 骨组织工程支架设计与制备技术 1 31 支架的设计与构造 由于支架的材料性能、微观结构及生物活性等都对材料在组织工程中的应用 有巨大的影响，因此对支架构设计也提出了极高的要求。支架的设计包括对材料 的选择、微观结构、支架的修饰以及制备方法的设计与优化等。 骨组织一般具有三维结构，因此对于硬组织的修复，支架应该在需要的部位 保持高的弹性模量，并给组织生长留下相应的物理空间，如果三维支架用作临时 的载荷承受装置，其机