（制糖工程专业论文）花生壳中木犀草素的分离提纯及其抑菌性能研究.pdf

花生壳中木犀草素的分离提纯及其抑菌性能研究摘要木犀草素( 1 u t e o l i n ) 是一种黄酮化合物，具有多种生物活性，在花生壳中有较高含量。本文以乙醇为提取剂从花生壳中提取木犀草素，优化提取工艺，采用多种方法进行分离纯化，并研究了木犀草素初步纯化物e p 1和精制物e p 2 的抗菌活性。主要研究结果如下：1 相同条件下三种提取方法木犀草素得率依次为：水浴浸提 微波提取 超声波提取，即o 8 7 6 ，0 8 0 1 ，0 4 3 0 ；水浴浸提所得干物中木犀草素含量为9 8 5 ，微波提取干物中含量为1 5 1 8 ；确定最优提取工艺为：微波功率9 0 0 w ，8 0 乙醇，提取时间7 0 s ，料液比1 ：2 0 ，提取率为8 2 6 6 。2 高效液相色谱法峰面积比法，分析了不同纯化物的纯度和可能存在杂质，乙酸乙酯萃取法使可检出水溶性成份得到富集，水沉法可明显降低乙醇液中水溶性成份含量，无水乙醇溶解干物质使木犀草素和另一种脂溶性成分得到富集，薄层展开系统可以实现样品的高度纯化。3 大孔树脂纯化法采用3 0 乙醇上样3 0 乙醇洗脱和7 0 乙醇上样7 0 乙醇洗脱所得产品纯度较高；无水乙醇上样法，样品处理量较大，目标物主要集中在7 0 乙醇洗脱部分；纯化工艺确定为无水乙醇上样，乙醇梯度沈脱，分段收集7 0 洗脱部分。4 初步纯化物( e p 一1 ) 对测试菌均有一定抑制或杀灭作用，具有广谱的抑菌性能，对细菌的杀灭效果尤为明显，对真菌的作用较差。在试验范t围内e p 1 的抑菌活性与浓度和时间成正相关，在相同的时间内，提取液的浓度越高，抑菌率越高；在相同浓度的提取液，作用时间越长，抑菌率也就越高。5 e p 一2 抗菌活性明显高于e p 1 ，并凸显出酚类物质的抗菌特点。其抑菌活性强于同浓度的山梨酸和亚硝酸钠，对枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌活性与山梨酸和亚硝酸钠均无协同或拮抗作用；对啤酒酵母抑制作用与亚硝酸钠有一定协同效果；培养温度、p h 对e p - 2 的抑菌效果有较大影响。6 通过生物显微镜对药液作用后的细菌形态进行了表征，结果显示：细菌的外膜及细胞壁结构和功能被破坏，出现大量菌体碎片，阻止营养物质向细胞内的运输，细胞质壁分离，导致其内容物外泄而起到抑菌作用。关键词：花生壳木犀草素分离纯化大孔树脂高效液相色谱薄层层析抑菌活性i ie x t r a c t i o n aa n dp u r i f i c a t i o no fl u t e o l i nf r o mp e a n u ts h e l la n di t sa n t i m i c r o b i a la c t i v i t ya b s t r a c tl u t e o l i ni saf l a v o n ec o m p o u n dw i t hm a n yb i o a c t i v i t i e sa n dh i g hp e r c e n ti nt h ep e a n u ts h e l l i nt h i sp a p e r , l u t e o l i nw a se x t r a c t e df r o mp e a n u ts h e l lw i t he t h a n o l ，t h ee x t r a c t i o np r o c e s sw a so p t i m i z e d ；t h e np r o d u c t sw e r es e p a r a t e da n dp u r i f i e dw i t hm a n ym e t h o d s ；a n dt h ea n t i m i c r o b i a la c t i v i t i e so fe p - 1a n de p - 2w e r es t u d i e d t h em a i nr e s u l t sw e r ea sf o l l o w s ：1 u n d e rt h es a m ec o n d i t i o n s ，t h eo r d e ro ft h el u t e o l i n sy i e l dw a sr e f l u xe x t r a c t i o n m a e u l t r a s o n i ce x t r a c t i o n ：t h ep u r i t yo fp r o d u c tf r o mt h er e f l u xe x t r a c t i o nw a s9 8 5 ，w h i l em a ew a s15 18 ，s ot h eo p t i m u mp r o c e s sw a sd e t e r m i n e d ：m i c r o w a v ep o w e r9 0 0 w , e t h a n o lc o n c e n t r a t i o n8 0 ，e x t a c t i o nt i m e7 0 s ，r a t i oo fs o l i dt ol i q u i d1 ：2 0 2 p e a ka r e am e t h o do fh p l cw a su s e dt od e t e r m i n et h ep u r i t ya n dc o m p o n e n t so fd i f f e r e n tp r o d u c t s t h er e s u l t ss h o w e dt h a ta c e t i ce s t e re x t r a c t i o ne n r i c h e dt h ew a t e rs o l u b l ec o m p o n e n t s ，a n dw a t e rd e p o s i t i o nc o u l dn o t a b l e l yr e d u c et h e i rp e r c e n t si nt h ep r o d u c t s ；a b s o l u t ee t h a n o ld i s s o l u t i o no ft h ed r yi i ie x t r a c te n r i c h e dl u t e o l i na n da n o t h e rf a t s o l u b l es u b s t a n c e ；p r o d u c t sw i t hh i 曲p u r i t yc o u l db eg o t t e nb yt l c 3 t h ep r o d u c t sg o t t e nf r o ml o a d e d e l u t e dw i t h30 e t h a n o lo nm a c r o p o r o u sr e s i na b - 8h a dt h eh i g h e rp u r i t ya n dt h es a m ew i t h7 0 e t h a n o l ；l o a d i n gs a m p l ew i t ha b s o l u t ee t h a n o ls h o w e dt h el a r g e s tp r o c e s s i n gc a p a c i t ya n dt h et a r g e tc o m p o u n dw a sm a i n l yi nt h ep a r te l u t e db y7 0 e t h a n o l ；t h eo p t i m u mp r o c e s so fp u r i f i c a t i o nu s i n gm a c r o p o r o u sr e s i na b - 8w a sl o a d i n gs a m p l ew i t ha b s o l u t ee t h a n o l ，t h e ne l u t e dw i t hg r a d sa n dt h ep a r te l u t e db y7 0 e t h a n o lw e r ef r a c t i o n a l l yc o l l e c t e d 4 e p 一1s h o w e di n h i b i t i n go rk i l l i n ge f f e c to nt h et e s ts t r a i n si nd i f f e r e n td e g r e e ，a n daw i d ea n t i m i c r o b i a ls p e c t r u m i nt h ee x p e r i m e n t ，t h ea n t i m i c r o b i a le f f e c tw a sb e t t e ro nt h eb a c t e r i a lt h a no nt h ee p i p h y t e t h e r ew a sap o s i t i v ec o r r e l a t i o nb e t w e e na n t i m i c r o b i a la c t i v i t yo fe p 一1a n dl u t e o l i nc o n c e n t r a t i o na n da c t i o nt i m e w i t ht h es a m ea c t i o nt i m e ，t h eh i g h e ro fl u t e o l i nc o n c e n t r a t i o n ，t h eh i g h e ri t sa n t i m i c r o b i a la c t i v i t yw a s ；w i t ht h es a m ec o n c e n t r a t i o no fl u t e o l i n ，t h el o n g e ro fa c t i o np e r i o d ，t h eh i g h e ro fi n h i b i t i n gr a t eo nt h et e s ts t r a i n s 5 w i t ht h es a m ec o n c e n t r a t i o n ，e p - 2s h o w e dh i g h e ra n t i m i c r o b i a la c t i v i t yt h a ne p 一1 ，s o r b i ca c i da n ds o d i u mn i t r i t e ，a n dh a dt h ea n t i m i c r o b i a lc h a r a c t e r i s t i c so fp h e n o l s s y n e r g i s me f f e c tw a sf o u n db e t w e e ne p 一2a n ds o d i u mn i t r i t eo ni n h i b i t i n gt h eg r o w t ho fs c e v e r c e ，b u tn o to ns t a p h y l o c o c c u sa u r e u s 2 6 0 0 3a n db a c i h u ss u b t i l i s 6 3501 t h e r ei sn os i g n i f i c a n ts y n e r g i s me f f e c tb e t w e e ne p - 2a n ds o r b i ca c i do nt h et e s t e ds t r a i n s c u l t u r et e m p e r a t u r ei va n dp hi n f l u e n c e dt h ea n t i m i c r o b i a la c t i v i t i e so fe p - 2o nt h et e s ts t r a i n s 6 t h es h a p eo fb a c t e r i a lt r e a t e db yd r u gw a sc h a r a c t e r i z e db ym i c r o s c o p e ，i ts h o w e dt h a tt h es t r u c t u r ea n df u n c t i o no fo u t e rm e m b r a n ea n dc e l lw a l l sw e r ed e s t r o y e d ，a n dm a n yc e l lf r a g m e n t sa p p e a r e d ，t r a n s p o r t a t i o no fn u t r i t i o ni n t ot h ec e l lw a sp r e v e n t e d ，t h e nc e l lp l a s m o l y s i sa p p e a r e d ，c a u s i n gc e l l u l a rc o n t e n tl e a k a g et h a tl e dt ot h ea n t i m i c r o b i a le f f e c t k e yw o r d s ：p e a n u ts h e l l ；l u t e o l i n ；p u r i f i c a t i o n ；m a c r o p o r o u sr e s i n ；h p l c ；t l c ：a n t i m i c r o b i a la c t i v i t yvc f um i cm b cr s dr f符号说明菌落形成单位最小抑菌浓度最小杀菌浓度相对标准偏差相对比移值广西大学学位论文原创性声明和使用授权说明原创性声明本人声明：所呈交的学位论文是在导师指导下完成的，研究工作所取得的成果和相关知识产权属广西大学所有，本人保证不以其它单位为第一署名单位发表或使用本论文的研究内容。除已注明部分外，论文中不包含其他人已经发表过的研究成果，也不包含本人为获得其它学位而使用过的内容。对本文的研究工作提供过重要帮助的个人和集体，均己在论文中明确说明并致谢。论文作者签名：夏帮龟劲弼年月i ；日学位论文使用授权说明本人完全了解广西大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即：按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本：学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并提供目录检索与阅览服务；学校可以采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存论文；在不以赢利为目的的f j 提下，学校可以公布论文的部分或全部内容。请选择发布时间：嘶口时发布口解密后发布( 保密论文需注明，并在解密后遵守此规定)论文作者签名：害凇导师签名：衅乙a花生壳中木犀草素的分离提纯及其抑菌性能研究第一章绪论微生物滋生是引起食品腐败变质( f o o dd e c a y ) 的主要因素，据估算，全世界每年约有1 0 2 0 的食品因细菌、霉菌、酵母菌等微生物的侵袭污染而废弃，造成巨大的资源浪费和经济损失。防腐剂的使用可有效降低微生物对的危害，但长期的研究表明一些合成防腐剂有诱癌性、致畸性和易引起食物中毒等问题。随着生活水平的不断提高，人们对食品的安全、营养、保健性也提出了更高的要求。因此具有抗菌性强、安全无毒、水溶性好、热稳定性好、作用范围广等特点的天然防腐剂的研究和丌发利用成了近年食品工业的一个研究热点。木犀草素作为黄酮类物质的典型代表具有明显的抑菌、抗氧化等多种生理活性。花生壳是己知木犀草素含量较高的材料，并且其本身也含有多种生理活性成分，但作为一种农副产品尚未得到有效开发。另一方面，加快我国农产品的综合开发和深加工，提高附加值，建立循环型绿色生态农业，是现代农业的重要课题。我国花生壳资源丰富，以其为原料开发以木犀草素为主导产物的防腐抑菌剂，将产生较好的经济和社会效益。1 1 天然植物防腐剂的研究现状研究和开发天然防腐剂是近年食品工业的一个热点问题。天然植物防腐抑菌剂因其安全、有效性而日益受到人们的青睐。而且许多植物源防腐抑菌剂还有一定的营养价值和其他的功能特性，如作为着色剂、风味调节剂、自由基清除剂等，因而，从植物中寻找和提取具有一定营养价值、安全性高的天然食品防腐剂己成为当前天然食品防腐剂研究的主流【l ，2 】。其中研究较多的包括香辛料、海藻类、树木、中草药及食药用菌等。香辛料的有效抑菌成分大多存在于精油中【3 ，4 1 。k a n e d a 等玎发现，海藻类对多种食品腐败菌具有明显的抑制作用，尤其对g + 细菌抑制效果显著。许多中草药不仅具有营养保健功效，还含有多种抗菌成分，对多种常见食品腐败菌具有较强的抑制能力，且活性p h 范围较宽7 ，8 1 。1 1 1 天然植物防腐抑菌剂的研究与应用植物源防腐剂来源广泛，目前世界上大约存在2 0 0 0 0 种药用植物具有抑菌作用。我花生壳中术犀革素的分离提纯及其抑菌性能研究国的中药大词典中收录传统中草药4 7 7 3 种，其中具有抗菌防腐作用的植物至少有2 0 0 0种左右，而且它们的药效和安全性较明确【9 , 1 0 。近年来，在国内外植物源杀菌剂的研究倍受重视，并取得了较大的进展，发现了很多具有开发潜力的抑菌、杀菌或抗菌的化学成分。植物提取物中的抗菌物质的有效成分结构类型较多，几乎涉及各类植物成分。在化学组成上分属于多类化合物，大致可以分为以下几类【1 1 】：萜类、含氧或含硫组分( 生物碱、胺和酰胺) 、脂肪族化合物和芳香族化合物。在一种植物中，可能含有多种不同的抗菌成分，发挥着不同的抗菌作用，包括酚类、生物碱类、皂甙类等，其中每一类结构又包含多种不同的结构：而在不同的植物中也可能含有同一种抗菌物质，例如甘草、沙棘、荷叶、越桔、蜂胶中的黄酮均具有抑菌作用【l2 1 。黄酮类物质的抑菌活性日益凸显出来。从植物中开发天然防腐剂进行复配抑菌效果的研究当前研究的热点。刘晓犁1 3 】用大蒜、生姜、桔皮提取液以相同体积复配对某些细菌、酵母和霉菌的抑菌效果进行研究表明抑制效果较好，比苯甲酸钠的抑菌作用强，而且抑菌浓度低，p h 作用范围广，热稳定性较好，这三种提取液复配具有协同效应，可以增强抑菌效果和扩大抑菌谱。如在牙膏中添加蜂胶、甘草等已经成为天然产物提取制剂产业化的典型例子。很多植物以及食用香料提取物的抑菌作用己得公认。但提取物与其他因素结合时对微生物生长的效果报道并不多。它们能否完全或部分取代普通的防腐剂来抑制腐败和致病菌还需要单独评价并与其他传统保藏因素如保藏温度、p h 、水分活度、其他防腐剂结合起来考虑。这些研究结果将有助于产品开发研究人员快速确定这些保藏因素的影响。1 1 2 天然抑菌物质抑菌效果的微生物测定法抑菌成分抑菌效果的测定方法，按性质来说可以分为三大类即物理方法、化学方法及微生物方法。对于那些已经知道成分化学结构的物质，可以用定性定量的化学分析方法求知其抑菌效力。但对于天然植物提取来讲，其成分多数是未知的，微生物学法是一种行之有效的方法，大致可以分为扩散法、比浊法、稀释法三大类1 1 4 l 。1 扩散法扩散法是在固体培养基融化凝固前接种试验菌，待凝固后，将待测品用不同的方法放在培养基上，待测样品在某一溶剂的带动下在培养基内呈放射状扩散。抑菌物质在培2花生亮中木犀草素的分离提纯及其抑菌性能研究养基中的浓度，随离开扩散原点的距离增大而降低，离扩散原点越远处，培养基中抑菌物质的浓度越低。当培养基中抑菌物质的浓度恰好高于该抑菌物质对实验菌的最低抑菌浓度时，试验菌的生长被抑制，形成透明的抑菌圈。从理论上讲，抑菌范围的大小可以作为抑菌物质生物效价评定的依据。管碟法和滤纸片法是扩散法的典型代表。2 比浊法比浊法是将不同量的被检样稀释液加入到液体培养基中，根据浊度的变化观察试验菌的生长情况。由于少量抑菌物质的存在，使试验菌的生长受到不同程度的抑制，而产生不同程度的浑浊。因而比浊法终点的观察不是根据试验菌生长与否作为终点的判断，而是借助其抑制试验菌生长的速度不同而定。3 稀释法稀释法是将含有不同剂量抑菌物质的培养基，依次分装在容器中，并于各个容器内加入对该抗菌物质有高度敏感性的试验菌，经过一定时间和温度的培养，观察其对菌体生长的抑制情况，确定其最低抑菌浓度。1 1 3 天然植物防腐剂抑菌机理抗菌机制是国内外医药、生化等领域研究的重大课题之一，各种的药物的抗菌活性，通过某一途径作用于微生物的某些特殊靶位，达到抑制或杀灭微生物的目的。这些特殊靶位主要是：细胞壁、细胞膜、蛋白质、核酸等。g o u l d 【”l 根据大量的试验观察，把抗菌机理归纳为三个方面：( 1 ) 作用于细胞壁和细胞膜系统，破坏其屏障作用，使细胞不能生长繁殖；( 2 ) 作用于遗传物质或细胞微粒结构，阻碍遗传信息的复制；( 3 ) 作用于酶或功能蛋白，使细胞丧失生长繁殖的物质基础。黄酮属于多酚类物质，其抑菌机理具有酚类物质的某些共性。c o n n e r 和b e u c h a t 1 6 】提出，当酚类物质与细胞膜交互作用时，与膜上的酶和蛋白质相互作用，导致质子的反方向流动，影响细胞活性。j u v e n 1 7 , 1 8 】等发现百里香香精油，庸香草酚或香芹酚浓度与抑菌效果无直接联系，但经过一个特定的浓度( 临界浓度) 后，s t y p h i m u r i u m 的活细胞有快速而剧烈的下降。酚类物质可以使细胞膜敏感化，当作用点饱和后，细胞膜整体会严重损伤，快速瓦解，从而减少细胞质体的组分。b r a n e n 【l 吼2 0 】等使用电子显微镜，发现没有经过酚类物质处理的细胞比较光滑，而酚类物质处理2 4 h 后的细胞粗糙并有不规则的表面结构。r i c om u n o z 等【2 l 】发现橄榄中的酚类物质对s a u r e u s 在细胞膜水平上没有作用，花生壳中木犀草素的分离提纯及其抑菌性能研究由此推断酚类物质抑菌并不是单一机理，而是很多种作用的综合。g o c h o 2 2 1 ，提出桂醛、茴香脑等有效芳香抗菌成分的抗菌性是基于孢子对抗菌剂的吸收而起作用的看法。1 2 花生壳的研究和开发现状花生( a r a c h i sh y p o 肜e al ) 又名长生果，属豆科一年生草本科植物。是我国重要的经济作物，在各省区均有种植。我国花生品质较好，已成为世界花生生产出口大国，近年总产量达到1 4 5 0 万吨以上。但与发达国家相比，我国花生资源的开发和利用程度还相距甚远，并未形成产业优势。目前，其开发利用的主要是花生仁、花生红衣，而加工过程中每年产生约4 5 0 万吨的花生壳，除了很少部分用于饲料加工、食用菌栽培、化工原料或药品生产等外大部分用做燃料或当作废渣弃去，造成很大的资源浪费，影响了花生的高附加值综合利用【2 引。1 2 i 花生壳成分花生壳是一复杂的有机化合物组合体【2 4 】。研究表明，其含蛋白质4 7 、粗脂肪1 2 、碳水化合物1 0 6 , - 一2 1 2 ( 其中包括单糖、双糖和低聚糖) 、淀粉0 7 、半纤维素1 0 1、粗纤维素6 5 7 - 7 9 3 、灰分1 9 - - - 4 6 。此外，花生壳中还含有一些药用成分( 如木犀草素、b 谷甾醇、胡萝卜素、皂草甙、木糖等) 。成熟的花生壳中多酚类物质的含量约为3 3 4 7 1 3 ，包括一定量的黄酮类化合物，其提取物可用作具有保健功能的食品抗氧化剂2 5 础】。该类黄酮化合物有很好的清除自由基的作用。其中，木犀草素是主要活性组分，其抗氧化活性相当于b h a ，但高于q 生育酚，对于治疗高血压、高血脂和冠心病等有明显的疗效用。研究表明：花生壳因产地、品种、成熟度不同所含黄酮类成分在0 2 5 。o - 1 4 2 之间，所含木犀草素的量也不刚2 9 3 1 1 。唐丽萍等3 3 1 运用高效液相色谱法测定不同产地花生壳中木犀草素含量在0 2 5 - 1 1 2 之间。1 2 2 花生壳中活性物质国内外研究现状分析早在九十年代就有报道，美国从花生壳中提取新药用于临床上能降低高血压、高血脂症状的药物，而且可以用于治疗皮肤烧伤、烫伤、恢复皮肤机能的特效药。日本也在研究从花生中壳提取药物，应用于临床上。国外有研究，花生壳用远红外线照射和热( 1 5 0。c ) 处理后，制备水提物( 3 0 0m g lom e ) ，当中总酚类物质( t p c ) 、辐射清除活性( r s a ) 、4广西大学硕士掌位论文花生壳中木犀章，素的分离提纯及其抑- j - 性能研究还原性，与未经处理的对照相比，均有显著提高。随着热处理和远红外线照射时问的延长，抗氧化活性增强。推断可能是热处理和远红外处理改变材料结构或者使目标物易于浸出【3 3 】。甲醇提取物经过不同时间紫外照射后，木犀草素的损失较少，仍有大量酚类物质的存在，抗氧化性基本不受紫外照射的影响【3 引。国内近几年有一些关于花生壳中的黄酮类物质的研究报道，也有降血压的中药胶囊运用于临床。有报道以多种溶剂在传统条件下提取花生壳中黄酮，发现甲醇和乙醇有较高的提取效果，而水提取效率较差【3 5 瑚】。花生壳的甲醇和乙醇提取物分别具有明显的抑菌活性和抑制油脂过氧化作用，并具有很好的热稳定性，但其抗氧化活性受p h 影响 3 s q 2 l 。陈春涛等在花生壳中以甲醇提取得到了抑菌活性较强、富含黄酮类的组分，经纯化得到三种具有较强抑菌活性的化合物，其中一种为木犀草素，得率为0 5 3 ；另一种物质的紫外光谱图表明其具有二氢黄酮结构的特征【4 3 1 。江海峰等对花生壳甲醇提取物中的木犀草素进行了分离与鉴定的研究，经水解试验证明，花生壳甲醇提取物中的木犀草素完全以游离形式存在m 】。1 3 木犀草素的研究概况木犀草素( l u t e o l i n ) 因最初是从木犀草属( r e s e d a ) 植物木犀草( 英文名r e s e d a ，植物分类拉丁文名r o d o r a t al ) 的叶、茎、枝中所分离出而得名，是一种天然色素组分，又名黄色黄素、黄示灵、5 ，7 ，3 ，4 四羟基黄酮、毛地黄黄酮，分子式为c 1 5 h l 0 0 6 ，分子量2 8 6 2 3 ，属弱酸性四羟基黄酮化合物，分子结构如下：溯k ；0已被世界权威性的英国色素化学家学会( u k ，t h e o s o c i e t yo f d y e r sa n dc o l o u r i s t s ) 载入该学会编辑出版的色素索i j l ( c o l o u ri n d e x c i ) 被命名为黄色天然色素2 ( n a t u r a ly e l l o w2 ) ，被编为c i n o 7 5 5 9 0 t 4 5 1 。花生壳中木犀草素的分离提纯及其抑菌性能研究1 3 1 木犀草素的理化性质1 3 1 1 木犀草素的溶解性木犀草素能溶于乙醇、乙醚，微溶于热水，难溶于冷水。金黄色针状结晶体是从乙醇离析出的一水合物。水溶液呈悦目的淡黄色，溶于1 0 氢氧化钠水溶液，并呈深黄色；溶于浓硫酸生成锌盐，呈暗红黄色。将木犀草素制成1 3 环糊精包合物后，能改善其溶解度，大大提高木犀草素的稳定性和生物利用度【删。1 3 1 2 木犀草素的熔点木犀草素的熔点为3 2 8 3 3 0 ，同时发生分解，与氢氧化钾共熔生成藤黄酚( p h l o r o g l u c i n 0 1 ) 和原儿茶酸( p r o t o c a t e o l n i c a c i d ) ，在真空下升华。木犀草素与化妆品常用的脂肪性、类脂性组分不相熔，即使经受热亦难熔合成均一相体【4 5 1 。1 3 1 4 木犀草素的弱酸性和络合性木犀草素分子上因存在着酚羟基，故其水溶液显示微弱的酸性。木犀草素能够与铁、镁、钙、铜、铝、锆等金属离子生成有色的络合物。由于这类化合物的生物活性和微量金属的配位有关，且微量元素c u 具有许多药理、生物功能活性。李敬芬等【4 7 】在无水乙醇溶剂中，通过溶解、回流合成了木犀草素合醋酸铜金属配合物，并通过元素分析、红外光谱、电子光谱和摩尔电导等表征手段，初步确定了配合物的结构。1 3 2 木犀草素的生理活性和应用价值木犀草素作为一种黄酮类天然抗氧化剂，其药用价值很高，具有抗氧化、抗肿瘤、抗动脉粥样硬化、降血糖、抑菌等多种保健和药理作用。其天然品己应用于临床治疗止咳、祛痰、消炎，有较好的疗效，无毒副作用。另外，木犀草素是合成许多其它药物的重要中间体，其糖甙均具有抗炎、解痉、去痰、降血压、增强冠状动脉血流量等药理作用 4 8 】。1 防治肝纤维化作用赵稳兴等4 9 , 5 0 1 研究证明木犀草素在体外能抑制h s c 增殖和胶原基因表达合成，其作用具有剂量依赖关系。另外，动物肝纤维化模型对照试验结果表明，经木犀草素治疗后，肝脏纤维化程度降低，羟脯氨酸含量减少；同时使肝脏i 型l j 胶原m r n a 表达降低和m d a 含量显著减少。证明木犀草素通过清除自由基，抑制胶原基因表达，在动物体内具有防治肝纤维化作用。6花生壳中木犀草素的分离提纯及；j t t t t 曹性能研究2 抗病毒的作用何丽娜等5 1 1 采用组织培养法，进行药物抗病毒实验，使用染料摄入法测定细胞存活情况，认为木犀草素在0 3 0 9 7 5 u g m l 浓度范围内，具有体外抗柯萨奇b 3 病毒的作用。3 抗癌作用近来研究证明木犀草素具有很广的抗癌作用盼5 35 4 ，5 5 1 。h o y o k u 等研究表明：木犀草素对促癌剂t p a 具有很强的抑制作用，并且抑制由t p a 引起的无机磷3 2 1 p 酸盐与宫颈癌细胞磷脂的融合。通过嗜碱性粒细胞抑制a p 1 的激活，并具有很强的抑制白细胞介素4 合成及原癌基因c j u n 的磷酸化和a p 1 的d n a 结合活性；保护h m b 2 细胞d n a免受h 2 0 2 及其所产生的诱裂效应破坏，使m h 引起的染色体异常几率明显减小。k o w g 等【5 6 , 5 7 1 通过多种方法研究证明了木犀草素具有抑制人h l 6 0 细胞增殖和诱导该细胞凋亡的作用，诱导人肺癌细胞c h 2 7 的凋亡。4 平喘作用有研究表明：木犀草素对慢性支气管炎症状，如咳嗽、咳痰、哮喘等都能有效缓解，而且未见有肝脏、心脏或肾脏毒性报道，有望将木犀草素开发成为能够治疗慢性支气管炎的药物4 8 1 。5 心血管作用木犀草素对麻醉犬具有明显扩张冠脉血流量及降低冠脉血管阻力的良好作用，而对心肌耗氧量无明显影响。抑制血小板引起的增长因素子所诱导的鼠大动脉壁平滑肌细胞增殖及其d n a 合成 5 8 , 5 9 , 6 0 】。6 促凝血作用都述虎等6 1 1 对仙桃草的主要化学成分木犀草素的体外促凝血作用进行了初步的探讨，结果表明，木犀草素有较好的促凝血作用。7 抗氧化和清除自由基作用标准程序的化学分析研究表明，等摩尔浓度条件下的木犀草素与槲皮素及辣椒素相比，木犀草素具有最强的抗氧化活性【6 2 ，6 引。8 抑菌作用木犀草素在1 ：3 5 0 0 0 0 浓度时可抑制葡萄球菌和枯草杆菌的生长，对卡他菌、白色念珠菌、变形杆菌等多种腐败菌也有抑制作用。可用作食品防腐保鲜剂，如延长月饼、桃酥的货架期，抑制含油脂食品的劣变等6 4 1 。9 抗炎作用【6 5 , 6 6 , 6 7 , 6 8 】7花生壳中木犀草素的分离提纯及其抑菌i t 能研究郑亦文等用荧光法研究了木犀草素对大鼠腹腔巨噬细胞释放h 2 0 2 的影响。结果表明，对酵母多糖诱导的大鼠腹腔巨噬细胞h 2 0 2 释放呈浓度依赖性的抑制，且以木犀草素与巨噬细胞共同培养4 h 抑制作用最明显。有研究表明木犀草素的抗炎作用与其抑制炎症介质的释放有关。1 3 - 3 木犀草素的来源木犀草素属于天然黄酮类化合物，存在于多种植物中。其获得途径主要有从相关药材中提取、半合成和全合成，其中合成法依然是主要方法。有研究从桔皮中提取橙皮苷，橙皮苷再经水解、脱甲基、脱氢三步合成木犀草素，三步总收率为4 5 9 【6 9 1 。但从安全和环保角度考虑植物中分离提取将会成为获得木犀草素的主要方式。目前，木犀草素的提取原料主要有菊科植物、唇形科植物筋骨草、全叶青兰、筋骨草、忍冬、白毛夏枯草等药材，但因总含量均较低，提取效果比较差，分离纯化工艺较复杂，市场上从天然植物提取木犀草素的含量仅4 0 ，供求处于小销量高价格的状况，限制了天然提取木犀草素的应用开发1 7 0 1 。因此，一方而应加强对木犀草素含量高的植物资源的开发，另一方面，还要加强对木犀草素提取和合成途径和工艺的研究，以提高木犀草素的得率。花生壳是目前已知的木犀草素含量较高、可再生、廉价、来源丰富的植物资源，是生产木犀草素的理想原料。以花生壳为原料来提取木犀草素，或生产含木犀草素的产品，通过改进提取分离纯化方法，降低成本，将产生较好的经济效益和社会效益。1 4 黄酮类成分的提取和分离方法1 4 1 黄酮成分的提取方法黄酮类化合物种类很多，多数以甙的形式存在，少数以游离形式存在。黄酮甙类以及极性稍大的甙元( 如羟基黄酮、双黄酮、查耳酮等) ，一般可用丙酮、乙酸乙酯、乙醇、水或某些极性较大的混合溶剂进行提取；一些多糖甙类则可用沸水提取；大多数黄酮甙元用极性较小的溶剂，如氯仿、乙醚、乙酸乙酯等提取。常用方法有溶剂浸提法、碱提取酸沉淀法、酶辅助提取法、超声技术提取、微波技术提取和超临界流体萃取法提取等，以及多种方法的复合提取法等 7 1 , 7 2 1 。下面简要介绍几种方法：8花生壳中木犀草素的分离提纯及其抑苗性能研究1 溶剂浸提法该法是传统的提取方法，也是相对经济的，包括浸渍法、渗漉法、煎煮法、回流提取法及连续回流提取法等。溶剂种类、浓度及用量，操作压力、温度、p h 值、提取时间是主要考虑因素。为加快提取速度和提高提取率多方面优化提取条件或者采用辅助性手段来强化提取效果。超高压提取由于压力较高，提高了传质速度，在非常短的时间内，有效成分就能被完全提取出来，具有提取效率高、时问短、杂质含量少等优点，而且在4 0 0 m p a 的压力下还有灭菌的效果【7 3 1 。2 微波辅助提取技术 7 4 , 7 5 】微波辅助提取( m i c r o w a v ea s s i s t e de x t r a c t i o n ，m a e ) 是将微波激活与传统的溶剂萃取法结合起来而形成的新型萃取方法，具有萃取时问短、提取效率高、节能、溶剂用量少等优点。其原理是被提取的极性分子在微波电磁场中快速转向及定向排列，从而产生撕裂和相互摩擦引起发热，使药材内分子间互相碰撞、挤压，可以保证能量的快速传递和充分利用，这样有利于有效成分的浸出，提取过程中，药材不凝聚，不糊化，克服了热水提取易凝聚、易糊化的缺点。微波对某些化合物有一定的降解作用，具有热效应和非热效应，尤以热效应特明显，水、乙醇等中药提取常用溶剂在微波作用下均升温明显，因而，只适宜于对热稳定的产物。3 超声波提取超声波提取能提高有效成分的提取率，缩短提取时间，节约成本，甚至还可提高产品质量和产量。目前超声波提取技术己在油脂、蛋白质、多糖、色素等物质提取中得到应用 7 6 , 7 7 】。近来有研究把双频超声应用于植物药有效成分的提取，其提取率显著高于单频超声强化的提取率，并可以降低提取温度，缩短提取时间，为热敏性药物的提取提供了新的强化方法【7 8 , 7 9 1 。4 超临界流体萃取【8 0 , 8 1 , 8 2 】超临界流体萃取率高，萃取速度快。控制参数主要是压力和温度，操作简单；萃取和分离合二为一，简化了过程；通常在较低温度下进行，特别适合于那些对热敏感性强、容易氧化分解成分的分离提取。黄酮类及其衍生物多数极性较大，用c 0 2 s f e 法提取时需要采用较高萃取压力，并且通常还要加入适当提携剂。超临界c 0 2 萃取技术与其他萃提技术相结合不断出现，有效地提高了活性物质的提取效果。5 酶辅助提取法【8 3 】9广西大学硕士学位论文花生壳中木犀草素的分离提纯及其抑菌性能研究植物酶法提取是在传统的溶剂提取方法的基础上，根据植物药材细胞壁的构成，利用酶反应所具有的高度专一性等特点，选择相应的酶，将细胞壁的组成成分水解或降解，破坏细胞壁结构，使有效成分充分暴露出来，溶解、混悬或胶溶于溶剂中，从而达到提取细胞内有效成分的目的的一种新型提取方法。6 碱提酸析法【蚓碱提酸析法提取是利用黄酮类物质的弱酸性特点，使用碱性水或碱性稀醇使其成盐被溶出，经酸化后得到黄酮类物质。常用的碱液是稀氢氧化钠和石灰水。采用此法进行提取黄酮类物质时，温度和碱度不宜过高，以免黄酮化合物母核发生裂解；酸化时需调p h 2 3 ，p h 过低黄酮类化合物会与酸生成烊盐而溶解。1 4 2 黄酮成分的分离和纯化方法黄酮化合物的分离纯化工作，主要依据以下几个方面进行：极性大小不同，吸附( 硅胶、氧化铝聚酰胺吸附柱等) 或分配原理进行分离酸性强弱不同，分子大小不同，分子中的某些特殊结构等特点进行分离。分离纯化黄酮有：液一液萃取法、沉淀剂法、吸附层析法、树脂吸附法，膜分离法，高效毛细管电泳法分离等多种。在黄酮的提取研究中，往往把提取与分离结合起来进行，简化工艺流程【8 5 , 8 6 】。1 4 2 1 传统分离方法液一液萃取法：依据目标物的极性及在不同溶剂中溶解度差异进行萃取。常用溶剂的极性强度强弱顺序可表示如下：石油醚( 低沸点一高沸点) 四氯化碳 二氯乙烷苯 二氯甲烷 氯仿 乙醚 乙酸乙酯 丙酮 乙醇 甲醇 c b ，浸提温度最主要因素，其次是提取时间和料液比。最佳提取条件为：a3 8 2 c l 即，按1 ：2 5 料液比加入7 5 乙醇，7 0 。c 浸提2 h ，木犀草素得率为0 8 7 6 。2 4 本章小结1 采用a 1 c 1 3 c h 3 c o o k 法测定样品中木犀草素含量，具有较好的显色稳定性、重现性和加样回收率；n a n 0 2 a i ( n 0 3 ) 3 - n a o h 法对样品的显色稳定性很差。2 水浴回流浸提法木犀草素得率o 8 7 6 高于微波提取得率0 8 0 1 ，超声波提取效果最差仅为0 4 3 ，明显不具有优势，与所报道的快速、高效特点不一致。可能所考察的超声波辐射时问、料液比并不是影响超生提取率的关键因素，而超声波功率、温度才是其主要影响因素，需要进一步研究。水浴回流提取，操作简单适于工厂大量制备，但高温加热不仅能耗高，且提出的杂质也比较多，粗品中木犀草素含量为9 8 5 ，影响后续纯化。而微波提取有快速、高效特点，专一性强，溶出杂质少，粗品中木犀草素含量为1 5 1 8 ，在实验室条件下具有明显优势，因而选择按料液比l ：2 0 加入8 0 乙醇，微波1 0 0 功率档辐射7 0 s 为最佳提取工艺，木犀草素提取率为8 2 6 6 。3 定性鉴定结果表明，粗提物中含有黄酮类物质和大量的糖类或糖苷类成分，因而除糖是后续纯化的关键一环。广西大掌硕士学位论文花生亮中术犀革素的分离提纯及其抑曹性能研究第三章花生壳乙醇提取物的分离纯化3 1 实验材料与仪器3 1 1 材料与试剂材料：花生壳乙醇提取物试剂：无水乙醇、9 5 乙醇、氯仿、冰醋酸、无水甲醇、石油醚、正丁醇、乙酸乙酯、浓硫酸、浓盐酸、浓磷酸、氢氧化钠( 以上均为分析纯) ；a b 8 大孔树脂，聚酰胺，木犀草素( 9 8 ，上海友思生物技术公司)3 1 1 仪器电脑全自动部分收集器d b s 1 6 0l c 1 0 a t 高效液相色谱仪f t i r - 8 4 0 0 s 红外分光光度计其他同2 1 13 2 实验方法3 2 1 初步纯化上海青浦西仪器厂日本岛津公司r 本岛津公司鉴于木犀草素在水、乙醇中溶解度不同，采用水沉醇溶法进行初步纯化，除去产品中糖、蛋白、胶体等水溶性杂质，再进行后续分离。微波粗提液5 0 。c 真空旋蒸成水浸膏一加1 0 倍量蒸馏水洗涤，4 8 0 0 r m i n 离心取沉淀，重复两次一无水乙醇溶解沉淀物一离心取上清一真空旋蒸近干，取出制成干品备用。3 2 2 大孔树脂吸附纯化3 2 2 1 大孔树脂的预处j 塑 s 4 l大孔树脂a b 8 ，为弱极性吸附型树脂，选择树脂a b 8 先用9 5 乙醇充分浸泡2 4 h ，然后用乙醇洗至洗出液1 份加入3 份水，无白色浑浊，再用蒸馏水洗尽乙醇，然后转入3 0花生壳中术犀草素的分离提纯及其抑菌性能研究酸碱处理：用5 h c l 溶液浸泡5 h ，再用去离子水洗至p h 值为中性，接着用5 n a o h溶液浸泡5 h ，最后用水洗至p h 值为中性，此时已经完成装柱。3 2 2 2 大孔树脂上样溶剂浓度的选择经过初步纯化的粗品在水溶液中溶解度很小，若采用水浊液上样，大量黄酮由于处于非溶液状态，而被水大量带出柱，得不到有效吸附，或者沉积在柱顶端，增加柱压。因而，实验只对3 0 7 , 醇溶液、7 0 7 , 醇溶液、无水乙醇溶液上样吸附情况进行考察。吸附率= 土苤铲1 。公式( 3 1 )1 上样液的制备：经过初步纯化的样品再次用无水乙醇溶解，在4 。c ，8 0 0 0 r m i n离心2 0 m i n ，取上清，测定含量后，加水调整成乙醇浓度为1 0 0 、7 0 、3 0 的上样液。2 3 0 乙醇溶液上样以l m l m i n 的流速上样，分步收集泄露液，测定木犀草素含量，绘制吸附曲线。3 7 0 乙醇溶液上样以l m l m i n 的流速上样，样品刚到柱子底部时停止上样。用水洗脱3 b v ，充分洗出糖类等水溶性物质。每4 m l 收集一管，每2 0 m l 用分光光度计测定木犀草素的洗出浓度。由于7 0 乙醇溶液上样时，与柱中的水浓度差比较大，存在热交换，流速过快就会产生大量气泡，影响吸附效果。上样完毕，进入水洗也具有同样问题，因而流速均为1 m l m i n 。4 无水乙醇上样首先将柱子顶端的水液放出，使液面高出柱床l c m ，将已处理好样液沿柱壁缓缓加入，同时打开放液阀，使样液缓缓浸入树脂中，避免加样过快，导致柱内热交换剧烈，柱子变花而降低吸附性。5 洗脱【1 叫上样结束，采用蒸馏水、3 0 乙醇、7 0 2 , 醇、9 0 7 , 醇梯度洗脱，分布收集。并考察7 0 乙醇的洗脱速度，比较1m l m i n 、2m l m i n 的洗脱效果。3 2 3 聚酰胺柱层析( 1 ) 聚酰胺的预处理与装柱聚酰胺颗粒过8 0 目筛，除去细小颗粒，然后加入9 0 9 5 乙醇浸泡，不断搅拌，花生壳中木犀草素的分离提纯及其抑菌性能研究除去气泡后湿法装柱。用3 4 倍量的9 0 9 5 溶液洗涤，洗至洗液透明并且蒸干后不留残渣或只留极少