（材料学专业论文）超滤法提取与纯化香菇多糖.pdf

中文摘要 本文主要研究香菇多糖的提取、分离和纯化工艺，首先讨论了多糖浸出的最 佳条件：提取温度为9 0 ，固液比为1 0 0 ：1 ，加热时间为6 h ；并比较了几种蛋 白去除的方法，筛选出一种既能有效脱除其中的蛋白，又不影响多糖含量的方法 一酶结合s e v a g 法，使用该方法可使蛋白的去除率达到8 8 1 ；在0 2 m p a 压力 条件下，采用超滤法对香菇多糖提取液进行分级纯化，为充分发挥膜分离技术的 优势，探索多糖分离纯化的新方法，本研究在借鉴已有香菇多糖分离技术的基础 上，采用超滤渗滤法除去小分子，并结合冷冻干燥技术，对香菇多糖的提取纯 化工艺改进，以期提高产品收率、降低成本。本文还探索了简捷、准确的香菇多 糖分析新方法，采用e l i s a 法检测香菇多糖粗品的纯度，纯度为7 2 8 ，多糖 粗品收率为0 6 7 。所得多糖产品在4 0 0 0 - - 6 5 0 c m 红外光谱扫描，呈多糖类特征 吸收峰，并有b 葡聚糖的特征吸收峰，与标准图谱对照证明是香菇多糖。实验结 果表明，超滤渗滤法是一种有效的香菇多糖提纯方法，再与色谱法结合可以低 成本、高效率地得到香菇多糖产品，为改善香菇多糖提纯工艺、降低成本提供了 一条新途径。该技术显著改善了多糖类药物的提纯工艺，是对传统分离工艺的革 新。 关键词：香菇多糖超滤纯化渗滤 a b s t r a c t an e wp r o c e s sw a sp r o p o s e dt oi m p r o v et h et r a d i t i o n a lp r o c e s sf o ri s o l a t i o na n d p u r i f i c a t i o no fl e n t i n a n ，a l le f f i c i e n ta n t i t u m o ra g e n t t e n t i n a n , o n eo fm u s h r o o m p o l y s a e e h a r i d e sc o u l db ee x t r a c t e df r o ml e n t i n u se d o d e si n t oa q u e o u ss o l u t i o nu n d e r o p t i m a lc o n d i d o 地( s o l i d d e i o n i z e dw a i s t = 1 ：1 0 0 ，d e e n c t i n ga t9 0 f o r 6h ) t h e n s o m em e t h o d sw e r el r i e dt or e l n o v ep r o t e i ni na ne f f i c i e n tw a y , s u c h 嬲e n z y m a t i c m e m o d ，w h i c hc o u l de l i m i n a t ep r o t e i ng r e a t l ya n dk e e pt h ec o n t e n to f p o l y s a e e h a r i d e i n v a r i a b l e 嬲w e l l t h er a t i oo fp r o t e i nr e m o v e dw a su pt o8 8 1 i s o l a t i o na n d p u r i f i c a t i o no fl e n t i n a nb yu l t r a f i l t r a t i o n w a ss t u d i e d ，d i a f i l t r a t i o nw a su s e dt o s e p a r a t ep r o t e i n sa n do t h e ri m p u r i t i e sf r o ml e n t i n a na q u e o u ss o l u t i o n f i n a l l yt h e p r o d u c tc o u l db eo b t a i n e db yc r y o d r i n g as e n t e n t i o u sa n dr a p i da n a l y t i cm e t h o dt o m e a s u r et h ec o n t e n to fp o l y s a c c h a r i d ei nf i n a lp r o d u c tn a m e de l i s aw a sa l s o i n v e s t i g a t e d c o m p 缸ew i t ht h ers p e c t r u mo f t h ep r o d u c tw i t ht h es t a n d a r do n e w e c o u l dc o m et ot h ec o n c l u s i o nt h a tt h ep r o d u c tt h r o u g ht h i sn & wp r o c e s si sl e n t i n a n t h ep u r i t yo fc r u d el e n t i n a ni s7 2 8 a n dt h er e c o v e r yy i e l di so 6 7 t h er e s u l t i n d i c a t e st h em e t h o do fp u r i f i c a t i o nb yu l t r a f i l t r a t i o nc a l li m p r o v et h et r a d i t i o n a l a b s t r a c t i o np r o c e d u r eo f p o l y s a e c a r i d e sg r e a t l y , a n dp r o d u c el e n t i n a nc o s t - e f f e c t i v e l y k e yw o r d s ：m u s h r o o mp o l y s a c c h a r i d e , p u r i f i c a t i o n , o l t r a f i l 仃a t i o n , d i a 矗l t r a t i o n 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的 研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得鑫鲞盘茎或其他教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中 作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名：弓长互王静 签字日期：五”年2 月2 - 7 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解鑫鲞盘茔有关保留、使用学位论文的规定。 特授权基鲞盘茎可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 学位论文作者签名：琴饫王王静 签字日期：弘，5 年月2 7 日 导师躲零寸中 p 签字日期：圳占年2 ，月功日 第一章前言 第一章前言 食用菌因含有高蛋白质、低脂肪、一定量的纤维素、多种维生素和矿物质等 特点，国内外已逐步的把食用菌抽提物广泛应用到保健食品、调味品等食品行业 中。随着糖类生化研究技术的发展，人们对糖类物质的生物学功能有了新的认识。 人们逐渐认识到糖脂、糖蛋白、蛋白聚糖等复合糖化物广泛地参与到生命过程的 许多方面去。例如：病原体对寄体的侵入，细胞的生发与分化等。食用菌中含有 的多糖具有增强人体免疫功能、抗肿瘤、抗衰老、抗疲劳等作用，这无疑会加速 食用菌多糖在医药保健行业的作用。 多糖是最重要的生物大分子之一，二十世纪六十年代以前，人们普遍认为多 糖仅是生物体的能量储源( 淀粉，糖元) 或结构支持物( 纤维素，甲壳素) ，很少关 注其生物活性，六十年代以后，随着现代仪器分析分离方法的迅速发展，人们已 经能够成功的分离、纯化、鉴定生物体内微量的活性物质，从而对多糖的认识也 有了一个飞跃，从研究结果发现几乎所有的生命过程均和糖类有关。另一方面， 多糖还具有多方面的生物活性和功能，如抗肿瘤、抗病毒、降血糖、降血脂等， 多糖治疗的最大特点是副作用小，其作用机理主要是促进免疫细胞( 淋巴细胞、 巨噬细胞) 的成熟、分化和繁殖，诱导产生细胞因子( i f n t n f , i l ) ，再由上述细 胞或细胞因子去吞噬、消除癌细胞和其他病原体。人们坚信多糖在预防和治疗包 括癌症在内的多种疾病方面有着巨大的应用潜力而糖化学研究的成熟将会使糖 的重要生物功能明朗，从而带动分子生物学的另一场突破。 本文选取香菇为代表进行实验，香菇 l c n t i n u se d o d c s b c r k s t a g 】是侧耳科 p l e u r o m c c a e 的担子菌，是一种食药用菌，具有化痰理气、健脾开胃、治风破血 及保肝等功能。历代的医药学家对香菇的药性及功用均有著述，如本草纲目 认为香菇“益气、不饥、治风破血”，现代食用中药认为香菇“为补维生素d 的 药剂，预防佝偻病，并治贫血”。香菇是由营养器官一菌丝体和繁殖器官子实 体两部分组成。子实体包括菌盖、菌褶和菌柄，多单生，少丛生或群生。由予实 体提取得到的糖蛋白是一种能增强人体免疫功能的生物活性物质，具有明显的抑 制肿瘤和抗病毒的活性，随着近代生物化学和医药学的发展，香菇的药用价值不 断被发掘，并得到科学证实。因此，以香菇为原料开发各种保健食品、饮品、调 味品和药品，已引起国内外许多生命科学研究所或生物高科技公司或商社的兴趣 和重视。我国香菇产量位居世界前列，以香菇为原料制成的功能性食品和药品具 第一章前言 有较好的市场前景。 近2 0 年来，随着分子生物学及生物信息学的发展，人们逐渐认识到多糖及 其复合物与细胞的各种生命现象的调节有着密切关系【l 】。大量药理和临床实验证 明，从天然产物中分离出的多糖与免疫功能的调节、细胞与细胞的识别、细胞间 物质的传输、癌症的诊断与治疗等都有密切关系 2 - 5 。 我国对香菇的研究起步较晚，目前对于香菇仍以食用为主，并没有充分实现 其药用价值。这其中主要因为香菇多糖提取的过程复杂、收率低，整个生产过程 造价相对较高，致使最后产品的价格过高。 本文中提到了许多提取香菇多糖的方法，以及它的分析方法，通过所查阅的 文献制定其实验过程。所以，本次实验将主要对于香菇多糖的提取工艺进行研究， 找到较为理想的提取方法，这就需要一系列的实验来确定最佳的条件，比如：提 取的时间、温度、浸提液的用量等：测出香菇提取液中糖的分子量分布；另外， 采用超滤的方法对所得的多糖进行纯化，计算其回收率和纯度；最后，冷冻干燥 制取产品，比较其收率。 第二章文献综述 第二章文献综述 2 1 多糖研究概况及其构效关系 2 1 1 多糖简介 多糖( p o l y s a c c h a r i d e ) 是一类由1 0 个以上单糖以糖苷键连接而成的，广泛存 在于动物、植物和微生物中的一大类聚合物。根据来源的不同，可分为动物多糖、 植物多糖和微生物多糖。根据其存在位置的不同，可分为细胞内多糖、细胞壁多 糖和胞外多糖。根据其结构和性质的不同可分为淀粉、糖原、几丁质、纤维素、 果胶类物质、藻类和地衣多糖、细胞多糖、真菌多糖、蛋白聚糖、糖脂等。长期 以来，人们对多糖的认识仅仅局限子淀粉、纤维素、糖原等结构和贮能多糖，认 为多糖的功能主要在于：其一构成细胞壁，使细胞维持一定的稳定性，保持其形 状和大小；其二作为细胞中的能量贮存物质；其三作为细胞的保护层，保护作用 仅限于使病原菌不易侵人。但从四、五十年代开始，随着生物技术的发展，对多 糖的认识有了进一步的深人，多糖的应用研究也迅速开展开来。 多糖的来源大致分为植物来源多糖、动物来源多糖、海藻来源多糖和微生物 来源多糖即细菌产生的多糖和真菌产生的多糖，这是迄今为止研究得比较详尽的 一类多糖。迄今为止，几百种天然多糖的发现，已给人类提供了丰富的生物多聚 体宝库。真菌作为药物研究始于5 0 年代，在6 0 年代以后成为免疫促进剂而引起 人们兴趣。多糖被认为是一种广谱的非特异性免疫促进剂，能够增强人体及动物 体的细胞免疫和体液免疫功能。香菇多糖就是研究的较透彻的多糖之一，香菇是 侧耳科的担子菌，世界名贵食用兼药用菌之一，它含有多种有效药用组分，尤其 是它含有抗病毒、抗肿瘤、调节免疫功能和刺激干扰素形成等功能的香菇多糖 ( l e n t i n a n 简称香菇多糖) 和增强人体免疫力的水溶性木质素这两种药用生理活 性物质，而引起人们广泛的重视【6 叫。 多糖( p o l y s a c c h a r i d e s ) 是所有生命有机体的重要组成成份，与维持生命所必 需的多种功能有关，大量存在于藻类、真菌、高等陆生植物以及动物体内，多糖 作为药物始于1 9 4 3 年，作为广谱免疫促进剂而引起人们极大兴趣是在六十年代 以后。越来越多的研究表明：多糖可以治疗免疫系统受到严重损伤的癌症，可以 治疗多种免疫缺损疾病如慢性病毒性肝炎和由于某些耐药细菌或病毒引起的慢 性疾病，还能治疗诸如风湿病之类的自身免疫病，而且多糖作为药物对细胞的毒 第二章文献综述 性小。近十年的研究发现多糖的糖苷键在分子生物学中具有决定性的作用，它能 控制细胞的分裂和分化，调节细胞的生长和衰老。一些研究还发现多糖具有抗炎、 抗病毒、抗辐射、降血糖、降血脂的作用，并对造血系统有一定的影响目前已作 为药物或药物辅剂的糖类有中华猕猴桃多糖、黄芪多糖、甲壳素、鳖鱼软骨制剂、 肝素等。多糖的生物活性因分子量、溶解度、黏度、初级结构和高级结构而异。 由于多糖结构复杂，人们对它的认识还远不如蛋白质、核酸。近二十年来，由于 多糖及糖类复合物的分离、分析方法的改善，特别是近年发展起来的气相色谱、 高效液相色谱、质谱、红外光谱、核磁共振等新技术，使国内外对多糖的研究有 了迅速的发展。 2 1 2 国内外研究概况 多糖作为药物，最早的研究是1 9 4 3 年从粘赛氏杆菌( s e r r a t i ai l l a l c e s c , e 1 1 s ) 中 分离到的由醛己糖，6 脱氧己糖和己糖胺组成的薛氏多糖( s h e a r s p o l y s a c c h a r i d e ) ，经腹腔注射( i p ) 能使小自鼠肉瘤一3 7 大量出血。不过残存的肿瘤 细胞最终还是引起小鼠死亡。1 9 6 4 年，c r e e c h 等从薛氏多糖中分离得一种多糖 级分，含d 葡萄糖，d 甘露糖和少量2 氨基2 脱氧d 葡萄糖单位，在剂量 2 0 0 4 0 0 斗g 时对小鼠呈抑瘤活性。其后发现薛氏多糖对于其它实验动物肿瘤也有 抑制作用，包括：肉瘤1 8 0 、e h r l i e h 肿瘤、w a l k e r 癌肿和肉瘤m - 1 。从5 0 年代 初到6 0 年代后期，已有不少报导某些真菌( 包括酵母和担子菌) 的粗提物具有抑 制实验肿瘤的活性。国内外先后从高等担子菌中分离到有生物活性的多糖类物质 2 0 0 余种，我国发现有价值的真菌多糖有近3 0 种。其中研究最为深人的当属香 菇多糖和云芝多糖。植物多糖研究的种类较少，较为深人的有：黄芪多糖、刺五 加多糖、当归多糖。 六十年代以来，可能具有抗肿瘤活性的多糖作为一种广谱免疫促进剂而引起 人们极大的兴趣。越来越多的研究证明：多糖不但能够治疗机体的免疫系统受到 严重损伤的癌症，还能治疗多种免疫缺损疾病如慢性病毒性肝炎和某些耐药细菌 或病毒引起的慢性疾病，有的还能诱导干扰素的产生等，另外还有些多糖具有抗 炎症、抗突变、信号识别、调控形态发育等多种生物调节活性。因此，多糖作为 一种生物反应调节剂( b i o l o g i c a lr e s p o n s em o d i f i e r s ，b r m ) 而成为现代生物化学 研究领域中的一个热点。到了八十年代，在多糖的结构和功能的研究上进展更为 迅速，除采用经典的化学方法外，借助于精密的高级检测技术：“c 标记的糖类、 红外光谱、核磁共振谱和质谱分析等成为常用的工具。由此开始对许多复杂的天 然多糖及其复合物的结构、理化性质和生物学性质有所了解，开辟了多糖及其复 第二章文献综述 合物的广阔应用研究领域。 糖生物学作为生物医学和生物化学交叉点的新前沿，己逐渐成为生物学研究 领域中的新热点，发达国家尤其重视这一研究：美国很多著名的大学、研究所都 有优秀的研究组从事糖的化学和生化的基础研究；日本从1 9 9 1 年开始实施一项 投资数百亿日元、为期1 5 年的“糖工程前沿计划”，开展糖生物学基础与应用研 究。1 9 9 8 年5 月于德国召开的“国际糖生物工程讨论会”将糖生物工程划分为3 个分支【l o 】：一是糖生物学，包括糖蛋白和糖脂合成的分子生物学、糖基转移酶的 分子生物学、细胞内的通路和投送受体、分化发育和基因治疗、免疫学和神经生 物学、寄主和病原体的相互作用、糖基化和疾病；二是糖化学，涉及的内容有化 学合成、组合合成、酶法合成、分子相互作用和结构分析、数据库和网络；三是 糖生物工程，主要包括发展糖药物的重组工具、表达系统、宿主和载体、宿主细 胞的耱基化工程、糖蛋白生产系统、生物工程工序、药理学和诊断、重组和天然 糖蛋白的糖信号及其在体内的命运和靶向性、质控和分子技术、法规条例。我国 糖生物学的研究起步较晚，但近年来对植物多糖，特别是具有中国特色的中药多 糖、真菌多糖的研究己取得一定的进展 现代分子生物学的进步和基因组计划的完成，也为糖生物学研究带来了极好 的机遇。比如基因k n o c k - o u t 和基因芯片技术在糖链功能和调控研究中的应用， 就加快糖生物学研究的步伐。可以预料，糖基转移酶及其它糖链代谢酶基因探针 和基因芯片的开发，将有力推动对糖链调控作用的分析和研究，而各种糖链结构 的确定也将为糖链参与细胞识别的研究提供坚实的基础【1 1 】。为此，各国科学家都 致力于在糖链结构分析和合成方法学上取得新突破，为糖链的功能分析提供技术 支持，同时糖链的功能研究方面又集中于在细胞水平上研究糖链的调控和识别机 制。毫无疑问，只有在方法学上获得突破、在功能研究上获得更多的基础数据积 累，开展功能糖组学研究的时代才能真正来临，而那一天的到来也才是人类揭示 自身全部基因功能的时刻。 2 1 3 多糖的构效关系 多糖是自然界中含量最丰富的生物聚合物，几乎存在于所有的生物中，具有 能量储存、结构支持、防御功能和抗原定性等多方面的生物功能。有些多糖或其 衍生物还有多种生物活性，如来自于真菌细胞壁的a 葡萄糖具有抗肿瘤作用和 免疫促进活性1 1 2 j ；银耳多糖具有增强机体免疫功能，抑制肿瘤细胞转移；茶叶多 糖具有降低血脂的功能【l 。近年来，多糖成为天然药物研究的一个热点。多糖的 生物合成取决于各种糖基因转移酶的活性，面酶的合成直接受遗传因素的调控， 所以多糖受遗传因素的间接控制。因此不同生物来源的多糖组分和结构差别很 第二章文献综述 大，具有明显的种后特异性。同时多糖的合成还受到养分、温度、季节等外界因 素的影响。在不同条件下，即使同种生物的多糖化学结构也常常有明显的变化， 与核酸、蛋白质等生物大分子相比表现出较大的变异性。因此，对多糖的研究多 集中在多糖的药理作用等方面，而对多糖进一步的分离、纯化、结构测定、结构 和功能关系等方面的研究工作较少。 关于真菌多糖的化学结构和生理活性之间的关系一直是人们关注的焦点。多 糖的构效关系是指多糖的一级结构和高级结构与其生物活性的关系。就其一级结 构而言；多糖中单糖的组成、糖苷键的类型以及一些官能团对其生物活性都有影 响，一般而言，多糖主链上( 1 - 3 ) 糖苷键是其活性前提。j h o m s o n 测定小核菌多 糖结构，发现它是分支的( 1 - - 3 ) 1 3 d 葡萄糖，具有抑瘤活性。而( 1 3 ) - a - d - 葡 萄糖没有抑瘤活性。另外，1 3 c - n m r 分析推断，连接在1 3 ( 1 - - 3 ) 一d 葡萄糖上的 多羟基基团对抗肿瘤活性起重要作用。m a k a i 等从黑木耳子实体中分离的一种多 糖b ，无活性，对其进行高碘酸氧化、硼氢还原和温和水解。并在口_ 6 上共价 连接多元羟基，显示很强的抑瘤活性。多糖立体结构中s 螺旋具有较强生物活 性，可拉伸状有一定的生物活性，而其它两种结构无生物活性。如有报道香菇多 糖的二级、三级结构比一级结构更具有免疫活性，x 衍射和粘度分析发现，香菇 多糖的b 三维螺旋一旦破坏，免疫活性随之消失【1 4 1 。目前，对于这种细微结构的 影响机理，仍不甚了解。 2 2 香菇多糖简介及其药理作用 2 2 1 香菇多糖的结构和理化性质 香菇多糖是从香菇l e n t i n u se c l o d e s ( b e r k ) s i n g 子实体中提取的多糖，具有明 显的肿瘤抑制作用和抗病毒活性1 1 5 j 阚。香菇多糖以一种b - 1 3 ( 1 3 ) 葡萄糖残 基为主链，侧链是一种( 1 6 ) 葡萄糖残基的葡聚糖，重复结构单位一般含有7 个葡萄糖残基，其中两个残基在侧链上【1 8 捌。有文献报道，香菇中的多糖结构 有利于诱生干扰素的活性1 2 0 ，因此在治疗肝炎方面具有积极的意义。通过采用凝 胶过滤法【1 7 1 ( h p l c ) 和激光拉曼散射法测的香菇多糖的相对分子量为4 0 8 0 1 0 4 ，其结构为： 第二章文献综述 香菇多糖为灰白色粉末状固体，对光和热稳定，在水中最大溶解度为 3 m g m l ，能溶解于0 5 m o l ln a o h 溶液中，溶解度可达5 0 1 0 0 m g m l ，不溶于 甲醇、乙醇、丙酮等有机溶剂。目前有人正在研究，在香菇多糖原有的结构上， 接硫酸根集团，在不改变药品功效的基础上，可大大提高水溶性。香菇多糖具有 吸湿性，在相对湿度为9 2 5 的2 5 室温环境下放置1 5 d ，吸水量可达4 0 。因 此，香菇多糖应保存在干燥状态下。 2 2 2 香菇多糖的药理作用 香菇多糖对同种异基因和原发肿瘤具有显著的抑制作用，可防止化学因素或 病毒引起的致癌作用，抑制肿瘤的转移，同时它还能增强宿主对不同纽菌、寄生 虫和病毒包括爱滋病毒等引起疾病的抵抗力。香菇多糖能增强机体抑制各种细 菌、病菌和寄生物的能力，能调节整体内部环境的稳定性，使病人恢复正常状态 1 9 1 。与传统中草药相同的是：l n t 的药理作用是它并非直接攻击致病源，而是 通过刺激免疫细胞成熟、分化和增殖，改善宿主机体平衡，达到恢复和提高宿主 细胞对淋巴因子、激素及其它生理活性因子的反应性【2 1 1 。因此，人们常称l n t 为生物反应修饰剂( b i o l o g i c a lr e s p o n s em o d i f i e r , b r m ) 。 2 2 2 1 特殊免疫功能 l n t 能使荷瘤或感染后机体的免疫应答能力得以提高，其制剂在动物体内 筛选实验中能明显促进体外淋巴细胞培养物的转化作用。因此认为，d 盯是一 种胸腺依赖型t 细胞导向并有巨噬细胞参与的特殊免疫佐剂。其免疫作用特点在 于识别脾及肝脏中抗原的巨噬细胞，促进淋巴细胞活化因子( l a e ) 的产生，释放 各种辅助性t 细胞因子。增强宿主腹腔巨噬细胞吞噬率，恢复或刺激辅助性t 细胞的功能阱捌。 2 2 2 2 抗肿瘤功能 大量实验结果认为l n t 提高了n k 细胞对某些血清因子的反应性，从而刺 激免疫关键细胞并伴有干扰索分泌以达到杀伤肿瘤细胞润的效果 2 3 】。l n t 还可 、if上 卫昶 雾 走雾j 昶 第二章文献综述 以激活补体系统的替代途径，导致巨噬细胞的非特异细胞毒性提高和中性白细胞 对肿瘤组织的浸润。在活化t 细胞等的同时，也活化了能抵抗肿瘤的羟色胺和5 一羟色胺的传递。与抗肿瘤活性关系密切的迟发性过敏反应( d h r ) 也得到恢复和 增强【2 8 2 9 1 。 2 2 2 3 抗感染功能 据报道香菇多糖可用于治疗结核杆菌感染，能使耐药性结核病人痰菌转阴， 病人外周血嗜中性粒细胞吞噬活性增加。香菇多糖还能延长李司忒氏菌感染小鼠 的生存时间，这与其提高巨噬细胞功能有关。香菇多糖对泡状口炎病毒感染引起 的小鼠脑炎有显著的治疗和预防作用，治疗组1 0 0 存活而对照组全部死亡。香 菇多糖对a b e l s o n 病毒、a 2 ( i - 1 2 n 2 ) 病毒、1 2 型腺病毒及流感病毒感染均有抑制 作用，是治疗各种肝炎特别是慢性迁移型肝炎的良好药物【2 7 】。香菇多糖抗病毒作 用与其诱生i f n 和提高n k 细胞活性有关。香菇多糖抗感染的机制与多糖本身的 特性有关。病原体表面的糖蛋白识别正常细胞表面的糖分子并发生粘附作用，是 引起感染的必要前提。体液中游离的糖分子可以与病毒结合起到屏蔽作用，因此 糖分子的于扰也是其抗感染的机制之一。h i v 是1 3 前最难对付的病毒之一。硫 酸化香菇多糖具有显著抗h i v 作用，体外 0 m g l 就完全抑制h 1 v 抗原的表达， 干扰h i v 对m t 4 细胞的侵染，抑制合胞体形成；临床使用能协同叠氮胸苷( a z t ) 更好地抑制h i v 抗原的表达【刈。 2 2 2 4 【n t 的其它作用 l n t 作为香菇中重要的药用成分，它除具有抑制肿瘤作用外，还具有降低 输氨酶、使乙型肝炎表面抗原由阳性转为阴性以及降低服固醇等作用。l n t 能 增加宿主动物脾重，由脾切片可见，脾滤泡发生中心扩大，并出现大量浆细胞， 说明l n t 能促进b 细胞增生并转化为浆细胞【3 0 l 。l n t 具有增强网状内皮系统， 提高识别抗原的功能。它对外周免疫器官起促进作用，相应抑制了中枢免疫器官 作用，达到抗肿瘤、抗感染免疫调节作用。l n t 被称为是免疫学中的外周疗法 ( s c h e m ee f f e r e n t ) i 面应用于抗肿瘤临床上，临床表明：在人体中，l n t 能增加d n a 的合成和外周单核细胞免疫蛋白的产生；在化疗过程中，l n t 与丝裂霉紊、5 一 氟尿嘧啶、环磷酰胺及阿糖胞苷等多种药物合用时，其免疫反应和宿主存活期都 超过单独使用上述药物的效果，表现出显著增效作用。 第二章文献综述 2 3 国内外研究概况 1 9 6 9 年日本千原吴郎首先利用热水从香菇子实体中浸提出6 种胞外l n t 唧， 1 9 7 0 年c h i h a r 和s a s a l d 用热水浸提结合有机溶剂沉淀从香菇中提取到另外4 种 多糖，8 0 年代以来，l n t 的研究更为深入、多元化 3 2 1 。如s c h u l t y 从深层发酵香 菇菌丝体中提取到一种胞内多糖k s 2 ，是一种相对分子质量在( 6 o 9 5 ) 1 0 4 之 间，含a 链的甘露糖苷，并伴有少量肽类( 由丝氨酸、苏氨酸和丙氨酸构成) 的免 疫活性物质。尽管有关l n t 的成分和结构报道甚多，但已明确结构与免疫活性 关系的只有8 葡聚糖物质。该多糖的一级结构具有1 3 - d ( 1 - - - 3 ) 连接的毗喃葡 聚糖主链，在主链中葡萄糖的c 6 位上含有支点( 每5 个d 葡萄糖有2 个支点) ， 其侧链是由b - d - ( 1 6 ) 键和b d ( 1 - - 3 ) 键相连的d 葡萄糖聚合体组成，在 侧链上也含有少数内部b d ( 1 6 ) 键【3 3 】。现己知道：水溶性1 3 - d 葡聚糖为线 状结构，无长分枝。另一些香菇中的多糖物质由d 葡萄糖、d 半乳糖、d 甘露 糖、l _ 5 可拉伯糖、d 木糖所组成，也有来源于深层发酵香菇菌丝体中的a 甘露 糖苷，这可能因提取方法和原料( 包括香菇来源品种及部位) 的不同所致。其化学 结构模型如图2 1 所示： 1 贰唧旧喇卜帮阳r 唧州f 0 哪矿响印睁 p 节簟伊r 牵脚孽 p 下印哥r 币 p u q q pp - r u 辱 图2 - 1 香菇多糖的化学模型 蛋白质、核酸和多( 寡) 糖为最重要的3 种生物大分子。糖类的研究工作和蛋 白质、核酸的研究工作相比，在我国还是一个薄弱环节。现在国际上多糖研究以 1 3 本、美国、德国、加拿大处于领先地位，我国多糖的研究起步较晚，经过一 个相对寂静的时期以后，自8 0 年代各地的研究如雨后春笋般掀起。目前，国内 外己从高等担子菌中筛选到2 0 0 余种有生物活性的多糖物质，我国发现有价值的 真菌多糖有2 8 种。其中化学结构较清楚的1 5 种。国内外研究的主要目标是：一 方面通过对l n t 药理和临床实验的研究进一步寻找活性更高，特别是对肿瘤、 艾滋病更有效的多糖；另一方面进行构效关系的研究，通过对l n t 化学修饰的 第二章文献综述 研究，以寻找更有效的多糖药物。这将不仅对发现新多糖起指导作用，而且对药 物学、分子生物学的理论作出新贡献。 2 4 香菇多糖的提取、分离和纯化的常用方法 2 4 1 多糖分离和纯化的常用方法 由于多糖在底物中的含量较低，且本身的稳定性差，分离纯化难度较大。但 是作为糖类药物，人们对多糖的最终产品质量的要求却很高，必须达到药典的相 关标准，从而导致目前多糖制剂生产成本昂贵。，由此可见，多糖等生物大分子的 分离纯化是糖类药物开发和应用时必不可少的重要环节，而且分离纯化的效能对 于提高糖类药物的质量、拓展产品在应用市场的竞争力是至关重要的。多糖来源 于动物、植物和微生物，它们又可分为胞内多糖和胞外多糖。尽管品种繁多，但 多糖的分离方法还是相当有限。目前，在多糖的分离提纯过程中常用的方法有【3 5 3 9 】： ( 1 ) 分级沉淀法：根据不同多糖在不同浓度的低级醇或酮中具有不同溶解 度的性质，逐次按比例由小到大加入这些醇或酮( 常用是甲醉、乙醇和丙酮) 分级 沉淀。这种方法适用于分离各种在有机溶剂中溶解度相差较大的多糖。 ( 2 ) 盐析法：根据不同多糖在不同盐浓度中具有不同溶解度的性质。加入 不同盐析剂使之逐步析出。常用的盐析剂有氯化钠、氯化钾、硫酸氨等，一般以 硫酸氨最佳。这种方法实质上是分级沉淀法的一种。 ( 3 ) 金属络合物法：根据不同多糖能与各种铜、钡、钙和铅离子形成络合 物而沉淀的性质，通过添加不同类型和不同浓度的络合剂将不同的多糖进行分 离。常用的络合剂有菲林溶液、氯化铜、氢氧化钡和醋酸铅等。 ( 4 ) 纤维素柱层析：将多糖混合物全部沉淀于隋性多孔的纤维素柱上面， 然后用不同浓度乙醇水溶液洗脱，在洗脱过程中，各种多糖在柱上进行无数次的 溶解和沉淀过程，最终将各种多糖分离出来。这种方法实质上与分级沉淀法相反， 可称为“分级溶解法”，其理论塔板数较高，所以，流出液的纯度较高。 ( 5 ) 季胺盐沉淀法：根据季胺盐能与酸性多糖成盐形成水不溶性化合物的 特性，以分离酸性及中性多糖。常用的季胺盐是十六烷基三甲基胺的溴化物 ( c t a b ) 及其碱( c t a o h ) 和十六烷基吡啶( c p c ) 。一般而言，酸性强或分子量大 的酸性多糖首先沉淀出来，因此，通过控制季胺盐的浓度能分离各种不同的酸性 多糖，再根据所形成的沉淀在盐溶液、酸溶液和有机溶剂中的溶解度不同，使不 同的多糖在相应的溶液中游离出来。 第二章文献综述 ( 6 ) 纤维素阴离子交换剂柱层析：常用的交换剂为d e a l 一纤维素和 e c t e o l - 纤维素，此法适合于分离各种酸性、中性多糖和粘多糖。在p h 6 时， 酸性多糖能吸附于交换剂，中性多糖不吸附，然后，用p h 相同但离子强度不同 的缓冲液将酸性强弱不同的酸性多糖分别洗出。 ( 7 ) 凝胶柱层析：通过多糖分子大小和形状的不同而达到分离的目的。常 用) 的凝胶有葡聚糖凝胶( s e p h a d a x ) 及琼脂糖凝胶( s e p h a r o s e ) ，展层剂为各种浓 度的盐溶液及缓冲溶液。凝胶柱层析不适宜粘多糖的分离，且凝胶柱的装填好坏 对分离效果及分离所需时间有很大的影响。 ( 8 ) 制备性区域电泳：不同的多糖在电场的作用下按其分子大小、形状及 其所带电荷的不同而达到分离，载体通常是玻璃粉。该方法不适宜用于中性多糖 的分离，且产量过低，目前尚处于探索阶段。 2 4 2 香菇多糖的提取、分离和纯化的常用方法 多糖的种类繁多，不同种多糖其提取分离方法各不相同。动物中所含多糖多 是酸性多糖，常与蛋白质结合在一起，因此常用碱溶液提取法、中性盐溶液提取 法和蛋白酶水解法；对植物根、茎、叶、花、果及种子中多糖，含脂高的应先脱 脂，含色素的需进行脱色处理；各类真菌中所含多糖类化合物，其提取分离方法 通常用水提酵沉，除去小分子杂质和蛋白质( s e v a g e 法、三氟三氯乙烷法) ，即得 多糖。对于香菇多糖，一般较为代表性的方法如下： ( 1 ) 取香菇子实体放入烘箱内，调温1 0 0 1 0 5 烘干，烘干后用家用粉碎 机粉碎，粉碎后过6 0 目筛。取1 0 0 9 香菇粉加水3 0 0 0 m 1 小火煮2 h ，2 5 0 0 r p m l o m i a 离心收集上清液，沉淀的再煮两次。合并上清液约7 0 0 0 m i 用于下项测定，其余 的放入9 0 烘箱中蒸发去1 5 的水分。冷却后，加入三倍体积预冷( 4 ) 的9 5 乙醇醇析，在冰箱中醇析2 4 h 。用离心机离心除去乙醇，沉淀依次加分析纯的无 水乙醇、丙酮各洗涤5 次。 ( 2 ) 用电动捣碎器，捣碎香菇子实体，加入蒸馏水在9 0 1 0 0 加热回 流8 h ，反复两次提取，离心，取上清液，加热浓缩后，加氯仿一正丁醇，在n 2 8 2 型台式恒温振荡器上，以1 9 0 r m i n 振摇2 0 m i n 去蛋白，后经自来水、无离子水 流动透析，去小分子物质，再用7 2 乙醇沉淀多糖，经离心取多糖沉淀，用无 水乙醇进一步脱水，在真空条件下，7 0 c 烘干，得到水提香菇多糖干品。 经水提后的香菇于实体残渣，用1 m o l 1 的n a o h 提取香菇多糖，在抽提过 程中，充氮防氧化。提取后，调p h 至中性，用水流动透析，此时出现的沉淀为 碱提非水溶性多糖，上清波为碱提水溶性多糖。这两种样品，分别经蛋白去乙醇 沉淀，烘干得多糖样品。 第二章文献综述 ( 3 ) 以香菇为原料，经1 0 5 恒温干燥箱烘干，用粉碎机粉碎，能过6 0 目筛，称取0 5 k g 香菇粗粉。用热水浸提，趁热抽滤。滤液用离心管装入定量的 多糖抽提物，并加人无水乙醇、调解乙醇浓度，放置离心3 0 分钟过滤、沉淀、 烘干、称量，得到粗多糖；粗多糖中蛋白质采用萃取法分离。 ( 4 ) 香菇经烘干后粉碎，过4 0 目筛，以水提浸，过滤，浓缩浸提液，接着 用s e v a g 试剂去除游离蛋白，再用乙醇处理，沉淀物经洗涤干燥后，得到香菇多 糖粗品，并测定其纯度。对水浸提的温度、时间、加水量进行单因素摸索以确定 各因素的水平，用正交实验优选出最佳浸提工艺条件。减压浓缩后对去除了游离 蛋白的样液：s e v a g 试剂( 体积比) 、氯仿：正丁醇( 体积比) 的比值进行单因素摸索 以确定各因素水平，再用正交实验定出最佳比例值。以沉淀物的多少来确定乙醇 的最佳浓度。 近年来有报道用链霉菌蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶及胰蛋白酶等处理多 糖粗品，经透析后能得到基本无蛋白质及小分子杂质的l n t 。考虑到香菇中还 有其它生理活性成分( 如腺膘吟、酪氨破氧化酶和维生素d 等) ，故制订提取方法 时，应明确最终产品的定式及提取目的。 以现有的技术手段可以得到纯度较高的多糖类物质，但想较大规模地生产出 高品质的多糖类物质，即实现工业化难度仍然很大 4 2 j 。主要原因是：原料体内的 含量较低，而需要耗用大量化学试剂；多糖粗品中的成分复杂且其所含的杂质与 多糖的理化性质相近；多糖本身化学性质不够稳定，遇热易变性、遇酸易降解。 使得分离与浓缩条件较为苛刻；传统分离提纯过程的连续性较差，整个处理流程 过长，有可能因此而增大活性物质的损耗。 2 5 超滤法纯化香菇多糖 作为下游加工过程的关键，分离纯化技术面临越来越高的要求：既要满足产 品的规格，又要达到较大的生产规模。近年来，由于超滤技术的日趋成熟，多糖 分离中也越来越多地采用超滤技术，这是因为虽然多糖水溶液粘度大且不稳定， 但是其水溶液大多是属于胶体溶液，各组分的分子量差别较大，而组分之间理化 性质却很相似。此外，超滤是一种非热分离技术且分离效率高，能较好地保持多 糖的活性。国外常利用超滤技术对多糖样品进行脱盐、分级、浓缩，而国内在 制备中药口服液、提取中药的有效成分及改善中药浸膏方面均有采用超滤技术的 报道【4 1 1 。 第二章文献综述 2 5 1 膜分离技术简介 膜分离技术是借助于人工合成的具有选择透过性的膜，利用压力差、温度差、 电位差作为推动力，基于物质能否透过膜或透过膜的速率不同，使流体中各成分 得以分离、分级或富集的技术1 4 3 】。从广义上讲，膜可以是固相的也可以是液相的 或气相的，但多数情况下用的是固相膜。根据推动力以及截留物质尺寸的大小， 膜分离技术可分为电渗析、微滤、超滤和纳滤等。膜分离现象在2 0 0 年前便己被 人类所发现。1 8 6 5 年f i c k 首次合成了硝基纤维素膜，1 9 2 7 年s a r t o r i u s 公司生产 出商业膜，1 9 6 0 年l o e b 和s o u r i r a j a n 在制备醋酸纤维膜方面取得了重大突破， 使膜分离技术进入了工业化阶段。在1 9 7 0 年左右，错流膜过滤模型的产业化使 得膜分离技术的应用范围和潜力得到迅速发展1 4 4 。经过近3 0 年的发展，目前， 膜技术中实现工业化的过程有：透析，电渗析( e d ) 、微滤o v t f ) 、超滤( u f ) ，反渗 透( r o ) ，渗透汽化) 等。超滤和微滤是膜分离技术中应用最成熟的一种。膜分 离技术是新兴的分离技术，并被世界公认为2 0 世纪末到2 1 世纪中期最有发展前 途的新技术之一。当前，膜分离技术己广泛应用于各工业领域，如汽车、纺织食 品，生物等工业中，而且，有关膜的制备和新应用方面的发明还在不断出现膜分 离技术与蒸馏、结晶、萃取、吸收、离子交换等技术在某些领域中可联合使用， 已作为一种单元操作日益受到人们的重视。目前，膜分离技术在电子工业、食品 工业、医药工业、环境保护和生物工程等领域得到广泛的应用【4 5 】。 2 5 2 膜分离技术的优越性 膜分离技术作为新兴的分离技术，与传统的分离技术相比，具有以下特点【4 6 】： ( 1 ) 分离精度高、选择性强，可根据不同生产需要选择相应的膜过程而得到 不同的产品，产品的品味高，品种多。 ( 2 ) 可在常温下操作，不会因高温或化学因素而破坏有用成分，可较好地保 持物料的原有有效成分及其活性，产品质量高。 ( 3 ) 节约能源，降低成本。 ( 4 ) 可提高资源利用率，减少污染，有利于保护环境。实际上，膜技术广泛 应用于废水处理和海水淡化，是环境工业中的一项重要技术。 ( 5 ) 膜分离用于食品工业中，不仅可以除掉影响食品质量的一些组分，而且 还可以更多地保留对人体有益的成分，达到理想的分离目的。大力推进膜分离技 术在食品中的应用，是食品工业发展的重要途径之一。 ( 6 ) 膜分离技术处理灵活，规模可大可小，可以连续操作也可以间歇进行， 膜组件可单独使用也可联合使用，工艺简单，操作简便，易于实现自动化操作。 第二章文献综述 2 5 3 膜分离原理 传统过滤( 又称为深层过滤) 是以垂直流动的模式进行的，所有的料液都垂 直经过过滤介质，最后滤液流出，被截留的粒子留在介质上。在这样的模式中， 料液和滤液经过相同的渠道。如图2 2 中a 所示。超滤则采用了错流( 又称十字 流) 的模式。在这种过滤模式中，大部分料液在膜表面流动，带起了不能透过膜 的粒子。这种方法由于料液作平行流动时所形成的经常、自动的清洗作用，使过 滤阻力大为降低，同时避免膜被污染。如图2 2 中b 所示。 。t ：8t 8 ” 抄二。移：t 。8 。” i 磊f 】 辱，体 l ：兰2l 纷吩 a 深层过滤b 错流过滤 2 - 2 过滤的两种操作方法 f i g2 2t w oo p e r a t i n gm e t h o d so f f i l t r a t i o n 超滤过程一般被看成是简单的筛孔分离过程，即在一定的压力下，膜孔允许 溶剂和小分子物质通过，而大分子物质即溶质被截留。另外，在一定程度上，膜 孔的特性及膜和分子之间的范得华引力也起了一定的作用【4 7 】。 2 5 4 膜污染及其解决方法h 8 】 膜分离技术，尤其是超滤膜分离技术，已被国际公认为2 0 世纪末至2 1 世纪 最有发展前途的一项重大生产技术。且前，在制药、生化、水处理等领域正得到 日益广泛应用，各种有关膜分离工艺研究的文章也频频见诸于期刊。在超滤膜分 离的操作中，膜的污染是限制其应用的一个重要因素，主要是由浓差极化和吸附 等所引起。膜污染是指料液中的某些组分在膜表面或膜孔中沉积导致膜渗透流率 下降的现象。组分在膜表面沉积形成的污染层将产生额外的阻力，该阻力可能远 第二章文献综述 大于膜本身的阻力而使渗透流率与膜本身的渗透性无关；组分在膜孔中沉积，将 造成膜孔减小甚至堵塞，实际上减小了膜的有效面积。总之，浓差极化和膜污染 都将使膜渗透流率下降，导致超滤和微滤过程无法进行较长时间的稳定操作，从 而使该技术在化工、生化过程和食品加工等极有应用价值的领域内不能充分发挥 作用。对它的控制措施有：( 1 ) 预先过滤除去料液中的大颗粒；( 2 ) 增加流速， 减薄边界层厚度，提高传质系数；( 3 ) 选择适当的操作压力，避免增加沉淀层的 厚度和密度；( 4 ) 制膜过程中对膜进行修饰，使其具有抗污染性；( 5 ) 定期对膜