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突触传递调节的突触前机制研究 摘要 通过突触囊泡与突触前膜融合介导的神经递质释放是神经元信 息传递的重要环节，受到一系列突触前蛋白和相关分子的协同作用 和精密调节。包括s y n t a x i n ，s n a p 2 5 和v a m p s y n a p t o b r e v i n 在内的 s n a r e s 蛋白是介导钙离子依赖的囊泡膜与突触膜融合的核心分子复 合体。s n a p i n 和s y n t a p h i l i n 是由酵母双杂交技术筛选出的，分别与 s n a p 一2 5 矛d s y n t a x i n 相互作用的蛋白。近年研究表明，它们均在神经元 功能中发挥重要作用。s n a p i n 通过加强钙离子感受蛋白s y n a p t o t a g m i n 1 与s n a r e 复合体间的相互作用，易化突触囊泡的融合，对于突触传 递起正向调节作用。而s y n t a p h i l i n ( s n p h ) 则对轴突线粒体的制动 起重要作用，并影响线粒体的分布。在此基础上，我们主要采用双 膜片钳全细胞记录技术，探索- j s n a p i n 基因敲除小鼠培养的大脑皮层 神经元以及s n p h 基因敲除小鼠培养的海马神经元的突触传递特性。 研究表明，s n a p i n 基因缺失导致基因丰度依赖性微突触后电流 ( m e p s c ) 频率下降，兴奋性突触后电流( e p s c ) 幅度下降，及 e p s c 时程延长；提示神经递质释放概率下降及突触前囊泡融合的不 同步性。在高频刺激下，s n a p i n 基因缺失神经元间的突触传递持续性 和精确性受到严重影响。提高细胞外液的钙离子浓度在增z i i j e p s c 幅 度的基础上，不能改变e p s c 的时程；然而特异过量表达s n a p i n 基因 4 在突触前神经元，不但使杂合子( + - ) 神经元的e p s c 恢复野生型 ( + + ) 的时程特性，而且表现出因过度增强的同步性导致的e p s c 时 程加速。这一现象提示了s n a p i n 在调节突触囊泡快速同步融合中的独 特作用，并对理解一系y l j s n a p i n 相关疾病的病理机制提供了研究线 索。 在s n p h 基因敲除小鼠的海马神经元中，约三分之一的轴突线粒体 由制动态转化为活动态，且轴突线粒体密度也显著下降。但是神经 元基础的突触传递并没有受至：l j s n p h 缺失影响。高频刺激下的突触易化 ( f a c i l i t a t i o n ) 在s n p h 纯合子( ) 神经元中显著增加，并可以被钙 离子敖合剂e g t a 阻断。这一现象提示轴突末梢钙离子缓释能力的下 降，并被进一步神经末梢钙离子成像实验证实。此外，我们发现突 触传递的稳定性也受至：l j s n p h 基因的调节。在s n p h ( ) 神经元中， e p s c 幅度的变异性( v a r i a b i l i t y ) 显著增加。过量表达s n p h 基因到突 触前神经元，不但消除了突触易化增强作用，而且降低了突触传递 的变异性，说明s n p h 及其对轴突线粒体的活动及分布影响，对调节 突触传递及可塑性具有重要意义。 关键词1 突触传递，神经递质释放，囊泡融合同步性，e p s c ，线粒 体，突触易化 5 p r e s y n a p t i cm e c h a n i s m sf o r m o d i f i c a t i o no fs y n a p t i c t r a n s m i s s i o n a b s t r a c t s y n a p t i cv e s i c l ed o c k i n g ，p r i m i n g a n df u s i o na r ek e yp r o c e s s e so f n e u r o n a lt r a n s m i s s i o n ，a n da r ef i n e l yr e g u l a t e db yac o n c e r to fp r e s y n a p t i c m s i o nm a c h i n c r i e s s n a r ep r o t e i n s ，w h i c hc o n s i s to fs y n t a x i n ，s n a p 2 5 a n dv a m p s y n a p t o b r e v i n ，h a v eb e e nc o n s i d e r e d a st h em a i nm o l e c u l a r p l a y e rt h a tm e d i a t ec a l c i u m d e p e d e n tf u s i o n s n a p i na n ds y n t a p h i l i na r e t w o p r o t e i n sf i r s ti d e n t i f i e db yy e a s t - t w oh y b r i ds c r e e n i n g ，u s i n gs n a p 2 5a n d s y n t a x i na s t h e i r b a i t sr e s p e c t i v e l y r e c e n ts t u d i e sh a v es h o w nt h a tb o t h p r o t e i n sp l a yc r i t i c a lr o l e si nr e g u l a t i o no fn e u r o n a lf u n c t i o n w h i l es n a p i n f a c i l i t a t e s t h es t r u c t u r a l c o u p l i n g b e t w e e n t h ec a l c i u ms e n s o r ， s y n a p t o t a g m i n 1 ，a n d t h es n a r ec o m p l e xd u r i n gn e u r o s e c r e t i o n ， s y n t a p h i l i n ( s n p h ) d o c k sa x o n a lm i t o c h o n d r i aa n dt h e r e b yc o n t r o l s t h e i r m o t i l i t ya n dd i s t r i b u t i o n i nt h ep r e s e n ts t u d y ，b yu s i n gd u a lp a t c h _ c l a m p w h o l e c e l lr e c o r d i n gf r o mc u l t u r e dc e i l s ，w ee x p l o r e dt h ep h e n o t y p e s o f n e u r o n a lt r a n s m i s s i o nf r o mb o t hs n a p i nk n o c k o u tc o r t i c a ln e u r o n sa n ds n p h k n o c k o u th i p p o c a m p a ln e u r o n s 6 o u rs t u d ys h o w e dt h a ts n a p i nd e f i c i e n c yr e s u l t e di nag e n ed o s e d e p e n d e n tr e d u c t i o ni n t h e f r e q u e n c yo fm i n i a t u r es y n a p t i cc u r r e n t s ，a s m a l l e rs i z ea n dap r o l o n g e dt i m ec o u r s eo fe x c i t a t o r yp o s t s y n a p t i cc u r r e n t s ( e p s c s ) ，r e f l e c t i n gt h e “d e s y n c h r o n i z e d ”f u s i o nf r o mas m a l l e rr e l e a s e r e a d yv e s i c l ep o o lw i t h i nt e n so fm i l l i s e c o n d t h e s ed e f e c t sh a dap r o f o u n d e f f e c to ns u s t a i n e dn e u r o n a lt r a n s m i s s i o n ，b yi m p a i r i n gb o t hi t sp r e c i s i o n a n de f f i c a c y e l e v a t i o no ft h ec a l c i u mc o n c e n t r a t i o no n l yi n c r e a s e dt h es i z e a n ds m o o t h e dt h es h a p eo fe p s c si ns n a p i nd e f i c e n tn e u r o n s ，l e a v i n gt h e i r k i n e t i c su n a f f e c t e d h o w e v e r ，t r a n s i e n to v e r e x p r e s s i o no fs n a p i nw a n s g e n e i n t ot h ep r e s y n a p t i ch e t e r o z y g o u sn e u r o n se f f e c t i v e l ya c c e l e r a t e dt h ee p s c k i n e t i c s ，e x h i b i t i n gn o to n l yar e s c u e d ，b u ta l s o ab o o s t e ds y n c h r o n yo f s y n a p t i cv e s i c l ef u s i o nu p o nc a l c i u mi n f l u x o u rr e s u l t sr e v e a l e dac r i t i c a l r o l eo fs n a p i ni nt h eg e n e d o s ed e p e n d e n tr e g u l a t i o no ft h es y n c h r o n i c i t yo f s y n a p t i cv e s i c l ef u s i o nd u r i n gf a s tr e l e a s e ，a n dm i g h tp r o v i d ev a l u a b l e p h y s i o l o g i c a li n s i g h t so n av a r i e t yo f s n a p i n r e l a t e dd i s e a s e s d e l e t i o no ft h em o u s es n p hg e n er e s u l t e di nt h em o b i l i z a t i o no fa b o u t 1 3o fs t a t i o n a r ym i t o c h o n d r i aa n dt h ed e c r e a s e dd e n s i t i e so ft o t a l m i t o c h o n d r i ai n a x o n s h o w e v e r , i td i d n o ta f f e c tb a s a l s y n a p t i c t r a n s m i s s i o n e n h a n c e df a c i l i t a t i o nw a sc o n s t a n t l yo b s e r v e du n d e ri n t e n s e n e u r o n a la c t i v i t ya td i f f e r e n tf r e q u e n c i e s ，w h i c hc o u l db eb l o c k e db yt h e c a l c i u mc h e l a t o r ，e g t a ，s u g g e s t i n ga ni m p a i r e dc a l c i u mb u f f e r i n gc a p a c i t y i ns n p hd e f i c i e n tn e r v et e r m i n a l s i ns u p p o r to ft h i s ，c a l c i u mi m a g i n go f s i n g l eb o u t o n sf r o mc u l t u r e dh i p p o c a m p a ln e u r o n sa l s or e v e a l e dab u i l d u p o fc a l c i u ms i g n a ld u r i n gp r o l o n g e ds t i m u l a t i o ni nt h es n p hm u t a n tn e u r o n s m o r e o v e r ，s y n a p t i cv a r i a b i l i t yw a sa l s os i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e di nm u t a n tv s w i l d - t y p en e u r o n s ，r e g a r d l e s s o ft h e p r e s y n a p t i cf i r i n g r a t e t h e s e 7 p h e n o t y p e sc o u l db ef u l l yr e s c u e db yr e i n t r o d u c i n gt h es n p hg e n ei n t ot h e m u t a n tp r e s y n a p t i cn e u r o n t h e s ef i n d i n g s h i g h l i g h t a n i n t e r e s t i n g c o r r e l a t i o nb e t w e e nc o m p l e xa x o n a lm i t o c h o n d r i a lm o t i l i t ya n ds y n a p t i c p l a s t i c i t y k e yw o r d s ： s y a n p t i ct r a n s m i s s i o n ， n e u r o t r a n s m i t t e r r e l e a s e ， s y n c h r o n i z a t i o no fv e s i c l ef u s i o n ，e p s c ，m i t o c h o n d r i a ，s y n a p t i cf a c i l i t a t i o n 8 上海交通大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下， 独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外， 本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。 对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式 标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名： 日期：纠年f 月c 7 日 2 、朝诎、 上海交通大学 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规 定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电 子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权上海交通大学可以将本学 位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影 印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密口，在一年解密后适用本授权书。 本学位论文属于 不保密回。 ( 请在以上方框内打“”) 学位论文作者签名矾 指导教师签名：面钮戎 日期：b q 睁溯l 气日 日期：纱豸年r 月i 1 日 3 第一部分s n a p i n 对突触囊泡融合同步性的促进作用 刖罱 在生理状态下，神经元的树突和胞体接受无数神经末梢的信号输入。大脑的信 息编码很大程度上取决于局部兴奋性输入在不同时间和空间的整合，这一综合膜电 信号进而影响神经元信息以动作电位的形式输出【1 1 。因此，兴奋性动作电流 ( e p s c ) 的幅度( a m p l i t u d e ) 和时程( t i m ec o u r s e ) 对调节突触传递的精确性具 有重要意义【2 3 】。突触后反应除受突触后膜受体和离子通道的影响外，还可以接受 突触前诸多因素调节。突触囊泡融合就是一个重要的调节点。部分搭靠 ( d o c k i n g ) 于神经末梢突触前膜活性区的囊泡在一系列辅助蛋白( p r i m i n g f a c t o r s ) 的作用下，进入“预融合状态，并在接受钙离子的激发时，迅速与突触 前膜融合，释放神经递质。这些进入“预融合”状态的待释放囊泡( r e a d i l y r e l e a s a b l ev e s i c l e ) 的数量是决定神经递质释放概率( r e l e a s ep r o b a b i l i t y ) 及突触反 应( e p s c ) 大小的重要因素【4 l 。虽然e p s c 的时程很大程度上取决于突触后膜的通 道组成，a m p a 受体介导的e p s c 时程则主要受突触前囊泡融合的同步性影响【5 j 。 突触囊泡的融合是突触前蛋白顺序相互作用和精确调节的结果。很多研究表 明，细胞膜融合需要克服巨大的能量势差，介导膜融合过程的蛋白分子间的紧密空 间结合是克服这一能量差的重要途径。早在1 9 9 4 年，r o t h m a n 等就提出囊泡膜融合 的s n a r e 模式( 又称“拉链”模式) ：位于突触前膜的t - s n a r e s ，包括s y n a t x i n 和s n a p 2 5 ( 两股0 【螺旋结构) ，与位于囊泡膜上的v s n a r e ， v a m p s y n a p t o b r e v i n ，在感受钙离子内流时形成稳定的四股链异三聚体复合物，是 介导膜融合的主要分子机器【6 7 】。在此基础上，研究亦发现了一系列相关突触前蛋 白，如m u n c 1 8 ( 8 1 ，m u n c1 3 1 9 】，及r i m l c t 1 0 ，1 1 】等参与了囊泡融合前的准备过程。 这些蛋白分子主要通过影响递质释放概率，调节突触反应的大小( 或e p s c 幅度) 及短时程可塑性；而对e p s c 时程的调节机制，我们还知之甚少。原因之一可能 是，e p s c 的时程更多决定于囊泡融合模式，而在极短的时间内完成的膜融合【l 2 1 ， 给分子机理的研究带来很多技术上的困难。一个重要的着手点是对膜融合及融合前 毫秒内发生的钙离子感受过程做进一步研究，从而理解神经递质释放( 或突触囊泡 融合) 同步化的机制【1 3 】。 位于突触囊泡膜的蛋s y n a p t o t a g m i n ( s y t ) 是目前较为公认的主要内流钙离子 感受器( c a l c i u ms e n s o r ) 。s y t 的构象变化对保证突触囊泡膜和突触前膜在几百微 秒内完成的融合起到重要作用。在分子结构上，s y t 有两个c 2 结构域( c 2 a 和 c 2 b ) 和钙离子结合。有研究表明，它对钙离子的敏感性主要受自身磷酸化及去磷 酸化的调节【1 4 】。同时，这两个结构域也和s n a r e 蛋白及膜磷脂相互作用，在脂质 膜融合过程中受到精细调控。s y t 有近1 0 种异构体，分别命名为s y t 1 ，s y t - 2 ，s 弘1 0 。它们在不同的组织和细胞内有不同的定位，并且在促使囊泡融合中 的作用也各异。s y t - 1 是现今比较肯定的，介导钙离子依赖的神经递质同步释放 ( s y n c h r o n o u sr e l e a s e ) 的重要分子。在大多数兴奋性突触中，短暂而局限性的钙 离子内流，是激活s y t 1 的前提。继而发生的s y t 1 与s n a r e 复合体的结合是使处于 囊泡准备期半稳定状态的s n a r e 复合体进一步聚合的重要促动力【1 5 t1 6 , 1 7 1 。近年 研究表明，s y t 2 和s y t 9 可能也参与了递质快速同步释放的过程【l8 1 ，对于其他s y t 异 构体的功能至今尚无定论。有人认为它们在调节囊泡融合孔动力学中发挥了一定的 作用，并可能介导了递质不同步释放( a s y n c h r o n o u sr e l e a s e ) 的过程 1 9 1 。 s n a r e 蛋白及其与s y t 间的正确紧密空间组合也是保证递质快速同步释放的重 要条件。有研究表明，突变s y n a p t o b r e v i n 分子的个别氨基酸，使得s n a r e 蛋白螺 旋内的物理距离增加后，显著延长了刺激胞吐的耦连时间，使囊泡融合呈不同程 度的延缓 2 0 1 。此外，氨基酸突变如使s y t 1 与s n a r e 间的结合距离增加，融合孔开 放的动态平衡遭到破坏，同样影响突触后反应的时程【2 。近年来对c o m p l e x i n 蛋白 的研究提示，它对s n a r e 介导的囊泡融合起可复性钳制作用。融合前，c o m p l e x i n 与处于半聚合态的s n a r e 复合体结合，阻止s y t 1 参与的进一步螺旋；在受钙离子 内流触发下，活化的s y t 1 竞争性的与s n a r e 结合，并“踢除“c o m p l e x i n 的钳制， 促使细胞膜的融合【2 2 ，2 3 ，2 4 1 。不论是敲除s y t - 1 基因或是导n c o m p l e x i n 基因，均抑制 1 2 了快速同步释放的突触电流。虽然我们已经对这一系列蛋白对囊泡融合的作用有了 相当的认识，但是保证或协助突触囊泡完成快速同步融合的机理至今尚不清楚。 s n a p i n 是首次由酵母双杂交技术筛选出的，与s n a p 2 5 相互作用的蛋白【2 5 1 。它 的羧基末端形成蛋白质相互作用的c o i l e d c o i l 结构，是与s n a p - 2 5 结合的位点。体外 蛋白结合实验表明，重组的s n a p i n 可以通过和s n a p 2 5 作用，增：j os y t 1 和s n a r e 复 合体间的相互作用，且此作用受p k a 磷酸化的调节【2 6 1 。之后的免疫共沉淀实验亦 验证了这一结果：在s n a p i n 敲除的小鼠大脑匀桨中，s y t - l 和s n a r e 形成的复合物 的量显著减少。用碳纤电极记录嗜铬细胞的囊泡释放发现，s n a p i n 缺失导致待释放 囊泡池稳定性下降，且显著减小快速释放相电流【2 7 】。为了进一步理解s n a p m 在中枢 神经元递质释放中的调节作用，尤其是它与s n a r e 及s y a n p t o t a g m i n 间协调促进囊 泡融合中的贡献，我们主要采用双膜片钳全细胞记录技术，结合部分生化及形态学 方法，对小鼠大脑皮层细胞间的突触传递进行了较为系统的研究。结果提示， s n a p i n 是神经末梢重要的突触囊泡融合“同步因子”，它的存在不但加强了突触囊 泡融合前在生化水平的“准备 过程，而且对其准备程度的均一性起决定性作用。 因而，s n a p i n 是保证突触囊泡同步快速融合的重要因素，对突触传递的效能和准确 性具深远影响。 材料和方法 一、 基因敲除鼠的交配和鉴定 由于册印觑( - ) 小鼠在出生后是致死性的，我们通过杂合子( 十- ) 鼠定期 隔夜交配，估算孕期的方法，获得孕1 8 1 9 天的胎鼠，并取尾尖做基因型鉴定。为 了保证基因型稳定性，我们每2 3 月将( 十) 鼠与野生型( + + ) 鼠( c 5 7 b l 6 ) 反交，获得新生杂合子小鼠，养至9 1 0 周时用于交配。 1 杂合子鼠定期交配 1 3 杂合子雄鼠与雌鼠合笼一夜； 第二天早上将其分笼并给雌鼠验栓，将有阴栓的雌鼠标记见栓日期； 两周后观察见栓雌鼠是否怀孕； 第1 8 1 9 天取孕鼠麻醉并取胎鼠。 2 p c r 反应基因型鉴定。 材料： t a k a r al at a q 酶及缓冲体系( c a tn u m b e rr r 0 0 2 m ) 琼脂糖粉( g i b c o ) 引物序列 w i l d - t y p e m u t a n t5 5 ，c a ct t ag a tg g ct c ag c g g t t - 3 w i l d t y p e3 5 ，c g tg a ga g tc g ag c t g c tg c a - 3 m u t a n t3 5 ，a c ga g ac t ag t ga g a c g tg c t 一3 溶液配方 t a e 缓冲液： 5 0 xt a eb u f f e r ( t r i s - a c e t a t e e d t a ) t r i sb a s e ，2 4 2 9 a c e t i ca c i d ，5 7 1m l 0 5m e d t a ，1 0 0r n l d dh 2 0 ，加至总体积1 l ，调节p h 值至8 5 。 组织溶解液： p r o t e i n a s ek ，4 0m g d i r e c t p c r , 2 0m l ( v i a g e n b i o t e c hc a t 群10 2 - t ) 方法： 一剪尾约0 3c m 置e p 管中，并给每个小管编号 一置5 6 。c 孵育箱过夜( 或待其全部溶解) 一于8 5o c 孵育4 5 分钟至1 小时 一以1 3 0 0 0r p m 离心一分钟 一取上清组织液备用 一冰上融化p c r 反应1 0 xb u f f e r 和2 5m md n t p 一按组织样品号标记每个p c r 管， 一每个样品分别准备两个反应管：分别用于w i l d t y p e 和m u t a n t 弓 物 一取1 l 上清组织液作p c r 反应模板，样品号与管号对应 一准备反应混合液( w i l d t y p e 与m u t a n t 各一管) 每个样品包括：1 0 xb u f f e r2 5 止 d n t p 4 此 h 2 01 5 此 5 引物1 旺 3 引物1 江( w i l d t y p e 与m u t a n t 分别对应) l at a q 酶 0 5 此 一混匀反应混合液，快速离心后，以每管2 4 旺平均分配 一按一下设置的p c r 反应程序扩增： 9 4o c6m i n 9 4 。c 3 嘶 1 6 8o c1m i n 3 0c y c l e s 7 2 。clm i nj 7 2 。c1 0m i n 4o c f o r e v e r 一准备l 琼脂糖凝胶 称取0 6g 干琼脂糖粉，溶解在6 0m lt a e 缓冲液中，在微波 炉中以高火加热一分钟煮化，倒入小电泳槽中。加入0 6m l 1 5 e b ，并用梳子赶均匀，插上两排梳子，静置至完全冷却，拔 去梳子。 一待p c r 反应结束，每管加2 吐电泳上样缓冲液 一准备5 0 0b p 分子量m a r k e r ：1m l 分子量m a r k e r 原液 2 此电泳上样缓冲液 2 0 此h 2 0 一上样，以1 2 0v 电泳2 0 分钟 一紫外灯下检测d n a 条带，并拍照记录 w i l d t y p e 弓l 物具s n a p i n 基因特异，而n m t a n t 引物是突变后n e o 基因特异 性的。所以，野生型小鼠只有w i l d t y p e 弓l 物反应阳性的条带，纯合子小鼠只有 m u t a n t ；j 物反应阳性的条带，而杂合子小鼠则两对引物反应均为阳性。 二、 小鼠大脑皮层神经元原代培养 1 仪器和材料 e 1 8 1 9 杂合子孕鼠 恒温c 0 2 培养箱( t h e r m o f o r m as e r i e s1 1w a t e rj a c k e t e d ) 解剖镜( 1 0 目镜) 3 5n l m 细胞培养皿 1 2r l l m 细胞培养盖片( c o r o l i n as c i e n c ea n dm a t h ) 解剖器械 5 号细尖组织剪两只( d u m o s t a r ) 5 号细尖嘴弯镊子两只( d u m o s t a r ! | 5 4 5 ) 微型手术刀( # 1 0 0 9 5 1 2 ) 大小手术剪各一 大中号弯镊子各一( f i n es c i e n c et o o l s ) ( 所有器械均在7 0 酒精中浸泡约3 0 分钟) 溶液： 1 6 神经元基础培养液 解剖液 p a p a i n 消化液 1 0 ：1 0 缓冲液 1 ：1 缓冲液 包被液 2 溶液配方( 所有药品未经说明均来f l s i g m a 公司) ： 神经元基础培养液 配方a ：n e u r o b a s a l ( g i b c o ) b 2 71 ：5 0 ( g i b c o ) g l u t a m a x1 ：5 0 0 ( g i b c o ) f e t a lb o v i n es e r u m1 ：15 ( g i b c o ) i n s u l i n2 5 m g m l ( s i g m a ) ；( 10 0 r a gi n4m l2 0m mh c d 配方b ：n e u r o b a s a l ( g i b c o ) b 2 71 ：5 0r g i b c o ) 解剖液 5 0 0m lh a n k sw i t h o u tc a 2 + 5m l1 mh e p e s ( f i n a l1 0m m ) ( g i b c o1 5 3 6 0 0 8 0 ) 5m lp e n s t r e p ( g i b c o1 5 1 4 0 - 1 2 2 ) d n a s e 溶液 用5 0 0i l l 含钙的h a n k s 溶液( g i b c o ) 溶解每d n a s e 末 ( w o r t h i n g t o n ，l k 0 0 3 17 2 ) 。 p a p a i n 消化液 用5m l 含钙的h a n k ，s 溶液( g i b c o ) 溶解每瓶p a p a i n 粉末 ( w o r t h i n g t o n ，3 17 6 ) ，j n a , 2 5 0 此d n a s e 溶液。过滤。 1 0 ：1 0 缓冲液 称取1 0 0m gt r y p s i ni n h i b i t o r 和1 0 0m gb s a ( s i g m a ) ，以1 0m l 含钙的 h a n k s 溶液( g i b c o ) 于3 7 。c 培养箱溶解。过滤。 1 ：l 缓冲液 6 0 0 此o v o m u c o i di n h i b i t o ra l b u m i n ( w o r t h i n g t o n318 2 ) 2 5 0 此d n a s e 4 3m l 含钙的h a n k s 溶液 过滤。 包被液 多聚一d 一赖氨酸( p o l y d l y s i n e ，p d l ) 以终浓度1 0 0 n g m l 溶于水，并 过滤。( s i g m aa l d r i c h ，c a t 撑p - 0 8 9 9 ) 3 实验方法 准备 一细胞培养盖片用超声在二甲苯溶液里洗一小时 一于1 0 0 酒精浸洗4 5 分钟( 15 分钟一次，共3 次) 一于纯净水里洗澡3 0 分钟，共5 次。 一用多聚- d - 赖氨酸包被过夜 一手工分离盖玻片，室温风干 - 2 5 0 。f 烘干2 d 时 一在每个3 5m i l l 细胞培养皿中加入4 个盖玻片，加入1m lp d l 包被液过夜 一无菌d d h 2 0 漂洗三次，备用 神经元分离及原代培养 一经雌雄杂合子小鼠定期交配得孕1 8 1 9 天杂合子雌鼠，c 0 2 麻醉 1 8 一用断头台去头 一打开腹腔，将胚胎移入含预冷解剖液的无菌平皿中 一将头取出，放入盛有预冷解剖液的平皿中 一同时剪尾置e p 管中，并标号( 用于基因型鉴定) 一取弯镊于眼睛处固定头部，另一镊子剥离头皮、撕裂头骨，暴露大脑 一从颅骨分离出整个大脑 一在解剖显微镜下用细尖镊分离左右半球，并将脑桥和小脑去除 一用细弯镊拨去脑膜 一切去海马、纹状体、嗅球等结构，剩下皮质 一将解剖好的皮质放入盛有预冷解剖液的平皿中 一移除多余的解剖液，用组织剪尽量剪碎 一将碎组织块转移到p a p a 纽消化液的离心管中，置培养箱中消化4 5m i n ( 每隔 1 0 分钟摇晃离心管以促进组织解离) 一吹打消化结束后的组织悬液，直到组织块彻底打散呈均匀混浊状 - 8 0 0r p m ，室温离心5 分钟 一吸取消化液，用1 ：1 缓冲液重悬细胞沉淀，吹打1 0 次至均匀 一静置后取上清，沿管壁小心缓慢力n n l 0 ：1 0 缓冲液液面上，形成梯度混合溶 液 - 8 0 0r p m ，室温离4 , 10 分钟 一吸去上清，用神经元基础培养液( 配方a ) 1m l 重悬分离的神经元 一取1 0 此细胞液在红细胞计数器上计数 一以6 * 1 0 5 培养皿左右的浓度，接种细胞( 每培养皿予2m l 配方a 神经元基础 培养液) 一置恒温c o 。培养箱中培养 一每隔三天换液：吸去5 0 原培养液( 配方a ) ，加入1m l 新鲜培养液( 配方 b ) 三、质粒及转染 1 9 1 p i r e s - g f p - s n a p i n 贡粒构建 质粒模板：p e g f p n i s n a p i n 质粒 载体：p l r e s 2 - g f p 质粒扩增用大肠杆菌：d h 5 a 菌种 引物： 上游5 ：5 t cc t gc a ga t gg c cg c gg c t g g tt c c 一3 ( p s ti ) 下游3 ：5 g t gg a tc c t t a tt t gc t tg g ag a ac c 一3 ( b a m hi ) 步骤： 一p c r 扩增( d n a 摸板5 0n g ，总体积5 0 此) 9 5o c5m i n 9 5 。c3 08 e c 5 8 。c1m i n 孓 2 5c y c l e s 7 2 。c1 5m i nj 7 2o c1 0m i n 4o cf o r e v e r 一琼脂糖凝胶电泳，切胶( 每管2 0 0m g 胶，得2 管) 一胶回收( i n v i t r o g e n 的d n a 抽提试剂盒) 一分别酶切消化p i r e s g f p i 经抽提纯化的s n a p i n ( 3 7 。c ，1r a i n4 0s e e ) s n a p i n ：( 总体积2 0 此x 2 ) 1 0 xb u f f e r ( h ) 2 “lx 2 b s a 0 2 止x 2 p s ti 1u lx 2 b a m hi 1u l ) 【2 s 1 1 a p l l l1 0 儿x 2 h 2 05 8 儿x 2 2 0 p l r e s g f p ( 总体积4 0 l ) 1 0 x b u f f e r ( i - i ) 4 此 b s a 0 4 此 p s ti 1 5u l b a m hi 1 5u l v e c t o r 2 此 h 2 0 3 0 6 儿 一连接( t a k a r al i g a t i o ni ) 1 6 。c ，1h r 一转化 将d h 5 a 感受态细菌从8 0 冰箱中取出，放置在冰上 待感受态菌溶解后加入5 “l 连接产物，冰上放置3 0 分钟 将感受态菌取出，4 2 放置4 5 秒，立即插在冰上 取5 0 此菌液h l l k 9 5 0 此3 7 预热的s o c 培养液，3 7 摇床l d , 时 转移菌液至1 7m le p 管中，1 3 0 0 0r p m 离心lm i n ，去上清 取管底细菌涂布在含k a n a m y c i n 的l b 平板上，3 7 倒置培养过夜 一克隆测序鉴定 一质粒大量抽提( q i a g e nm a x ip r e p 试剂盒c a t 撑1 2 3 6 2 ) 脂质体转染 材料 质粒p l r e s g f p s n a p i n ，p l r e s g f p l i p o f e c t a m i n e t m2 0 0 0 ( 1 n v i t r o g e n ) o p t i - m e m ( g i b c o ) 神经元基础培养液配方b ( - n e u r o b a s a l + b 2 7 ) 步骤 一取2 0 0 m lo p t i m e m 分别加入两个e p 管 2 1 一于一管中加入3 此l i p o f e c t a m i n e t m2 0 0 0 ，另一管中加入质粒载体2 嵋，混匀 5 m i n 一将两管中溶液混合，吹打混匀后室温放置3 0m i l l 一取体外培养至7 8 天的皮层神经元，移去并保存原培养液 一用神经元基础培养液洗2 次后，加入培养液1 4m l 一质粒和脂质体混合液加入培养的细胞中 一将培养皿放入培养箱孵育3h r s 一取出培养皿，洗2 次，换回原培养液 四、双膜片钳全细胞记录 1 材料和仪器 防震台( v h 2 6 4 3 - o p t ，n e w p o r t ) 放大器( m u l t i c l a m p7 0 0 b ，m o l e c u l a rd e v i c e s ) 数模转换器( d i g i d a t a13 2 2 a ，m o l e c u l a rd e v i c e s ) 刺激器( m a s t e r 8 ，a m p i ) 恒流泵( m i n i p u l s e3 ，g i l s o n ) 计算机数据采集软件( p c l a m p9 ，m o l e c u l a rd e v i c e s ) 数据分析软件( m i n i a n a l y s i s ，s y n a p t o s o f t ) 倒置相差显微镜( t e 3 0 0 ，n i k o n ) 荧光灯( n i k o n ) 微操纵器( b u r l e i g h ) 电极拉制仪( s u t t e ri n s t r u m e n tc o m o d e lp 9 7 ) 电极抛光仪( n a r j s h i g e ，m f 8 3 0 ) 玻璃电极( s u a e ri n s t r u m e n tc o c a t 撑b f1 2 0 6 9 1 0 ) 2 溶液及配方( 所用药品购自从s i g m a ) 细胞外液 2 2 n a c l 1 4 5m m k c l3m m c a c l 2 2m m | 6m m h e p e s1 0m m m g c l 2 ( f l u k a ) 2m m l m m d g l u c o s e 8m m p i c r o t o x i n 5 0 m 用n a o h 调节p h 值至7 2 7 3 ，渗透压至3 0 0m o s m 左右。 记录微电流时，加入1k t mt t x 。 使用前2 3 天内新鲜配制，4 。c 保存。 细胞内液 k g l u c o n a t e 14 6 5m m k c l7 5m m n a c l 2 9m m m g c l 2 ( f l u k a ) 1m m h e p e s1 0 m m e g t a0 2m m a t p n a 2 2m m 用k o h 调节p h 值至7 3 ，渗透压至3 0 0m o s m 。 过滤后使用或2 0 。c 冻存， 3 实验方法 原理：使用膜片钳记录，因电极边缘和细胞膜形成电阻大于1 0 9 q 的紧密封 接( 又称g i g