（细胞生物学专业论文）杜氏盐藻完整叶绿体的分离和叶绿体转化体系的构建.pdf

郑州人学2 0 0 7 年颂l j 学位论文丰| 氏盐凛南纯度叶绿体的提取和n 1 绿体转化载仆的构建 杜氏盐藻( d u n a l i e l l a $ a i i n a ) 完整叶绿体的分离和叶绿 体转化载体的构建 硕士研究生曲东京 导师薛乐勋 郑州大学细胞生物研究室，郑州大学生物工程系郑州，河南4 5 0 0 5 2 中文摘要 随着转基因研究的不断深入，人们将越来越多的研究兴趣集中在生长迅速， 培养简单的单细胞绿藻上。利用单细胞绿藻进行遗传转化有其优越性，与传统的 微生物发酵、动物细胞和转基因动物等转化系统相比，它不需要昂贵的设备和严 格的培养条件，具有光合自养、培养成本低，易于转化等优点，是一类比较廉价 和安全的生物反应器。 目前，对单细胞绿藻的转化工作主要集中在两大方向：细胞核转化和叶绿体 转化。经过数十年的发展，植物的核转化技术r 臻成熟并得到了广泛的应用，但 是核基因组的遗传转化仍存在一系列至今尚未解决的内在问题：如由于核基因组 大、背景复杂、易出现基因失活、基因沉默、位置效应等现象；所表达的原核基 因必须经过修饰改造，环境安全难以保证等。 而在叶绿体转化系统中却可以克服这些困难。与核转化相比，叶绿体基因组 小，遗传操作简单，外源基因是通过同源重组机制定点整合进叶绿体基因组。定 点整合有利于人为控制外源基因的插入位点，可以将目的基因定位在适于表达的 位点，能较好地解决“顺式失活”、“位置效应”等类的基因沉默问题。由于叶绿 体中d n a 分子有多个拷贝，同时叶绿体对表达产物的积累有较强的承受能力， 保障了外源基因在叶绿体中的高效表达。另外，由于叶绿体基因组的原核性质， 对来自原核生物的外源基因无需改造就可以在叶绿体内高效表达，而且可以将多 个外源基因采取“多顺反子”的原核表达形式同时引入，并由共同的启动子控制， 既方便操作又可避免由于存在多个相同启动子所带来的“共沉默”。这是核基因 郑州人学2 0 0 7 年坝l ：学位论文札氏黼凛一矗9 b 度叶绿体的提取和叶绿体转化裁体的构建 转化无法做到的。 杜氏盐藻( 以下简称赫藻) 是一种低等的单细胞真核绿藻，属绿藻门绿藻纲 团藻目，进化树分析显示其与具有细胞壁的莱茵衣藻十分相似，没有细胞壁，长 约6 - 1 5 1 a n ，呈椭圆形或梨形，能依靠其双鞭毛在水中游动。光镜下可明显看到 其内含一个大型的杯状叶绿体，约占细胞总体积的5 0 。可在0 0 5 m 一5 5 m 的赫 水中生长，最佳生长繁殖盐度为2 m 3 m ，目前已知最耐盐的真核生物。由于盐 藻可在高渗盐溶液中生长，这是许多其它生物难以生存的环境，故其大规模培养 不需昂贵的发酵罐或其他培养装置，可以直接采用开放式培养，大大降低生产成 本，由于没有细胞壁可很容易的用基因枪，电击法等一系列转化方法进行遗传转 化，这些独特使得杜氏盐藻可被开发为一种生产药用蛋白的良好宿主。 基于叶绿体转化的优越性以及盐藻的独特性，本实验意欲在盐藻中实现稳定 高效的叶绿体转化。在我们以前的实验中，初步的盐藻叶绿体转化系统已经构建 成功，但是由于用于重组的同源片段长度不足使得得到的转化系统不太稳定。本 实验首先分离大量完整的叶绿体，进而抽提高纯度叶绿体d n a ( c p d n a ) ，利用 四个平端酶随机切割c p d n a 并连上特异设计的接头( l i n k e r ) ，构建四个叶绿体 基因组步行文库，通过巢式p c r 扩增到足够长度的同源片段，进而构建叶绿体 转化载体。 实验方法 1 盐藻完整叶绿体的分离及c p d n a 的提取 在进行盐藻叶绿体的分离时，从某种程度上讲对其大量高效的培养显得至关 重要。合适的培养条件一方面可以使细胞快速增殖，另一方面则可以保持整个生 长过程中叶绿体保持良好的形态。我们在比较了不同的盐藻生长的培养基的基础 上，对u t e x 液体培养液进行了部分改良，如将n a c l 的浓度调至i m 。 取对数生长后期的杜氏盐藻细胞进行高压破碎，利用差速离一t l , 和蔗糖密度梯 度离心得到完整的叶绿体。采用优化的s d s p r o t e i n a s ek 一酚氯仿异戊醇方案抽 提得到高纯度的c p d n a 。 2 盐藻c h i n 基因未知侧翼区的扩增 c h i n 被选择用于我们进行叶绿体转化的同源片段。它和c h l l 、c h l b 参与编 码光非依赖性的原叶绿素酸醋还原酶( d p o r ) ，任何一个基因的破坏都阻断黑暗 条件下叶绿素的合成。c h l l 基因插入失活后，盐藻还可通过光依赖性的原叶绿素 2 郑州人学2 0 0 7 年域l j 学位论文车| 氏曲；2 i ，岛9 l 度n i 绿体的提取和叫绿体转化找体的构硅 酸醋还原酶系统( l p o r ) 完成叶绿素的合成，而不影响转化藻的正常生存。 2 1 赫藻叶绿体基因组步行文库的构建 将抽提得到的高纯度c p d n a 分别用d r ai 、e c o rv 、p v “和s t ui 四个平 端限制酶切，之后和特异的接头连接制成叶绿体基因组步行文库，作为巢式p c r 扩增的模板。 2 2 c h l n 基因未知上游侧翼的扩增 通过在c h i n 基因上游设计特异引物，在制成的叶绿体基因组步行文库中进 行c h i n 基因未知上游的扩增。 2 3 c h i n 基因未知下游侧翼的扩增 同样，通过在c h i n 基因下游设计特异引物，在叶绿体基因组步行文库中进 行c h i n 基因未知下游的扩增。 3 盐藻双交换叶绿体转化载体的构建及转化结果的初步鉴定 在新增同源片段的基础上，对已有的叶绿体转化载体进行改造，构建成盐藻 叶绿体转化载体p m d k o b a r 以用于叶绿体转化。用电击转化法转化野生型盐藻 细胞。 实验结果 1 盐藻完整叶绿体的分离及高纯度c p d n a 的制备 蔗糖密度梯度离心结果表明分离到了大量的叶绿体，相差显微镜及电镜观察 证实了所得叶绿体的完整性。1 琼脂糖凝胶电泳检测c p d n a ，并用紫外分光光 度仪检测c p d n a 的浓度和纯度，结果显示，抽提到的c p d n a 浓度约2 2 0 9 9 m l ， a 2 6 0 a 2 8 0 接近1 8 ，说明其含量及纯度都达到了比较理想的状态。 2 盐藻c h i n 基因未知侧翼区的扩增 2 1 c h l n 基因未知上游侧翼的扩增 经过两轮的扩增得到一条3 0 0 0b p 的片段，测序结果显示其3 端与以前实 验中用简并引物扩增得到的1 2 6 9h p 的c h i n 的5 端完全吻合。 2 1 c h l n 基因未知下游侧翼的扩增 两轮的扩增得到一条6 5 0h p 的片段，测序结果显示其5 端与已知的1 2 6 9 b p 的c h l n 的3 端完全吻合。 3 盐藻双交换叶绿体转化载体的构建及转化的初步鉴定 酶切鉴定双交换叶绿体转化载体p m d k o b a r 插入片段大小、方向均讵确。转 郑州人学2 0 0 7 年坝i 学位论文札氏盐凛扇纯度n 1 绿体的提取和n 绿休转化载体的构建 化过的藻株在筛选压力下，于一周后肉眼观察到转化藻株与阴性对照藻株( 未加 质粒，电击转化后加入p p t ) 生长状态存在明显差异。而与阳性对照( 未加质粒， 电击转化后不力 i p p t ) 的生长状态并无很大差别。则可以推知已将目的基因成功 转入盐藻叶绿体。 结论 1 在分离到了大量完整的盐藻叶绿体基础上，通过对传统方案的优化得到 足量的高纯度c p d n a 。 2 从构建的盐藻叶绿体基因组步行文库中成功扩增得到用于叶绿体遗传转 化的同源片段，并构建了叶绿体转化载体。 3 转化结果显示目的基因已转入盐藻叶绿体基因组。 关键词：杜氏盐藻；叶绿体；基因组步行文库：；转化 4 郑州人学2 0 0 7 年彤! i j 学位论文 氏盐藻，岛纯度叫绿体的提取和叶绿体转化载体的构矬 i s o l a t i o no fi n t a c tc h l o r o p l a s t sf r o md u n a l i e l l as a l i n aa n d c o n s t r u c t i o no fv e c t o rf o rc h l o r o p l a s tt r a n s f o r m a t i o n g r a d u a t e s u p e r v i s o r q ud o n g i i n g x u el e x u n l a b o r a t o r yf o rc e l lb i o l o g y , d e p a r t m e n to fb i o e n g i n e e r i n g ，z h e n g z h o uu n i v e r s i t y z h e n g z h o n , h e n a n4 5 0 0 5 2 a b s t r a c t r e c e n t l y , t h er e s e a r c hf o c u s i n go ng e n e t i ct r a n s f o r m a t i o no fa l g a eh a sb e e n c a r d e do u t i n t e n s i v e l y , a n ds o m eo ft h e mh a v eb e e nd e v e l o p e da sn e wt y p e b i o r e a c t o r sf o rt h ep r o d u c t i o no fp h a r m a c e u t i c a lp r o t e i n so rv a c c i n e s c o m p a r e dt o t r a d i t i o n a lt r a n s f o r m a t i o n a ls y s t e m si n c l u d i n gm i c r o b i a lf e r m e n t a t i o n , t r a n s g e n i c a n i m a l sa n dp l a n t s ，t r a n s g e n i ca l g a eh a v es o m ep a r t i c u l a ra d v a n t a g e s ，f o re x a m p l e ， t h e ya r ea u t o t r o p h ya n dd on o tr e q u i r ee x p e n s i v em e d i ao rs t r i c tc u l t u r ec o n d i t i o n s b e c a u s eo ft h e s eu n i q u ec h a r a c t e r i s t i c s ，t h ea l g a ea r ed e v e l o p e dt ol o w - c o s ta n ds a f e b i o r e a c t o r s n o w a d a y s ，s t u d i e sf o rt h eg e n e t i ct r a n s f o r m a t i o no fu n i c e l l u l a re u k a r y o t i ca l g a e m a i n l yf o c u so nt w oa p p r o a c h e s ：n u c l e u sa n dc h l o r o p l a s tt r a n s f o r m a t i o n t h o u g ht h e n u c l e i ct r a n s f o r m a t i o ni np l a n t sh a sb e e nd e v e l o p e da n du s e dw i d e l y , s o m ei n t r i n s i c p r o b l e m si ng e n e t i ci n f o r m a t i o nh a v en o tb e e ns o l v e d t h en u c l e i cg e n o m ei ss ob i g a n dc o m p l i c a t e dt h a tt h ei n t e g r a t i o ns i t e sa n dc o p i e so ff o r e i g ng e n e sc a l ln o tb e c o n t r o l l e da c c u r a t e l y , l e a d i n gt ot h ei n e f f i c i e n te x p r e s s i o no ft h ef o r e i g ng e n e s b e c a u s eo fg e n es i l e n c i n g t h ec h l o r o p l a s tt r a n s f o r m a t i o nm a ys o l v es o m eo ft h ep r o b l e m sm e n t i o n e da b o v e c o m p a r e dt on u c l e i cg e n o m e ，t h ec h l o r o p l a s tg e n o m ei ss m a l l e ra n de a s i e r t ob e o p e r a t e dg e n e t i c a l l y , a n dt h ef o r e i g ng e n ei ss i t e d i r e c ti n t e g r a t e di n t ot h ec h l o r o p l a s t 郑州人学2 0 0 7 年伽li 卑位论文 丰i 氏特；l ；i 一岛纯度叫绿体的提取和叶绿体转化载体的构矬 g e n o m et h r o u g hh o m o l o g o u sr e c o m b i n a t i o n b e s i d e s ，t h e r ea r cm a n yc o p i e so f c h l o r o p l a s td n a ( c p d n a ) i ns i n g l ec h l o r o p l a s t ，a n dt h ec h l o r o p l a s th a sas t r o n g t o l e r a n c et oa c c u m u l a t i o no ft h ep r o d u c t se x p r e s s e db yt h ei n t r o d u c e dg e n e ，w h i c h w i l le n s u r et h eh i g he f f i c i e n te x p r e s s i o no ft h ef o r e i g n g e n e m e a n w h i l e ，t h e p r o k a r y o t i cg e n e sa r ee f f i c i e n te x p r e s s e di nt h ec h l o r o p l a s tw i t h o u ta n ym o d i f i c a t i o n b e c a u s eo fp r o k a r y o t i cp r o p e r t yo ft h ec h l o r o p l a s tt r a n s f o r m a t i o n , b u tn o ti nn u c l e i c t r a n s f o r m m i o n d u n a l i e l l as a l i n a s a l i n a ) b e l o n g st oc h l o r o p h y t a , c h l o r o p h y c e a s e ，v o v o c a l e s i t ss h a p ea n ds t r u c t u r ea r ev e r ys i m i l a rt oc h l a m y d o m o n a sr e i n h a r d t i i ( cr e i n h a r d t i o e x c e p tf o rl a c k i n go f c e l lw a l l i th a sal a r g ec u p s h a p e dc h l o r o p l a s ta b o u t5 0 o f t h e c e l lv o l u m e t h ec e l l sa r ea b l et og r o wi ne x t r e m ee n v i r o n m e n t ss u c ha si na v a r i e t y o fs o d i u mc h l o r i d ec o n c e n t r a t i o nr a n g i n gf r o mo 0 5 mt o5 m ，w h e r eo t h e ro r g a n i s m s h a r d l ys u r v i v e ，s ol a r g e - s c a l ec u l t u r e so f d s a l i n ad on o tn e e de x p e n s i v ee q u i p m e n t s ， s u g g e s t i n gt h a td s a l i n ai saf a v o r a b l eh o s tf o rp r o d u c i n gp h a r m a c e u t i c a lp r o t e i n s i n t h i ss m d ga f t e rac h l o r o p l a s tg e n o m ew a l k i n gl i b r a r yw a sc o n s t r u c t e d ，t a r g e t h o m o l o g o u sd n af r a g m e m sw e r eo b t a i n e db yu s i n gn e s t e dp c r ，a n df i n a l l yav e c t o r f o rc h l o r o p l a s tt r a n s f o r m a t i o nw a ss u c c e s s f u l l yc o n s t r u c t e d m e t h o d s ： 1 i s o l a t i o no ft h ei n t a c tc h l o r o p l a s tf r o md s a l i n aa n de x t r a c t i o no fc p d n a t h ec e l l sg r o w na t 2 7 i nu t e xm e d i u mc o n t a i n i n gi mn a c l a n da l i g h t d a r kr e g i m eo f1 2 1 2 hw a ss e l e c t e d b e f o r eh a r v e s t i n g ，c u l t u r e sw e r ee x a m i n e d m i c r o s c o p i c a l l yf o rc o n t a m i n a t i o n s u b s e q u e n t l y , e x p o n e n t i a l l yg r o w i n gc u l t u r e s ， a b o u t7d a y sa f t e ri n o c u l a t i o n , w e r eh a r v e s t e da n db r o k e nt h r o u g hc e l lb o m b t h e i n t a c tc h l o r o p l a s t sw e r eo b t a i n e db yd i f f e r e n t i a l c e n t r i f u g a t i o na n ds u c r o s ed e n s i t y g r a d i e n tc e n t r i f u g a t i o n am o d i f i e ds c h e m eo f s d s - p r o t e i n a s ek p h e n o l c h l o r o f o r m i s o a m y la l c o h o lw a se m p l o y e dt oe x t r a c tc p d n a 2 a m p l i f i c a t i o no f u n c h a r a c t e r i z e df l a n k i n gl e g i o n so f t h ec h i ng e n e c h i nt o g e t h e rw i t h c h l la n dc h l ba r e r e s p o n s i b l ef o r t h eb i o s y n t h e s i so f l i g h t - i n d e p e n d e n tp r o t o c h l o r o p h ) r l l i d er e d u c t a s e ( l i p o r ) o ft h ec h l o r o p l a s t si nn 6 墅堂叁兰! ! 堕生堡! ：兰丝堡兰! ! 垦竺鲨鲎! 塞! ! 堡堡塑丝坠塑! 竺型型型兰墨竺堕坠 s n h 协nc e l l s d ? s a l i n ac e l l s c a na l s op e r f o r mc h l o r o p h y l lf o r m a t i o nt h r o u g h l i g h t d e p e n d e n tp r o t o c h l o r o p h y l l i d er e d u c t a s e ( l d p o r ) e r g o w i t h o u t c h i ng e n e s o t h el o c io f t h ec h i ng e n e sw e q z es e l e c t e da st h eh o m o l o g o u sr e c o m b i n a t i o nr e g i o n s 2 1c o n s t r u c t i o no f c h l o r o p l a s tg e n o m ew a l k i n gl i b r a r i e s f o u rc h l o r o p l a s tg e n o m ew a l k i n gl i b r a r i e sd l ，e l ，p la n ds lo fd s a l i n aw e r e c o n s t r u c t e da f t e rt h ec p d n ad i g e s t e db yd r ai ，e c o rv p v ui ia 1 1 ds t u1w a sl i g a t e d t od e s i g n e da d a p t o r s 2 2a m p l i c a f i o no f u n c h a r a c t e r i z e df l a n k i n gr e g i o n so f t h ec h i ng e n e s p r i m e r su s e di nt h ea m p l i f i c a t i o nw e r ed e s i g n e da c c o r d i n gt ot h eu p s t r e a ma n d d o w n s t r e a ms e q u e n c e so f t h ec h i ng e n e ，a n dt h ec h l o r o p l a s tg e n o m ew a l k i n g l i b r a r i e s w e r es e r v e da st h et e m p l a t e s t h en e g e dp c rw a ss e l e c t e d f o ra m p l i f i c a t i o no f u n c h a r a c t e r i z e df l a n k i n gr e g i o n so f t h ec h i ng e n e s 3 c o n s t r u c t i o no fv e c t o rf o rt h ec h l o r o p l a s tt r a n s f o r m a t i o na n di d e n t i f i c a t i o n f o rr e s u l to ft r a n s f o r m a t i o n an e wv e c t o rn a m e da sp m d k o b a rf o rc h l o r o p l a s tt r a n s f o r m a t i o nh a db e e n c o n s t m c t e da f t e rt h eh o m o l o g o u sr e c o m b i n a t i o nf r a g m e n t sw e r eo b t a i n e d ，a n d t h e nt h ed m d k o b a rw a si n t r o d u c e di n t ow i l dt y p e c e l l so fd s a l i n ab y e l e c t r o p o r a t i o n r e s u l t ： 1 i s o l a t i o no ft h ei n t a c tc h l o r o p l a s tf r o md s a l i n aa n de x t r a c t i o no fc p d n a r e s u l to fs u c r o s ed e n s i t yg r a d i e n tc e m r i f u g a t i o n r e v e a l e dt h a tam a s so f c h i o r o p l a s t sw e r ei s o l a t e d t h ei n t e g r i t yo f t h ec h l o r o p l a s t sw a sc o n f i r m e d w i t hp h a s e c o n t r a s tm i c r o s c o p ea n de l e c t r o n i cm i c r o s c o p e t h er e s u l t so fe x a m i n a t i o nf o rt h e c o n c e n t r a t i o na n dp u r i t yo ft h ec p d n at h r o u g ha nu l t r a v i o l e ts p e c t r o p h o t o m e t e ra n d 1 a g a r o s eg e l sw e r es a t i s f a c t o r y 2 a m p l i f i c a t i o no fu n e h a r a c t e r i z e df l a n k i n gr e g i o n so f t h ec h i ng e n e t h er e s u l to fn e s t e dp c ri n d i c a t e dt h a t6 0 0b pa n d3 0 0 0b po ff r a g m e n t sw e r e a m p l i f i e df r o mt h eu p s t r e a mc h i n ，a n d6 5 0b po ff r a g m e n tw a sa m p l i f i e df r o m t h e d o w n s t r e a mc h i nt h r o u g hg e n o m ew a l k i n gt e c h n i q u e t h es e q u e n c i n gr e s u l t s 7 郑州人学2 0 0 7 年顾f 学位论文 1 氏朴藻，岛纯度叶绿体的挺取和n l 绿体转化找件的构建 s h o w e dt h a tt h ea m p l i f i e df r a g m e m sw e r ec o r r e c t 3 c o n s t r u c t i o no fv e c t o rf o rt h ec h l o r o p l a s tt r a n s f o r m a t i o na n di d e n t i f i c a t i o nf o r r e s u l to ft r a n s f o r m a t i o n t h ei d e n t i f i c a t i o nf o rv e c t o rp m d k o - b a ri n d i c a t e dt h a tb o t ht h es i z ea n d d i r e c t i o no f t h ei n s e r t e df r a g m e n tw e r ec o r r e c t o n ew e e kl a t e r , t h et r a n s f o r m e dc e l l s w e r ea b l et og r o wu n d e rt h es e l e c tp r e s s u r eo f0 2p _ g m lp p t ，w h i l et h en e g a t i v e c o n t r o lh a r d l ys u r v i v e d t h ea b o v eo b s e r v a t i o ns u g g e s t st h a tt h et a r g e tg e n eh a s b e e ni n t r o d u c e di n t ot h ec h l o r o p l a s to f d s a l i n ac e l l s c o n c l u s i o n ： 1 c p d n aw i t hh i 【g hp u r i t yh a sb e e ne x t r a c t e da f t e ri n t a c tc h l o r o p l a s t sw e r e i s o l a t e df r o md s a l i n ac e l l s 2 av e c t o rp m d k o b a rf o rc h l o r o p l a s tt r a n s f o r m a t i o nh a sb e e ns u c c e s s f u l l y c o n s t r u c t e da f t e rh o m o l o g o u sf r a g m e n t sw e r eo b t a i n e d 3 i d e n t i f i c a t i o nr e s u l t sr e v e a lt h a tt h et a r g e tg e n eh a sb e e ni n t r o d u c e di n t ot h e c h l o r o p l a s t so f d s a l i n a c e l l s k e y w o r d s ：d u n a l i e l l as a l i n a ；c h l o r o p l a s t ；g e n o m ew a l k i n gl i b r a r y ；t r a n s f o r m a t i o n 8 郑州人学2 0 0 7 年顾f + 学位论文捌氏盐藻完整n l 绿体的分离和n l 绿怍转化找体的构建 杜氏盐藻完整叶绿体的分离和叶绿体 转化载体的构建 硕士研究生曲东京 导师薛乐勋 郑州大学细胞生物研究室，郑州大学生物工程系郑州，河南4 5 0 0 5 2 引言 近些年来，人们在转基因植物方面进行了大量的研究。与微生物发酵、动物 细胞和转基因动物等生产系统相比，转基因植物具有光合自养、成本较低、易于 转化、植物病毒不感染人类等优点，已成为一类比较廉价和安全的生物反应器。 然而高等植物培养周期过长，生长受季节性限制，因此许多研究兴趣集中到生长 迅速，培养易的单细胞绿藻上。其中莱茵衣藻遗传背景己研究清楚，有多种外源 性蛋白质在衣藻中表达成功1 卸，其它单细胞绿藻o h , i , 球藻等也有类似研究。 而与衣藻和小球藻比较，具有更多优点的盐藻作为生物反应器的研究至今国内外 尚缺乏。 盐藻是一种低等的单细胞真核绿藻，属绿藻门绿藻纲团藻目，除缺乏细胞壁 外，其形态和结构特征与衣藻十分相似，是一种原生质裸露的嗜盐性浮游单细胞 藻，长约6 1 5t a m ，呈椭圆形或梨形，能依靠其双鞭毛在水中游动。光镜下可看 到其内含一个大型的杯状叶绿体，约占细胞总体积的5 0 。可在o 0 5m 5 5m 的盐水中生长，最佳生长繁殖盐度为2m 3m 1 “1 ，目前已知最耐盐的真核生物。 盐藻的很多优点使得它可被丌发为一种继微生物发酵、动物细胞和转基因动 物之后的第四大类生物反应器：繁殖快，效率高：可以在数天时间内产生数量 巨大的后代个体。培养成本低：表现在两个方面。其一，盐藻属自养生物，不 需要昂贵的培养基，只需适宜的光照，温度和无机盐，培养简单，故成本低廉。 其二，盐藻可在高盐溶液中生长，这是许多其它生物难以耐受的环境，故其大规 模培养不需昂贵的发酵罐或其他培养装置，可以直接采用丌放式培养而不会产生 郑州人学2 0 0 7 年顾i 学位论文t l 氏特糖完整n l 绿体的分离和n l 绿体转化载体的构挫 大的污染，因此也大大降低生产成本，据我们丰h 略计算，目前利用化学方法生产 一克单克隆抗体成本约1 2 0 0 元，而用转基因盐藻生产同样质量的单抗仅需0 4 元，而前者成本是后者的3 0 0 0 倍! 易于操作：盐藻属于低等的真核绿藻，基 因组小，且无细胞壁，因此许多用于转染哺乳动物的方法，如磷酸钙法、d e a e - 葡聚糖法、电激法和脂质体法等，也非常适合于盐藻细胞。盐藻本身无毒无害， 且富含多种天然维生素，食用价值高。因此，如果用盐藻生产口服型疫苗或其他 e l 服型药物，甚至无须纯化即可直接服用，是作为生物反应器的理想材料。 植物基因工程主要研究方向集中在将外源基因在细胞核中表达，其发展己趋 于成熟，并得到广泛应用。但随着研究的不断深入，人们逐渐认识到对细胞核基 因组的遗传转化存在一系列难以解决的问题。例如核基因组大，背景复杂，外源 基因的整合位点和整合的拷贝数难以人为控制，造成外源基因表达效率低，在后 代中表达不稳定，以及容易出现基因失活、基因沉默、位置效应等现象。同时转 入多个基因时操作步骤过于复杂，所表达的原核基因必须经过修饰改造。 叶绿体转化中则不存在这些现象。利用叶绿体进行遗传转化有以下细胞核转 化无法比拟的优越性：基因组相对较小，遗传背景清晰，易于操作。目前已有 几十种植物和藻类的叶绿体基因组全序列得到测定，且每年都有来自叶绿体基因 组测序的大量数据，从而为外源基因通过定点整合进叶绿体基因组奠定了基础。 定点整合有利于人为控制外源基因的插入位点，可以将目的基因定位在适于表达 的位点，能较好地解决“顺式失活”、“位置效应”等类的基因沉默问题，而且简化 y # l - 源基因转化后的筛选工作。且不影响其它基因的功能。外源基因可大量表 达。在植物细胞中，一个叶肉细胞中可含有4 0 0 5 0 0 叶绿体，而叶绿体中d n a 分子又有多个拷贝。同时叶绿体对表达产物的积累有较强的承受能力，目的基因 产物的积累不会对其正常行使功能产生太大影响，因而外源基因可大量表达。一 系列实验结果表明叶绿体转化系统可以使目的基因超量表达，蛋白产量比核基因 表达强度高2 0 倍以上，甚至高达1 0 0 3 0 0 倍 1 2 , 1 3 1 4 】。基因表达的原核方式。由 于叶绿体基因组基因的排列方式、调控方式、g c 碱基对含量及翻译所偏爱的密 码子与原核生物类似。因此，对来自原核生物的有重要价值的外源基因，无需改 造和修饰就可以在叶绿体内高效表达l i s a 6 1 ，这是核基因转化无法做到的。利于 同时进行多基因转化。在叶绿体基因组中，许多功能相近的基因聚合在一起，共 2 郑州人学2 0 0 7 年倾l 学位论文扑氏赫；2 ；i 完整叶绿体的分离和州绿体转化载体的构建 用同一个启动子，组成操纵子，这种结构为在同一启动子的调控之下同时表达多 个外源基因提供了可行性。许多产品和重要性状往往是多基因共同作用的产物， 仅转入单个基因难以取得理想效果。核转化系统转入多个基因操作复杂，工作量 大，而且易出现基因沉默。在叶绿体中表达多个外源基因时可采取“多顺反子” 原核表达形式，通过一次转化就可将多个基因引入受体植物，并由共同的启动子 控制，既方便操作又可避免由于存在多个相同启动子所带来的“共沉默”【l7 1 。外 源基因可稳定遗传。叶绿体属于母系遗传，这为整合在其中的外源基因的稳定遗 传提供了方便。一旦得到纯合而稳定的叶绿体转化体，这种纯系的种子后代永远 保持为纯系，不会因有性杂交而发生分离。在农业生产中只需将转基因植株作为 母本就可获得所需要性状的后代【l 引。母性遗传，环境安全性高。通过核转化技 术培养的转基因植物阳自j 释放后，转基因会通过花粉传播扩散到相邻的植物中 去，这种外逸现象使周围地区的生物安全受到威协。使用叶绿体转化系统就不存 在这些问题，因为外源基因整合到叶绿体基因组后，只能进行母系遗传，不像核 基因那样可以随花粉而扩散，从而保证了转基因安全。 基于叶绿体转化的优越性以及赫藻的独特性，我们意欲在盐藻中实现稳定高 效的叶绿体转化。在我们以前的实验中，初步的盐藻叶绿体转化系统已经构建成 功，但是由于用于重组的同源片段长度不足使得得到的转化系统不太稳定。因为 用简并引物扩增同源片段时，由于保守区较短，得到的同源片段也较短，不足以 构建成稳定的转化系统。因此在本实验中我们首先分离到大量完整的叶绿体，进 而抽提到高纯度的c p d n a ，构建四个叶绿体基因组步行文库，通过巢式p c r 扩 增到足够长度的同源片段，进而用于构建稳定的叶绿体转化体系，从而为实现叶 绿体的稳定转化奠定了略实的实验基础。 郑州人学2 0 0 7 年颅i 学位论文札氏能f i f 完整叶绿休的分离和n l 绿体转化找体的构锉 第一章盐藻完整叶绿体的分离及o p d n a 的提取 在进行盐藻叶绿体的分离前，对其大量高效的培养显得至关重要。合适的培 养条件一方面可以使细胞快速增殖，另一方面则可以保持整个生长过程中叶绿体 保持良好的形态，也只有保持了叶绿体的良好生长状态，才可能分离到完整的叶 绿体。 我们在比较了不同的盐藻生长的培养基的基础上，对u t e x 液体培养液进 行了部分改良，在没有降低明显盐藻的生长速度的基础上，保持叶绿体的状态良 好，从而得到了大量的完整的盐藻叶绿体，并采用优化的s d s p r o t e i n a s ek - 酚 氯仿异戊醇方案抽提得到高纯度的c p d n a 。 第一节盐藻完整叶绿体的分离 l 材料与方法 1 1 材料 1 1 1 主要仪器设备 b c m 1 0 0 0 a 型生物洁净工作台：苏净集团苏州安泰空气技术有限公司 b r 4 i 型台式高速低温离心机：法国j o u a n 公司 s i m f 1 2 4 雪花制冰机：同本三洋 h i t a c h ic p l 0 0 超速离心机：同本r 立 普通光学显微镜：o l y m p u s 公司 n i k o nt e 2 0 0 0 u 相差显微镜：同本尼康 a u t o c l a v es s 3 2 5 消毒柜：日本t o m y 公司 h p g 4 0 0 型光照培养箱：哈尔滨市东联电子技术开发有限公司 高压细胞破碎仪：美国p a r r 公司 电镜观察由上海蓝创生物技术服务公司负责 1 1 2 藻种 杜氏盐藻( ds a l i n a u t e x l b 1 6 4 4 ) 购自美国德州大学藻种中心。 4 郑州人学2 0 0 7 年坝i j 学位论义扎氏朴凛完整n | 绿体的分离和川绿体转化找体的构矬 1 1 3 培养基 培养基为优化的u t e x 培养液，组成见表1 1 。 表1 - 1 杜氏盐藻u t e x 培养液配方 组分浓度 k n o ， n a c l m g s 0 4