（遗传学专业论文）中国林蛙皮肤抗菌肽temporin1cea基因的串联融合表达.pdf

! 眦1 1 1 1 i 洲l y 17 9 5 2 2 7 中国林蛙皮肤抗茵肽t e m p o ri n - l c e a 基因的串联融合表达 学位论文独创性声明 本人承诺：所呈交的学位论文是本人在导师指导下所取得的研究成果。论文中除特别加以标注和 致谢的地方外，不包含他人和其他机构已经撰写或发表过的研究成果，其他同志的研究成果对本人的 启示和所提供的帮助，均已在论文中做了明确的声明并表示谢意。 学位论文作者签名： 益面垄 学位论文版权的使用授权书 本学位论文作者完全了解辽宁师范大学有关保留、使用学位论文的规定，及学校有 权保留并向国家有关部门或机构送交复印件或磁盘，允许论文被查阅和借阅。本文授权 辽宁师范大学，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库并进行检索，可以采 用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质 论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后使用本授权书。 |一 眵 学位论文作者签名： 熬碰l 垒 指导教师签名： 签名日期： 年月日 辽宁师范大学硕士学位论文 摘要 抗菌肽( a n t i b a c t e r i a lp e p t i d e s ，简称a b p ) 是一类小分子肽类物质，由生物体特定基 因编码，具有高效的杀菌能力和广谱的抗菌活性。皮肤抗菌肽是两栖类先天防御系统的 主要组成部分，是两栖类抵御病原菌的武器。在当今抗生素滥用而引发大量耐药菌株产 生的情况下，具有独特抗菌作用机理的两栖类皮肤抗菌肽具有广阔的开发和应用前景。 然而，从两栖类皮肤中提取天然抗菌肽工艺复杂，难以规模化生产，用基因工程重组表 达两栖类皮肤抗菌肽无疑是最经济的方法，是生产抗菌肽的最佳选择。由于两栖类皮肤 抗菌肽对细菌有很强的杀伤作用，因此不宜在原核系统中直接进行表达，一般采用融合 表达策略或在真核细胞中进行表达。 本研究采用串联融合表达策略在大肠杆菌表达系统中表达中国林蛙皮肤抗菌肽 t e m p o r i n 1 c e a 基因。人工合成中国林蛙皮肤抗菌肽t e m p o r i n 1 c e a 基因序列，用p c r 方法将6 个t e m p o r i n 1 c e a 基因同向串联连接，并在每个基因前面加上3 个单核苷酸 a t g ，最后在6 个串联t e m p o r i n 1 c e a 基因片段的5 和3 端分别加入两个酶切位点：s m a h i n d 。目的片段全长3 3 9 b p ，将目的基因插入表达载体p e t - 4 2 a ( + ) ，形成融合表达， 测序结果证实t e m p o r i n 1 c e a 基因6 串联体正确插入表达载体p e t - 4 2 时) 中。并将阳性 克隆转化至大肠杆菌表达菌b l 2 1 ( d e 3 ) 。 i p t g 诱导融合蛋白表达，s d s p a g e 凝胶电泳检测目的蛋白的表达情况。经过培 养基p h ，诱导剂浓度，诱导时间和诱导温度四种条件的筛选，最终确定在培养基p h 为 7 2 。菌体o d 6 0 0 达到7 0 9 时，i p t g 至终浓度为0 8 m m o i l ，诱导温度3 0 ，诱导时 间4 小时条件下，目的蛋白表达情况最好，表达产物相对分子量约4 3 k d ，占菌体总蛋 白量的1 0 8 。此时目的蛋白主要以可溶性蛋白的形式存在于细菌裂解液中。 将可溶性蛋白用g s t 亲和层析柱、n i 2 斗心汀a 亲和层析柱分别进行纯化，纯化后 的目的蛋白纯度达到6 0 。x a 因子切割去除融合标签后，用滤纸片法对酶切产物进行 了抗菌肽活性检测。为基因工程方法制备抗菌肽提供新的思路。 关键词：抗菌肽；t e m p o r i n - 1 c e a ；基因重组；融合表达 中国林蛙皮肤抗茵肽t e m p o r i n - i c e a 基因的串联融合表达 f u s i o ne x p r e s s i o no fs i xt e m p o r i n 一1c e a g e n e sf r o m t h es k i no f c h i n e s e b r o w nf r o g s ，r a n ac h e n s i n e n s i sr e p e a ti nt a n d e m a b s t r a c t a n t i b a c t e r i a lp e p t i d e s ( a b p s ) ，s m a l lm o l e c u l ep e p t i d e se n c o d e db yt h es p e c i f i cg e n e ， h a v eb r o a d - s p e c t m ma n t i m i c r o b i a la c t i v i t y a m p h i b i a ns k i np e p t i d e sa r eak i n do fa b p s c o n s i d e r e dt ob eam a i ne l e m e n to fi n n a t ei m m u n i t y ，w h i c ha r ea l s ot h ew e a p o nf o rf i g h t i n g b a c kt h ep a t h o g e n i cb a c t e r i a f o rt h ee m e r g e n c eo fm u l t i p l e - a n t i b i o t i cr e s i s t a n ts t r a i n s ，a b p s f r o ma m p h i b i a ns k i np l a ya ni m p o r t a n tr o l ei nt h ed e v e l o p m e n to fn o v e la n t i b i o t i c sb e c a u s e t h e i rb r o a d - s p e c t r u ma n t i m i c r o b i a la c t i v i t i e sa n ds p e c i f i ca n t i m i c r o b i a lm e c h a n i s m h o w e v e r , t h ei s o l a t i o na n dp u r i f i c a t i o no fn a t u r a lb i o a c t i v ep e p t i d e sf r o ma m p h i b i a ns k i ni st o od i f f i c u l t t om e e tt h en o o d so fl a r g e s c a l ep r o d u c t i o n s o ，i ti sa ni n e v i t a b l ec h o i c et op r o d u c eb i o a c t i v e p e p t i d e sb yt h eg e n ee x p r e s s i o ni np r o k a r y o t e so re u k a r y o t e s a m p h i b i a ns k i nr e c o m b i n a t i o n p e p t i d e sc a nn o tb ee x p r e s s e dd i r e c t l yi np r o k a r y o t i ce x p r e s s i o ns y s t e mb e c a u s et h eh i g h a n t i m i c m b i a la c t i v i t y t h e r e f o r e ，t h ef u s i o ne x p r e s s i o ns y s t e m , 0 1 e x p r e s s i o ni ne u k a x y o t i c c e l l sf o rr e c o m b i n a t i o na n t i - b a c t e r i a lp e p t i d e se x p r e s s i o no f t e ni su s e d i nt h i sr e s e a c h , w eu s er e c o m b i n a n tt e c h n o l o g ya n dt h ef u s i o ne x p r e s s i o ns y s t e mt o e x p r e s ss i xt e m p o r i n 1c e ag e n e sf r o mt h es k i no fc h i n e s eb r o w nf r o g s b a s e do nt h ea m i n o a c i ds e q u e n c eo f t e m p o r i n - l c e a ，w es y n t h e s i z et e m p o r i n - 1 c e ag e n es e q u e n c e w eu s ep c r m e t h o dt oc o n n e c tt h es i xo ft e m p o r i n - lc e ag e n e s ，o fw h i c he a c hg e n ei sp r e c e d e db ya t g c o d o n l a s t l y ，a tt h e5 a n d3 e n d , t w or e s t r i c t i o ns i t e so fs m ai h i n d 历w e r ea d d e d , r e s p e c t i v e l y t h e3 3 9 b pf r a g m e n tw a sc o n s t r u c t e di n t 0t h ee x p r e s s i v ev e c t o rp e t - 4 2 a ( + ) f o r t h ee x p r e s s i o no fg s t - t e m p o r i n - 1 c e af u s i o np r o t e i na f t e rs i xo ft e m p o d n - 1 c eg e n ew e r e s y n t h e s i z e di nt a n d e m t h es e q u e n c i n ga n a l y s i sc o n f i r m e dt h a tt h es i xo ft e m p o r i n - l c e a g e n e sh a db e e nc o r r e c t l yi n s e r t e di n t ov e c t o rp e t - 4 2 + ) mr e c o m b i n a n tv e c t o mw e r e t r a n s f o r m e di n t oe c o i lb l 2 1 t h eg s t - t e m p o r i n 1 c e af u s i o np r o t e i n se x p r e s s e di nt h eh o s tb a c t e r i au n d e rt h ei p t g i n d u c t i o n ，a n da n a l y z e dw i 也s d s - p a g e d i f f e r e n ti n d u c e dt e m p e r a t u r e ，p h ，i p t g c o n c e n t r a t i o n sa n dt h ei n d u c t i o nt i m ew e r es c r e e n e dt od e t e r m i n et h eo p t i m u mi n d u c i n g c o n d i t i o n s a tl a s t , w ec h o o s et h ec o n d i t i o na sf o l l o w i n g ：a f t e rb a c t e r i ag r o w i n gi nl b m e d i u mo fp h 7 2t os a t u r a t i o n i n d u c e dr e c o m b i n a n tp r o t e i nf o r4 h 砒3 0 w i t h0 8 m m 口t g t h ee x p e r i m e n t a lr e s u l t ss h o w e dt h a tt h er e c o m b i n a n tp r o t e i nm o l e c u l a rw e i g h ti s 4 3 l ( d ，w h i c ho c c u p y10 8 c o n t e n to ft o t a lb a c t e r i a lp r o t e i na n dp r e s e n ti nt h ef o r mo f s o l u b l ep r o t e i ni nb a c t e r i a ll y s a t e s 一i i 辽宁师范大学硕士学位论文 f u s i o np r o t e i nw a sp u r i f i e dw i t hg s t m pf fa f f m i t yc h r o m a t o g r a p h ya n dh i s t r a ph p a f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h y t h ep u r i t yo ff u s i o np r o t e i ni sa b o u t6 0 a f t e rp u n f y m g a f t e rt h e f u s i o nt a gw a sc l e a v e db yf a c t o rx a , t h ea n t i b a c t e r i a la c t i v i t yw a st e s t e d t h ec o n s t r u c t i o no f p r o k a r y o t i ce x p r e s s i v ep l a s m i do fm m p o r i n - 1 c e ag e n ee s t a b l i s h e sas o l i db a s i sf o rf u r t h e r s t u d y i n gt h ea m p h i b i a ns k i na n t i b a c t e r i a l k e y w o r d s ：a n t i m i c r o b i a lp e p t i d e ：t e m p o r i n - 1 c e a ；g o n er e c o m b i n a t i o n ：f u s i o ne x p r e s s i o n i i i 中国林蛙皮肤抗菌肽t e m p o r i n - l c e a 基因的串联融合表达 目录 摘要i a b s t r a c t i i 弓i言l l 文献综述2 1 1 抗菌肽的研究进展2 1 1 1 抗菌肽的发现2 1 1 2 抗菌肽的结构特性及分类2 1 1 3 抗菌肽的作用机理3 1 1 4 抗菌肽的应用4 1 2 两栖类皮肤抗菌肽的研究进展4 1 2 1 两栖类皮肤抗菌肽的结构特点和防御机制4 1 2 2 两栖类皮肤抗菌肽的基因工程研究进展5 1 2 3 融合蛋白中的标签蛋白技术。6 1 3 本研究的意义和内容7 2 串联融合表达载体的构建9 2 1 实验材料9 2 2 实验方法9 2 2 1 目的基因的人工合成9 2 2 2 目的基因与克隆载体的连接1 0 2 2 3p c r 法检测阳性克隆及测序1 0 2 2 4 目的基因的双酶切10 2 2 5 表达型载体p e t - 4 2 a ( + ) 的双酶切1 0 2 2 6 目的基因片段与p e t - 4 2 a ( + ) 酶切片段的连接l l 2 2 7 重组表达载体的转化及测序鉴定l l 2 2 8p e t 一4 2 a ( + ) 6 t e m p o r i n - i c e a 质粒的提取1 2 2 3 结果与分析1 3 2 3 1 重组克隆载体测序结果1 3 2 3 2 重组表达载体构建结果1 3 2 4 讨论l5 3 重组抗菌肽t e m p o r i n - i c e a 表达条件的筛选1 7 辽宁师范大学硕士学位论文 3 1 实验材料。l7 3 2 实验方法。17 3 2 1 外源目的蛋白的诱导表达1 7 3 2 2 诱导条件的筛选。17 3 3 结果与分析。l8 3 3 1 外源目的蛋白诱导表达结果18 3 3 2 不同i p t g 浓度诱导表达结果1 9 3 3 3 不同时间诱导表达结果1 9 3 3 4 不同温度诱导表达结果2 0 3 3 5 不同p h 诱导表达结果2 0 3 3 6 优化条件下诱导表达结果2 2 3 4 讨论2 2 4串联融合表达蛋白的纯化2 4 4 1 实验材料2 4 4 2 实验方法2 4 4 2 1 重组蛋白的g s t 亲和层析2 4 4 2 2x a 因子柱上酶切纯化蛋白2 5 4 2 3 重组蛋白的n i 柱亲和层析纯化2 5 4 2 4x a 柱外去除目的蛋白的融合标签2 6 4 2 5 酶切产物的抗菌活性鉴定2 6 4 3 结果与分析2 6 4 3 1g s t 亲和层析纯化结果2 6 4 3 2 ) 【a 因子柱上酶切结果2 7 4 3 3 重组蛋白的n i 柱亲和层析纯化一2 8 4 3 4x a 柱外去除目的蛋白的融合标签2 9 4 3 5 酶切产物的活性鉴定结果3 1 4 4 讨论31 结论：；：l 参考文献3 4 附录a 测序结果3 8 攻读硕士学位期间发表学术论文情况4 0 1 改谢1 1 辽宁师范大学硕士学位论文 引言 抗菌肽( a n t i b a c t e r i a lp e p t i d e s ) 是指存在于生物体内的，具有对抗外界微生物侵害， 清除生物体内突变细胞的一类小分子多肽。抗菌肽是在诱导条件下，生物体防御系统产 生的对抗病原体的一类阳离子活性肽，是生物体天然免疫防御系统的一个重要组成部 分，又称“第二防御体系”或“第二免疫体系”。在细菌、昆虫以及高等哺乳动物体内均普 遍存在抗菌肽。由于抗菌药物的广泛应用甚至滥用，耐药菌株不断涌现，导致抗菌治疗逐 渐陷入危机。为了化解这种危机，研究者一边通过改造传统抗生素的结构来降低细菌的 耐药性，一边积极开发研制新型的抗菌药物。抗菌肽的发现引起了科学家和医务工作者 的广泛关注。抗菌肽分子量小、理化特性稳定，能够广谱的杀伤包括耐药菌株在内的细 菌、部分真菌、寄生虫、某些病毒以及肿瘤细胞等，并且具有结合脂多糖、中和内毒素 等作用，最重要的是抗菌肽具有抗菌机制独特、对高等动物正常细胞无害、不易产生耐 药性等特点。抗菌肽被认为是目前抗生素的绝佳代替品，在医学和农业上具有潜在的重 要研究和应用价值。 生活在潮湿环境中的两栖类，体内淋巴细胞稀少，皮肤抗菌肽是其先天性防御系统 的主要组成部分。两栖类皮肤抗菌肽的结构具有多样性：结构的多样性决定了抗菌肽的7 “ 功能也具有多样性，如同时具有抗菌、抗肿瘤、抗病毒、抗原虫等活性。因此两栖类皮 肤成为抗菌肽开发的资源宝库。 中国林蛙属于两栖纲，无尾目，蛙科，蛙属，是我国东北地区特有的经济蛙种，主- 要集中于长白山、小兴安岭。本研究通过基因工程方法克隆中国林蛙皮肤抗菌肽基因 t o m p o r i n i c e a ，用大肠杆菌表达系统对其进行串联表达，并对其进行纯化、酶切研究， 为中国林蛙抗菌肽的外源表达方法提供新的思路。 中国林蛙皮肤抗菌肽t e m p o r i n - l c e a 基因的串联融合表达 1 文献综述 1 1 抗菌肽的研究进展 1 1 1 抗菌肽的发现 1 9 7 2 年瑞典斯德哥尔摩大学b o m a nh g 等最早开始了关于抗菌肽的研列1 3 】。他们 将蜡状芽抱杆菌( b a c i l l u sc e r e u s ) 注射到借古比天蚕( h y a l o p h o r ac e c r o p i a ) 蛹，诱导其产 生一种碱性多肽物质，命名为c e c r o p i n s 4 。最初人们发现这类活性多肽对细菌具有广谱 高效杀菌活性，因此命名为“a n t i b a c t e r i a lp e p t i d e s ，简称a b p ，中文译为抗菌肽。自首 次发现抗菌肽一天蚕素( c e c r o p i n s ) 后，人们相继从不同昆虫体中分离到了抗菌肽，在细 菌、真菌、两栖类、高等植物、哺乳动物以及人类中也相继发现了多种抗菌肽。特别是 在两栖动物的皮肤分泌物中更是富含大量的抗菌肽类物质，如目前研究最为深入、广泛 的m a g a i n i n s ，来源于南美蛙的d e r m a s e p t i n 以及来自日本蛙的m e l i t t i n 等【5 】。两栖类皮肤 抗菌肽是动物抵抗外来细菌、病毒入侵的第一道屏障，在动物非特异免疫机制上发挥着 极其重要的作用，是生物体不可或缺的重要成分【q 丌。抗菌肽的产生没有特异性，各种理 化因子均可作为各种生物产生抗菌肽诱导源，为一类有抗菌性强、抗菌范围广、不易产 生耐药性等优点的功能性多肽。 1 1 2 抗菌肽的结构特性及分类 抗菌肽最初是从昆虫中发现的，随后人们在各种其他生物中也相继发现许多抗菌 肽，使抗菌肽家族不断扩大，至今已在不同生物中发现了9 0 0 余种抗菌肽【8 】。抗菌肽一 般由1 2 到4 5 个氨基酸残基组成的带正电荷的两性分子，来源于不同物种的抗菌肽的一 级结构有相似之处：( 1 ) n 端富含亲水性的碱性氨基酸残基，如赖氨酸、精氨酸；( 2 ) c 端富 含疏水性氨基酸，c 末端均酞胺化。碱性带正电荷部分利于抗菌肽与细胞膜相互发生作 用，使抗菌肽易吸附到细胞膜上，抗菌肽的疏水端有利于其进入膜的磷脂双分子层以及 形成a 螺旋两亲性结构。研究表明抗菌肽的杀菌能力与a 螺旋的程度，所带的电荷数有 关，并且多肽的c 末端酞胺化会增强杀菌的能力。根据抗菌肽结构的不同可分为5 类： 单链无半胱氨酸残基( c y s ) 的或由无规则卷曲连接起来的两段a 螺旋组成的抗菌肽【9 1 ， 如m a g a m i n s 。富含某些氨基酸但不含半胱氨酸残基的抗菌肽【1 0 1 ，如半翅肽 h e m i p t c ：r i c i n 中富含甘氨酸【1 1 1 。含一对二硫键的抗菌肽，二硫键的位置通常在c 端。 如非洲爪蟾皮肤分泌的抗菌肽b 船，i n i l l s l l 2 1 。含有2 个或2 个以上的二硫键和p 折叠 一2 一 辽宁师范大学硕士学位论文 结构的抗菌肽。如绿蝇防御素【1 3 1 。由己知功能的分子量较大多肽解离而来的具有抗菌 活力的多肽。 1 1 3 抗菌肽的作用机理 从目前的研究结果看，一般认为抗菌肽的杀菌机理主要是作用于细菌的细胞 膜，破坏细胞膜的完整性并产生穿孔现象，造成胞内内溶物溢出而使细胞死亡。也有学 着提出了不同的看法，对抗菌肽的作用机制目前还未能达成共识。研究认为有5 种作用 机理： ( 1 ) 对质膜的攻击作用抗菌肽与质膜的相互作用是目前研究抗菌肽作用机理的主 要集中问题。大量研究表明，抗菌肽主要是作用在细菌的细胞膜上，通过破坏细胞膜的 完整性来发挥抗菌的效应，即以物理的方式使细胞膜穿孔，造成阳离子外流，从而引起 胞内溶质大量渗出，最终导致细胞的死- i = 1 4 , a s 】。抗菌肽分子的a 螺旋具两亲性，所以当 抗菌肽分子相互聚集在一起时可形成离子通道，使细菌失去细胞膜的保护，不能保持正 常的渗透压而死亡。例如抗菌肽天蚕素的两亲性q 螺旋中的正电荷与细菌细胞膜磷脂“ 分子上的负电荷之间能够产生静电吸引，从而结合聚集在质膜上，接着抗菌肽分子中的 疏水c 端a 螺旋能够插入到疏水质膜中央，而两亲性a 螺旋则留在细胞膜表面，于是 打乱了质膜上蛋白质和脂质排列顺序，使得膜外的正电荷增多，超过阈值时导致质膜去 极化【1 6 1 。不同抗菌肽及同一抗菌肽对不同细菌的最小致死浓度均有很大不同，就是因为 抗菌肽对细菌细胞壁的透过能力不同。 ( 2 ) 抑制细胞呼吸f e h l b a u m 等【1 7 】从刺肩蝽体内分离得到一种抗菌肽t h a n a t i n ，它 不是通过改变细胞膜的通透性来杀菌的。用4 0 p m o l lt h a n a t i n 处理细菌l h 后，可明显监 测到细菌呼吸作用变弱，6 h 后呼吸完全停止，因而认为t h a n a t i n 可能是通过调控细胞的 呼吸作用来杀菌的。 ( 3 ) 攻击线粒体b o b e k 等【墙】发现人唾液中提取的抗菌肽m u c 7 2 0 对真菌和细菌 有很强的杀伤作用，其线粒体出现肿胀、嵴脱落和排列不规则等一系列异常状态，表明 m u c 7 2 0 的作用机制可能与对线粒体的攻击有关。 ( 4 ) 抑制细胞壁的形成在细菌的细胞壁未形成时，抗菌肽s a r e ot o x i n s l l 对抑制细 菌细胞壁的形成效果明显，能够使细菌的生长受到阻碍【嘲。 ( 5 ) 抑制细胞内d n a 的合成有的抗菌肽还可以通过抑制癌细胞d n a 的合成、断 裂癌细胞d n a 的方式杀死癌细胞【2 0 】。 中国林蛙皮肤抗菌肽t e m p o r i n - l c t a 基因的串联融合表达 1 1 4 抗菌肽的应用 ( 1 ) 在食品工程中的应用抗菌肽是食品工业中十分优良的防腐剂、保鲜剂、保藏剂。 实验证明，抗菌肽对人畜无毒害作用，而对革兰氏阴性、革兰氏阳性菌有杀灭或抑制微 生物生长的作用。在酸性条件下抗菌肽的活性很强，耐受p h 值范围宽泛且有良好的溶 解性和稳定性，因此对于酸性食品，尤其对饮料是卓越的防腐剂。最早发现于1 9 2 0 年 的抗菌肽乳链菌肽是目前研究较为清楚的阳离子抗菌肽，己被5 0 多个国家注册为食品 保藏剂。 ( 2 ) 在医药方面的应用微生物很容易通过基因突变对传统的抗生素产生耐受性，而 微生物几乎不可能通过基因突变的方式来对抗抗菌肽，并且抗菌肽具有抗细菌、真菌、 病毒和肿瘤细胞却不破坏人体正常细胞的功效，被认为将在医药工业上有着广阔的应用 前景。不同种类抗菌肽的抗菌活性有所不同，抗菌谱也存在差异，但也有许多相似之处 【2 1 1 ，因此寻找高效广谱的生物抗菌肽具有相当重要的意义，一直是广大临床医疗工作者 和科研工作者努力的方向。来自两栖类皮肤的抗菌肽m a g a n i n 作为基因工程药物正在进 行临床三期试验。美国i - i b m 公司对天蚕抗菌肽的突变体c y t o p o n n s 正在进行临床应用 研究【冽。加拿大i n t r ab i o n f i c s 公司开发的i s e g a n a nh c l o r a l s o l u t i o n ，对治疗呼吸道感染 及口腔粘膜炎，疗效显著】。我国以五龄家蚕为材料，经热激诱导后制成干燥粉末，装 入胶囊作口服药物治疗肝炎。经1 3 6 例肝炎临床试验，有效率达7 6 5 刚。 ( 3 ) 在动物或植物基因工程技术上的应用通过基因工程技术将抗菌肽基因导入动 物或植物体内，能够增强动植物体对各种病原菌的抵抗力。1 9 8 3 年一种含有抗生素药类 抗体的烟草在美国问世，这是世界上第一例转基因植物。美国是世界上转基因作物最多 的国家，最主要的转基因作物包括大豆、玉米、棉花和油菜种等，主要用于动物饲料生 产、炼油及制药等。我国在抗菌肽转基因水稻，马铃薯、棉花、果树等农作物育种上也 是硕果累累。 1 2 两栖类皮肤抗菌肽的研究进展 1 2 1 两栖类皮肤抗菌肽的结构特点和防御机制 两栖类抗菌肽一般由l l _ 4 7 个氨基酸残基构成。来源于b o m b i n a 属的一些抗菌肽如 b o m b i n i nh 含有d 氨基酸：约5 0 的抗菌肽c 端酰胺化；两栖类皮肤抗菌肽都含有一些精 氨酸和赖氨酸残基，因而是阳离子肽；几乎所有的两栖类皮肤抗菌肽都含有较多的亮氨酸 和异亮氨酸残基。所以是疏水肽；绝大多数肽分子在水溶液中呈无规则卷曲构象，而在亲 脂性溶液( 如5 0 的三氟乙醇溶液) 中或接触到平面脂双层时能够形成两亲性洳螺旋结 构 2 5 - 2 8 】。不仅不同种类的两栖类皮肤中有不同种类的抗菌肽，而且单个种类甚至单个个 一4 一 辽宁师范大学硕士学位论文 体的两栖类皮肤中的抗菌肽结构都存在大量的不同，因此两栖类皮肤抗菌肽的结构表现 为多样性的特点【2 9 】。 两栖类的生存环境及裸露、湿润的皮肤都有利于细菌的滋生，为了抵抗病原微生物 的入侵，在进化过程中两栖类形成了三道防线：第一道防线是物理屏障，即包裹于皮肤 外表面的粘液腺分泌大量糖蛋白和蛋白聚糖【3 0 】，构成一道天然屏障，阻碍病原菌的入 侵；第二道防线是获得性免疫系统，即皮肤中的抗体i g g 3 1 1 ；第三道防线是先天性免疫 系统【加一2 】，其中的皮肤抗菌肽是先天性免疫系统的主要组成部分。两栖类皮肤抗菌肽具 有抗菌、抗肿瘤、抗病毒、抗原虫等活性，正电荷对于抗菌肽的活性起着非常重要作用。 抗菌肽对哺乳动物正常细胞一般没有损伤，但是大多数两栖类皮肤抗菌肽在高浓度下甚 至少数抗菌肽在低浓度下有溶血作用，因此对哺乳动物的正常细胞也存在一定的毒性。溶 血作用的强弱与疏水残基的含量有关，疏水残基含量越高往往溶血作用也越耐3 引。 1 2 2 两栖类皮肤抗菌肽的基因工程研究进展 研究抗菌肽的前提是解决抗菌肽的生产问题。天然两栖类皮肤抗菌肽的含量十分稀 少，并且从生物体内分离抗菌肽的步骤繁琐，产率较低，远远满足不了研究和临床应用 的要求；化学合成成本太高；飞速发展的基因工程技术成为抗菌肽大规模生产的主要途 径。 ( 1 ) 融合表达法运用重组d n a 技术能够获得大量的两栖类皮肤抗菌肽。但异源表 达抗菌肽面临一些困难：一是由于抗菌肽会抑制细菌生长，并且高浓度下对真核细胞也有 一定的毒性，因此不能直接在原核或者真核表达体系中表达抗菌肽；二是抗菌肽分子量较 小，转录的m r n a 一般只有1 0 0 , - 2 0 0 b p ，同时其表达的抗菌肽在中也容易被表达细胞识 别而降解，因此很难实现抗菌肽的大量表达阡弘1 ；目前，在基因工程中通常采用融合表达 的方式生产抗菌肽。融合表达法是将一段适合在细菌中表达的蛋白质序列连接在抗菌肽 的n 端，表达出的融合蛋白没有杀菌活性，。不会对宿主造成伤害且防止了抗菌肽被 表达宿主的降解，而有效的提高了抗菌肽基因的表达水平。 目前已有几个成功融合表达两栖类皮肤抗菌肽的报道【3 3 1 。m a g a i n i n 和e s c u l e n t i n 2 1 都能采用将蛙皮抗菌肽融合在表达蛋白质的c 端来获得。如果表达产物是包涵体形式则 更为有效【3 7 】。在大肠杆菌中大量表达外源融合蛋白容易形成不溶性产物包涵体。包涵 体的形成主要是由于肽链折叠过程中部分折叠的中间态之间特异性的错误聚合。包涵体 是表达蛋白不正确的折叠形式，因此常常是没有活性的，但抗菌肽的包涵体形式可提高 目的蛋白的稳定性，利于分离纯化。可利用纯化包涵体的方法收集表达蛋白，再通过复 性的方法使抗菌肽的包涵体形式恢复活性。2 0 0 8 年【弼】，陈晓平等采用s o e 法人工设计 中国林蛙皮肤抗菌肽t e m p o r i n - l c f 擅基因的串联融合表达 和合成两栖类皮抗菌肽m a g a i n i ni i 基因，以p e t2 8 a 表达载体，h i s 融合的方式在e c o i l b l p 中表达，经镍柱亲和层析纯化包涵体后，对融合蛋白的包涵体进行变性、复性和切 除融合标签，通过活性试验证明表达产物具有抗菌活性。抗菌肽的包涵体形式易于纯化 目的蛋白，但是溶解和重折叠这些抗菌肽的过程复杂，存在许多变数，产率往往不高。 对于大多数的抗菌肽来说，往往希望减少包涵体的产生，增加可溶性的表达形式。通过 使用合适的融合表达系统来改善可溶性蛋白的表达量，还可通过对各种影响细菌生长的 因素来改善，如通过改变发酵条件：降低发酵温度、加入不能代谢的糖、降低培养基的 p h 值等来改善表达蛋白的溶解性。 ( 2 ) 串联表达法抗菌肽分子量较小，克隆、表达、纯化、检测都会有一定困难，为 了减少外源表达引起的目的蛋白的低含量，从源头上提高目的蛋白的收率，人们采用一 个基因多拷贝同向串联融合表达的策略，将抗菌肽基因多拷贝同向串联，并克隆到载体 中。抗菌肽基因的串联表达不仅极大的提高了抗菌肽的产量，而且也大大的降低了抗菌 肽对表达宿主的毒性。为了方便串联基因的分离常在串联体间引入一些切割位点，如甲 硫氨酸密码子( a t g ) 。甲硫氨酸经c n b 砌割作用后转变成高丝氨酸，不影响抗菌肽的生 物活性，使串联基因相互分离。2 0 0 5 年【3 引，栗学清等构建了两栖类皮肤抗菌肽a u r e i n l 2 基因多拷贝串联体，并将基因串联产物克隆到载体p u c l 8 上，方便高效地获得了所需要 的多拷贝基因。 另外还可以通过将几种抗菌肽相串联形成杂合抗菌肽的方法来提高目的蛋白的产 量。目前，有许多关于两栖类皮肤抗菌肽杂合肽基因在原核微生物中克隆与表达的报道。 2 0 0 3 年m ，周霞等构建了天蚕素a 两栖类皮肤抗菌肽杂合基因，克隆到具有自切割功能 的表达载静n 曰1 2 上，并在大肠杆菌b l 2 1 中成功表达，经纯化后显目的蛋白对大肠杆 菌和金黄色葡萄球菌有抗菌活性。串联表达的方法不受限制酶和载体的局限，既可以提 高外源蛋白的表达量和稳定性，又不影响抗菌肽的活性，可适用于多种基因和载体。 1 2 3 融合蛋白中的标签蛋白技术 抗菌肽在基因工程中常采用融合表达的方式进行生产，就是在抗菌肽的n 端融合一 段蛋白序列，这段蛋白被称做标签蛋白。标签蛋白不仅能起到降低抗菌肽毒性，提高抗 菌肽表达的稳定性的作用，它还使抗菌肽能够进行亲和纯化从菌体蛋白中分离出来。在 选择抗菌肽融合标签蛋白过程中一般应遵循如下原则：抗菌肽是分子量小于5 k d a 的小 分子多肽，如标签蛋白的分子量为抗菌肽的3 4 倍，在从融合蛋白切割后会非常有利于 抗菌肽的分离，标签蛋白的分子量不宜过大【4 1 1 ；抗菌肽是阳离子肽，所选标签蛋白应 为酸性蛋白，从而中和抗菌肽的正电荷【4 2 】标签蛋白应具有亲水性或特殊水融性，使 辽宁师范大学硕士学位论文 融合蛋白能够以可溶性或以特殊水融性蛋白的形式表达，便于纯化；在标签蛋白和抗菌 肽之间应存在敏感切割位点，便于表达的标签蛋白与抗菌肽的分离【4 3 1 标签蛋白对表 达宿主无毒性。 每一个亲和标签都有特定的缓冲液条件。因此大规模生产重组蛋白质策略有所不 同。一种方法是使用分子量很小的肽标签，这种小肽标签不会干扰融合的蛋白质的活性。 这类标签有多聚精氨酸标签，f l a g - t a g ，多聚组氨酸标签，c - m y c - t a g ，s t a g ，和s t r e ph - t a g 。 这些小标签不具有免疫原性，经常可以直接作为抗原用于生产抗体m 。对于某些应用， 小标签无需去除，十分方便。另一种方法是使用分子量较大的标签蛋白质作为融合单体。 大标签的使用可以增加目标蛋白的溶解性；缺点是对于某些应用，如结品或抗体产生等， 标签必须去除。一般说来，对于特定的目标蛋白质很难确定选择何种融合系统是最佳的。 往往需要综合考虑目标蛋白本身的理化性质( 如稳定性、疏水性) ，表达系统以及纯化后 蛋白的用途。目前成功的融合表达系统主要有：g s t 系统肛半乳糖苷酶系统麦芽 糖结合蛋白m m p ) 系统金黄色葡萄球菌蛋白a 系统纯化标签融合：如f l a g - t a g 和 s i s - t a g 其他融合系统，如硫氧还原蛋白等 4 5 1 。 1 3 本研究的意义和内容 一 一三? 两栖类皮肤抗菌肽是两栖动物天然防御系统的主要组成成分。它通过干扰细菌细胞 膜结构导致质膜通透性增大，从而起到抑菌或杀菌作用，由于其独特的抗菌机制使抗菌 肽不同于传统的抗生素，病原体对其不易产生抗药性，且对人体正常细胞几乎无毒害作i ：， 用。在耐抗生素病原菌株频繁出现，病毒和肿瘤等疾病对人类健康造成极大威胁的情况 下，抗菌肽有望成为新一代的抗菌药物。目前，如何降低生产成本，提高抗菌肽的产量 和纯度是抗菌肽开发利用迫切需要解决的问题。天然提取抗菌肽造价高，工艺复杂；化学 合成费用昂贵；基因工程技术无疑为抗菌肽开发利用提供了有利条件。随着基因工程技 术的飞速发展和分子生物学技术的提高，抗菌肽在医药、农业和科研等领域将有着广阔 的应用前景。 本研究利用基因工程的方法构建了中国林蛙皮肤抗菌肽串联融合表达载体。根据中 国林蛙皮肤抗菌肽t e m p o r i n - 1 c e a 的氨基酸序列，运用化学合成的方法将6 个 t e m p o r i n 1 c e a 基因通过甲硫氨酸同向串联，与克隆质粒相连接，利用此载体转化大肠杆 菌j m l 0 9 ，p c r 测序鉴定确定阳性克隆后，经过酶切后与表达载体p e t - 4 2 a ( + ) 连接形成 融合表达并转化至大肠杆菌表达菌b l 2 1 ，p c r 检测确定阳性克隆。i p t g 诱导融合蛋白 表达，s d s p a g e 凝胶电泳检测目的蛋白的表达情况。表达产物经过g s t 亲和层析、n i 2 中国耕嘲担明翘柏密肽t e m p o r i n - l c e a 基因的串彤融合。表达 和层析柱纯化及凝血酶切割，得到纯度较高的抗菌肽t e m p o r i n 一1 c e a ，最后检测 活性。为基因工程方法制各抗菌肽提供新的思路。 一8 一 辽宁师范大学硕士学位论文 2 串联融合表达载体的构建 2 1实验材料 ( 1 ) 菌株和质粒：大肠杆菌j m l 0 9 、b l 2 1 ( d e 3 ) 、克隆质粒载体p s i m p l e 1 9e