（遗传学专业论文）家蝇抗菌蛋白多肽的诱导、纯化及相关基因分离的研究.pdf

南开大学博士研究生毕业 ( 学位) 论文摘要 个与c e c r o p i n s 类似。 用反相h p l c技 术， 从蛹中 分 离到一 种分子量在6 2 0 0 左 右的 抗菌 肤，可能与幼虫中的 p 6 2 0 0 一致， 也有明显的 抗革兰氏阳性球菌活性， 而对大肠杆菌效果不明显。从家蝇体内分离本文中抗菌相关蛋白/ 多肤的工作， 尚 未 见 报 道 。 y d 利用d d r t - p c r技术对家蝇成虫的免疫诱导基因进行了 分离。共选定并回 收到三组差异带，分别命名为 t , , 毛、 t , ， 其片段大小分别约为4 5 0 b p , 2 8 0 b p 和 8 0 b p e 件 过 再 扩 增 克 隆 、 丁 1 和t 2 都克隆到了p u c m - t 转化反应后，用 p s t i 酶切提取的质粒结果表明， 载 体 上 并 转 化 成 功 。 目 前 正 在 测 序 。 ta 经过免疫诱导后，家蝇抗菌物质粗提液中存在一些不知名的生长因子，在 抑菌实验中，它们的存在促进了细菌的生长， 的表现。这类成分在高温下会失活或部分失活 同时也掩盖了部分抗菌物质活性 归和多项式回归分析结 果表明，家蝇蛹体内存在两种耐热生长因子，分别为 1 3 7 0 0和 5 0 0 0 蝇幼虫有一种耐热生长因子， 分子量为7 6 9 0 ，它们的合成表达与创伤诱导有关。 目 前 尚 未 见 到 关 于 家 蝇 体 内 生 长 因 子 研 究 的 报 道 少 丫 一- 关键词 : 家 蝇 ;诱 戴 抗 菌 蛋 白 / 多 肚 ;抗 菌 活 性 ;分 离 纯 化 ; 生长因子: d d r t - p c r 南开大学博士研究生毕业 ( 学位)论文ab s t r a c t t h e i n d u c e m e n t a n d p u r i f i c a t i o n o f a n t i b a c t e r i a l p r o t e i n s / p e p t i d e s a n d i s o l a t i o n o f i m m u n i t y - r e l a t i v e g e n e s i n h o u s e f l y ab s t r a c t i n s e c t s r e s p o n d t o b a c t e r i a l c h a l l e n g e a n d t o i n j u ry b y t h e r a p i d a n d t r a n s i e n t s y n t h e s i s o f p o t e n t a n t i b a c t e r i a l p e p t i d e s . t h e s e a r e m o s t l y s m a l l , c a t i o n ic p e p t i d e s w i t h l a r g e s p e c t r u m o f a c t iv i t y a g a i n s t g r a m p o s i t i v e a n d / o r g r a m n e g a t i v e b a c t e r i a . wh a t s m o r e , t h e y c a n k i l l s o m e v i r u s a n d c a n c e r c e l l s . i n s e c t p e p t i d e s m a y b e c o m e p r o m i s i n g m e d i c i n e s i n t h e f u t u r e . h o u s e fl y ( m u s c a d o m e s t i c a ) i s o n e o f t h e m o s t i m p o r t a n t k i n d s o f i n s e c t s a n d i t h a s s t r o n g a b i l i t y t o a d a p t t o t h e a d v e r s e c i r c u m s t a n c e s . i t i s o f m o m e n t o u s t h e o r e t i c a l a n d p r a c t i c a l s i g n i f i c a n c e t o r e s e a r c h t h e i m m u n i t y s y s t e m o f h o u s e fl y . d i ff e r e n t i n d u c i n g m e t h o d s , s u c h a s u lt r a s o n i c t r e a t m e n t , p r i c k i n g t r e a t m e n t , p r i c k i n g w i t h b a c t e r i a , b a c t e r i a - b r e e d i n g , w e r e r e s e a r c h e d t o in d u c e a n t i b a c t e r i a l s u b s t a n c e s . t h e r e s u l t s s h o w t h a t a l l t h e me t h o d s c o u l d i n d u c e a n t i b a c t e r i a l s u b s t a n c e s t h a t h a d s t r o n g a c t i v i t y a g a i n s t g r a m p o s i t iv e b a c t e r i a i n l a r v a e , p u p a e a n d i m a g o o f h o u s e fl y , a n d t h e i n d u c i n g k i n e t i c s w e r e d i ff e r e n t b e c a u s e o f t h e p e r i o d s a n d i n d u c i n g m e t h o d s . t h e r e s u l t s o f p a g e s u g g e s t e d t h e r e w e r e a t l e a s t 5 p r o t e i n s / p e p t i d e s t h a t w e r e i n d u c e d t o e x p r e s s b y p r i c k i n g a n d u l t r a s o n i c t r e a t m e n t . t h e y a r e a l l c a t i o n i c p o l y p e p t i d e s . s o m e o f t h e a c t i v it y w o u l d l o s s w h e n t r e a t e d w i t h b o i l i n g w a t e r . t h e r e l a t i o n s b e t w e e n a n t i b a c t e r i a l a c t i v i t y a n d s p e c i fi c p r o t e i n s / p o l y p e p t i d e s e x p r e s s e d u n d e r i n d u c i n g i n h o u s e fl y p u p a e a n d l a r v a e w e r e i n v e s t i g a t e d b y t h e m e t h o d s o f s d s - p a g e c o m b i n e d w it h s t e p w i s e r e g r e s s i o n a n a l y s i s a n d r e s p o n s e s u r f a c e r e g r e s s i o n a n a l y s i s . x , ( 1 3 7 0 0 ) . x 6 ( 7 6 0 0 ) a n d x s ( 5 0 0 0 ) i n p u p a e , x , 2 ( 7 6 9 0 ) , x 1 3 ( 5 8 6 0 ) . x , ( 2 6 0 0 0 ) , x , 6 ( 3 0 0 0 ) . x , ( 1 2 3 9 0 ) i n l a r v a e ( r a n k e d a s t h e i r c o n t r i b u t i o n ) t h a t w e r e e x p r e s s e d u n d e r i n d u c i n g p l a y e d im p o r t a n t r o l e s t o a n t i b a c t e r i a l a c t i v i t y . 茂 in p u p a e , x 13 x i 、x 1 6 . x ,0 i n l a r v a e m a d e p o s i t i v e c o n t r i b u t i o n t o a n t i b a c t e r i a l a c t i v i t y . h o w e v e r , x 4 , x b in p u p a e a n d x , 2 i n l a r v a e m a d e n e g a t i v e c o n t r i b u t i o n t o a n t i b a c t e r i a l a c t i v i t y . i t w as d e d u c e d t h a t x 4 , x 8 , x 12 w e r e f a c t o r s t h a t s t i m u l a t e d c e l l t o g r o w r a p i d l y . t h e a n t i b a c t e r i a l c r u d e w e r e p u r i f i e d u s i n g h e a t i n g a c i d 盆 南开大学博士 研究生毕业 ( 学位)论文ab s t r a c t tr e a t m e n t , u l tr a f i l tr a t i o n , c m- s e p h a r o s e i o n e x c h a n g e c h r o m a t o g r a p h y , s e p h a d e x g - 7 5 g e l c h r o m a t o g r a p h y , s o l i d p h a s e e x tr a c t i o n a n d r e v e r s e p h a s e h p l c , e t c . t h e s a m p l e s w e r e a n a l y z e d b y s d s - p a g e . t h e r e s u l t s i n d i c a t e d t h a t f i v e a n t i b a c t e r i a l s u b s t a n c e s a g a i n s t g r a m p o s i t iv e b a c t e r i a w e r e p u r i f i e d f r o m l a r v a e a n d o n e f r o m p u p a e , t h e y w e r e p m ow, p ，二。 ， p b z p p , p 2 0 w ( fr o m l a r v a e ) a n d p 6 z o o ( fr o m p u p a e ) . i n t h i s p a p e r , w e a l s o i s o l a t e d t h e i m m u n i t y - r e l a t e d g e n e s u s i n g d d r t - p c r . w e s e l e c t e d t h r e e d i ff e r e n t i a l b a n d s a n d n a m e d t h e m t t i a n d t , . t h e s e f r a g m e n t s w e r e 4 5 0 b p , 2 8 0 b p a n d 8 0 b p r e s p e c t i v e l y . a ft e r r e a m p l i f i c a t i o n , c l o n i n g a n d t r a n s f o r m a t i o n , t h e p l a s mi d s w e r e e x tr a c t e d . t h e r e s u l t s o f t h e p s t i d i g e s t i o n i n d i c a t e d t h a t t 毛w e r e s u c c e s s f u l l y c l o n e d . s e v e r a l r e s u l t s i n t h i s p a p e r s u g g e s t e d t h a t s o m e u n n a m e d g r o w t h f a c t o r s w e r e e x p r e s s e d w h e n t h e h o u s e fl i e s w e r e i n d u c e d . t h e y c o u l d s t i m u l a t e b a c t e r i a t o g ro w t h r a p i d l y a n d s c r e e n e d t h e a n t i b a c t e r i a l a c t i v i t y t o a c e r t a i n e x t e n t . k e y w o r d s : h o u s e fl y ( mu s c a d o m e s t i c a ) ; i n d u c e m e n t ; a n t i b a c t e r i a l a c t i v i t y ; a n t i b a c t e r i a l p r o t e i n / p e p t i d e ; p u r i f i c a t i o n ; g r o w t h f a c t o r ; d d r t - p c r i v 南开大学博士研究生毕业 ( 学位)论文材料和方法 材 料 与 方 法 1 家蝇的饲养 1 )饲养配方: 成蝇饲料:奶粉和白糖按照 1 : 1 的比例配制 幼虫饲料:麦数: 奶粉:水= 3 3 0 : 1 4 0 :7 5 0 , p h 6 .5 - 7 . 0 2 )家蝇的饲养管理: 种蝇为遗传工程研究室长期养殖，最初是由收集野生家蝇所产卵孵化而 来。 成蝇的饲养管理:将蛹放在种蝇笼内，室温下培养 3 - 4天即可羽化，羽 化前放入成蝇饲料和水，并按实际情况进行更新。成虫羽化后 2 -3天开始交 尾， 4 天后开始产卵。产卵期间注意相对湿度不宜太高。 蝇卵的收集:成蝇羽化后3 天时在笼内放入产卵盒，产卵盒中松散地放置 诱导产卵的物质 ( 万分之一的氨水拌麦数)，每天收集两次，连同诱导产卵物 质一同加入饲料中。成蝇产卵期一般2 5 天左右，但高峰在前1 5 天，高峰过后 即可淘汰。蝇笼灭菌消毒后再用。 幼虫饲养: 接种时将蝇卵均匀地撒在饲料面上， 每立方厘米放2 0 - 2 5 粒， 3 0 左右饲养。幼虫孵化后向下取食，可根据生长情况、幼虫密度、饲料消耗 情况及时 补充 新鲜饲料。 如 在3 0 恒温下4 - 5 天 后， 幼虫可 达2 0 - 2 5 m g , 5 -6 后达到老熟， 选择干燥环境下化蛹。可在饲料表层撒一层干的麦数，为幼 虫提供化蛹环境。 大多数幼虫化蛹后将饲料和蛹一起收集，用分样筛将蛹和饲料分开;或者 放入水中，漂在上层的是蛹，而饲料沉降到底部，将蛹捞出、晾干。蛹集中后 用5 %甲醛溶液浸泡5 分钟，再用无菌水冲洗、无菌滤纸吸干后置于培养皿内， 放入蝇笼。 卵灭菌:虫卵用灭菌水洗后，用5 %甲醛溶液浸泡5 分钟，再用无菌水冲 洗、 无菌滤纸吸干后移入育幼虫的 饲料中。 饲养温度为3 0 1c . 2 供试菌株 溶 壁微球菌 ( m i c r o c o c c u s l u t e u s ) ， 金 黄色葡萄 球菌( s t a p h y l o c o c c u s a u r e u s ) 大肠杆菌( e s c h e r i c h i a c o l i ) 、 枯草 杆菌 ( b a c i l l u s s u b t i l is ) ， 变形杆菌 ( p r o t e u s v u l g a r i s )， 本实验室保存。 培养基成分及细菌培养: l b固 体培养基: n a c i l 0 g / l t ry p t o n e 1 0 g / l 南开大学博士研究生毕业 ( 学位)论文材料和方法 y e a s t - e x t r a c t 5 g / l 琼脂1 2 g / l p h 7 .4( 氢氧化钠调节) l b液体培养基: n a c l l o g / l t r y p t o n e i o g / l y e a s t - e x t r a c t 5 g / l p h 7 .4( 氢氧化钠调节) 3 抗菌物质的诱导 用多种方法对不同龄期的家蝇幼虫、蛹以及成虫进行诱导处理。 1 )针刺诱导:挑取所需家蝇材料，冲洗干净。诱导处理前将幼虫和成虫 用乙醚麻醉，使其活动暂时停止，然后在冰块上迅速诱导;对于蛹，可直接进 行诱导。用细昆 虫针由 后向前斜刺入昆 虫腹腔， 每只各刺一针。 2 ) 带菌针刺诱导: 培 养细菌( 溶壁微 球菌、 大 肠杆菌) 至 对数 期， 5 ,0 0 0 r p m 离心，用细昆虫针蘸取少量菌液，斜刺入昆虫腹腔。分别以溶壁微球菌、大肠 杆菌、混合菌 ( 两种菌等量合并)带菌针刺诱导。 3 ) 饲喂大肠杆菌诱导:将家蝇幼虫养至 3龄，分出一部分，置另一容器 中， 所配 制的 饲 料中 含有大量 溶壁微球菌 和大肠杆菌 ( 每 1 0 0 g饲料中 含有处 于对数期的两种细菌各5 0 m l )，培养一定时间。 4 )超声波诱导:选取实验材料，将幼虫和蛹清洗干净，置于干净烧杯中， 加入少量无菌蒸馏水，然后放在超声波洗涤仪中进行超声波处理。 探索最佳处 理时间。 免疫家蝇的饲料:将诱导后的幼虫放在一方盒内，内有幼虫饲料，在需要 的时间内取出;将处理后的蛹放置于烧杯内，纱布封口，饲养一定时间后提取 抗菌物质。另外，将各种诱导家蝇材料各取1 0 0 只 ( 包括幼虫、蛹、成虫) 放 一专门容器内，配以对照，观察处理后的成活情况，统计成活率。 4 免疫家蝇的收集和抗菌物质粗提液的制备 各种方法诱导处理家蝇后，养殖一段时间，取出，无菌水洗净，无菌滤纸 吸干虫体表面水分，称鲜重，同时以未处理的家蝇作为对照。 在制备抗菌物质粗提液时，进行多种方法的尝试: 1 )直接吸取血淋巴法:直接用毛细管提取血淋巴，吹入内有少量苯硫w 的0 . 5 m 1 离心管中，-7 0 冰箱保存备用。 ( 适用于幼虫、蛹、成虫) 2 )研磨提取法:免疫家蝇幼虫收集后，1 0 0 沸水瞬时处死，滤掉水分， 吸 水纸上晾干， 称鲜重， 加入一定 量含 有0 .2 %疏基乙 醇、 1 0 0 u g / m l p m s f( 多 种蛋白酶的抑制剂，有剧毒，半衰期为半个小时，可加热分解)的无菌蒸馏水 南开大学博士研究生毕业 ( 学位)论文材料和方法 溶液，置电动搅拌机中 搅碎，将匀浆液离心取上清，加少量苯硫服，于冷冻干 燥机中浓缩，-7 0 冰箱保存备用。此法适用于大量制备抗菌物质，并且加热 处死法只适用于幼虫，因为蛹和成虫用沸水瞬时处理时虫体体液外泄，造成免 疫血淋巴的流失。 免疫家蝇的蛹、成虫或幼虫洗净后称重，在液氮下研磨，用含有 0 .2 % 琉 基乙 醇、 1 0 0 u g / m l p ms f 或a p r o t i n i n 的 抽提液于冰浴中抽提半小时， 1 5 , 0 0 0 r p m 4 离心3 0分钟，取上清，加入少量苯硫脉，一部分置于冰箱保存，一部分浓 缩干燥，用灭菌水定容，用于各种处理。从冰箱取出时，用药匙可以将上层脂 类刮去，无菌滤纸吸附，可以去除大部分脂类物质。 5 杭菌活性的测定 1 ) 抑菌圈法:参阅 文献 ( s t e i n e r h , 1 9 8 1 ) 进行， 有改动。 通过测定琼脂 板上的抑菌圈来分析抗菌活性。l b液体培养基培养细菌至对数期;将固体培 养基加热化开， 冷却至5 0 左右， 取适量上述菌液加入固体培养基( 2 0 闪菌液 / l o o m l 培养基) ，摇匀后铺板，置冰箱半小时后在平板上打一些小孔， 每空加 入所测样品2 闪 ， 3 7 下培养1 一3 天后， 记录抑菌圈大小。 2 )比 浊法:参阅文献 ( h u l t m a r k d , 1 9 8 0 ) 进行，有改动。 用 l b液体培 养基活 化大 肠杆菌、 枯草 杆菌、 溶 壁微球菌等到对数期， 5 , 0 0 0 r p m离 心 1 0 分 钟， 收 集菌体， 用冷冻的p h 6 .4 . 0 . 1 m的 磷酸钠缓冲液悬浮， 并 稀释到 对数期 浓度， 大肠杆菌a 5 7 0 0 .3 - 0 . 5 湘似方法悬浮干燥的m .l u t e u s 至a 5 7 0 0 .2 - 0 .3 , 取一 定量( 1 0 川 ) 的 样品( 可 根据样品 浓 度而定， 只要保持一致即 可)， 加到 i m l 冰浴的菌悬浮液中，对照加缓冲液， 3 7 培养半小时后转入冰浴，一般在 共育一个小时测定光吸收。一个裂解活性单位为: e .c o l i : u=寸 ( a o 一 a ) / a a :处理菌悬液的光吸收 6 杀菌动力学分析 ml u t e u s : u = ( a o - a ) / a a o : 对照菌悬液的 光吸收。 1 )用比浊法测定抗菌活性:取一定量的样品与菌悬液一起室温下共育， 不同时间测定其吸光度，并且于相应时间吸取少量菌悬液，稀释一定倍数后铺 平板，一天后统计菌落个数，得到的数据用于统计学分析。 2 ) 液体生长抑制分析: 参阅 文献 ( b u l e t p , 1 9 9 3 ) ， 略有改动。纯化过程中 各不同组分的抗菌活性的分析可按照此法进行。i o u l 的待测样品与 i o o u l 对数 中 期细胞在微量滴定板上培育， 起始时a 6 a o = 0 . 0 0 1 ， 通过共育 ( 2 4 小时，2 5 0c ) 后，用a 6 o o 的增长率来评价细菌的生长。 南开大学博士研究生毕业 ( 学位)论文材料和方法 7 电泳分析 本文中要对抗菌物质进行不同形式、不同浓度的碱性、酸性和 s d s变性 聚丙 烯酞胺凝胶电 泳的 探索，主要方法参照张承圭等 ( 1 9 9 0 )。 7 . 1 非变性平板凝胶的制备与电泳 1 )连续缓冲体系凝胶配制: 最终丙烯酞胺浓度 ( %) ( m 1 ) 贮备溶液 2 0 . 01 7. 51 501 2 . 51 0 . 07 . 5 丙烯酞胺:双叉丙烯酞胺 ( ac r : b i s = 3 0 : 0 .8 ) 1 0 . 08 . 7 57 . 56 . 2 53 . 2 5 缓冲液 ox) 1 0 %过硫酸胺 ( a p ) 0 . 1 2 50 . 1 2 5 0 . 1 2 5 0 . 1 2 5 0 . 1 2 5 0 . 1 2 5 tem e d0 . 0 0 80 . 0 0 8 0 . 0 0 8 0 . 0 0 8 0 . 0 0 8 0 . 0 0 8 凝胶混合溶液总体积加水至总体积 1 5 m 1 2 )不连续缓冲体系凝胶配制: 最终分离胶丙烯酞胺浓度 %) ( m i ) 贮备溶液浓缩胶 2 0. 0 1 7 . 51 5 . 0 1 2 . 5 1 0 刀7 . 5 807 . 0605 . 04 . 03 . 0 l020 幼01 l50l l50l l50l l501 l50l ac r : bi s ( 3 0 : 0 . 8 ) 浓缩胶缓冲液贮液 分离胶缓冲液贮液 1 0 %ap tem ed 0 . 0 4 0 . 0 0 40 . 0 0 8 0 . 0 0 8 0 . 0 0 80 .0 0 8 0 . 0 0 8 0 . 0 0 8 1; t 体积加水到 4 m 1加水至总体积 1 2 m 1 3 )不连续缓冲体系缓冲液的配制: 碱性电 泳:电 泳时 浓缩胶p h 8 . 3 ，分离 胶p h 9 .5 a 浓缩胶缓冲液: t ri s - h c i ( p h 6 . 8 ) , 6 . 0 g t ri s 溶于4 0 m l 水中， 用i m o l/ l h c l 滴定至p h 6 . 8 , 然后加水至终体积1 0 0 m l ( 0 .5 m ) , 分离胶 缓冲液: t ri s - h c i ( p h 8 . 8 ) , 3 6 .3 g t ri : 和4 8 .o m l l m o l/ l h c l 混合， 加水定容到l 0 0 m l 或滴定到p h 8 . 8 , 电 极缓冲液: t ri s - g l y ( p h 8 . 3 ) , 3 .o g t ri s 和 1 4 .4 g g l y用水溶解并定容到 1 0 0 0 m1 o 酸性电 泳:电 泳时浓缩胶p h 5 . 0 ， 分离胶p h 3 .8 0 2 6 南开大学博士研究生毕业 ( 学位)论文材料和方法 浓缩 胶缓冲 液: 醋 酸一 k o h ( p h 6 .8 ) , l m o l/ l k o h 4 8 . 0 m 1 和2 .9 m l 冰 醋酸混 合，定容至i o o m . 分离胶缓冲液:醋酸一 k o h印 h 4 . 3 ) , l m o l / l k o h 4 8 . o m l 和1 7 .2 m 1 冰醋酸 混合，定容至l 0 0 m l , 电 极缓冲液: 醋酸一 0 - a l a ( p h 4 . 5 ) , 3 1 .2 g 0 - a l a 和8 .o m l 冰醋酸用水溶解， 稀释至1 , 0 0 0 m 1 . 4 ) 样品制备: 每一标准平板凝胶加入混合蛋白 样品 1 0 0 g ，或每种蛋白1 - i o u g 连续体系:样品溶于稀释 5 - 1 0倍的凝胶缓冲液，样品溶液含 1 0 %蔗糖， 0 .0 0 2 %指示染料， 不连续体系:稀释4 - 8 倍的浓缩胶缓冲液，加入蔗糖和所需的指示剂染料。 如需要，应对样品溶液透析以除去盐和小分子量的杂质，有时需离心 ( 1 0 , 0 0 0 r p m , 1 5 m i n )以 除 去 不溶杂质， 最后再加入蔗糖和染料。 指示剂:碱性电泳:澳酚蓝 ( 0 .0 0 2 %);酸性电泳:甲基绿 ( 0 .0 0 5 %)， 上样一般加i o u l ( 5 u g 蛋白 ) ，稀释可加3 0 u 1 . 5 )电泳条件: 凝胶浓度为 1 0 %的连续缓冲体系平板凝胶电泳，一般条件是 5 0 v ，室温过 夜;也可2 5 - 3 0 m a恒流电泳， 不连续缓冲体系: 浓缩胶电 泳时1 2 0 v ，分离胶可高至2 0 0 v , 碱性电泳上负下正，酸性电泳上正下负。 7 .2 染色与脱色 染色液成分: 考马斯亮蓝 甲醇 冰醋酸 水 总共 脱色液成分: 甲醇 冰醋酸 水 82 5 0 1 2 . 5 g 2 2 5 m1 5 0 m1 2 2 5 ml 5 0 0 ml 总共 7 .3 s d s 聚丙烯酞胺凝胶电泳 ( s d s -p a g e ) 2 2 5 ml 5 0 ml 2 2 5 ml 5 0 0 ml 试剂: 南开大学博士研究生毕业 ( 学位)论文材料和方法 3 0 %丙烯酞胺溶液 ( a c r 与b i s 的比例根据实际需要配制) 1 0 %s ds 1 .5 m o l / l p h 8 .8 t r i s - h c i 缓冲液 ( 分离胶用) l o m o l/ l p h 6 . 8 t r i s - h c i 缓冲液 ( 浓缩胶用) t e me d 1 0 % ( w / v ) 过硫酸胺 t r i s 一 g l y 电泳缓冲液 ( 6 g t r i s , 2 8 . 8 g g l y , 1 g s d s ，加水至1 , 0 0 0 m l ) 电泳: 分离胶 ( l o m l )配制: 3 0 % 丙烯酞胺溶液根据所需凝胶浓度适量量取 1 . 5 m o l / l p h 8 .8 t r i s - h c i 缓冲液2 . 5 m l 1 0 %s ds o . i ml 1 0 %ap 0 . 0 4 m t e me d 0 . 0 0 4 ml 水加至总体积 l o m l 浓缩胶 ( 4 m l )配制: 3 0 %丙烯酞胺溶液0 .6 7 m l i .o m o l / l p h 6 .8 t r i s - h c i 缓冲液0 . 5 m l 1 0 %s ds 0 . 0 4 ml 1 0 % ap 0 . 0 4 m1 t e me d 0 . 0 0 4 ml 水2 . 7 ml 加样缓冲液 ( 2 x) ( i o m l )配制: 1 .5 m o 1 / l p h 8 .8 t r i s - h c i 缓冲液2 .5 m l 甘油 ( 丙三醇)2 . 0 m1 1 0 %s ds 0 . 4 m1 1 0 %溟酚蓝0 . 5 m l 2 - 0 疏基乙醇l o m l 重蒸水。 . 5 m 1 电泳条件上负下正，开始时 8 v / c m,染料进入分离胶后 1 5 v / c m，大约 4 小时到达底部。 染色、脱色同非变性聚丙烯酞胺凝胶电泳。 7 .4 蛋白质的银染方法 ( 何效忠，1 9 9 9 ) 1 )溶液配制: 固定液:1 0 %冰醋酸 ( v / v ) 2 0 0 m l 南开大学博士研究生毕业 ( 学位)论文材料和方法 染液: 2 0 0 m l 重蒸水， 0 .2 g 硝酸银， 0 .3 m l 3 7 %甲 醛 ( 现用现配) 显影液: 2 0 0 m l 重蒸水， 6 g碳酸钠，溶解之后冷却至 1 0 0c ，用时全部加 入0 .3 m l 3 7 %甲 醛， 4 0 u l 硫代硫酸钠 ( l o g / m l ) 2 ) 步骤: 将凝胶置于干净的培养皿中，用固定液覆盖，摇动 2 0分钟，直到指示剂 看不到颜色为止; 倒出固定液，水洗3 次， 每次2 分钟，尽量控干水分;加入 染色液摇动 3 0分钟 ( 时间不宜过长，以防染色太深)，回收染液;将凝胶投 入水中，5 -1 0秒内移入显影液，以免清洗过度，加入显影液后，摇动，有带 出现后马上倒出显色液，加入固定液。 a c r 与b i s 聚合反应得到的孔径大小，取决于反应体系中单位体积的丙烯 酞胺 ( a c r )的用量，以及交联剂 ( b i s )的用量。交联剂 b i s的含量与不同凝 胶浓度平均孔径之间的关系见下表。本实验中进行了多种配比和多种浓度的凝 胶电泳探索。 附表b i s 含量与不同凝胶浓度平均孔径之间的关系 b i s 占总凝胶的百分数 ( %) 总凝胶浓度 ( t %) 1 5 1 5 2 5 平均孔径平均孔径 : . :3. 6 4rjc，74 ， 乙勺11，.盆 1 0 . 1 2. 2. 8 2. 4 2. 03 . 0 1 5. 0 1. 9 1 . 6 1 . 4 0. 9 0. 7 8 家蝇抗菌相关蛋白 / 多肤的确定及其表达规律 将材料经过诱导处理后， 每隔一定时间取样， 制备粗提液， 测定抑菌活性， 并且经过 s d s 一 聚丙烯酞胺凝胶电泳后，测定各条带的相对含量，使用统计分 析软件 s a s ( s t a t i s t i c a l a n a ly s i s s y s t e m ) 6 . 1 2版以 各泳道中的蛋白 带的 i o d 值为自 变量 凡，以 抑菌活性为因变量 y ， 进行逐步回归分析，筛选对抗菌活 性贡献显著的条带。在此基础上，以时间为横坐标、积分光密度为纵坐标，对 与抗菌活性显著相关的条带进行多项式回归分析，阐述其表达规律。 抗菌物质的分离纯化 葡聚糖凝胶过滤层析 凝胶选择: 南开大学博士研究生毕业 ( 学位)论文 材料和方法 本实 验 选用了 两 种型号的 葡聚 糖凝胶: s e p h a d e x g - 7 5 , s e p h a d e x g - 5 0 a s e p h a d e x g -7 5颗粒直径 4 0 -1 2 0 u m，分级范围为 3 ,0 0 0 - 7 0 , 0 0 0 m w , s e p h a d e x g - 5 0 颗粒直径为1 0 0 - 3 0 0 u m ， 分级范围为1 , 5 0 0 -3 0 , 0 0 0 m w o 层析柱选择: 所选层析柱为9 0 x 4 c m, 8 0 x 3 c m两种型号。 缓冲液制备: 0 . 1 5 m乙 酸钱缓冲液: 取9 .6 4 m l 氨水，加水到9 0 0 m l ， 用冰醋酸调节p h 至5 . 0( 约需冰醋酸3 . o m l )。 凝胶的处理和装柱: 取s e p h a d e x g - 7 5 6 0 g( 或s e p h a d e x g - 5 0 6 0 g ) 缓缓的 撒在1 , 0 0 0 m l 缓 冲液的液面，同时用玻璃棒轻轻搅动缓冲液， 然后让悬浮液静置过夜。将平衡 好的凝胶悬浮液移入另一容器中，让 9 0 -9 5 %的凝胶下沉以除去微细颗粒， 用抽吸法将剩下的 5 -1 0 %沉淀缓慢的物质除去;重复操作，直至得到迅速沉 下的淤浆为止。 将悬浮液转移至真空抽滤瓶内，抽气 1 0 -1 5 分钟。 将玻璃柱固定在牢固的支架上，确保玻璃柱处于完全垂直状态。 参阅文献 ( 苏拔贤，1 9 8 6 ) 装柱。 平衡、 上样 和 洗脱: 用0 . 1 5 m的乙 酸 钱缓冲液 ( p h 5 . 0 ) 平衡层析柱 ( 9 0 c m x 4 c m ) ， 取粗提液5 0 m 1 上样， 流速为l m l/ m i n ， 使样品进入凝胶。 最后用0 . 1 5 m 的乙酸钱缓冲液洗脱， 流速1 m l/ m i n ，自 动部分收集器收集， 6 m l/ 管。 在2 8 0 n m 处测其光密度。 9 .2 c m- s e p h a r o s e 离子交换层析 将c m - s e p h a r o s e 用 o . 1 m含n p 4 0( 乙 基苯基聚乙二醇)的甲 酸钱缓 冲液 ( p h 7 .6 ) 平衡后装柱 ( 层析柱规格根据实验情况而定)，取一定量样品 上 样 ( 以同样缓冲液溶解)， 5 0 m l 含n p 4 0的甲 酸铰缓冲液 ( o . 1 m, p h 7 .6 ) 冲 洗柱子， 再 用不 含n p 4 0 的甲 酸钱缓冲 液( 0 . 1 m , p h 7 .6 ) 冲洗， 至a 2 8 0 m n p ( x 8 ) = 0 .0 2 8 7 从结果可以 看出， x 6 的p 值小于0 . 0 1 ， 是一个对y有极显著贡献的 变量。 x : 和茂的p 值小 于0 .0 5 ， 是 对y 具有 显 著 贡献的 变 量。 从 结 果 还 可以 看出 ， 茂 的偏回归系数是正值，说明该自 变量对因变量 y的贡献是正的，它在蛹受到细 菌感染时的防御具有重要的作用。 x 4 , x : 的偏回归系数是负的，它们对因 变量 y有负贡献，说明这两种蛋白 / 多肤不仅对抗菌活性无效，而且还促进了细菌的 生长，有可能是促进生长的因子。 由以 上结果 可以 得出， 沁、 x 6 , x : 是家蝇蛹 在受到 针刺和细菌 感染时， 对 抗菌活性贡献最大的三种蛋白 / 多肤，它们的相对分子量约为 1 3 7 0 0 . 7 6 0 0和 5 0 0 0 0 3 . 1 . 2 蛹抗菌相关蛋白的表达规律 以 时间 为 横坐标、 积分光密 度为 纵坐 标， 对与 抗菌 活性显 著相关的x 6 , 凡、 x : 进行多项式回归分析，得到了三个最优拟合方程: y 4 - 2 9 9 .3 7 4 0 0 5 + 2 0 9 .9 7 5 9 2 3 x - 2 2 .8 3 7 8 7 3 x 2 + 0 .8 8 7 1 9 9 x - 0 .0 1 1 6 x 4 ，相关系数 r = 0 . 8 0 5 7 9 3 ; y 6 = 一3 1 9 . 8 7 6 6 9 + 1 1 5 .9 1 5 4 2 9 x - 3 .9 9 0 8 8 8 x - 0 .0 7 0 6 2 8 x 3 + 0 .0 0 3 1 6 3 x 4 ，相关系数 r = 0 . 7 0 7 0 2 2 ; y s =一1 4 0 .7 4 2 2 9 2 +2 2 3 .7 8 5 7 7 6 x一6 4 .4 8 3 3 8 6 x +7 .8 0 2 6 4 8 x 一0 .4 6 2 4 9 x 4 + 0 .0 1 3 3 6 1 x 5 -0 .0 0 0 1 4 8 x 6 ，相关系数r =0 .7 3 1 8 4 3 . 南开大学博士研究生毕业 ( 学位)论文结果与分析 对三个相关系数的显著性检验结果表明，三者均 p 0 .0 1 ，说明以 上三个回 归方程相关显著。 在对凡的拟合方程中，当x为7 . 2 h时， y出 现理论最大值 为3 3 0 ; 在对x 6 的拟合方程中， x为1 3 . 5 h 时y出现最大值为4 4 0 。而x : 的 拟 合方程却显示出了其独特的规律，整个曲线分成了两个部分。多项式回归模型 如图3 . 1 所示。 s w o a :、 x4|甲 xr + 、 了 +心 0 协俗一 林 今 t4 碑 山本牛 斗 图 7. 3 . ， 、j 叫 卜 . 曰 卜 _4s = 4. 戊 、 、一象 i s 1 6 i s泛2 8劫 x s 和x a 的多项式回归模型 佑娜 f i g 3 . 1 r e s p o n s e s u r f a c e r e g r e s s i o n m o d e l o f x t , x 6 a n d x b 从x , , x 6 . x ， 的 拟和多 项式回归图 上可以 看出， 三者在经过诱导 之后都能 迅速合成并积累到一定水平， 并且x , 比茂合成快，分别为诱导后 1 .3 h 和3 .2 h 开 始出 现。 x , 出 现高 峰的 时 间 也明 显比茂早 ( 分 别为7 .2 h 和1 3 .5 h ) 。 而x : 在 诱导以前就存在， 只是在诱导以后合成量有了增加， 有意思的是8 . 5 h 以后消失， 到了 2 2 h时，它又能迅速的合成。对蛹进行带菌针刺诱导时，不仅有细菌侵入 了蛹体内，更重要的是蛹的体壁受到了严重伤害。蛹所做出的首要反应是尽快 将伤口弥合，阻止病菌的继续侵染，于是就快速合成了能促进细胞生长的活性 因 子 x 。 和 凡， 使 伤口 很快愈 合， 所以 在抑菌实 验中， x e . x ; 对抗菌活性有显 著负贡献， 也就是说x s , x , 的存在促进了 细菌的生长。 之后， 创伤反应和细菌 的 侵入也激活了有