（环境科学专业论文）东南景天和鸭跖草的遗传多样性研究及镉耐性基因克隆.pdf

邓金川东南景天和鸭跖草的遗传多样性研究及镉耐性基因克隆 奠基者效应，导致其遗传多样性下降。然而，鸭跖草虽然种群问的遗传多样性变 化很大，但矿山污染种群与对照种群之间没有显著性差异，这可能是种群间的基 因流或连续的定居事件平衡了因瓶颈效应和奠基者效应产生的遗传多样性的下 降。 3 a m o v a 分析和u p g m a 聚类表明，东南景天和鸭跖草种群间的遗传分化 极显著。其中，东南景天的7 个种群被分为污染、对照和q z ( 三大类群；而鸭 跖草的1 4 个种群直接被分为污染和对照两大类群。这说明土壤重金属污染对东 南景天和鸭跖草的遗传分化起重要作用。另外，种群阳j 的遗传距离与地理距离的 相关性分析表明，地理隔离对污染种群问的遗传分化没有影响，但在对照种群问 的遗传分化过程中有显著影响。因此，可以推测重金属胁迫是超富集植物进化的 关键因子。 4 根据植物外形、金属耐性富集特性以及r a p d 结果，东南景天的q z 种 群可能已进化为一种新的矿山生态型或亚种。利用东南景天的q z 种群为材料， 以2 0 0j m l o ll 1c d s 0 4 处理的叶的c d n a 为t e s t e r ，对照为d r i v e r ，构建了一个 s s h 差减文库，经过测序比对，得到2 2 个与重金属胁迫或其他胁迫下诱导表达 的有关基因同源性较高的独立克隆，如：蛋白激酶( p r o t e i nk i n a s e ) ，脂氧合酶 ( 1 i p o x y g e n a s e ) 、叶绿体超氧化物歧化酶( r i b u l o s e 1 ，5 一b i s p h o s p h a t e c a r b o x y l a s e o x y g e n a s e ) 、金属硫蛋白( m e t a l l o t h i o n e i n ，m t ) 、含组氨酸的磷酸 转移蛋白( h i s t i d i n e c o n t a i n i n g p h o s p h o 仃a n s f e r p r o t e i n 2 ，h p t 2 ) 对文库中分别 与m t 和h p t2 表达基因同源性高的两个克隆进行n o r t h e r n 杂交，结果初步显示， m t 基因可能是东南景天叶中一组成型表达基因，月p r 2 基因在c d 胁迫下上调表 达，其可能在c d 胁迫的信号传导中起作用。 关键词：超富集植物；东南景天；鸭跖草；遗传多样性；镉：耐性基因 a b s n l a ( 了 g e n e t i cd i v e r s i t i e so fs e d u m a l f r e d i ia n dc o m m e l i n a c o m m u n i sa n dc a d m i u mt o l e r a n tg e n ec l o n e m a j o r ： e n v i r o n m e n t a ls c i e n c e name：deng j i n c h u a n s u p e r v i s e r ：p r o f l a nc h o n g y u a b s t r a c t t h eh y p e r a c c u m u l a t o rw i t hac h a r a c t e r i s t i co ft o l e r a n c ea n da c c u m u l a t i o nh i g h c o n c e n t r a t i o no f h e a v ym e t a l si sa l li d e a lm a t e r i a lf o rs t u d y i n gp l a n t s a d a p t a t i o na n d e v o l u t i o nu n d e rh e a v ym e t a ls t r e s s i th a sb e e nf o u n di nc h i n ai nr e c e n ty e a r st h a t s e d u ma 驴e d i ii st h ez n c dh y p e r a c c u m u l a t o ra n dc o m m e l i n ac o m m u n i si st h ec u a c c u m u l a t o r i nt h i ss t u d y , m e t a lc o n c e n t r a t i o n si ns a l f r e m ia n dc c o m m u n i sa n d t h e i ra s s o c i a t e ds o i l sw e r e i n v e s t i g a t e d i n f i e l d r a p d ( r a n d o ma m p l i f i e d p o l y m o r p h i cd n a ) w a su s e dt oa s s e s sg e n e t i cd i v e r s i t i e si nd i f f e r e n tp o p u l a t i o n so f t h et w os p e c i e s m o r e o v e r , s s h ( s u p p r e s s i o ns u b s t r a c t i v eh y b r i d i z a t i o n ) w a s c o n d u c t e dt oc o n s t r u c tt h ee d n al i b r a r yo fs d 狮m il e a fa n ds c r e e nt h ec d t o l e r a n t a c c u m u l a t i v e g e n e s ，i n o r d e rt o e x p l a i n t h ec h a r a c t e r i s t i co fc d t o l e r a n c e a c c u m u l a t i o n t h em a j o rr e s u l t so f t h i ss t u d yw e r ec o n c l u d e da sf o l l o w s ： 1 s e n v e n p o p u l a t i o n s o fsa l f r e d i i i n c l u d i n g2p o p u l a t i o n s ( r e f e r e n c e p o p u l a t i o n ) f r o mn o r m a ls o i l sa n d5p o p u l a t i o n sf r o mm e t a lc o n t a m i n a t e ds o i l s ，h a d b e e nc o l l e c t e di ne a s ta n ds o u t h c h i n a c o m p a r e d w i t hr e f e r e n c e o n e s ， c o n c e n t r a t i o n so fz n , c d p bi nt h e5c o n t a m i n a t e dp o p u l a t i o n sa n dt h e i ra s s o c i a t e d s o i l sw e r ee x c e p t i o n a lh i g hm o r e o v e r , z na n dc dc o n c e n t r a t i o n si nq z p o p u l a t i o n ， o n eo fc o n t a m i n a t e dp o p u l a t i o n s w e r ea c c o r d e dw i t l lh y p e r a c c u m u l a t o r sc r i t e r i a f o u r t e e np o p u l a t i o n so fcc o m m u n i s i n c l u d i n g7p o p u l a t i o n sf r o mc o p p e rm i n e sa n d 7p o p u l a t i o n s ( r e f e r e n c ep o p u l a t i o n ) f r o mn o r m a l ss o i l s ，h a db e e nc o l l e c t e df l u n g c h a n g j i a n gr i v e r t h e7m i n i n gs i t e sw e r es e v e r e l yc o n t a m i n a t e dw i t l lc ua n dt h e i r c o r r e s p o n d i n gp o p u l a t i o n sh a dv e r yh i 出c o n c e n t r a t i o n so fc u c uc o n c e n t r a t i o n si n r o o s to f t h r e ep o p u l a t i o n se x c e e d e d1 ，0 0 0m gk g 1 2 r a p dr e s u l t ss h o w e dt h a tt h e r ew a sas i g n i f i c a n td e c r e a s ei nt h eg e n e t i c d i v e r s i t yo ft h ec o n t a m i n a t e dp o p u l a t i o n so f 最a l f r e d i f i nc o m p a r i s o nw i t hi t s i l l 邓会川 东南最灭和鸭跖草的遗传多样性研究及镉耐性堆w 克降 r e f e r e n c ep o p u l a t i o n s g e n e t i cd i v e r s i t i e so fd i f f e r e n tp o p u l a t i o n sw e r es i g n i f i c a n t l y n e g a t i v er e l a t e dw i t ht h eh e a v ym e t a lc o n c e n t r a t i o n si ns o i l s i tw a sp r e s u m e dt h a t h e a v ym e t a ls t r e s sr e s u l t e di nr a p i dd e c r e a s eo fg e n e t i cd i v e r s i t yi nsa l f r e d i ib y b o t t l e n e c ka n df o u n d e re f f e c t s h o w e v e r , t h e r ew a sn os i g n i f i c a n td i f f e r e n c eb e t w e e n t h eg e n e t i cd i v e r s i t e si nc o n t a m i n a t e da n dr e f e r e n c ep o p u l a t i o n so fcc o m m u n i s w h i c hm i g h tb ed u et ot h a tt h eg e n ef l o wo rs u c c e s s i v es e t t l e m e n ti ncc o m m u n i s b a l a n c e dt h eb o t t l e - n e c ka n df o u n d e re f f e c t so n e s 3 s i g n i f i c a n td i f f e r e n c e si nt h eg e n e t i cv a r i a t i o nw e r eo b s e r v e df o rb o t hs a t f r e d 玎a n dcc o m m u n i sp o p u l a t i o n s ，a c c o r d i n gt oa m o v aa n du p g m aa n a l y s i s t h e7p o p u l a t i o n so fsa l f m d i ic o u l db ed i v i d e di n t o3g r o u p s ( c o n t a m i n a t i o n ， r e f e r e n c e ，a n dq z ) ，w h i l et h e1 4p o p u l a t i o n so fcc o m m u n i sw e r ed i r e c t l yd i v i d e d i n t o2g r o u p s ( c o n t a m i n a t i o na n dr e f e r e n c e ) i ts u g g e s t e dt h a th e a v ym e t a ls t r e s s p l a y e da ni m p o r t a n tr o l ei nt h eg e n e t i cv a r i a t i o no fs a t f r e d 豁a n dc ，c o m m u n i s p o p u l a t i o n s t h eg e o g r a p h i cd i s t a n c eh a dn oe f f e c to nt h eg e n e t i cv a r i a t i o na m o n g c o n t a m i n a t e dp o p u l a t i o n sb u ta f f e c tt h eg e n e t i cv a r i a t i o no fr e f e r e n c ep o p u l a t i o n s s i g n i f i c a n t l y t h e r e f o r e ，i tc o u l db ec o n c l u d e dt h a th e a v ym e t a ls t r e s sh a dm o r ee f f e c t t h a ng e o g r a p h i cd i s t a n c eo ng e n e t i cv a r i a t i o n , a n dm e t a ls t r e s sm i g h tb et h ek e y e l e m e n tf o rt h ee v o l u t i o no f m e t a l t o l e r a n to rh y p e r a c c u m u l a t i n ge c o t y p e 4 t h eq zp o p u l a t i o no f 口批讲fh a de v o l v e di n t oa ne c o t y p eo rs u b s p e c i e s ， a c c o r d i n gt ot h ea p p e a r a n c eo fp l a n t s ，m e t a l - t o l e r a n to rh y p e r a c c u m u l a t i n gc a p a c i t y ， a n dt h er e s u l to fr a p da n a l y s i s i nt h i ss t u d y , t h eq z p o p u l a t i o nl e a v e so fs a t f r e d i i w e r ec o l l e c t e da se x p e r i m e n t a lm a t e r i a l st h a tw e r et r e a t e dw i t h2 0 0l a m o ll c d s 0 4 a l i b r a r yw a s c o n s t r u c t e db yu s i n gs s hm e t h o dw i t he d n a o f t h el e a v e sa st e s t e ra n d t h er e f e r e n c ea sd r i v e r i tw a sf o u n di nt h el i b r a r yt h a tt h e r ew e r e2 2i n d e p e n d e n t c l o n e sw i t hh i g ho rp a r th o m o l o g yt og e n e so re s t si n d u c e db yh e a v ym e t a lo ro t h e r s t r e s si na r a b i d o p s i st h a l i a n aa n do t h e rp l a n ts p e c i e s ，s u c ha sp r o t e i nk i n a s e ， l i p o x y g e n a s e ，r i b u l o s e l ，5 - b i s p h o s p h a t ec a r b o x y l a s e o x y g e n a s e ，m e t a l l o t h i o n e i n ( m t ) a n dh i s t i d i n e c o n t a i n i n gp h o s p h o t r a u s f e rp r o t e i n2 ( h m2 1 n o r t h a mb l o tr e s u l t s s h o w e dt h ec l o n ew i t hah i g hh o m o l o g yw i t hm t g e n em i g h tb et h ec o n s t i t u t e dg e n e ms a 汐e d i i sl e a v e s ，w h i l eo t h e rc l o n ei d e n t i f i e da sh p t2w a su p r e g u l a t e di nl e a v e s o fs a l f r e d i iu n d e rc ds t r e s sa n dm i g h tp l a yar o l ei ns i g n a lt r a n s d u c t i o ni nr e s p o n s e t o c ds t r e s s k e y w o r d s ：h y p e r a e e u m u l a t o r , c o m m e l i n ac o m m u n i s ，s e d u ma l 劳e d i i , g e n e t i c d i v e r s i t y , c a d m i u m ，t o l e r a n tg e n e i v 第1 章前言 第1 章 前言 1 1 环境污染对自然种群遗传多样性的影响 “八大公害事件”的发生，人们认识到环境污染对人体健康以及生物的生长 发育的毒害效应，并开展了大量相关的研究，制定出环境保护的法律和决策。但 以往对污染物研究大都集中在大剂量的急性毒理研究，研究污染物在生物个体的 不同组织、器官的迁移积累、生理生化受害机制等方面的研究( 王焕校，2 0 0 0 ) 。 而环境中更多的污染物对生物的效应方式是小剂量、长期持续性作用，这种作用 在个体水平上很难检测出来，需要在种群水平以上才能发现污染物的影响，也只 有在种群水平上的研究才能消除个体因素的差异，而真正了解污染物的毒性。日 本的“水禊病”、“米糠油事件”以及最近全国陆续报导出现的“癌症村”，就 是污染物的长期毒害效应，一旦爆发，就会影响整个的种群以及相应的生态系统。 自然种群在遭受环境污染的毒害作用时，其内部的遗传多样性会发生改变。 1 1 1 遗传多样性的概念及意义 1 1 1 1 遗传多样性概念 遗传多样性( g e n e t i cd i v e r s i t y ) 泛指地球上所有生物的遗传信息的总和，包 括不同物种间以及物种内的遗传变异。狭义的遗传多样性指物种内的不同种群间 以及种群内不同个体间的遗传变异的总和( w i l s o n ，1 9 8 5 ；m a g u r r a n 。1 9 8 8 ) ，本章 中所讨论的是狭义的遗传多样性。遗传多样性是生物多样性的基本组成部分，是 生态多样性和物种多样性的基础。 遗传多样性的表现形式是多层次的。在分子水平，可表现为核酸、蛋白质、 多糖等生物大分子的多样性：在细胞水平可体现在染色体结构的多样性即细胞结 构与功能的多样性；在个体水平，可表现为生理代谢差异、形态发育差异以及行 为习性的差异。遗传多样性通过对上述各层次的生物性状的影响，导致生物体的 不同适应性，进而影响生物的分布和演化( 陈灵芝和马克平，2 0 0 3 ) 。但是， d n a 分子结构的突变是遗传多样性产生的主要来源。各种突变在选择的作用下， 邓金川东南景天和鸭跖草的遗传多样性研究及镉耐性基因克隆 一部分被淘汰，另一部分被保留下来，这些被保留的突变得到不断的积累，最终 形成新的个体和类型。 遗传多样性最直接的表达形式就是遗传变异性的大小，但也包括遗传变异分 布格局，即群体的遗传结构。例如，对大范围连续分布的异交植物来说，遗传变 异的大部分存在于群体之内；而对自交为主的植物来说，群体之间的遗传变异明 显大于群体之内。至于无性繁殖为主的植物，因为每个无性系内大部分位点都是 纯合的，形态变异也很小，而不同无性系之间都有很大或明显的差异，遗传变异 分布在无性系之间。 1 1 1 2 遗传多样性研究在环境科学中的意义 遗传变异既是生物生存和适应的基础，也是物种发生、选择、进化的基础。 一个物种或群体的进化潜力和抵御不良环境的能力既取决于种内遗传变异的大 小，也有赖于遗传变异的群体结构。一个物种或群体遗传多样性越大或遗传变异 越丰富，对环境变化的适应能力就越强，越容易扩展其分布范围和开拓新的生存 环境。物种或群体中遗传变异的大小与进化的快慢成正比( 董玉深，1 9 9 5 1 马克 平等，1 9 9 4 ：葛颂等，1 9 9 4 ) 。遗传多样性在一定程度上决定了物种的分布以及 数量多样性。缺乏对生物遗传多样性的深入研究，就无法完整地认识物种进化过 程或适应机理，以及种群地理分布格局、数量增长及物种灭绝等问题。另外，由 于遗传多样性是现有生物适应现有环境和未来未知环境的遗传基础，因此当污染 物影响种群的遗传多样性时，也会影响种群对其他逆境条件的适应( 段昌群， 2 0 0 0 ) 。 遗传多样性存在和扩大的基础是基因频率在群体间的不同分布，以及繁殖体 系可能引起的基因重组。然而，自然群体中的变异类型及其存在状况除了受到自 身和自然因素的影响外，也受到了环境污染的影响。环境中的污染物( 如：重金 属、有机污染物、放射性污染、石油等) 对自然种群长期低浓度慢性胁迫或短期 急性毒害都会引起种群的遗传多样性交化，甚至导致种群的灭绝( 文传浩等， 2 0 0 1 ；m e n g o n ie ta 1 ，2 0 0 0 ，2 0 0 1 ；r o s se ta 1 ，2 0 0 2 ；d u b o i se ta 1 ，2 0 0 3 ；w h i t e h e a de t a 1 2 0 0 3 ：m u l l e re ta 1 。2 0 0 4 ；t h e o d o r a k i se ta 1 ，2 0 0 6 ) 。k e t t w e l l ( 1 9 5 4 ) 发现工业 污染导致大量桦尺蛾等昆虫体表变黑。生长在重金属污染的蛇纹岩和矿冶废弃地 的土著植物在耐受吸收重金属能力上，以及生理和生物学特征上都与生长在正常 2 第1 章前言 土壤的种群有显著差异( m a c n a i r ，1 9 9 7 ) 。因此，遗传多样性的研究能使人们 更多了解污染物对生物种群水平以及生态系统的影响，有利于更准确客观地评价 环境状况( c i a e f i oe ta 1 ，2 0 0 2 ) ，并促使决策者制定出更合理的环境标准( b e l f o r e & a n d e r s o n , 2 0 0 1 ) 。 1 1 2 污染物对自然种群遗传多样性的影响 正常情况下，影响种群遗传多样性的主要因素有：选择压力、突变、生殖方 式、小种群基因频率的随机波动、迁移扩散等( 陈灵芝和马克平，2 0 0 3 ) 。化学 污染物对生物的生理和基因毒性而形成的选择压力，往往会使受污染种群的遗传 多样性水平下降，其下降主要有三个方面原因：污染条件下，种群的敏感性个 体消失，这些个体所具有的特异性遗传多样性也因此不复存在，从而整个种群的 遗传多样性水平降低；污染引起种群的规模减小，由于随机的遗传漂变( g e n e t i c d r i f t ) ，降低了种群的遗传多样性水平；污染引起种群数量急剧减小，以至于 达到了种群的遗传学瓶颈( b o t t l e n e c k ) ，即使种群最后实现了完全的适应，并 恢复到原来的种群数量时，由于奠基者效应( f o u n d e re f f e c t ) ，从而造成遗传来 源单一，遗传变异性的来源也极大的降低( 段昌群，2 0 0 0 ) 。 一般而言，植物营固着生长，被动接受化学污染物的胁迫，动物可以主动扩 散，逃离化学污染物的伤害，从而植物在污染条件下遗传多样性的丧失机会远远 大于动物，其变化的程度比动物更容易察觉，而且变化的过程有所不同。研究污 染物对植物种群的影响时，侧重于植物的微进化( m i c r o e v o l u t i o n ) ，而在动物 种群中则侧重于生态毒理( e c t o t o x i c o l o g y ) 。 1 1 2 1 污染胁迫下植物遗传分化 在众多的化学污染物中，土壤重金属污染物由于隐蔽性、长期性、难治理等 特点，对植物遗传多样性的影响是最为深刻而明显。在重金属污染严重的矿业废 弃地和蛇纹岩，有些植物不能忍受重金属的毒害而退出，有些植物对重金属有一 定耐性，能定居下来形成耐性种群，甚而矿山生态型，其结果是污染种群与相隔 仅几米的非污染种群比较，遗传多样性已发生改变。相对周围未污染土壤，重金 属污染土壤就如同孤岛一般，因而矿山种群多数是小型的，容易受奠基者效应或 瓶颈效应影响。 对重金属胁迫下的植物来说，影响其遗传多样性水平的最大因素是重金属的 邓金川东南景天和鸭跖草的遗传多样性研究及镉耐性基园克隆 选择压力。选择压力使敏感者消失，同时也使抗性个体发生进一步分化。段昌群 等( 1 9 9 7 ) 发现在p b 、c d 、h g 、z n 污染下，蚕豆在株高，首次开花时间、每株 结豆荚数、种子重量等数量性状发生代内和代间改变，污染对植物的进化分化起 作用。在初始种植代内，低浓度的重金属使各数量性状( 除开花时间) 受刺激而 升高，高浓度则使性状明显受抑制。在代间，低浓度下，f l 代表现出一定的应激 反应，性状指标或无变化或略有下降，到f 2 时，性状明显趋于负向变化，之后几 代又逐渐回升；高浓度污染，在第l 代就产生了毒性反应，性状明显受抑制，随 后的第2 代或第3 代，受抑制现象加深，但之后的几代，相关性状又得到恢复。张 太平( 1 9 9 9 ) 、文传浩( 2 0 0 1 ) 等利用r a p d 和等位酶技术对不同空间地段上同 一种质但受重金属污染经历不同的玉米( z e am a y s ) 和曼佗罗( d a t u r a s t r a m o n i u m ) 种群的遗传分化进行了系统研究，发现短期污染下其遗传多样性水 平降低，但随时间推移以及人工选择作用的加强，遗传多样性有所回升和提高。 因为重金属毒性，矿冶地蛇纹岩与周边非污染的地方分离，形成一个个相 对孤立的小岛镶嵌于非污染的土壤中( m e n g o n ie ta 1 ，2 0 0 1 ) 。对于这样的小种群， 瓶颈效应和奠基者效应也会影响其遗传多样性。采矿和冶炼活动导致植物原有的 生境发生剧变，再加上重金属本身的毒性，使原有种群中的大量个体死亡，甚至 整个种群退出，若有幸运个体能残存下来并适应环境的条件，在环境稳定后重新 恢复原有的种群规模，甚至转而成为优势种( s h u e ta 1 ，2 0 0 5 ) ，但原有的遗传结构 和多样性却无法恢复。在矿业废弃地经常可以看到一片一片的单优群落。瓶颈效 应导致一些等位基因尤其是稀有的等位基因的消失和总体遗传多样性的下降。而 如果这耐性种群是由少数几个耐性个体组成，并与相邻的非耐性种群有区别，则 实质性的奠基者效应发生。耐性种群与非耐性种群间的遗传差异可能是奠基者效 应和重金属的选择压力共同作用( v e k e m a n s & l e f e b v r e ，1 9 9 7 ) 。 在对耐性植物的研究中发现，重金属耐性种群比相应的非耐性种群更多采用 自交繁殖的方式( s e l f - r e r t i l e ) ，例如：a n t h o x a n t h u mo d o r a t u m 和a g r o s t i sc a p i l l a t i s ( a n t o n o v i e s ，1 9 6 8 ，1 9 7 2 ：m e n e i l l y & a n t o n o v i c s , 1 9 6 8 ) ，a r m e r i am a r i t i m e ( l e f a b v r e ，1 9 7 0 ，1 9 7 3 ) ，a r r b e n a t h e r u me l a t i u s ( c u g u e ne ta 1 ，1 9 8 9 ) 。自交繁殖往往 导致繁殖成功率降低或后代生存适应能力下降。这种伴随近亲繁殖而出现的适应 度下降的现象被称为近交衰退( i n b r e e d i n gd e p r e s s i o n ) 。近交衰退在大多数有性 生殖生物中存在，其作为自体受精植物的进化的重要因子已得到广泛研究。关于 4 第1 章前言 近交衰退的机理有两个学说：1 ) 显性学说：生物群体具有隐性不利基因，近交 使隐性不利基因成为纯合子，表现出不良性状；2 ) 超显性学说( 杂合子优势学 说) ：基因组整体上的杂合性对适应性有利。近交衰退能使隐性不利基因被清除 掉，而有利基因通过近交衰退对自交率的直接效应被放大，因此，从进化的角度 来说，近交衰退可以为新基因型的产生合扩散提供特殊条件。a n t o n o v i c s ( 1 9 6 8 ) 认为，自交可能是耐性种群在重金属选择压力下的一种进化机制，能防止邻近非 耐性种群的基因流对自身的适应特征的破坏。对m i m u l u sg u t t a t u s 的研究发现，生 殖障碍进化为重金属耐性的多效性( m a c n a i r & c h r i s t i e ，1 9 8 3 ) 。另外，k o c h 等 ( 1 9 9 8 ) 发现，t h l a s p ic a e r u l e s c e n s 的种群密度与远交繁殖率成正相关，即在种 群的密度偏低时，自交繁殖能保证在定居的地方有一个可依赖的种子库( h e r l i h y & e c k e r t , 2 0 0 2 ) 。d u b o i s 等( 2 0 0 3 ) 对分布在比利时、卢森堡和法国的z c a e r u l e s c e n s 的1 4 个种群( 耐性种群和非耐性种群各7 个) 进行繁殖方式研究，其 结果支持k o c h 的结论。 1 1 2 2 污染物对动物的遗传毒性 对于动物而言，污染物造成的生殖细胞突变不仅改变一个种群的遗传组成因 为引进新的可遗传的差异( c a s t a n o & b e c e r r i 。2 0 0 4 ) ，而且经常减少配子、胚胎 的生存力来间接影响种群的遗传结构。相反，体突变( 除生殖器官) 不会传递给 下一代，但是会使细胞坏死或使细胞转为恶性，或降低个体的适合度( 图1 1 ) ( w o l f c ta 1 ，2 0 0 4 ) 。因此，致畸物或直接或间接通过遗传细胞的突变或畸变引起 的死亡等来影响种群的遗传结构。显然，非畸变物通过或间接干扰生物的生理活 动或改变生存环境潜在降低个体的舒适度或者繁殖力，来影响种群的遗传组成。 当这些对种群不利的因素增加急剧，随意影响个体时，就将产生瓶颈效应。在这 个过程中，由于低频少见的等位基因的丢失，遗传差异将会减少。 基因流对小的种群特别不利，因为会降低潜在的有用的基因在代际问的遗传 ( t h e o d o r a k i se ta 1 。2 0 0 6 ) 。另外，有害突变很容易在小种群中稳定，引起繁殖衰 退，最终使种群垮掉。相反，瓶颈效应能增加种群的遗传差异，因为罕见基因变 得更为普遍同时原先不表达的基因可能表达。由于死亡繁殖力之间的差异适当 的依赖，他们将以非随机的方式( 基因型依赖) 影响个体，这被称作自然选择。 实际上。如果某些的基因型对有毒物比较敏感，有毒物将会对这些位点产生选择 邓金川东南景天和鸭跖草的遗传多样性研究及镉耐性基因克隆 胁迫，而这些位点对生物的生存和繁殖比较重要。这些位点的基因频率将在相对 短的时期内发生转移，这种改变取决于选择压力的强度。一般而言，这些位点的 遗传差异会减少，除非杂合体的适度超过纯合体。 图1 1 污染物影响自然种群遗传结构的主要过程( w o l f e t a l ，2 0 0 4 ) f i g 1 - lf l o wc h a r tr e p r e s e n t i n gt h em a j o rr o u t e sb yw h i c h t o x i c a n t sa t ek n o w nt o a f f e c tt h eg e n e t i cs t r u c t u r eo fn a t u r a lp o p u l a t i o n s 注：t ，增加；l ，降低；一，无影响。指向遗传变异的箭头宽度代表发生的可能性 n o t e ：e i t h e ri n c r e a s i n g ( t ) d e c r e a s i n g ( 1 ) o rn o ta f f e c t i n gt h eg e n e t i cv a r i a b i l i t y ( 一) t h e i n t e n s i t yo ft h ea r r o w st h a ta r ed i r e c t e dt o w a r d st h eg e n e t i cv a r i a b i l i t yb o x e s ，a r ei n d i c a t i v e f o rt h el i i c e l i h o o do f o c g u r r e n g e 然而，如果有抗性基因的存活者在其他位点发生改变，那么受胁迫的种群的 这个遗传差异根本不会被影响。相反，如果毒物的抗性是多基因的，那么这个选 择力可能会减少这个的遗传差异。因此，取决于抗性的遗传背景，耐性的选择会 使受胁迫的种群的遗传特性从无改变到有极显著改变。 种群的遗传分析对分析这些影响非常有效，它可以检测种群在目前的遗传多 态性，推断它的历史，预测种群的未来方向。但是对种群的预测要谨慎，因为当 基因流成为主导时，某特定的种群将不可能预测。但也可以在一个可能的框架内 作一个一般的估计，然而不能确切的预计基因频率将会如何变化。 1 1 3 遗传多样性的研究方法 遗传多样性主要是通过遗传标记的多态性来反映的。所谓遗传标记就是生 物在不同水平的特征特性。有效的遗传标记应具备以下特点：丰富的多态性，即 6 第l 章前言 多态性越丰富，应用潜力就越大：良好的稳定性，即不因组织、器官、实验条件 等的不同而产生差异；高度的遗传性，即基因型和环境的相互作用小。遗传标记 根据检测技术和内容的不同主要有形态标记、细胞学标记、同工酶标记和d n a 标记。由于同工酶标记和d n a 标记比较客观准确，目前在环境学和生态学应用 较多。 1 1 3 1 等位酶( a l l o z y m e ) 等位酶分析是根据生物体内由单一位点的不同等位基因产生的具有生理功 能相同而结构不同的一类酶即同工酶，来反映不同位点的等位基因变化情况。自 6 0 年代以来该技术被发展为广泛应用的分子标记，来探测种群的遗传结构。等位 酶的优点是共显性，能反映每个位点等位基因的情况，分析方法相对d n a 分析 来说简单快速有效，能在种群内、种群间发生变化而反映大量生态渐变群和种群 水平上的遗传结构的变化( 张军丽等，2 0 0 0 ) ，但检测到的遗传变异性相当低 ( w e s t n e a te t a l ，1 9 8 7 ) ，无法分析分布狭窄的地方种群或经过瓶颈效应的种群( 张 军丽等，2 0 0 0 ) 。另外，等位酶的统计分析中通常假设其不同基因型为选择中性， 这是不够科学，如等位基因频率的地理差异就可能是自然选择的结果( p o w e r se t a 1 ，1 9 8 6 ) ，所以等位酶分析技术存在一定的局限性。 1 1 3 2d n a 分析技术 以d n a 为基础的多态性检测可以直接比较核苷酸序列的变异，是遗传多样 性检测的强有力工具。原则上，d n a 分子标记的方法可以对任何基因组中任何 片段进行分析，包括核d n a ( n u c l e a rd n a ，n d n a ) 、叶绿体d n a ( c h l o r o p l a s td n a ， c p d n a ) 和线粒体d n a ( m i t o c h o n d r i a ld n a ，m t d n a ) ，d n a 的编码区和非编码区， 保守区和高变区。但是，每一种基因组是以不同的方式存在和独立进化的，核 d n a 是通过双亲遗传的并依盂德尔定律分离，而叶绿体和线粒体d n a 为单亲遗 传，既非孟德尔遗传，且叶绿体d n a 高度保守，线粒体d n a 存在大量突变。在 过去的研究中，大多数d n a 标记都是采用的核d n a 。 1 1 321 限制性片段长度多态性( r f l p s ，r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t h p o l y m o r p h i s m s ) r f l p s 利用限制性内切酶对专一性位点进行酶切，再通过克隆技术扩增，由 于同一种群或不同种群中个体间或个体内两组基因序列有限制性酶切片段长短 7 邓金川东南景天和鸭跖草的遗传多样性研究及镉耐性基因克隆 或位点的缺失造成的变化，经电泳分离后，再转移至尼龙膜上，用d n a 分子探 针进行杂交，放射自显影后进行多态性分析( b o s t e i n , 1 9 8 0 ) 。r f l p s 具有共显性， 灵敏度高、可重复性强等特点。r f l p 标记不依赖于基因的表达，无表现效应， 标记检测不受环境条件与发育阶段的影响。r f l p 标记在理论上是无限的 ( t a n k s l e y & o r t o n1 9 8 3 ) 。由于r f l p s 需要筛选一系列不同的探针对不同的酶所产 生的酶切片段进行检测，以探讨基因组酶切位点的多态性，但可选择的内切酶有 限，且耗时费钱，有放射性危害。r f l p 标记适合构建连锁图谱，鉴定品种和群 体间或内的遗传多样性，进行系谱和亲缘关系分析( w i l l i a m & c l a i m ，1 9 9 3 ) 。 1 1 3 。2 2 随机扩增多态性d n a ( r a p d s ，r a n d o ma m p l i f i e dp o l y m o r p h i cd n a s ) r a p d s 标记是利用随机合成的寡聚核苷酸( 一般为1 0 b p ) 作引物，直接通过与 基因组d n a 上相应的互补序列结合，再通过p c r 反应产生的d n a 多态性标记 ( w i l l i a n s e t a l 1 9 9 0 ) 。r a p d 灵敏度较高，对解决一些种下亲缘关系相近的分 类单位是有效的( w a c h i r a e ta 1 ，1 9 9 5 ) ，也经常用于种群遗传变化的研究( l y n c h & m i l l i g a n ，1 9 9 4 ；g i l l i e se ta 1 ，1 9 9 7 ；m e n g o n ie ta 1 ，2 0 0 0 ；文传浩等，2 0 0 1 ) a 除此， 该方法有如下特点：可对新物种直接进行多态性分析：操作简单，效率高， 费用少。一次r a p d 扩增实际就是一次简单的p c r 反应，适合大量的样本快速 分析：所需模板d n a 极少；同时适用于基因组的单拷贝区域或重复序列区， 标记位点较丰富，基本能反映整个基因组的变化。正因为如此，r a p d 受到研究 者的欢迎。但由于p c r 对