（茶学专业论文）茶汤蛋白对茶饮料冷后浑形成的影响.pdf

浙江大学博士学位论文 摘要 饮料是重要的食品种类之一丰富多彩的饮料产品不仅满足了消费者的各种 需求，而且创造了良好的经济效益和社会效益。2 0 0 7 年全球饮料产量估计达到 1 3 万亿升，销售收入达9 1 0 0 亿美元浑浊问题是目前饮料研发和生产过程中普 遍面临的重要技术障碍多酚和蛋白互作引起的浑浊是各种饮料中最重要、也是 最难彻底清除的浑浊类型之一。资料显示，蛋白分子中脯氨酸或者组氨酸等氨基 酸侧链通过疏水堆叠方式与多酚分子中芳香环结合，分子间的氢键进一步强化两 者的互作形成的可溶性多酚蛋白复合物通过“多酚桥”相互团聚，并形成浑 浊和沉淀多酚蛋白互作强度主要取决于多酚、蛋白浓度以及两者比例，环境 温度、酸度、金属离子等对两者互作也有显著影响。添加明胶或单宁加速絮凝， 皂土等吸附剂吸附、超滤以及酶处理是常用的饮料浑浊控制措施 虽然蛋白对茶饮料浑浊有重要影响，但由于茶饮料中蛋白含量低、分离纯化 困难，有关茶汤蛋白性质及其对茶饮料浑浊影响的研究报道较少。本项目主要采 用电泳技术研究茶汤蛋白的理化特性；并以e g c g 蛋白咖啡因浑浊模型研究蛋 白以及不同温度和酸度条件对茶饮料浑浊形成的影响；比较不同吸附剂对茶汤蛋 白的去除效果，优选吸附剂的种类和使用剂量，为茶饮料浑浊控制奠定基础 利用2 4 个杀青叶样品，对离心前后透过率差值t 与色差和粒度等相关指 标进行了分析结果显示，a t 6 6 0 n m 与l 值、遮光比、比表面积、d 3 等粒度 参数具有显著或极显著的相关关系。以a t 6 6 0 n m 为依据建立了l 值和遮光比等 参数的预测模型，以外部验证法对建立的模型进行了验证证明以a t 6 6 0 为基 础建立的模型可以有效对遮光比、l 、比表面积等参数进行预测，a t 6 6 0 是一种 可用于少量样品( b s a i ng e n e r a l ，p f fi sm u c hs i m i l a rt ob s a b e c a u s eo ft h e i rl o wa b i l i t yo fh a z ef o r m a t i o n p r o t e i n se x t r a c t e df r o mc o m m o nt e a b e l o n g e dt on o n h a p si n t h i sm a n n e r s i g n i f i c a n te f f e c t so fp r o t e i n st y p ea n d c o n c e n t r a t i o n e g c gc o n c e n t r a t i o na n ds y s t e mt e m p e r a t u r eo nt h eh a z ef o r m a t i o n w e r ef o u n di nm o d e ls y s t e m f u r t h e r m o r e ，s t r u c t u r ed a m a g ea n de x p o s i n gm o r e v 浙江大学博士学位论文 p o l y p h e n o l sb m d m g s i t e sw a st h em a i nc a u s ef o rm u c hm o r eh a z ef o r m a t i o na f t e r h e a tt r e a t m e n t so fe g c o p r o t e i ns y s t e m h a z eo fm o d e ls y s t e ma l s oa f f e c t e db yp h v a l u e ，i e w h e np hv a l u ew a sm e a l t h ep r o t e i np im u c hm o r eh a z ew a sd e v e l o p e d ，a n d m u c hm o r el o s eo f e g c ga n dp r o t e i nw a sa l s of o u n d t 6 6 0 ，l i q u o rc o l o rd i f f e r e n c e ，p a r t i c l ei n d e xa n di n g e d i e m ss u c h 器c a t e c h i n s w e r ei n v e s t i g a t e di n1 6s a m p l e sp l u c k e df r o md i f f e r e n tc u l t i v a r s f i v ee i g e n v a l u e s w e r ee x t r a c t e df r o m2 7v a r i a b l e s ，w h i c hr e p r e s e n t e d9 2 c u m u l a t i v ev a r i a t i o n e i g e n v e c t o r sw i t hb i g a b s o l u t ev a l u ew e r es e l e c t e df o r r e g r e s s i o ne q u a t i o n e s t a b l i s h m e n t r e l i a b i l i v yo fe q u a t i o n sw a se s t i m a t e db ya n o t h e r8v a l i d a t i o ns a m p l e s t 6 6 0 ，“l ”v a l u e ，e ( t o t a lc o l o rd i f f e r e n c e ) ，s p e c i f i cs u r f a c ea r e a , a n dp a r t i c l e i n d e x ( e x c e p td a v ) w h i c he s t i m a t e db yt h ee q u a t i o nw e r ec o n s i s t e n tw i t l lt h e “t r u t h v a l u e ”w h i c hw a sg o t t e nb ya c t u a la n a l y s i s i tw a sc o n c l u d e dt h a th a z ef o r m i n ga b i l i t y o ft h et e as a m p l e sc o u l db ee s t i m a t e de f f e c t i v e l yb yc h e m i c a lm e a s l l r e m e n t t h i s r e s u l tc a nb ea d o p t e df o rh a z er e l i e f i nt h em a n n e ro f r a wm a t e r i a ls e l e c t i o n r e s u l t ss h o w e dt h a ts i l i c ag e lh a dt h eh i g h e s ta b s o r p t i o np o t e n t i a lc o m p a r i n gt o t h eb e n t o n i t ea n dw h i t eb o l e s i l i c ag e lc o u l de f f e c t i v er e m o v et h eb s a ( 9 9 ) ，g e l ( 8 8 ) a n dp f t ( 7 7 ) f r o mt h ea q u e o u ss o l u t i o n p r o t e i nc o u l db ee l u t e df r o mg e l e a s i l yb yo 1 mn a o h ，b u ti n e f f i c i e n te l u t i o nw a so b t a i n e dw h e nu s i n gc i t r a t eb u f f e r m o r et h a n8 5 p r o t e i n sw e r er e m o v e db ya d d i t i o no 5 r w v ) s i l i c ag e li n t ot e a i n f u s i o na n dc e n t r i f u g a t i o n t h eg r a d i e n t ss u c ha sc a t e c h i n sa n dc a f f e i n ew e r e a f f e c t e ds i g n i f i c a n t l yb yt h es i l i c ag e lt r e a t m e n t a n dh e a t s t a b i l i t yw a se n h a n c e d d r a m a t i c a l l ya f t e rg e la b s o r p t i o n i tw a sp r o v e dt h a tt h es i l i c ag e lw a sae f f e c t i v e c l a r i f i c a t i o nr e a g e n tf o rp r e p a r a t i o no f r e a d y - t o - d r i n kt e a k e yw o r d s ：p r o t e i ne x t r a c t e df r o mf i x e dt e al e a v e s ，h a z e - a c t i v ep r o t e i n s ( h a p s ) ， p o l y p h e n o l s ，e p i g a l l o c a t e c h i ng a l l a t e ( e g c g ) ，c a f f e i n e ，t r a n s m i t t a n c ed i f f e r e n c eo f b e f o r ea n da f t e rc e n t r i f u g a t i o n ( a t ) ，h a z ef o r m a t i o n ，p r o t e i na b s o r b e n t v i 浙江大学博士学位论文 缩略语 a r g b s a c c a f c v d m s o e c e c g e g c g g a g c g g e l a t i n g l i g l u g l v h a p s h i s h y p k d l z m g m w o b s p f t p g g p i p r p r o p r p p v p s c s d s e s s a t a t c a t g g t s a r g i n i n e b o v i n es e r u ma i b u m i n c a t e c h i n c a f f e i n e c o e f 诧c i e n to f v a r i a t i o n d i m e t h y ls u l f o x i d e e 0 i c a t e c h i n e p i c a t e c h i ng a l l a t e e p i g a l l o c a t e c h i ng a l l a t e g a l l i ca c i d g a l l o c a t e c h i ng a l l a t e g e l g l i a d i n g l u t a m i ea c i d g l y e i n e h a z e a c t i v ep r o t e i n s h i s t i d i n e h y d r o x y p r o l i n e k i l o d a l t o n l y s o z y m e m e t h y lg a l l a t e m o l e c u l a t w e i g h t 0 b s c u r a t i o n p r o t e i n sf r o mf i x e dt e al e a v e s p e n t a g a l t o y l g l u c o s e i s o e l e c t r i cp o i n t p a t h o g e n e s i s r e l a t e d p r o l i n e p r o l i n e r i c hp r o t e i n p o l y v i n y l p y r r o l i d o n e s o l i dc o n c e n t r a t i o n s t a n d a r dd e v i a t i o n s t a n d a r de r r o r s p e c i f i cs u r f a c ea r e a t a n n i ea c i d t r i e h l o r o a c e t i ca c i d t r i g a l l o y l g l u c o s e s h r i n k a g et e m p e r a t u r e 精氨酸 牛血清白蛋白 儿茶素 咖啡因 变异系数 二甲基亚砜 表儿茶素 表没食子儿茶素 表没食子儿茶素没食子酸酯 没食子酸 没食子儿茶素没食子酸酯 明胶 麦醇溶蛋白 谷氨酸 甘氨酸 浑浊活性蛋白 组氨酸 羟脯氨酸 千道尔顿 溶菌酶 没食子酸甲酯 分子量 遮光比 茶汤蛋白 五没食子酰葡萄糖 等电点 病程相关 脯氨酸 富脯氨酸蛋白 聚乙烯吡咯烷酮 固形物浓度 标准差 标准误 比表面积 单宁酸 三氯乙酸 三没食子酰葡萄糖 收缩温度 浙江大学博士学位论文 图片索引 图1 1 1 9 9 7 2 0 0 7 年全球碳酸饮料销售情况 图1 2 全球瓶，桶装水发展趋势 图1 3 全球果蔬汁饮料发展趋势 图1 4 全球酒精饮料发展趋势 图1 52 0 0 6 年美国软饮辩销量组成 图1 61 9 9 9 2 0 0 6 年奎美主要较饮料销售情况 图1 72 0 0 6 年全美酒精饮料市场份额 图1 8 全美1 9 9 8 - 2 0 0 6 年酒精饮料销售情况 图1 9 我国茶饮料发展情况 图1 1 0 多酚蛋白互作产生沉淀的作用机制 圈2 1 茶汤粒径分布 图2 2 离心前各茶汤样品透光率扫描结果 图2 3 离心后各茶汤样品透光率扫描结果 图2 4 茶汤离心前后的透光率差值t 图2 5 根据t 推测的粒子分布情况 囤2 6a t 与色差和粒度指标的相关性 图3 1 不同方法提取的茶叶蛋白电泳结果 图3 2 冷藏和干燥对杀膏叶中大分子量蛋白溶解性的影响 图3 3 杀青叶上清和沉淀中蛋白的等电点 图3 43 7 c 条件下e g c g 对蛋白组成的影响 图3 58 0 c 条件下e g c g 对蛋白组成的影响 图4 13 7 c 温浴条件下e g c g 、c a f 和b s a g * 合体系离心前后的t 变化 图4 2e g c g b s a i c a f 体系3 7 温浴处理后的t 6 6 0 值 图4 38 0 c 温浴条件下e g c g b s a c a f 混合体系离心前后的t 变化 困4 48 0 温浴条件下e g c g ，b s a c a f 各处理a t 6 6 0 值 图4 5不同温浴条件下e g c g b s a c a f 体系平均粒度分析 图4 6 不同温浴条件下e g c g s s a c a f 体系比表面积分析 图4 7 不同温浴条件下e g c g b s a c a f 体系遮光比分析 图4 83 7 c 条件下e g c g o e l ，c a f 体系t 值 图4 93 7 c 条件下e g c g g e l ，c a f 各处理a t 6 6 0 图4 1 08 0 c 条件下e g c g g e l c a f 体系各处理t 值 图4 ，ll8 0 c 条件下e g c g g e l c a f 各处理a t 6 6 0 图4 ，1 2 不同温浴条件下e g c g g e l c a f 体系平均粒度分析 x i v 3 3 4 5 6 7 8 8 他卯柏铊们 们“驰铂卯 鳃 酤酪己刀记弛乃w 弛 浙江大学博士学位论文 囹4 1 3 不同温浴条件下e g c g g e l c a f # 系比表面积分析 图4 1 4 不同温浴条件下e g c g g e l c a f 体系遮光比分析 圈4 1 53 7 ( 2 条件下e g c g p f t c a f 体系各处理a t 值 图4 1 63 7 c 条件下e g c g p f t c a f 各处理a t 6 6 0 值 图4 1 78 0 条件下e g c g p f t c a f 体系各处理t 值 田4 1 s8 0 ( 2 条件下e g c g p f t c a f 各处理t 6 6 0 馑t 圉4 1 9 不同温浴条件下e g c g p f t c a f 体系平均粒度分析 图4 2 0 不同温浴条件下e g c g p f t c a f 体系比表面积分析 图4 2 l不同温浴条件下e g c g p f t c a f 体系遮光度分析 圉4 2 2 不同类型蛋白对a t 6 6 0 的影响 图4 2 3 各因子不同水平对模拟茶汤体系a t 6 6 0 的影响 图4 2 4 不同温度温浴对e g c g b s a c a f 体系中e g c g 变化的影响 图4 2 5温浴对e g c g ，g e u c a f 体系中的e g c g 变化的影响 图4 2 6 温浴对e g c g p f t c a f 体系中的e g c g 变化的影响 图5 1脱除儿茶素类和蛋白对茶汤外观的影响 图5 2p h 对8 s a e g c c _ r 躲a t 6 6 0 的影响 图5 3p h 对g e l e g c g 体系t 6 6 0 的影响 图5 4 温浴6 0 r a i n 时e g c g b s a 体系中e g c g 的变化 图5 5 温浴6 0 r a i n 时e g c g g e l 锚k 系q b e g c g 的变化 图6 1 不同吸附剂对三类蛋白的吸附情况 图6 2s i 0 2 对p f t 等的吸附和洗脱效果 图6 3 不同洗脱剂对s i 0 2 吸附的p f t 的洗脱效果 圉6 4s i 0 2 吸附茶汤中蛋白的实验验证 侣他为舳肌跎昭舭弭跖豁盯黔虬埘啪mm m 浙江大学博士学位论文 表格索弓 表1 12 0 0 6 年上半年世界主要饮料产品消费趋势 表1 21 9 9 9 2 0 0 6 年美国软饮料发展增速情况 表l _ 3 全美酒精饮科历年销售增长情况 表1 42 0 0 7 年日本即饮型清凉饮料组成分析 表1 5 各种蛋白对琢花色素沉淀同位素标记蛋白的竞争性抑制作用 表1 6 不同m w 多聚p r o 对同位素标记b s a 愿花色素互作的抑制作用 表1 7 分子量、没食子酰基数目对多酚与胶原蛋白互作强度的影响 表1 8 不同位置酚羟基对蛋白与多酚互作的影响 表2 12 4 个茶汤样品色差和粒度分析结果 表2 2 色差与粒度指标的相关性分析 表2 3 荼饮料透光率差值指标与其它浑浊指标的相关性分析 表2 4a t 与色差和粒度指标的回归关系 表2 5 用于验证回归关系的1 8 个样品的a t 4 8 0 和a t 6 6 0 表2 6 根据a t 4 8 0 和a t 6 6 0 对l ，遮光比和比表面积的预测效果 表2 7 根据a t 4 8 0 和a t 6 6 0 对粒径预测效果分析 表3 1e g c g 处理对茶汤蛋白透光率差值和蛋白含量的影响 表4 1 试验因素和水平 表4 2 试验组合 表4 33 7 温浴条件下e g c g ，c a f 和b s a 对体系a t 6 6 0 的影响 表4 43 7 c 条件下e g c g b s a j c a f 体系各处理t 6 6 0 比较 表4 58 0 条件下e g c g b s a ，c a f 体系各处理t 6 6 0 比较 表4 68 0 条件下e g c g 、c a f 和b s a 对体系a t 6 6 0 的影响 表4 7 温度和e g c g 等对e g c g b s m c a f 体系a t 6 6 0 的影响 表4 83 7 ( 2 条件下e g c g 等对e g c g g e l c a f 体系t 6 6 0 的影响 表4 93 7 条件下e g c g g e l c a f 体系各处理t 值显著性比较 表4 1 08 0 c 条件下e g c g 等对e g c g g e l c a f 体系a t 6 6 0 的影响 表4 1 l8 0 c 条件下e g c g g e l c a f 体系各处理t 值显著性比较 表4 1 2 温度和e g c g 等对e g c g g e l c a f 体系a t 6 6 0 的影响 表4 1 33 7 ( 2 条件下e g c g 等对e g c g ，p f t c a f 体系t 6 6 0 的影响 表4 1 43 7 c 条件下e g c g ，p f t ，c a f 体系各处理t 值显著性比较 表4 1 58 0 c 条件下e g c g 等对e g c g p f t c a f 体系t 6 6 0 的影响 表4 1 68 0 c 条件下e g c g p f t c a f 体系各处理t 值显著性比较 表4 1 7温度和e g c g 等对e g c g ，p f t c a f 体系a t 6 6 0 的影响 表4 1 8蛋白类型和温浴温度对a t 6 6 0 的影响 表4 1 9 原始添加量对温浴后e g c g b s a c a f 体系中各成分变化的影响 表4 2 0原始添加量对温浴后e g c g g e l 肥a f 体系中各成分变化的影响 表4 2 l原始添加量对温浴后e g c g p f t c a f 体系中各成分变化的影响 袁4 2 2温度对e g c g ，p r o t e i c a f 体系各种成分保留的影响 表4 2 3蛋白类型对e g c g p r o t e i n c a f 体系各种成分保留的影响 x l l 2 6 8!悖孙m叭帖钉船帕如引矾“卵矾刀w竹硼舳趴跎站跗罟g如蛇舛舛 新江人学博士学位论文 温浴温度与蛋白类型互作对体系e g c g 等的影响 温度与模拟体系化学成分变化的相关性分析 e g c g 添加量与模拟体系成分变化的相关性分析 咖啡目添加量与模拟体系成分变化的相关性分析 蛋白添加量与模拟体系成分变化的相关性分析 模拟体系各种成分与t 6 6 0 的相关性 茶汤沉淀中的主要成分分析( ) 热促发浑浊形成机理试验处理组合 1 6 个样品的色差和粒度指标变异情况 1 6 个建模样品的t 变异情况 1 6 个茶汤样品蛋白、咖啡因和几茶素类台量 h p l c 分析获得的茶汤中的未知物质峰面积 茶场化学成分与色差、粒度和透光率之问的相关性 一些未知物质与茶汤色差指标等相关性 各参数之问的协方差分析结果 主成分的特征根 主成分的特征向量 回归方程 用于验证预测方程可靠性的茶汤样品已知化学成分含量 用于验证预测方程可靠性的茶汤样品未知化学成分含量 方程对a t 6 6 0 等指标的预测结果及与实际检测值之间的差异 方程对粒度指标的预测效果分析 加热活化对e g c g 蛋白体系t 6 6 0 的影响 酸度和温浴时问对b s a e g c g 体系t 6 6 0 的影响 酸度和温浴时问对g e l e g c g 体系t 6 6 0 的影响 不同酸度条件下e g c g b s a 体系e g c g 保留情况( p g m 1 ) 不同酸度条件下e g c g b s a 体系中e g c g 水解情况( 1 t g m 1 ) 不同酸度条件下e g c g b s a 体系中e g c g 沉淀和氧化损失情况( a g m 1 ) 不同酸度条件下e g c g g e l f 本系e g c g 保留情况( r t g m 1 ) 不同酸度条件下e g c g g e l 体系中e g c g 水解情况( ) t g n a l ) 不同酸度条件下e g c g g e l c g 系中e g c g 沉淀和氧化损失情况( a g m 1 ) 酸度对e g c g b s a 体系蛋白保留量的影响 酸度对e g c g g e l 体系蛋白保留量的影响 酸度和处理时问对e g c g b s a 体系蛋白保留量等的相关性分析 酸度和处理时问对e g c g g e l 陬- $ 蛋白保留量等的相关性分析 s i 0 2 对b s a 等的吸附和洗脱 不同硅胶用量洗脱液中蛋白浓度 s i 0 2 处理荼汤去蛋白效果 硅胶处理后茶汤儿茶素类和咖啡园含量分析结果( m g l ) 硅胶处理对茶汤热稳定性的影响 舛舛卯mm m m 川m m!兰；兰!呈m m 啪m m m mm协蜥|量m m m拍嚣凹2 3 4 5 6 7 3 9 加挖b h”m体修如甜挖m笃拍勰四2 3 4 5 缸瓤耙瓤靴瓤和耜私私私粘和耔粘粞耔私豁耔秘和耥粘耜粘耜粘耥耜私都耜秘耜都耜粕和都 浙江大学研究生学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得堑鎏太堂或其他教育机构的学位或 证书而使用过的材料与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文 中作了明确的说明并表示谢意 洲黼鲐尸主壶夏蝴期：渺p 年扩日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解澎堑态堂有权保留并向国家有关部门或机 构送交本论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅本人授权泣婆太堂 可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用影 印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：随圣砖 签字日期：钟年占月，驴甘 导师签名 签字日期：7 伊t 揖步月，7 日 浙江丈学博士学位论文 致谢 本论文是在导师梁月荣教授的悉心指导下完成的从论文选题、试验设计和 具体试验以及论文撰写等各方面，导师都投入了大量的时问和精力在该过程中， 导师严谨的治学态度、开阔的科研思路、忘我的工作精神和豁达的学术风范给我 留下深刻印象在本论文完成之际，谨向粱老师致以最崇高的敬意和衷心的感谢! 本论文的完成得到了本系众多老师和同学的指导与帮助。杨贤强教授馈赠了 高纯度e g c g 单体，曾晓维、梅鑫、潘顺顺、杨晓丽同学协助完成了论文研究 中的部分分析测试工作，刘祖生教授对毕业设计提出了一些很好的意见和建议， 郑新强博士对试验研究和论文撰写也提供了很多帮助和建议，朱晓玲老师为本论 文试验研究的顺利开展给予很多仪器设备使用上的方便，d e b a j i t b o r t h a k u r 先生 对英文摘要修改提供了帮助。此外论文研究过程中还得到了张广辉、黄福平、林 晨、杜颖颖、叶倩等同学的无私帮助在这里谨向曾经给予支持和帮助的老师和 同学致以崇高敬意! 在此论文完成之际，我要特别感谢我爱人和我母亲对我学习、工作和生活的 支持与鼓励。 最后，谨向所有关心、支持和帮助我的老师、同学和朋友表示感谢，向参与 论文评阗、答辩的所有专家致以最诚挚的谢意! 陆建良 2 0 0 8 年5 月于华家池 浙江大学博士学位论文第1 章饮料浑浊机理及其控制技术研究进展 第1 章饮料浑浊机理及其控制技术研究进展 饮料是重要的食品种类之一，可分为2 个大类，即酒精饮料和非酒精饮料。 其中酒精饮料又包括烈性酒( 如白酒等) 、啤酒( 包括贮陈啤酒和麦芽酒) 、葡 萄酒、果酒，黄酒和利1 2 酒等。非酒精饮料品类非常繁多，大致可分为软饮料和 固体饮料软饮料包括碳酸饮料、即饮非碳酸饮料( 即饮茶、即饮咖啡等) ，瓶 桶装水，纯果汁及果味饮料、酸乳饮料和运动能量饮料等；非即饮茶和咖啡是 最主要的固体饮料种类 1 1 饮料业发展趋势和存在的主要技术问题 1 1 1 世界饮料发展现状 根据a c n i