（光学工程专业论文）双光子荧光显微镜的研究.pdf

人学颤p 学位论文 摘要 双光子荧光显微镜通过对样品在双光子激发后发出的荧光进行探测，实现样 拘三维成像。与单光子比较，双光子荧光显微成像具有光损伤小、分辨率高等 点，可以对生物样品实时在体监测，已成为研究细胞结构和功能检测的重要工 本文从一般的荧光和荧光显微镜理论出发，引出了双光子荧光显微镜的概 ：对双光了荧光显微镜的成像理论进行研究，通过和单光子荧光成像比较，分 了双光予荧光显微镜的成像特点；然后，完成了双光子荧光显微成像系统的措 ，并对平面扫描做了研究，利用双压电晶片的一维振动实现了光纤二维的扫描： 此基础上用r h o d a m i n eb 作为荧光探针进行了双光子荧光探测实验，分析了 。o d a m i n e b 不同浓度水溶液的荧光强度特性；同时，通过对实验结果的分析， 出引起误差的原因，从而改进系统。 全文共分为h 章。第一章主要讲述了本课题研究工作的背景，简要介绍了荧 和荧光显微镜以及双光予荧光显微镜的应用。第二章从基本原理出发，在理论 分析了双光了荧光显微镜的成像特点，推导了双光子荧光探测公式，并得到了 光子共焦显微镜的点扩散函数。第三章介绍了双光子荧光显微镜系统的几个主 组成部分，说明了各部分的要求，研制了新型的光纤扫描探头。第四章利用搭 完成的双光子荧光显微镜进行了实验，并分析了实验结果。第五章对本论文所 的工作进行了总结，并提出了下一阶段需要完善和深入研究的工作。 键词：双光子荧光显微镜成像理论扫描 塑坚叁! 型! ：兰堡堕兰 塑蔓 a b s t r a c t f h et w o p h o t o nf l u o r e s c e n c em i c r o s c o p yh a sb e e nu s e df o rt h r e e d i m e n s i o n a l i m a g i n gb yd e t e c t i n gt h ef l u o r e s c e n c ee m i t t i n gf r o mt h es p e c i m e nw h e na b s o r b i n g t w op h o t o n s hh a sb e c o m ea ni m p o r t a n ti n s t r u m e n to f r e a lt i m es t u d y i n gt h ec e l l u l a r c o n s t r u c ta n df u n c t i o ni nv i v o ，b e c a u s ei tr e d u c e st h ep h o t o d a m a g e ，l i g h ts c a t t e r i n g a n di n c r e a s e st h er e s o l u t i o nc o m p a r e dw i t ho n e - p h o t o ne x c i t a t i o n i n t h i sd i s s e r t a t i o n ，t h ec o n c e p to ft h et w o p h o t o nf l u o r e s c e n c em i c r o s c o p yi s b r o u g h to u tb a s e do nt h et h e o r yo f f l u o r e s c e n c ea n df l u o r e s c e n c em i c r o s c o p y a n dt h e c h a r a c t e r i s t i c so ft w o p h o t o nf l u o r e s c e n c ei m a g i n ga r ea l s oa n a l y z e dc o m p a r e dw i t h o n e p h o t o nb ys t u d y i n go ft w o - p h o t o ni m a g i n gt h e o r y w h a t sm o r e ，an e wo p t i c a l s c a n n i n gf i b e rw h i c hc a l la c h i e v et w o - d i m e n s i o n a ls c a n n i n gt h r o u 曲o n e d i m e n s i o n a l v i b r a t i n go fb i m o r p hh a sb e e nd e v e l o p e d a f t e rb u i l d i n gt h et w o - p h o t o ns y s t e m ，w e m e a s u r et h ef l u o r e s c e n ti n t e n s i t yo fr h o d a m i n ebw i t hd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o na n d i m p r o v et h es y s t e mb ya n a l y z i n gt h ee r r o r si nt h ee x p e r i m e n t s 1 - h i sd i s s e r t a t i o ni sc o m p o s e do ff i v ep a r t s c h a p t e ro n ee x p l a i n st h eb a c k g r o u n d o fc a r r y i n go u tt h et w o p h o t o nf l u o r e s c e n c e m i c r o s c o p yr e s e a r c h ，i n t r o d u c e s f l u o r e s c e n c ea n df l u o r e s c e n c e m i c r o s c o p y , a n dt h ea p p l i c a t i o no ft w o - p h o t o n f l u o r e s c e n c e m i c r o s c o p yc h a p t e r t w o a n a l y z e s t h e t w o - p h o t o ni m a g i n g c h a r a c t e r i s t i c st h e o r e t i c a l l ya n dg e t st h ep o i n ts p r e a df u n c t i o no ft w o - p h o t o nc o n f o c a l m i c r o s c o p y c h a p t e rt h r e eg i v e sab r i e fi n t r o d u c t i o no fb u i l d i n gt h et w o p h o t o n i m a g i n gs y s t e ma n dd e v e l o p san e wt y p eo fo p t i c a ls c a n n i n gf i b e r c h a p t e rf o u r c o n m i n st h ee x p e r i m e n t sc a r r i e do u ta n dt h ea n a l y s i so ft h er e s u l t s c h a p t e rf i v e m a k e sac o n c l u s i o no f t h i sr e s e a r c ha n dp r e s e n t st h em a i nt a s ki nf u t u r e k e yw o r d ：t w o - p h o t o n ，f l u o r e s c e n c e ，m i c r o s c o p y , i m a g i n gt h e o r y ，s c a n n i n g i l 浙江人学硕十学位论文 第一章绪论 1 1 课题的提出 第一章绪论 随着生物分予光学标记技术的不断进步，光学技术在揭示生命活动基本规律 的研究中正发挥越来越重要的作用，也为医学诊疗提供了更多、更有效的手段。 生物医学光学( b i o m e d i c a l0 鲥c s ) 是近年来受到国际光学界和生物医学界广泛 关注的研究热点，在生物活检、光动力治疗、细胞结构与功能检测、基因表达舰 律的在体研究等问题上取得了一系列研究成果，目前订三在从宏观到微观上对大脑 活动与功能进行多层面的研究。 细胞重大生命活动( 包括细胞增殖、分化、凋亡及信号转导) 的发生和调节 是通过生物大分子问( 如蛋白质一蛋白质、蛋白质一核酸等) 相互作用来实现的。 蛋白质作为基因调控的产物，与细胞和机体生理过程代谢直接相关，深入研究基 因表达及蛋白质一蛋白质相互作用不仅能揭示生命活动的基本规律，同时也能深 入了解疾病发生的分子机理，进而为寻找更有效的药物分子、提高药物筛选和药 物设计的效率提供新的方法和思路。 1 1 1 现代分子生物学的局限 现代分子生物学技术的迅速发展和科技的进步，特别是随着后基因组时代的 到来，人们已经能够根据需要建立各种细胞模型，为在体研究基因表达规律、分 子问的相互作用、肿瘤细胞的增殖、细胞信号转导、诱导分化、细胞凋亡以及新 的血管，成等提供了良好的生物学条件。 然而，尽管人们利用现有的分子生物学方法，已经对基因表达和蛋白质之间 的相互作用进行了深入、细致的研究，僵仍然不麓实现对蛋白质和基因活动的实 时、动态监测。在细胞的生理过狸中，基因、尤其是蛋自质的表达、修饰和相互 作用往往发生可逆的、动态的变化。目前的分子生物学方法还不能捕获刘蛋自质 和基因的这些变化，但获驭这些信息对与研究基因的表达和蛋白质之间的相互作 用又至关重要。因此，发展能用于活体、动态、实时、连续监测蛋白质和基因活 浙江人学坝上学位论文第一章绪论 动的方法非常必要。 光学成像技术与分子生物学技术的结合为研究上述科学问题提供了条件与 可能。因此，在现代分子生物学技术基础上，急需发展新的成像技术。在活体动 物体内，如何实现基因表达及蛋白质之间相互作用的实时在体成像监测是当前迫 刨需要解决的重大核心科学技术问题。这是也生物学、信息科学( 光学) 和基础 临床医学等学科共同感兴趣的重大问题。对这一科学问题的研究不仅有助于测明 生命活动的基本规律、认识疾病的发生发展规律，而且对创新药物研究、药物疗 效评价以及发展疾病早期诊断技术等产生重大影响。 1 1 2 基于分子光学标记的光学成像技术 光学成像技术正成为实时在体研究分子间、分子内蛋白质一蛋白质相互作用、 离子通道、细胞膜蛋白及相关信号转导、生化底物及酶转运等的重要手段，由于 具有高时间、空间分辨率，比现有其他手段更为直接，因而可望成为后基因组时 代新药靶发现和高通量药物筛选的新方法。 表1 - 1 和表l 一2 分别给出了目前处于研究和应用阶段的几种主要成像技术的 应用场合及参数比较【l 叫。 表1 一i 主要成像技术及应用场合 成像方法主要应用场合 核磁共振成像( m r 【)高对比度，用于表型、生理成像和细胞跟踪的最 好的全方位成像系统。 计算机层析成像( c t ) 肺和骨癌成像 。超声成像盘管和介入成像 正电子发射断层成像 分子代谢，如葡萄糖，胸腺嘧啶核苷等的成像 p e t 单毙子发射断层成像探针，如抗体，肽等的成像 s p e c t 荧光反射成像f 糙表面肿瘤分子事件的快速成像 荧光介导层析成像f m t对深部肿瘤靶向标记或“灵活的”荧光染料标记 进行定量成像 牛物发光成像b l i基因表达，细胞追踪成像 活体显微成像 以更高分辨率实现上述所有参数成像，但测量深 度和范围有限。 浙江人学坝 学位论文 抬章绪论 表卜2 常用成像技术及参数比较 j 0 中：$ 表示价j | 备 3 0 万美 时间分 成像方法空间分辨率测量深度造影剂价格 辨率 m r i 1 0 1 0 0 i f t mm i n h r s无限制 钆，镝和氧化铁离子 $ $ $ c t 5 0 u r n m i n 无限制碘$ $ 超卢5 0 l i t mm i nm m 微型气泡 $ $ p e t1 2 r a mm i n 无限制1 8 f 1 l c 。1 5 0$ $ $ 9 9 m t c ( 亚稳态锝) s p e c t 1 2 m m m i n无限制$ $ 1 “i n ( 铟) 荧光反射 1 2 m m s e c m i n l c l n 荧光蛋白 成像f r i近红外荧光染料 $ 荧光介导 层析成像 1 2 m ms e c m i n 1 0 c m 近红外荧光染料 $ $ f m r _ i 物发光 几m m m i nc m 萤光素 $ $ 成像b l l 活体显微荧光蛋白，发光蛋白 成像 1 i - t m s e c m i n 4 0 0 l _ t m$ $ $ 近红外荧光染料 比较两表格中的相关参数可以看出，基于分子光学标记的成像技术已经在q 三 物活检和基因表达规律方面展示了较大的优势。例如，正电子发射断层成像 ( p e t ) 可实现对分子代谢的成像，空间分辨率：1 - 2 r a m ，时间分辨率：分钟量 级。与p e t 比较，光学成像的应用场合更广( 可测量更多的参数，请参见表1 - 1 ) ， 且具有更高的时间分辨率( 秒级) ，空间分辨率可达到微米。因此，二者相比， 虽然光学成像在测量深度方面不及p e t ，但在测量参数种类与时空分辨率方面有 一定优势。对= 于二小动物( 如小白鼠) 研究来说，光学成像技术可以实现小动物整 体成像和在体基因表达成像。例如，初步研究表明，荧光介导层析成像可达到近 1 0 c m 的测量深度；基于多光子激发的显微成像技术可望实现小鼠体内基因表达 的实时在体成像。 1 1 _ 3 本课题主要研究目标和内容 光学成像技术正逐步成为分子实时在体监测的重要手段，尤其是活体显微成 笫章绪论 像在生物医学光学成像研究中显示了较大的优势。而在活体显微成像中，双光子 荧光显微镜凭其独有的优点，成为研究细胞结构和功能检测的重要工具。 本课题主要研究目标为： 针对双光子荧光显微镜的特点，从理论上分析双光予成像特点，并搭建一套 时间、空间分辨率高，能实时、动态、多参数测量的双光子荧光显微镜系统。具 体系统应实现：( 1 ) 能对不同染料的双光子荧光进行探测；( 2 ) 用特定染料对样品 标记以后，能实现双光子荧光的三维成像；( 3 ) 通过实验的研究，改进双光子荧 光显微成像系统；( 4 ) 在保证成像质量的前提下，简化整个系统，使得实验操作 方便、安全。 本课题研究的主要内容为： ( 1 ) 从理论上分析双光子荧光显微镜的成像特点，指出系统中各因素对成像 造成的影响。 ( 2 ) 完成双光子荧光显微镜的搭建。利用双光子显微镜探测r h o d a m i n e1 3 水 溶液的双光子荧光。 ( 3 ) 对不同浓度r h o d a m i n eb 溶液的双光子荧光强度进行探测，分析实验结 果，找出误差的原因，并改进系统。 ( 4 ) 验证荧光强度和激发光强、荧光采集效率和物镜数值孔径之间的关系。 ( 5 ) 对双光子荧光显微镜的平面扫描结构进行改进，研制了新型的光纤扫描 探头。 ( 6 ) 扩展本课题的研究成果，不仅可直接应用于双光子成像，还可与o c t 技 术相结合，对样品实现结构和功能的成像。 1 2 荧光及荧光显微镜简介 1 2 1 荧光简介 单光子激发荧光的过程，就是荧光分子吸收个光子，从基态跃迁到激发念， 跃迁以后，能量较大的激发态分子，通过内转换把部分能量转移给周围的分子， 自己回到最低电子激发态的最低振动能级。处于最低电子激发态的最低振动能级 4 像存牛物医学光学成像研究中显示了较大的优势。而在活体显微成像中，般光子 荧光显微镜凭其独有的优点，成为研究细胞结构和功能检测的重要工具。 本课题主要研究目标为： 针对敢光子荧光显微镜的特点，从理论上分析双光子成像特点，并搭建一套 时间、空间分辨率高，能实时、动态、多参数测量的双光子荧光显微镜系统。具 体系统应实现：( 1 ) 能对不同染料的双光子荧光进行探测；( 2 ) 用特定染料对样品 标记以后，能实现双光子荧光的三维成像；( 3 ) 通过实验的研究，改进双光予荧 光显微成像系统：( 4 ) 在保证成像质量的前提下，简化整个系统，使得实验撰作 方便，安全。 本课题研究的主要内容为： ( ) 从理论上分析双光子荧光显微镜的成像特点，指系统中各因素对成像 造成的影响。 ( 2 ) 完成双光子荧光显微镜的搭建。利用取光了显微镜探测r h o d a m i n eb 水 溶液的双光子荧光。 ( 3 ) 对不同浓度r h o d a m i n eb 溶液的双光子荧光强度进行探测，分析实验结 果，找出误差的原因，并改进系统。 验证荧光强度和激发光强、荧光采集效率和物镜数值孔径之叫的关系。 ( 5 对双光子荧光显微镜的平面扫描结构进行改进，研制了新型的光纤扫描 探头。 ( 6 ) 扩展本课题的研究成果，不仅可直接应用于双光子成像，还可与o c t 技 术相结合，对样品实现结构和功能的成像。 1 2 荧光及荧光显微镜简介 1 2 1 荧光简介 单光了激发荧光的过程，就是荧光分予口及收一个光予，从批态跃迁到激发态， 跃迁以后，能量较大的激发态分子，通过内转换把部分能量转移给周同的分子， 自己回到最低电于激发态的晟低振动能级。处于最低电子激发态的最低振动能级 自己回到最低电了激发态的晟低振动能级。处于最低电子激发态的最低振动能级 4 笫章绪论 像在生物医学光学成像研究中显示了较大的优势。而在活体显微成像中，双光子 荧光显微镜凭其独有的优点，成为研究细胞结构和功能检测的重要工具。 本课题主要研究目标为： 针对双光子荧光显微镜的特点，从理论上分析双光予成像特点，并搭建一套 时间、空间分辨率高，能实时、动态、多参数测量的双光子荧光显微镜系统。具 体系统应实现：( 1 ) 能对不同染料的双光子荧光进行探测；( 2 ) 用特定染料对样品 标记以后，能实现双光子荧光的三维成像；( 3 ) 通过实验的研究，改进双光子荧 光显微成像系统；( 4 ) 在保证成像质量的前提下，简化整个系统，使得实验操作 方便、安全。 本课题研究的主要内容为： ( 1 ) 从理论上分析双光子荧光显微镜的成像特点，指出系统中各因素对成像 造成的影响。 ( 2 ) 完成双光子荧光显微镜的搭建。利用双光子显微镜探测r h o d a m i n e1 3 水 溶液的双光子荧光。 ( 3 ) 对不同浓度r h o d a m i n eb 溶液的双光子荧光强度进行探测，分析实验结 果，找出误差的原因，并改进系统。 ( 4 ) 验证荧光强度和激发光强、荧光采集效率和物镜数值孔径之间的关系。 ( 5 ) 对双光子荧光显微镜的平面扫描结构进行改进，研制了新型的光纤扫描 探头。 ( 6 ) 扩展本课题的研究成果，不仅可直接应用于双光子成像，还可与o c t 技 术相结合，对样品实现结构和功能的成像。 1 2 荧光及荧光显微镜简介 1 2 1 荧光简介 单光子激发荧光的过程，就是荧光分子吸收个光子，从基态跃迁到激发念， 跃迁以后，能量较大的激发态分子，通过内转换把部分能量转移给周围的分子， 自己回到最低电子激发态的最低振动能级。处于最低电子激发态的最低振动能级 4 浙江大学舰卜学位论文第一章绪论 的分子的平均寿命大约在1 0 。8 s 左右。这时它不是通过内转换的方式来消耗能量， 回到基态，而是通过发射出相应的光量子来释放能量，回到基态的各个不同的振 动能级时，就发射荧光。因为在发射荧光以前已经有一部分能量被消耗，所以发 射的荧光的能量要比吸收的能量小，也就是荧光的特征波长要比吸收的特女e 波长 来的长。 一般说来，荧光具有以下的特性： f 1 ) 物质要发射荧光，必须吸收激发光能量。单光子激发荧光所发出的荧 光波长比激发光长，能量比激发光弱。 ( 2 ) 物质荧光的光谱特性是固有的。当它接收特定激发光照射时，就会发 出固有荧光。因此依据荧光的特异性可判断是什么物质。 ( 3 ) 荧光是冷光，在激发光停止照射时，在1 0 1 0 培8 时问内消失。 ( 4 ) 荧光发光方向与激发光的方向无关，呈球体辐射。 ( 5 ) 荧光的衰减与淬灭。荧光的衰减是指在受激发光照射时候，发出的荧 光光强减弱的现象，主要是由光漂白引起的。荧光的淬灭是一种复杂的 现象，由处于激发态的荧光发色团发生变化而导致。 ( 6 ) 荧光的光强一般较弱的，荧光发色团的效率在0 1 o 9 之间，通常只 有0 3 o 4 。 ( 7 ) 荧光具有偏振性。 某种物质能产生荧光，首要条件是分子必须具有吸收的结构，即生色 眉( 分 子中具有吸收特征频率的光能的基团) 。其次，该物质必须具有一定的量子产率 和适直的环境。我们把分子中发射荧光的基团称为荧光团。荧光团一定是生色刚， 但生色团不一定是荧光团。因为，如果生色团的量子产率等于零，就不能发射出 荧光，处于激发态的分子，可以由许多方式( 如热，碰撞) 把能量释放出来，发 射荧光只是其中的一种方式。此外，一种物质吸收光的能力及量子产率又与物质 所处的环境密切相关。 判断化合物能否产生荧光，一般可以从以下几方面来分析： ( 1 ) 碳原予骨架 荧光通常发生于具有共轭双键体系的分子。这种体系中的7 电子共轭度越 火，则非定域石电子越易被激发，荧光也就越易产生，而且荧光光谱将向长波移 浙江人学坝1 学位论史 第一章绪论 动。所以绝大多数能产生荧光的物质含有芳香环或杂环。 ( 2 ) 分子的几何排布 具有强烈荧光的有机分子，多数具有刚性的平面结构。 ( 3 1 取代基的类型和位置 在芳香化食物的芳香坏上，进行不同基团的取代，对改化合物的荧光强度和 荧光光谱都将产生很大的影响。取代基可以分为三类： 加强荧光的如：- - o h ，- - o r , - - n h 2 ，一n h r ，- - n r2 ， - - c n ，- - o c h 3 ，- - o c2 h5 减弱荧光的如：- - c 0 2h ，一c o o h ，- - c = o ，- - n o2 ， - - n o ，一s h ，- - f , 一c i ，- - b r 影u 目不明显的如；一r ，- - s o ，h ，一n h 3 + 荧光坷分为自然荧光和人工荧光两种【2 8 】： 自然荧光( 或称次荧光、自发荧光、自体荧光和原发荧光) ：某些物质不需 要经过处理，当受到激发光照射就能产生荧光的称为自然荧光。如植物的叶子、 茎；动物的一些组织：牙齿、骨质、尿液、血浆及维生素等；某些结晶体、有机 化合物、合成物、油类、蛋白质、腊等。所以自然荧光在造纸、纤维、染料、化 学药品、食品和油脂等工业方面被用作检查和鉴别。在环保中对大气污染公害的 监测中也用紫外线进行粉尘荧光观测。荧光显微镜初期就用于观察动、植物标本 的自然荧光。 人工荧光( 也称二次荧光、继发荧光、染色荧光) ：某些物质必须经过化学处 理，如用染料( 荧光色素) 与其结合，才能在激发光下发射荧光。所谓荧光色素 是一类能产生明显荧光，并能作为染料使用的有机化合物，它有天然和人工合成 两类，后者常用的有数十种之多，如吖啶橙、若丹明等。荧光色素也叫荧光染料， 这样非荧光样品通过有选择的荧光色素进行染色后，在荧光显微镜f 就可从颜色 和反差中清晰地分辨其中不同的细胞组织。染色荧光方法在细胞化学和组织化学 中很早就应用了，如用盐基黄( a u r a m i n e ) 对结核菌染色是常见的。 免疫荧光是利用抗原抗体能进行特异性结合的免疫化学特性，阻荧光色素标 记已知的抗体( 或抗原) 作为试剂，在特定条件下检测未知的抗原( 或抗体) 。借助 浙江人学唢1 学位论文 第幸绪硷 r 荧光显微镜观察抗原抗体结合物的荧光现象，从而可对抗原抗体物质进行定 性、定位观察。此技术已被广泛应用于医学和生物学多种领域之中，并在标准化、 定量化、自动化三方面达到了较先进水平。免疫荧光也称为荧光抗体法，它在1 9 5 0 年由美国生物学家d c o o n s 试验成功。几十年来在细菌学、病毒学、免疫学、免 疫病理学、寄生虫学、肿瘤学方面得到了广泛的应用。 1 2 2 荧光显微镜简介 荧光显微镜是荧光显微检测的专用工具，它是光学显微镜的一种。除了具有 光学显微镜的基本结构和光学放大作用外，基于荧光的特性，还具备以下的功能 利特殊要求： ( 1 ) 需要能量足够强的光源来激发出荧光。 f 2 ) 需要适应不同激发光源的一组滤光片，从光源中选择合适的激发光波 氏，来使之与物质的吸收光谱相同，获得最大的荧光。一般激光作为光 源的单色性较好，可以不用激发光滤光片。 ( 3 ) 为获得荧光图像，还需要一套适用于荧光的滤光片，只让所需的荧光 进入系统进行成像，将其他杂散光，包括激发光，阻挡在外，以提高系 统的信噪比。 ( 4 ) 光学系统应适应荧光的特性，使最终能获得高分辨率的荧光图像。 根据以上的要求，荧光显微的光源选择首先取决于所需检测的荧光物质的吸 收光谱，根据不同的物质选择不同的激发光源；其次要考虑它的功率，原则上只 要能激发出光源就可以，但有时候功率太低，导致激发出来的荧光不稳定等一些 问题，同时也不能功率太大，这样容易导致荧光的衰减和淬灭，也可能对光学元 件造成损伤，所以功率要从光学系统的整体的构架和系统探测的要求来设计。还 有就是滤光片的设计：带通滤光片按波带宽度又可分为“宽波带”和“窄波带” 滤色片，如果半宽带( 即h w = 5 0 的透射峰的主透射带的宽度之半) 大于5 0 n m ， 视为“宽波带型”；若小于2 0 r i m ，则可视为“窄波带型”。多数荧光生色团具 有相当宽的荧光波带，所以在需要得到强荧光时，很少使用窄带滤光片，因为它 致使相当大的荧光能量损失了。在实验中，如果荧光的波长范围和激发光源的范 嗣没有重叠的话，可以使用宽带滤光片，获取最大的荧光能量。在需要选择某种 浙汀大学顺f 学位论丈第。章绪论 特定荧光波长的时候才用窄带滤光片。 荧光显微镜按其结构分，有两种基本形式：透射式和落射式。 透射式荧光显微镜如图1 一l 所示，光源从样品的一端激发，激发出来的荧光 被物镜在样品的另一端收集。 图1 - 1 透射式荧光显微镜简图 落射式荧光显微镜如下图1 - 2 所示 图1 - 2 落射式荧光显微镜简图 激发光由二向色镜( d i c h r o i cm i r r o r ) 反射后通过物镜汇聚在样品上，被激发 浙江人掌旧i 学位论义 出来的荧光经同一物镜收集以后，透过二向色镜被探测器接收。落射式荧光显微 镜的关键是二向色镜，它是多层膜干涉滤光片，可以剥某一波段的光，选择性的 进行反射或透射，与主光路呈4 5 。放置。 这两种基本形式，各有特点和使用价值。 f 1 ) 落射式激发时，物镜兼作聚光镜，就没有聚光镜的定中与调焦问题， 而且物镜的数值孔径随倍率而增大，荧光图像亮度也随之提高； ( 2 ) 落射式激发光不必透过载玻片，因而减少损失，而且激发光与荧光对 物镜而言方向相反，分得很丌不可能产生互相干扰，就是有部分反射激 发光进入物镜后也被二向色镜反射至光源，仪有极小部分透过，使探测 器前的滤光片负担小，可制成较薄的片； ( 3 ) 用透射式激发时，大部分荧光产生于切片底部，必须透过切片射出， 而且还会产生散射。而落射照明和观察面在同一表面，荧光图图像亮度 毫无损耗，而且对象质也无影响，特别对厚的切片，如菌落和组织培养 等更具有独特的功能； ( 4 ) 落射荧光的物镜因要通过紫外区光谱，因此必须要考虑紫外段的透过 率，为此专门研制透紫外区荧光物镜系列，而透射式则不必。 本次实验中，综合考虑，我们选择了落射式光路。 1 2 3 单光子荧光共焦显微镜和双光予荧光显微镜 d i c h r o i c o b i e c t i v e 田 1 一 图1 3共焦荧光显微镜原理图 浙江人学硕j 学位论文 第章绪论 在荧光显微镜结构中，共焦荧光显微镜技术的发展是光学显微镜技术的一次 革命。共焦显微成像工作原理如图1 - 3 所示，它是以光学系统的共焦成像为基础， 利州光扫描技术和样品扫描技术对样品进行三维动态测量的装置。它利用激光作 为光源，在光学设计时，采用共轭焦点( 共焦) 技术，使光源、被照物点和探测 器处在彼此对应的共轭位置。光源经物镜在样品内聚焦成衍射极限的光点，其荧 光( 或反射光) 再次通过物镜或聚光镜到达空间滤波器的共焦针孔内，由靠近针 孔后面的探测接收器接受信号。通过扫描聚光点在样品内的位置对样品进行二维 成像。如图1 3 ，由激光器发出的激光经过照明针孔形成点光源，通过二向色镜， 被物镜聚焦在样品上，可在焦平面上进行扫描。焦平面发出的荧光经物镜收集， 经二向色镜反射，再通过一个共轭针孔，入射到探测器。它的关键技术是共焦小 孔( p i n h o 】e ) 的引入。由于共焦小i l 的存在，探测器只接收来自物镜焦点处的信 息，焦点以外的光将全被共焦小孔屏蔽。因而共焦激光扫描显微镜要比常圳光学 显微镜的分辨率要高些，且图像清晰度也有所增强。而且正是由于共焦小孔的存 在使之其有三维成像的特点，这是常规光学显微镜所不能比拟的。 但是，我们也可以发现：由焦平面发出的荧光有效的被探测器接收了，而在 焦平面的i 二面或下面发出的荧光绝大部分被挡住，而不能接收，也就是说荧光的 利用率较低。如果在成像系统中移去共轭针孔，那么离焦的光线也能到达探测器， 深度方向的分辨率就降低了。而且由于生物的组织的散射作用，使得随着深度的 增加，散射增强，因此发射出来的荧光也受到影响，单光子荧光共焦显微镜，往 往不能深入观察生物组织。还有，虽然荧光只在焦平面上产生，样品焦平面上边 或者f 边的组织在激光的照射下，虽然不参与成像，但会产生光漂白，并会受到 一定的损伤。所以，单光子共焦显微镜不能做长时间的活体组织的观察使用。下 面我们提出了双光子激发荧光的概念。 j 9 3 1 年，o o p p e r t - - m a y e r i j e 明，荧光分子能在足够短的时间内遇上两个或多 个光子，荧光分子就能同时吸收两个或多个光子。1 9 6 1 年得到了实验验证。1 9 9 0 年，d e n k 等将双光子激发用于荧光激发系统，制造出了世界上第一台双光子扫 描显微镜，并应用于生物学观测1 2 1 。1 9 9 7 年，美国伯乐公司首次制造出商业化的 双光子显微镜。双光子激光扫描显微镜( t w o - p h o t o nl a s e rs c a n n i n gm i c r o s c o p y ， t p l s m1 一经问世，很快被应用于神经信号传导、生物代谢过程及其药物研究 浙扛大学硕士学位论文第章绪论 等生物学研究领域，取得了一系列显著成果吲。 近年来，随着飞秒激光技术和光学显微镜技术的发展，现在人们已经能够比 较容易地制造并使用双光子激光扫描荧光显微镜，对样品在双光子激发后发出的 荧光进行观察和三维成像。目前，双光予激光扫描显微镜已成为半导体制造和检 测、生物医学研究 4 , 5 , 6 1 和三维高密度存储及其微细加工的重要工具，利用双光予 激光扫描荧光显微镜的特点揭示了许多新现象和新规律，为丌拓新学科和促进科 学研究领域向更高层次发展起到了非常重要的作用。 双光子荧光显微成像主要有以下优点： a 光损伤小：双光予荧光显微镜使用可见光或近红外光作为激发光，对活 体细胞和组织的光损伤很小，适合于长时间的研究； b 穿透能力强：相对于紫外光，可见光或近红外光具有很强的穿透性，可 以对生物样品进行深层次的研究： c 高分辨率：由于双光子吸收截面很小”，只有在焦平面很小的区域内可 以激发出荧光，双光子吸收仅局限于焦点处的体积约为岔范围内： d 漂白区域很小j ，焦点以外不发生漂白现象。 e 荧光收集率高。与共聚焦成像楣比，双光子成像不需要光学滤波器( 针 孔) ，提高了荧光收集率。收集效率提高直接导致图像对比度提高。 f 对探测光路的要求低。由于激发光与发射荧光的波长差值加大以及自发 的三维滤波效果多光子显微镜对光路收集系统的要求比单光予共焦显 微镜低得多，光学系统相对简单。 g 适合多标记复合测量。许多染料荧光探针的多光子激发光谱耍比单光予 激发谱宽阔【2 9 1 ，这样，可以利用单一波长的激发光同时激发多种染料， 驭而得到圆一生命现象中的不犀信息，便予穗互对照、 充。例如，g f p 和d s r e d ( 一种从热带珊瑚虫中提取的荧光蛋白) 的单光子激发波长分别 为4 8 8n m 和5 6 8n n l ，无法实现利用一束单波长激光同时激发。j a k o b s 等 利用双光子技术，n 9 2 5 n m 激光同时激发了两种荧光蛋白【3 0 】，观察了它 们在大肠杆菌内的表达情况。 但是双光子荧光显微成像也有一定的局限： ( 1 ) 双光子荧光显微镜中的高光子密度可能会产生高次光子相互作用，并 浙江人学顺l 。学位论文 第一章绪论 产生比普通显微镜中更快的光漂白【9 】： ( 2 ) 只能对荧光成像； ( 3 ) 由于红外和近红外光源的使用，样品可能受到热损伤； ( 4 ) 受昂贵的超快脉冲激光器的限制，目前双光予激光扫描荧光显微镜的 成本较高； 这些原因一定程度上限制了双光子激发荧光技术在生物医学和化学等领域 的应用。 这里我们要指出的是，单光子激发荧光和双光子激发荧光，是从荧光产生的 机理上求区分的。而共焦则是荧光显微镜的一种结构，其目的是为了，通过共焦 结构，提高整个荧光显微镜的空间分辨率。所以共焦荧光显微镜可以根据激发光 源的不同，实现单光子共焦荧光成像或者双光子共焦荧光成像。往往个普通的 双光子荧光显微镜( 没有共焦结构) 其空间分辨率也可以达到单光子共焦荧光显 微镜的水平。这样就可以简化整个系统，相对来说，就提高了激发光源的利用率， 以及荧光的探测效率，这个也是我们提倡双光子荧光成像的原因之一。双光子荧 光共焦显微镜由于双光子效应和共焦结构，分辨率则会更高，而我们通常说的共 焦漫微镜都是指单光子激发荧光的。在第二章中，我们将会从原理上来阐述各因 素对双光子荧光显微镜或单光子荧光显微镜空间分辨率的影响。 1 3 双光子荧光显微镜的应用 1 3 1 细胞中c a 2 + 的研究 c a 2 + 是重要的第二信使，对于调节细胞的生理反应具有重要的作用，丌发和 利用双光子荧光显微成像技术对c a 2 + 荧光信号进行观测，可以从某些方面对有机 体或细胞的变化机制进行分析，具有重要的意义。 利用双光子荧光显微成像技术可以观察细胞内用荧光探针标记的c a 2 + 的时 剐和空间的荧光图像的变化，还可以观察细胞某一层面或局部的( c a 2 + ) 荧光图 像和变化。通过对单细胞的研究发现，c a 2 + 不仅在细胞局部区域问的分布是不均 匀的，而且细胞内各局部区域的不同深度或层次间也存在不同程度的c a 2 + 梯差即 所l 胃的空间c a ”梯差。细胞在受到外界刺激时，随着刺激时间的增长，即使刺激 浙江大学顺l 学位论文第一章绪论 继续存在，c a 2 + 荧光信号不但不会继续增强，反而会减弱，直至恢复到未加刺激 物时的水平。对于细胞受精过程中c a ”荧光信号的变化情况，研究发现，酣了在 粘着过程中，c a 2 + 荧光信号未发生任何变化，而配子之间发生融合作用时，c a 2 + 荧光信号强度却会出现一个不稳定的峰值，并可持续几分钟。这些现象，对研究 受精发育的早期信号及c a ”在卵细胞激活和受精卵的发育过程中的作用具有重 要的意义。在其它一些生理过程如细胞分裂、胞吐作用等，c a 2 + 荧光信号强度 也会发生很显著的变化。 1 3 ，2大脑皮层在体神经元功能的双光予成像 双光子荧光成像技术，采用长波激发，能对组织深层次成像，且许多常用最 佳激发波长位于8 0 0 - - 9 0 0 n t o ，水、血液和固有组织发色团对这个波段的光吸收 低，还有散射的激发光子不能激发样品，因此背景和光损伤小，所以适用于在体 检测。 双光子荧光成像技术能准确确定细胞内微电极的位置，能够探测到胞体、树 突甚至单个树突棘的活性。实验表明，通过双光子荧光成像技术，观察到发生在 大脑神经元间突触的活动，动作电位引起的钙离子的变化f l 。 1 3 3 三维高密度存储 现有的密度最高的存储技术是以光盘为代表的光存储方法。传统的二维光存 储方法用可见光或者红外光，在衍射极限内实现大约1 0 8 b i t s c m2 的数据密度存 储。1 9 8 9 年，美国科学家r e n t z e p i s 教授提出了一种三维b i t 数据存储的方法f 1 2 j ， 存储密度高达1 0 1 2 b i t s c m3 。这种方法主要是在现有的二维光盘的基础上将数据 存储扩展到三维空间。而双光子激发具有有效作用体积小的特点，避免了层与层 之阳j 的相互干扰，极大的提高了数据的存储密度。目前利用双光子激发现象实现 i 维高密度存储的方法有很多种：光致变色作用、光致聚合作用、光致漂白作用 和光折变效应等【1 3 。所引起的吸收光谱的不同、折射率不同、荧光量子产率不同 的现象都可以作为实现数字式三维光存储机理 1 4 - 1 9 1 ，并且很容易与现有存储技术 帽兼容。这为利用现有的技术大规模开发和生产这种三维高密度存储设备提供了 浙江人学碗士学位论义 第章绪论 技术上的可行性，具有开阔的研究和应用前景。 l 3 ，4 三维微细加工 由于在紧聚焦的条件下，双光子吸收仅局限于焦点处的体积约为范罔 内，化学和物理过程就发生在这一微小的体积内，体积内的材料吸收舣光子后， 材料就会变成液体或气体，或收缩或膨胀，以及发生其他可能的变化，而焦点外 的其他区域则不发生任何变化。正是由于这一重要作用，人们可以利用通过移动 焦点在样品内的位置来进行三维任意方向的微细加工。c u m p s t o n 及其合作者利 用双光子激发的方式成功地制造出具有独特光学特性的光子带隙( p h o t o n i cb a n d g a p ，p b g ) 材料，重复周期为l u m 。同时还加工出锥型波导管，其截面积从 1 0 0 u m 1 0 0 u m 变化至2 t m ax 1 0 m n 。其制造原理是利用材料在双光子激发下发生 双光子诱导聚合( t w o p h o t o ni n i t i a t e dp o l y m e r i z a t i o n ，p 1 p ) 现象，导致材料溶解 度的变化。事先根据需要的三维形状，利用经物镜聚焦的激光点对材料进行三维 扫描，激光点扫到的位置，其材料的溶解度提高，将其溶解掉就得到了所需形状 的物体1 。它是真正的三维任意方向上的微细加工新方法，开辟了三维微细加工 的新途径。 1 3 5 胚胎学与组织学研究 胚胎发育本身包含复杂的生命信怠，对外界条件十分敏癣。共聚焦显微成像 往往妨碍胚胎发育，不能得到胚胎正常发育的信息。多光予成像非常适合胚胎发 育的氏期动态跟踪。s q u i r r e l l 和w o k o s i n 等用多光子四维成像连续2 4 h 观察了 h a m s t e r 胚胎线粒体动力学，胚胎发育未受影响【2 0 1 ；而对比实验中，共聚焦显微 观察8 h 就抑制了胚胎发育的进行。 多光子能够获取深层次组织清晰的荧光图像，尤其适用于高散射介质的活体 观测，具有其他光学显微镜不可比拟的优势。共聚焦显微镜可以探测到牙齿表面 f 4 0 u m 处，丽双光子的探测深度可以超过1 0 0 u m i ”1 。p a r a s a s s i 等利用双光子显 微镜观察 l a u r d a n 标记的纤维之间的细胞以及蛋白质荧光，研究了小鼠主动脉 血管壁横切面中氢氧化物诱导的蛋自水解过程1 2 2 l 。 浙江人学坝l 学位论文第一肯绪论 1 3 6 代谢过程研究 双光子技术可以用来对标记物质的代谢过程进行监测，记录代谢物的分卉j 、 代谢速度，从而突破传统的生物化学分析方法，从单个细胞层次实时研究代谢过 程，已应用于药物、糖类等物质的代谢研究。例如，细胞p k j n a d ( p ) h 水平反映 了葡萄糖的代谢水平；哺乳动物组织中的葡萄糖代谢时间经历数小时，而且 n a d ( p ) h 酶的荧光激发需要3 5 01 1 1 1 1 紫外光。受对细胞活性和组织的光损伤局 限，共聚焦显微镜无法实现这种观测；双光子技术就能很容易地解决这一问题。 p i s t o n 利用双光子技术观察了不同细胞中n a d ( p ) h 荧光的变化【2 。 1 3 7 荧光关联谱学 荧光关联谱学( f l u o r e s c e n c ec o r r e l a t i o ns p e c t r o s c o p y ，f c s ) 是一种和单分子 探测技术密切相关的信号处理方法。它利用微区内发光分子的荧光涨落获得有关 荧光分子浓度、荧光分子扩散速度等信息，分析产生涨落的物理机制口”。f c s 首 先应用于溶液等非生物体系。随着f c s 技术的成熟，目前，f c s 探测已经深入 到细胞内部，并且达到单分子层次1 2 ”。例如，利用f c s 技术可测量注射到缅胞 内荧光小球的扩散系数；与绿色荧光蛋( g f p ) 结合，可进行活细胞内部蛋白 质扩散系数的测量【2 ”。 塑坚查兰塑堂堡堡壅 笙二童堕丝 参考文献 【1 1k a i s e rw ，g a r r e uc gbp h y s r e v l e t t ，1 9 6 1 ，7 ：2 2 9 - - 2 3 1 2 jd e n kw ，s t r i c k e rjh ，w e b bww s c i e n c e ，19 9 0 。2 4 8 ：7 3 7 6 3 】s optc ，d o n