（细胞生物学专业论文）twist1基因在白血病细胞中的表达及其意义.pdf

中国医学科学院北京协和医学院硕士研究生毕业论文 目录 中文摘要3 英文摘要5 前言8翮吾8 第一章1 1 第二章2 7 讨论4 8 参考文献5 2 小结5 5 综述5 6 缩略词6 4 攻读硕士学位期间发表的论文6 6 致谢6 7 独创性声明6 8 中国医学科学院北京协和医学院硕士研究生毕业论文 中文摘要 1 、嘶s t l 基因是1 9 8 7 年m s s eb 等首先在果蝇中发现的一个新基因，它属于 碱性的螺旋一环一螺旋( b 部i ch e l i ) 【一l o o l e l 议，b h l h ) 转录因子家族成员之一，进化 过程中非常保守，在不同种属之间其核苷酸和氨基酸序列高度保守，在胚胎的发生 发展中发挥重要作用。此外t w i s t l 被认为是癌基因，影响肿瘤细胞凋亡，而且作 为上皮间质转换( e p i t h e l i a l m e s e n c h y 腿lt r a n s i t i o n ，e m t ) 过程中的关键调控 因子，t w i s t l 对肿瘤的侵袭和转移有重要影响。t w i s t l 可参与多种细胞的分化， 包括肌细胞、软骨细胞、骨原细胞，并与心瓣膜的发育有关。t w i s t l 的缺失或突变 会导致尖头一并指畸形综合症。到目前为止，其促肿瘤作用及其与分化关系的报道 多局限于实体瘤，在造血系统中鲜有报道。 我们首先采用r e a 卜t i m ep c r 方法检测了1 8 7 例白血病患者( 1 0 6 例初治患者， 9 例治疗后c r 患者) ，7 例如s 患者，2 9 例i t p 患者及3 例正常人骨髓，3 例正 常人外周血中t 耐s t l 基因的表达情况。c m l 、蝴l 患者同i t p 及正常人相比，确s t l 表达明显升高( p 0 0 5 ) 。t 、) l ，i s t l l 】埘a 表达水平与患者性别，年龄，外周血w b c ，是否表达 c d 3 4 抗原等均未显示出明显的相关性( p 0 0 5 ) 。 无论相对于正常人还是其他白血病类型，c m l 、触儿患者均显示出了t 丽s t l 高表达趋势。蝴l 患者中，m 2 ，m 3 ，m 5 患者的1 s t l 表达中位数显著高于i t p 及正常人( p 0 0 5 ) ，并显著低于舭e t o 阴性的m 2 患者 0 0 3 9 0 ( 0 0 2 7 0 o 7 0 6 0 ) ，( p o 0 5 ) 。在m 3 患者中，初治患者隔s t lm r n a 表达明显高于治疗后c r 患者表 0 6 7 5 5 ( o 0 3 6 0 3 1 1 4 ) v e r s eo 1 1 1 0 ( 0 0 3 8 0 7 2 8 2 ) ，但没有明显统计学差异( p o 0 5 ) 。在c 地患者中，b c 啪l 表达阳性患者的隔s t l 表达中位数 0 5 3 3 0 ( o 0 2 9 0 9 3 4 9 ) 明显高于b c 啪l 阴性患者o 8 0 0 0 ( 0 0 0 6 0 2 9 3 4 ) ，并具有显 中国医学科学院北京协和医学院硕士研究生毕业论文 著统计学意义( p o 0 5 ) 。 由于大量临床标本的检测采用的是r e a l t i m ep c r 方法测m r n a 水平，是否代 表蛋白水平表达尚不清楚。我们取7 例i t p 患者、7 例a l l 患者、8 例c 池患者、 1 l 例舭患者共3 3 例病人的骨髓标本，用i b a l - t i i n ep c r 和免疫组织化学方法同 时检测1 晰s t l 在m r n a 和蛋白水平的表达，并进行两者的相关性分析，结果显示 t 丽s t l 在删眦水平的表达和在蛋白水平的表达具有明显相关性( y = 0 0 1 9 5 9x o 1 5 8 0 ，p = o 0 2 1 1 ) 。提示，r e a l n m ep c r 检测1 谢s t lm r n a 表达，完全可以代 表蛋白表达水平。 上述结果提示，m s t l 可能在c m l 、a m i ，尤其是在b c 啪l 阳性、a m l e t o 阴性和p m i 瓜a r a 阴性白血病的发生和发展中有重要的作用。 2 、在前期工作中我们发现，在k 5 6 2 细胞中转染m d a - 7 i l 2 4 ，可以使1 晰s t l 表达大幅度下降，而m d a - 饥l 一2 4 与细胞的分化有着密不可分的关系，在t p a 诱导 h l 6 0 、u 9 3 7 分化过程中m d a - 饥l 2 4 表达上调，并在n a 诱导分化中起重要作用。 由于k 5 6 2 细胞高表达t 丽s t l 基因，为了研究隔s t l 与白血病细胞分化及 m d a - 饥l 2 4 的关系，我们选取了k 5 6 2 细胞系用n a 诱导细胞分化，分别于2 4 h 、 4 8 h 、7 2 h 用实时定量p c r 和w b s t e mb 1 0 t 方法检测分化过程中m d a - 7 i l 2 4 与1 晰s t l 的表达情况，结果发现，1 r i ) a 处理的k 5 6 2 细胞随着巨核系分化，出现m i 协7 i l 2 4 表达的大幅上调，同时，1 嘶s t l 表达有下降趋势，提示m d a 7 i l 2 4 可能通过下调 t 、) l ，i s t l 表达，促进t p a 诱导的k 5 6 2 细胞分化。用s i r n a 干扰k 5 6 2 细胞中 m d a 7 i l 一2 4 的表达，同时加矸a 处理，检测1 晰s t l 的表达，发现1 晰s t lr i l i 矾a 表达下降，进一步证实了m d a - 饥l 2 4 与1 晰s t l 的关系。为进一步证明t 晰s t l 与分 化的关系，我们构建了p c d n a 3 1 m ) ，c - h i s ( ) b t 丽s t l 重组质粒，转染k 5 6 2 细胞， 筛选出表达t 丽s t l 的稳定细胞株，以期在过表达情况下研究t 丽s t l 与分化的关系。 我们的工作首次证明，m s t1 基因可能在白血病细胞分化过程中具有抑制作 用，m d a - 饥l 2 4 可能是分化过程中1 s t 基因表达下调的机制之一。 关键词：吼s t l ，分化， 白血病，实时定量p c r ， 分化， 几2 4 ，s i i 矾a 4 中国医学科学院北京协和医学院硕士研究生毕业论文 e x p r e s s i o na n d e f f e c t o ft w i s t lg e n eo nh e m a t o p o i e t i cm a i i g n a n c e s a b s t r a c t b a s i ch e l i x l o o p - h e h x 似 l h ) t r a 璐丽p t i o nf a c t ( 潞h a v eb e e ns _ h o 、nt 0p l a y 纽 h p o n a l l tr o l ei nc o n 缸1 0 l l i i 培c e ut ) ，p e d e t e 舢缸撕0 na n dd i 虢r e 】嘶a t i o n n e r 丽s t - l p r o t e i n ( 2 l l s oc a l l e dt 丽s t ) i sah i g l l l yc o n s e r v e d 缸让s 耐p t i o nf a c t o rn l a tb c l o n g st 0 仕屺 伽血l yo fb a s i ch e l i x - 1 0 0 p - h e l i x ( b h l h ) p r o t e i i l s s i i l c ei t s “t i a lf o u i l di nd r o s o p l l i l 毛 也et 1 w i s tg e n eh a sb e e ns t i l d i e di nm m l e r o u so t l l e rs o l i dt u m o rt y p e s ，i n c l u d i n g c a r c i l 】o m ao f t l l el u n g ，b r e a s t ，蜘a c h ， p a n c r e a s ，p r o s t a t e ，c 0 n s i s t e n u yd e m o n 删n g g r o w m l ) r o m o t e ，p r o m o t i i l g 血g 枷o n ，觚t i 一印o p t o s i s ， e m te 丘i e c t so nv 撕o u s 慨r t y p e s 舢t h o u 曲t l w i s th a sb e e na k n o w nc a n d i d a t ec a n c e rg e n et l l e r 印砌cm 0 1 e c u l e ，t 1 1 e e 能c t so nl e 删ar e m a j ne l u s i v e h lo u rp r o t o p h 硒es t u d y ，w ef o u l l dm a t1 晰s t ls h o u l d b eap o s i t i v er e g u l a t o ri nt 1 1 ed e v e l o p m e n to fh e m 咖p o i e t i cm a l i g n a r l c i e s h l 廿l i ss t u d y ， w ed e t e c t c dt 诚s t le x p r e s s i o ni i lv 撕o u sl e u l 【e i l l i ap a t i e 鹏s p e c i i i l e i l s ，t oe x p l o r en l e c o i r e l a t i o nb e t w e e nt 、7 i r i s t la n d 】e u k e m i ac e l ld i 丘l e r e n ：t i a t i o n 惭s t lg e n ee x p r e s s i o nw a sd e | c e c t i 耐b yr e a l 也eq u a i l ：t i ! t i v er t p c r ( r q r t - p c r ) i n b o n em a n 0 wc e l l so f2 2 6p 撕e n t si n c l u d i r 培10 2 创lp a t i e n t s ，5 6c m lp a t i e n t s ，2 9a l l p a t i 哪s ，6m d sp 撕e n t s ， 31 1 e a l t l l yd o n o r sa i l d2 9i r pp a t i e n t sw e r eu s e da u sn o 锄a l c o n 仃0 1 1 1 1 er e l a t i o i l s h i pb 咖e e n1 、i s t le x p r e s s i o na n dt 1 1 ee s t a b l i s h e dp r o 印o s t i c f 孤o r ss u c ha l sa g e ，k a r y o t y p e ，c d 3 4e x p r e s s i o n ，b l a s tp e r c e n t a g e 舡l df a bs u t y t y p e sw a s e x p l o r e d w ef o u i l d 也a te i m e rd i s e a s es t a t u s ，o rk i r y o t ) ， p e w e r ec o r r e l a t c d 诵m 也e e x p r e s s i o no f1 w i s t l w 池r e s p e c tt 0f a bc y t o t ) ，p e s ，e x p r e s s i o no ft 丽s t lg e n ei nc m l ，剐lw a s s t a t i s t i c a l l yl l i 曲e rt h 雒岫i nn o m a l 锄do t h e rs u l 卿e sp o 0 5 ) 1 1 1 ee x p r e s s i o n o f t 丽s t li i lm 2 ，m 3a n dm 5p a t i e n _ c sw 硒m u c hl l i 曲e r 吐l a l lt 1 1 a to f n o m a lc o n t r o l s ，p 0 0 5 ) m o r e o v as i g 证f i c 锄td i c ei nt 丽s t lg e n ee x p r e s s i o nw a so b t a i n e d b 咖e e nt 1 1 e 蝴l e t o p o s i t i v eg r 0 1 l p a i l dt h e 刖l - e t o n e g a t i v e 铲o u p 0 0 3 9 0 ( 0 0 2 7 0 0 7 0 6 0 ) v e r s eo 8 0 0 0 ( 0 0 0 6 0 - 2 9 3 4 ) ，q o 0 5 ) t 丽s t le x p r e s s i o nw 嬲i i l 岫d e n to f 廿：屺b l a s t p e r c l m t a g ei i ld i a g n o s t i cb o n em 踟wq 0 0 5 ) 1 晰s t lg e n ee x p r e s s i o n 、v 鹊d e t e c t e db yr e a l - t i m eq u a n t i ! t i v er t - p c r ( r q i m p c r ) a i l di m 删s t o c h e 戚s t 巧i i lb o n em a 盯o wc e l l so f3 3 p a t i e n t sk l u d 吨1 la m l p a t i e n ：t s ，8c m lp a t i e n t s ，7a l lp a l i e n t s ，锄d7i t pp a t i e n _ t s 袱i r el l s e da sn o 咖a lc 0 n 觚1 t h er e s u l ts h o w s 也a t 让屺e x p r e s s i o no fn v i s t l1 1 1 i 矾aw 舔l l i g h l yr e l a t i 耐t 0 吐l e e x p r e s s i o no ft 丽s t lp r o t e h l ，吐l a tm e a i l sm ee x p r e s s i o no ft 丽s t lm i 斟ac o u l dr e f l e c t 也ee x p r e s s i o nl e v e lo f m s t lp r o t e i n ( y = 0 0 1 9 5 9x 一0 1 5 8 0 ，p = 0 0 2 1 1 ) c o n c l u s i o n l l i 曲e x p r e s s i o no f1 r v 讨s t li nc m l ，m 2 ，m 3a n dm 5p a t i e n t sp r o v i d e s n o v e li l l s i g b t si nt h ed i a 驴o s i so fl e u k e i i l i aa i l dl e u k e m o g e m e s i ss t u d y w b i i e s t i g a t e dt h er e l a t i o n s t l i pb e 帆e e nm ee x p r e s s i o no ft 丽s t la n dd i 伍删a t i o n o fl e u k e i i l i ac e l l sl l s i l l g1 1 ) aw m c hl 埘a p p a r e n te 毹c ti 1 1m e g 出a 巧o c y t ed i 位r e n t i a t i o n i nk 5 6 2c e l l s 1 1 1 e nr e a j t 妇ep c r 、够l l s e dt 0d e t e c t l e e x p r e s s i o no ft 丽s t l ， m d a - 7 i l - 2 4 s i 鲥f i c a n t i n c r e a s e d e x p r e s s i o n o fm 缸7 i l - 2 4 ，锄dd e c r e a s e d e x p r e s s i o no ft 晰s t lw a so b s e n ，e di i lk 5 6 2c e l l sw l l i c h 仃e a t e d 耐t 1 1t 队，c o m p a r e d 晰t 1 1 n o n - t p ac 0 n 们lc e l l s t h e e x p r e s s i o no fc d 4 1 ，c d 6 ld e t e c t e db yf a c s ，w e r e a p p a r e n t l yl l i 曲e rt h 觚n o n - t p ac o n t r o l ，s u g g e s tt l l a tk 5 6 2c e l l sw e r ei i l d l l c e dt ou n d e 玛o m e g a l 【a 巧o c 州cd i 钕e n t i a t i o n k 5 6 2c e l l sw e r e 缸狮s f e c t e d 谢也m d a - 饥l - 2 4 砌曜咄洒 s i r n ao rn e g a t i v ec o n 仃o ls i r n ab yu s i n gl i p o f e c t a 缸n e 仃a n s f e c t i o l l a t 也es 锄et h e t f aw a sa d d e di n t oe a c h s y s t e m t oi i l d u c et h e e x p r e s s i o n o fm d a - 7 i l 2 4 m d a - 7 i l 一2 4 - t a 喀e t e ds i r n as p e c i 矗c a l l y r e d u c e di l - 2 4 e q ) r e s s i o nb y8 0 嬲 唧a r e d 衍mc o n t r o lg r o u p s t h ee x p r e s s i o no ft w i s t ld e c r e a u s e d i i l d i c a t e st l l a t m d a - 7 i l 一2 4c o u l di n l l i b i tt 1 1 ee x p r e s s i o no ft 丽s t l 1 1 1 e s ed a ：c as u g g e s t 斌 i i lo r d e rt op r 0 v ep h e n o m e n aa b o v e ，w ec o l l s 仃u c t e dp c d n a 3 1 一m y c 坷s ( 一) b t 丽s t l 6 中国医学科学院北京协和医学院硕士研究生毕业论文 p l a u s 蚵也a n d 仃舭s 矗娥i ti 1 1 t 0 k 5 6 2c e l ll i n e ，t 0s t u d y l er e l a t i o n s l l i po ft 丽s t l ， m 缸7 i l 2 4 舡l dc e l ld i 伍e n t i a t i o n 1 酞e nt o g e m e r ，也e s ed a t as 廿0 n 9 1 ys u p p o r tt 1 1 a tt 丽s t ls h o u l db ei i n p l i c 砷甜i i l 廿l e d i 航r e i l t i 撕o no fl u e k e m i ac e l l s t 丽s t lr n i g h tb ep a no ft l l er e 嬲o n 也a tm 拯7 i l - 2 4 c o u l di n d u i c ed i 脓n t i a t i o no fl u e k e m i ac e l l s k e yw o r d s ：t 丽s t l ，砌帆虹，l e u k e m i a ，r e a l - t 妇er e c e r s et e a n s c 啦炮s ep 0 1 y m e r a u s ec h a 试 r e a c t i o i l d i 筇：r e n t i a t i o n ，m 出【- 7 i l - 2 4 7 中国医学科学院北京协和医学院硕士研究生毕业论文 】【- 翮雷 隔s t l 基因首先在果蝇中被发现，它属于碱性的螺旋一环一螺旋m 嬲i c h e l i ) 【1 0 0 p - h e l i ) 【，b 甩h ) 转录因子家族成员之一，进化过程中非常保守，在不同种属 之间其核苷酸和氨基酸序列高度保守，并且在不同的种属中其d n a 结合区域具有 1 0 0 的保守序列，即它们都能结合具有e - b o x 的d n a 序列。 人t 而s tl 基因位于7 p 2 1 2 ，含有2 个外显子和1 个内含子。第1 个外显子长为7 7 2 b p ，包含整个编码区域；内含子长为5 3 8b p ；m r n a 全长l6 6 9b p 。t 丽s t 蛋白分子量 为2 6k d ，等电点为9 5 9 1 ，其羧基末端含有碱性的d n a 结合序列和二聚化作用基序， 羧基末端具有疏水性而氨基末端却具有亲水性。惭s t l 基因5 端调节区域的启动 子序列上游有n f 诎，e n g r a i l e d ，a p 2 ，s p 1 ，r b 和删r e b 的结合位点。t 而s t l 蛋白还有二聚化结合基序，可以形成同源二聚体或与含有h l h 的其他蛋白形成异源 二聚体，这些二聚体复合物对下游基因表达有着不同的调节作用。 人类蛳s t l 基因表达在内胚层来源的细胞系和组织中。在成人组织中，隔s t l 在胎盘、成人心脏和骨骼肌肉以及肾脏和胰腺中表达，而脑组织不表达。在不同来 源的正常组织细胞系中，腹膜间皮细胞和子宫内膜纤维母细胞也存在t 丽s t l 表达。 t 丽s t l 可参与多种细胞的分化，包括肌细胞、软骨细胞、成骨细胞【l 一钉，并与心瓣膜 的发育有关【5 1 。两s t 表达阴性的小鼠胚胎只能存活十天左右，并伴有各种缺陷，如 露脑、肢芽发育不全、血管缺陷等嘲。人t 丽s t l 基因编码序列种系突变导致尖头一 并指畸形综合症，大部分尖头一并指畸形综合症患者都存在着t 丽s t 基因的缺失、 错义突变或无义突型6 】。t 丽s t l 能抑制细胞凋亡，在肿瘤的发生、发展及转移过程 中，使细胞失去上皮性标记如e c a d h e r i n 而诱导间充质标记如n c a d l l e r i i l ，f i b r o n c c t i i l ， 和s m i l 的表达，使细胞失去e c a d h d n 介导的细胞间的粘附，导致细胞骨架重建， 并赋予细胞迁移能力，也就是肿瘤细胞上皮一间充质转化( e p i m e l i a l l m e s e n c b y m a l 位i i l s i t i o n ，e mt ) ，表现出癌基因的特点【7 ，引，对肿瘤的转移和浸润有重要意义，它 在许多如乳腺癌、胃癌、肝癌等实体恶性肿瘤中都有表达【9 - 1 1 】，而e m t 的出现也提 示肿瘤的复发，在乳腺癌患者中往往预示着预后不副1 2 】。 黑色素瘤分化相关基因一7 ( m d a - 7 ) 是1 9 9 5 年采用减数杂交技术在诱导终末分 化的人黑色素瘤细胞h o 1 中发现的新基因。该基因在诱导分化后的黑色素瘤细胞和 正常人黑色素细胞中高表达，在原发性黑色素瘤和转移性黑色素瘤组织中表达明显 8 中国医学科学院北京协和医学院硕士研究生毕业论文 降低。由于其基因定位于染色体1 q 3 2 2 1 q 4 1 区域，该区域为细胞因子i l - 1 0 家族相 关基因丛集区，又被命名为几2 4 。m d a 7 m 2 4 在很多实体肿瘤( 包括黑色素瘤、前 列腺癌、宫颈癌、小细胞肺癌、恶性神经胶质细胞瘤等) 中异位表达时具有肿瘤细 胞特异性抑制生长和诱导凋亡作用；此外，还可以抑制肿瘤血管新生、具有抗肿瘤 “旁观者效应”，以及能够增强肿瘤细胞对射线的敏感性。 我室前期工作发现，皿a 在诱导白血病细胞分化过程中诱导i n ( k 7 i l 2 4 表达， m d a - 7 】 l 2 4 参与t p a 诱导白血病细胞单核一巨噬分化的机制，并发现其能抑制k 5 6 2 、 u 9 3 7 、h l 6 0 细胞生长、诱导人急性髓系白血病分化。将m d a - 7 m 2 4 异位过表达于 k 5 6 2 ，m d a - 7 i l 2 4 通过周期阻滞抑制k 5 6 2 细胞体内外生长，基因表达谱芯片结果 显示m d a - 饥l 2 4 显著下调t 丽s t l 表达。 最近有人报道t 丽s t l 参与了卵巢上皮癌干细胞ei ，c d 4 4 + ) 向白伊ei i c d 4 4 - 细胞的分化过程【1 3 】。在造血系统中，成人t 细胞白血病细胞中确s t l 高表达，并 且在干扰h t l v - 1 感染的t 细胞系中惭s t l 的表达后，细胞增殖活性大幅下斛1 4 1 ， 提示t 丽s t l 可能对血液系统疾病的发生发展也有着重要意义。我们在前期工作中发 现，干扰1 晰s t lm r n a 的表达亦可抑制造血系统恶性肿瘤的生长，迁移，有效促进 其凋亡。为了进一步探索t 丽s t l 在造血系统恶性肿瘤中的表达情况，我们首先利用 实时定量p c r 的方法检测了1 8 7 例造血系统恶性肿瘤患者骨髓、2 9 例i t p 患者骨 髓及3 例正常人骨髓中t 丽s t l 的表达情况，并结合患者的临床资料进行分析。由于 大量临床标本的检测采用的是r e a l - t i m ep c r 方法测m i 矾a 水平，是否代表蛋白水 平表达尚不清楚。我们取7 例i t p 患者、7 例a l l 患者、8 例c 地患者、1 1 例a ， 患者共3 3 例病人的骨髓标本，用r e a l t i i n ep c r 和免疫组织化学方法同时检测 t 丽s t l 在m r n a 和蛋白水平的表达，并进行两者的相关性分析，结果显示t 而s t l 在删 斟a 水平的表达和在蛋白水平的表达具有明显相关性( y = o 0 1 9 5 9x o 1 5 8 0 ， p = 0 0 2 1 1 ) ( f i g u 鹏3 ) 。提示，r e a l n i n ep c r 检测确s t li i l 】5 a 表达，完全可以 代表蛋白表达水平。 其次，为了研究t 丽s t l 与m 缸饥l 一2 4 及白血病细胞分化的关系，我们以终浓度 为1 0 n m 的n a 诱导k 5 6 2 细胞，分别于2 4 h 、4 8 h 、7 2 h 用实时定量p c r 和w e s t e mb 1 0 t 方法检测n 狐诱导k 5 6 2 细胞向巨核细胞方向分化过程中m 缸饥l 一2 4 及t 丽s t l 的 表达情况，同时，用s i i 斟a 干扰k 5 6 2 细胞中m d a - 饥l 2 4 的表达并用t p a 处理，于 2 4 h 、4 8 h 、7 2 h 三个不同时间点检测晰s t l 的表达情况。为进一步证明t 丽s t l 与分化 9 中国医学科学院北京协和医学院硕士研究生毕业论文 的关系，我们构建了p c d f 心1 m ) 争- h i s ( - ) b 栅i s t l 重组质粒，转染k 5 6 2 细胞，筛 选表达t 丽s t l 的稳定细胞株，以期在过表达情况下进一步研究t 丽s t l 与分化的关系。 l o 第一章t w i s t l 在造血系统恶性肿瘤细胞中的表达及临床意义 一、材料与方法 一)材料与试剂 1 5 6 例慢性粒细胞白血病病人骨髓标本，急性髓系白血病病人标本1 0 2 例，急性 淋巴细胞白血病病人标本2 9 例，特发性血小板减少性紫癜病人及正常人标本2 9 例， 骨髓增生异常综合症病人标本7 例均来自我院。 2 f i c 0 1 1 淋巴细胞分离液 肝素钠 i 心m 1 1 6 4 0 培养基 f b s 二乙酯焦炭酸( d e p c ) m m l ，v 逆转录酶 d n a 聚合酶 s y b rp r e m i xe x d n a 聚合酶 d l 2 0 0 0m 池r d l l5 0 0 0m a r k e r 琼脂糖 溴化乙啶( e b ) r a b b i ta n t i t 锄s t 抗体 r a b b i t - a m i h u m 趾1 w i s t l 抗体 辣根过氧化酶标二抗 甲醇 d a b 粉剂 二)主要仪器 台式离心机 超净工作台 中国医学科学院血液学研究所 中国医学科学院血液学研究所 美国g i b c o 公司 美国g m c o 公司 美国s i 舯a 公司 美国p r o m e g a 公司 大连宝生物( t a k a r a ) 公司 大连宝生物( 仫a r a ) 公司 天根公司 天根公司 美国g i b c o 公司 美国s i 舯a 公司 s a n l ac i u 亿公司 s a n t a c r u z 公司 中杉金桥 天津北方天医化学试剂厂 中国上海试剂二厂 德国e p p e n d o r f 公司 江苏苏净集团安泰公司 中国医学科学院北京协和医学院硕士研究生毕业论文 倒置显微镜 c 0 2 孵箱 低温离心机 低温离心机 d u 7 0 型紫外分光光度计 g e n e 舢p c rs 皿e m 2 4 0 0 p c r 扩增仪 7 5 0 0 荧光实时定量p c r 扩增仪 恒温循环水浴箱 d y 氍i i l 2 稳压稳流电泳仪 日本0 1 y m p u s 公司 美国1 1 1 e 衄of o n n a 公司 德国h e r e a u s 公司 美国s i 鲫a 公司 美国b e c 蛔姐公司 p e r l d n e h e r 公司 美国a p p l i e db i o s y s t e m s 公司 瑞典b r o 姗a 公司 北京六一仪器厂 三) 实验方法 1 骨髓单个核细胞分离 1 ) 常规无菌条件下行骨髓穿刺术采集患者及健康造血干细胞供者骨髓3 5 n d ，肝素 抗凝，用等体积p b s 稀释后，沿离心管壁缓慢加于f i c o n 分离液之上，注意不要破 坏液面，15 0 0 l8 0 0 印m 离心15 2 0 m i n 。 2 ) 经离心后液体分三层，小心吸取中间白膜层，转移至另一离心管中，p b s 洗涤2 次，1 0 0 0 平m ，5 1 0 i n i n ，弃上清。 3 ) 用白细胞计数板于显微镜下计数细胞，p b s 调整细胞密度至1 x 1 0 6 “，按1 n 山管 分装入经d e p c 处理的1 5 i i l le p 管中，台式离心机离心，2 0 0 0 平m ，6 m i i l ，细胞沉 淀冻存于8 0 备用。 2 细胞总r n a 提取 1 ) 将收集的标本细胞沉淀加1 i n l 啊z o l 提取液，吹打混匀室温放置5 分钟。 2 ) 加0 2 血氯仿，强烈振荡1 5 秒，室温放置2 - 3 分钟，1 2 0 0 0r p m4 离心1 5 m 氓小 心吸取上层水相，转入新e p 管( d e p c 处理) 。 3 ) 加0 5 血异丙醇混匀，室温放置1 0 m i i l ，1 2 ，o o or p m4 离心1 5i i 血l 。弃上清。 4 ) 加1 i i l l7 5 乙醇( d e p c 水配制) 洗涤沉淀，7 5 0 0 印m4 离心5 商n 。 5 ) 空气中干燥，加2 0 山d e p c 处理水溶解对叮a ，8 0 贮存备用。 6 ) 取2 山所提的总i i l i 矾a 溶液进行紫外分光光度仪分析( a 2 6 0 a 2 8 0 1 8 ) 和定量。 3 逆转录反应合成c d n a 按照p r o m e g a 公司m m l v 逆转录酶产品说明书推荐方法逆转录，反应体系： 1 2 中国医学科学院北京协和医学院硕士研究生毕业论文 5 m m l v 逆转录酶缓冲液 4 p l 5 0 0 p g h l lo l i g o ( d d l 2 1 8 1m 1 0 m m d n t p 1 山 m m l ，v 逆转录酶 1 山 总m r n a 2 5 p g d e p c 处理水补至2 0 p l 3 7 6 0 m 妣9 0 1 0 i 血。2 0 贮存备用。 4 p c r 扩增 反应体系( 于冰浴中混合各反应液) 模板 2 1o x p c r 反应缓冲液 2 5 m 上游引物 1 山 ( 1 0 i l m ) 下游引物1 m( 1 0 n m ) d n t p 0 5 山( 1 0 m m ) e x 嘲聚合酶( 5 u 肛1 )o 1 2 5 山 双蒸水补至2 5 p l 9 4 预变性2 n 血；9 4 1m i i l ，5 7 x 1l i l i i l ，7 2 1i n i i l ，3 0 个循环后，7 2 延伸 l om i l l 5 实时定量p c r 检测，1 w i s t lm r n a 表达水平 5 1 理论数据 采用c t 法，即以g a p d h 为内参照基因，计算各样品c t ( 确s t lc t - g a p d hc t ) ，设定c t 值最大的正常人对照为校正样品，计算c t ( 各样品c t 校正样品c t ) ，某患者标本的各基因相对表达量( i 值) 可用如下公式计算： r q = 2 出q 。取两复孔的r q 值计算其均值作为r q 值，并将所得的均值进行以l o 为 底的对数变换。 引物： t 丽s t l ： 上游引物：5 c g c a c c c a g t c g c t g a a c g 3 下游引物：5 c a g a c c g a ( h 蚣g g c g l a g c 一3 t 扩增产物片段长度l9 6 b p 1 3 中国医学科学院北京协和医学院硕士研究生毕业论文 ( 孔心d h ： 上游引物：5 一g a a g l 3 t q 蚣帆g g a g t c 3 下游弓l 物：5 g aa g a t g g t g a t g g g a t t t