（生物医学工程专业论文）应用巴斯德毕赤酵母表达重组人tfpi.pdf

北京协和医学院中国医掌科掌院硕士掌饿论文 a b s t r a c t t i s s u ef a c t o r ( t f ) p l a y sav e r yi m p o r t a n tr o l ei nm a n yk i n d so fd i s e a s e s ， s u c ha sa t h e r o m a t o u sl e s i o n s ，c a n c e ra n ds e v e r es e p s i s ，t h r o u g hi n d u c i n g c o a g u l a t i o na n dc l o tf o r m a t i o n ，w h i c hd i r e c t l yc a u s et h ed e v e l o p i n go ft h e d i s e a s e sa n dt h ed e a t ho ft h ep a t e i e n t s a sam a j o rp h y s i o l o g i c a li n h i b i t o r o ft f ，t i s s u ef a c t o rp a t h w a yi n h i b i t o r ( t f p i ) h a sb e e ne x t e n s i v e l ys t u d i e d a sab i o l o g i c a ld r u gt ot r e a tt h r o m b o t i cd i s o r d e r sa n de n c o u r a g i n gr e s u l t s h a v e b e e na c h i e v e di ni t sa p p l i c a t i o nf o rt r e a t i n gt h r o m b o s i s ，i n f e c t i v e s h o c k ，v a s c u l a rr e s t e n o s i s ，e n d o t o x e m i aa n dd i s s e m i n a t e di n t r a v a s c u l a r c o a g u l a t i o n ( d i c ) ，e t c a p p l i c a t i o no fe c o l i ，s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e a n dm a m m a l i a nc e l l sf o rp r o d u c i n gr e c o m b i n a n tt f p ih a v eb e e n1 i m i t e dd u e t oc o n s i d e r a t i o no fe x p r e s s i o nl e v e l ，c o s to fp r o d u c t i o n ，a n d t h e f u n c t i o n a l i t yo fp r o t e i n i nt h ec u r r e n ts t u d y ，p i c h i ap a s t o r i sw a su s e d t op r o d u c er e c o m b i n a n tt f p i ，a i m i n ga tp r o v i d i n gam o r ee f f i c i e n ts y s t e m f o rh i g hl e v e le x p r e s s i o no fa c t i v et f p i b yi n c r e a s i n gt h ec o p yn u m b e ro f t f p ic d n ai nt h ep i c h i ag e n o m ed n a ，t h ey i e l do ft h er e c o m b i n a n tt f p lw a s i n c r e a s e dt o1 2 5 5 0 2 2 3 m g la sc o m p a r e dw i t h0 2 11 0 0 2 3 m g lf r o mt h e p i c h i ap a s t o r i sc o n t a i n i n gas i n g l ec o p yo ft f p ic d n a t h ee x p r e s s i o nl e v e l o f t f p lw a sf u r t h e re l e v a t e dt o6 8 3 8 0 1 6 m g lb yh i g h d e n s i t yf e r m e n t a t i o n ， w h i c hi s4 4 5t i m e sh i g h e rt h a nt h a tf r o mf l a s kc u l t u r e b yo p t i m i z i n gt h e c u l t u r et e m p e r a t u r ea n dc o n c e n t r a t i o no fm e t h a n o l ，t h ey i e l do ft h e r e c o m b i n a n tt f p lw a si n c r e a s e dt o9 9 5 1 0 7 8 2 m g ln g m l ，w i t ht h ea c t i v i t y b e i n g3 9 1 1 3 7u m 1 k e y w o r d s ：t f p i ：r e c o m b i n a n tp r o t e i n ：e x p r e s s i o n 2 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。论文中除了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人已经发表或撰写 过的研究成果，也不包含为获得其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我 一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢 意。 学位论文作者签名： 拯字脚 9 。 润7 年 | 学位论文版权使用授权书 6 窍8 日 本学位论文作者完全了解兰塞垫塑医堂医有关保存、使用学位论文的管理 办法。有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查 阅和借阅。本人授权j 垂塞逊塑医堂隍可以将学位论文的全部或部分内容编入有关 数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 虢俞槛聊始雠 签字日期朋产毛月痧只 ， 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 签字日期渺7 年月日 电话： 邮编： 北京协和医掌院中国医掌科学院硕士掌位论文 前言 组织因子途径抑制因子( t i s s u ef a c t o rp a t h w a yi n h i b i t o r ，t f p i ) ，也曾称 作脂蛋白相关的凝血抑制因子( l i p o p r o t e i na s s o c i a t e dc o a g u l a t i o ni n h i b i t o r ， l a c i ) 或外源凝血抑制因子( e x t r i n s i cp a t h w a yi n h i b i t o re p i ) ，是一种内源性 蛋白酶抑制因子，它通过直接抑制组织因子( t i s s u ef a c t o r ，t f ) 活性因子v i i ( f v l i a ) 复合物的催化作用及间接抑制活性因子x ( f x a ) 依赖的凝血调控外源性 凝血的起始阶段n 2 1 。t f p i 包括一个带有负电荷的氨基末端，三个相邻的库尼兹 ( k u n i t z ) 蛋白酶抑制结构域以及一个带正电荷的羧基末端( 结构见图一) 。第一 个库尼兹结构域是t f f v i i a 复合物结合的位点，第二个库尼兹结构域是f x a 结合 的位点口4 1 ，第三个库尼兹结构域及羧基末端可以与肝素及细胞表面( 例如，血管内 皮细胞) 结合畸1 。t f p i 主要由血管内皮细胞表达，在体内有三个存储池：1 0 位于 血小板中，当受到凝血酶及其他激动剂的刺激后会释放t f p i 阳1 ；在血管内皮细胞上， t f p i 会与内皮细胞表面的肝素硫酸盐或其他葡糖氨基聚糖类结合h 1 ；以单体或脂蛋 白结合形式在血浆中循环随1 。血浆中t f p i 多数为分子量3 4 至4 1 k d a ，浓度大约为 5 0 至l o o n g m l 【9 1 0 1 。 在新的凝血理论中，组织因子( t i s s u ef a c t o r ，t f ) 在凝血及血栓形成中扮演 了很重要的角色n 卜1 ( 组织因子在凝血中作用简图见图二) 。在动脉粥样化损伤中， 例如，主动脉瘤，颈动脉及冠状动脉粥样硬化，都发现了大量的t f 存在n 1 6 1 。表达 在恶性肿瘤表面的t f 所介导的血栓形成被公认为是肿瘤病人致死的第二大因素 口7 1 8 1 。同时，t f 在败血症发展中扮演了双重重要角色，即炎症及凝血。当败血症及 其严重时，可观察到由t f 所导致的脏器的损伤n 引。 t f p i 作为一种治疗血栓形成异常的糖蛋白已经进行了较多的研究附2 3 i 。在研究 重组t f p i 治疗败血症的研究中，一期及二期临床实验结果其在治疗方面的成功性， 且不会造成出血倾向1 。然而三期临床实验结果却未能证明其对于严重败血症患者 生存率明显的提高乜朝。综上所诉，对于t f p i 的研究还需更进一步。 为了获得重组t f p i 用于研究及今后的临床应用，多种表达系统已经被用来表达 这一糖蛋白，但到目前为止效果都不太理想。利用大肠杆菌( e c o l i ) 表达系统表 达重组t f p i ，虽然其具有可以大规模及低成本诱导表达的优势，但是其表达的蛋白 多为包涵体，需要经过繁琐的复性环节才能被利用；同时，由于大肠杆菌属于原核 生物，缺乏真核生物对于蛋白翻译后最简单的加工与修饰，表达的t f p i 缺乏糖基化， 使其半衰期远小于由哺乳动物细胞表达的r h t f p i 啪删。利用酿酒酵母 ( s a c c h a r o m y c e sc e r e visia e ) 表达系统表达重组t f p i ，其表达全长( 卜2 7 6 氨基 酸序列) t f p i 的活性只有0 1 4 0 0 4 u 1 0 8 细菌心8 1 ，而且，尽管酿酒酵母作为真核生 物可以提供重组t f p i 糖基化，但其糖基化提供的核心寡糖多为0 c l ，3 形式连接的多糖 3 北索协和医学院中圈医掌科学院硕士学位论文 2 9 , 3 0 ，容易引起严重的免疫反应故不适合用于医疗用途的t f p i 表达。利用哺乳动物 细胞( m a m m a lj a nc e l l ) 表达系统表达重组t f p i ，多个细胞株已被用以表达重组t f p i ， 例h e p g 2 、c h a n gl i v e r 、s k 和新生仓鼠肾细胞等d 1 ，但t f p i 表达量仅有1 - 5 m g l ， 考虑到表达蛋白时需使用昂贵的动物源性生长因子，表达重组t f p i 成本高。 近年来巴斯德毕赤酵母( p i c h i ap a s t o r i s ) 表达系统已经成功应用于多种重 组蛋白的表达堋。因其具有可以在无需生长因子的化学物质培养基中生长，可大 规模发酵培养，外源蛋白表达量大，自身蛋白分泌少等优势；而且，巴斯德毕赤酵 母作为真核生物，提供了接近于人的蛋白翻译后加工与修饰，其糖基化结构相对于 酿酒酵母表达系统更适合表达医疗用途的糖蛋白。更有研究者通过基因工程改造巴 斯德毕赤酵母菌株，使得外源蛋白的糖基化与人类自身糖蛋白糖基化一致嘲。利用 巴斯德毕赤酵母表达系统表达重组糖蛋白t f p i 将会获得大产量，高活性及接近于天 然的重组t f p i ，使其具有良好的临床应用前景。 许多因素影响着巴斯德毕赤酵母表达系统对于外源蛋白的表达，如外源基因在 酵母基因组中的拷贝数，诱导表达的温度、甲醇浓度、溶解氧和p 1 等。它们可以影 响巴斯德毕赤酵母菌体的生长密度及活力，促进或抑制外源蛋白的合成与降解等， 进而影响表达量。 外源基因拷贝数：外源基因插入的巴斯德毕赤酵母基因组d n a 中拷贝数的多少 直接影响外源目的蛋白的表达量，一般认为拷贝数越高，外源蛋白表达量就越高汹_ 铂 诱导温度：诱导温度对酵母自身的生长、外源蛋白的表达量有重大影响，巴斯 德毕赤酵母的最适生长温度为3 0 c ，然而，毕赤酵母在较低温度( 甚至1 2 ) 下 仍可以较快生长n5 j 。一些研究表明采用较低的温度表达外源蛋白可以增加外源蛋白 的表达量。低温发酵增加重组蛋白表达的依据可能有以下几个方面：首先，较低的 温度有可能更利于外源重组蛋白的翻译后修饰及正确折叠，使有活性的重组蛋白量 相应增加。z h e n g j u nl i 在诱导表达外源蛋白h e r r i n ga n t i f r e e z ep r o t e i n 时用较 低的温度( 2 3 ) 提高了具有生物活性的蛋白表达量，可能由于该蛋白容易形成无 活性聚合体和分子问二硫键n 引。其次，在较高温度时，酵母的比生长速率较高，有 研究表明比生长速率较高时，菌体死亡率高，菌体大量裂解，造成大量的胞内蛋白 酶释放至发酵液中，外源重组蛋白易被降解h 引。再次，低温条件下蛋白酶的活性降 低，使其对于外源蛋白的降解程度减轻。 甲醇浓度：在诱导表达阶段以甲醇为作为唯一碳源，外源蛋白c d n a 在上游p 删 的强烈启动之下，外源重组蛋白即被诱导表达h0 4 8 。5 2 3 。然而，过高的甲醇浓度增加 了甲醇代谢产物甲醛和过氧化氢的积累，它们对巴斯德毕赤酵母有毒害作用，会增 加细胞的死亡和裂解，导致胞内蛋白酶大量释放，这些蛋白酶可能对分泌型表达的 外源蛋白的降解负有重要责任。过低则限制菌体生长且诱导强度过低。选择合适的 4 北京协和医掌院中国医掌科学院硕士学位论文 甲醇浓度，能够显著提高外源蛋白的表达量晦引。 溶解氧含量：巴斯德毕赤酵母通过氧化途径利用甲醇，因此在以甲醇为碳源培 养时，需要消耗大量的氧气，溶氧不足会限制菌体增殖，并且造成甲醇及其代谢物 甲醛和过氧化氢的累积，对酵母产生毒性嘲脚1 。发酵过程中，溶氧暂时性的不足能 造成菌体死亡裂解，释放大量蛋白酶，降解外源分泌型重组蛋白，严重影响蛋白表 达量及品质。因此，有必要对溶解氧进行控制以维持其充足及稳定的供应。 诱导p h ：在p h 值3 - 7 范围内，毕赤酵母的生长受影响很小呻1 ，而诱导表达时的p h 则可显著影响外源蛋白的表达量或品质晴引。发酵过程中，酵母细胞分泌或者裂解释 放蛋白酶，不同的外源重组蛋白可能主要被其中某些酶降解，而这些酶促反应的最 适p h 有所不同。因此，诱导时的p h 可以通过影响蛋白酶活性来改善蛋白产物的降解， 从而提高活性全长蛋白产物的表达量嘟朋。 综上所述，通过选择合适表达条件，可以优化重组t f p i 在巴斯德毕赤酵母表 达系统中表达量及活性。基于实验室现有条件，本文对影响外源蛋白表达的三个重 要因素，即外源基因拷贝数，诱导温度以及甲醇浓度进行优化。 5 北京协和医掌院中国医掌科学院硕士掌位论文 - k u n i t z 2 k u n i t z - 3 图一：组织因子途径抑制因子的二级结构 h n n u r e v m e d 1 9 9 5 4 6 ：1 0 3 - 1 2 6 北京协和医学院中国医学科学院硕士学位论文 i x 4 1 x j a - 1 f i b r i np o l y 腿r f i b r i n o p e p i i d e s 舳一 图二：组织因子在凝血中作用简图 a n a e s t h e s i a ，2 0 0 4 ，5 9 ，4 8 3 4 9 2 7 北京协和医掌院中国医掌科学院硕士掌位论文 课题的提出 组织因子途径抑制因子( t i s s u ef a c t o rp a t h w a yi n h i b i t o r ，t f p i ) 是外源性凝血 途径的主要抑制物，能够抑制凝血及血栓形成异常。对动脉粥样化损伤，癌症及败 血症等疾病的治疗具有很大应用潜力，因此t f p i 重组蛋白具有重要的药用价值， 在前期工作基础上，通过含高拷贝t f p ic d n a 菌株的筛选和表达条件的优化，进一 步提高t f p i 重组蛋白在毕赤酵母细胞的表达量，应用前景良好。 8 北京协和医掌院中国医掌科掌院硕士学位论文 第一部分巴斯德毕赤酵母表达质粒的构建、制备及鉴定 试剂、耗材和仪器 1 试剂及耗材 表达质粒m t f p i - p p i c 9 ：本实验室构建 ec o l i 菌株t b l ：本实验室提供 表达质粒载体p p i c 9 k ：美国i n v it r o g e n 公司 e xt a q 酶及1 0 e xt a q 缓冲液：日本t a k a r a 公司 d n t p 混合物：r 本t a k a r a 公司 限制性内切酶e c o ri 及1 0 k 缓冲液：日本t a k a r a 公司 限制性内切酶x h oi 及1 0 k 缓冲液日本t a k a r a 公司 限制性内切酶b g li i 及1 0 k 缓冲液：日本t a k a r a 公司 限制性内切酶h i n di i i 及1 0 k 缓冲液：日本t a k a r a 公司 t 4 连接酶及l o t 4 连接酶缓冲液：日本t a k a r a 公司 琼脂糖：北京s o l a r b i o d n a 分子量标准( 入h i n di i id n am a r k e r ) ：日本t a k a r a 公司 d n a 分子量标准( 1 0 0 6 ，0 0 0w i d er a n g ed n am a r k e r ) ：日本t a k a r a 公司 酵母提取物：英国o x o i d 公司 胰蛋白胨：英国o x o i d 公司 质粒小量提取试剂盒：北京天根 琼脂糖凝胶d n a 片段回收试剂盒：北京天根 其他试剂均为市售分析纯试剂 2 仪器 加样器( 0 5 一l o u l ) ：德国b r a n d 公司 加样器( 2 - 2 0 u 1 ) ：德国b r a n d 公司 加样器( 2 0 2 0 0 u 1 ) ：德国b r a n d 公司 加样器( 2 0 0 - 1 0 0 0 u 1 ) ：法国g i i s o n 公司 电子天平：p l 6 0 2 - s ，瑞士m e t t l e rt o l e d o 公司 微量电子天平：a l l 0 4 ，瑞士m e t t l e rt o l e d o 公司 超净工作台：苏州净化 孵育箱：日本s a n y o 公司 恒温细菌摇床：h z q - f 1 6 0 ，哈尔滨h d l 涡旋混合仪：w h 2 ，上海沪西分析仪器厂有限公司 9 北京协和医掌院中国医掌科学院硕士学位论文 台式微量离心机：上海飞鸽电器厂 立式微量离心机：h i m a cc f1 5 r ；t 1 5 a 2 2 ；日本h i t a c h i 公司 落地式高速离心机：a v a n t ij 一2 5 ；j l i t er o t o r ；美国b e c k m a n 公司 4 一2 0 冰箱：中国海尔公司 一8 6 冰箱：中科美菱 液氮罐：c r y o s y s t e m4 0 0 2 ，美国c b s 公司 p c r 仪： a t c 一2 0 1 ，美国a p o l l o 公司 电泳仪：p o w e r p a c2 0 0 ，美国b i o - r a d 公司 琼脂糖凝胶电泳槽：d v c p - 3 1 b n ，北京市六一仪器厂 凝胶成像仪：g i s - 2 0 2 6 ，上海天能科技有限公司 酶标仪：v a r i o s k a nf l a s h ，美国t h e r m o 公司 1 0 北京协和医学院中圜医学科学院硕士学位论文 主要试剂的配制 1 培养基配制 1 )l b 培养基 酵母提取物y e a s te x t r a c t 胰蛋白胨t r y p t o n e 氯化钠n a c l 加去离子水至4 0 0 m l ，混匀，1 2 1 高压3 0 m i n 4 保存 2 )l b 琼脂平板 酵母提取物y e a s te x t r a c t 胰蛋白胨t r y p t o n e 氯化钠n a c i 琼脂粉a g a r 加去离子水至4 0 0 m l ，混匀，1 2 1 高压3 0 m i n ，铺板，冷却。 4 保存 3 )l b 一氨苄( 氨苄青霉素含量为1 0 0ug m 1 ) 培养基 酵母提取物y e a s te x t r a c t 胰蛋白胨t r y p t o n e 氯化钠n a c i 加去离子水至4 0 0 m l ，混匀，1 2 1 高压3 0 m i n 将培养基冷却至4 5 。c ，加入氨苄青霉素( 1 0 0 m g m 1 ) 4 0 0 u l ， 4 保存 4 )l b 一氨苄( 氨苄青霉素含量为1 0 0 | lg m 1 ) 琼脂平板 酵母提取物y e a s te x t r a c t 胰蛋白胨t r y p t o n e 氯化钠n a c l 琼脂粉a g a r 加去离子水至1 0 0 m ，混匀，1 2 1 高压3 0 m i n 将培养基冷却至4 5 1 2 ，加入氨苄青霉素( 1 0 0 m g m 1 ) l o o u g m l 铺板，冷却。 4 保存 1 1 4 0 0 m l 2 9 4 9 2 9 4 0 0 m l 2 9 4 9 2 9 6 9 4 0 0 m l 2 9 4 9 2 9 4 0 0 m l 2 9 4 9 2 9 6 9 l o o u l ，配成终浓度 北京协和医学院中豳医掌科学院硕士学位论文 2 工作液配制 1 ) 5 0 t a e 缓冲液 t r i s n a 2 e d t a 加入8 0 0 m l 双蒸水，混匀 冰乙酸 双蒸水定容1 l 使用时，将5 0 x t a e 缓冲液稀释5 0 倍后使用 2 ) o 5 琼脂糖凝胶 琼脂糖a g r o s e t a e 缓冲液 煮沸，混匀 1 2 1 l 2 4 2 9 3 7 2 9 5 7 1 m l 2 0 m l 1 9 2 0 m l 北京协和医掌院中圜医学科学院硕士学位论文 方法 1 分别设计上、下游p c r 引物，上游引物：5 g a a g g a t c c a a a c g a t g a g a t t t c c t a g3 带有限制性内切酶b a mhi 酶切位点；下游引物：5 c g c c c t a g g k a a t t q a c a t a t t t t 3 带有限制性内切酶e c o ri 位点。由上海生工负责合成并纯化。以重组质粒 m t f p i p p i c 9 为模板，用上述引物，e xt a q 酶及d n t p 混合物扩增出t f p id n a 阅读框架 反应体系为 1 0 0l l1 t a k a r ae xt a q ( 5 u p1 )o 5ul l o x e x t a q b u f f e r ( m 9 2 + p l u s ) 1 0 u1 d n t pmixture(各25ram)4u1 模板d n a 2 0 n g 上、下游引物( 1 0 0 u m )各0 4i l1 无菌去离子水 8 0 5p1 反应条件为： 9 4 3 0 s e c 5 5 3 0 s e c 7 2 l m i n 上述反应3 0 个循环 将p c r 反应液上样琼脂糖凝胶电泳，结果见图1 。 北京协和医学院中国医掌科学院硕士学位论文 2 使用限制性内切酶b a mhi 和e c o r1 分别双酶切上述p c r 扩增片段以及表达质 粒载体p p i c 9 k ， 反应体系：2 0pl p h c 9 k p c r 扩增片 1pg t a k a r ab a mhi ( 1 5 u | l1)05u1 t a k a r ae c o ri ( 1 5 u u1)05ul t a k a r a1 0 kb u f f e r2 u1 无菌去离子水 7 | ll 反应条件：3 7 2 小时 将反应液上样于琼脂糖凝胶电泳，使用琼脂糖凝胶d n a 片段回收试剂盒，分别 回收纯化上述p c r 扩增和载体质粒p p i c 9 k 酶切后片段( 具体方法详见附录) 。 3 将上述纯化后的p c r 扩增和表达质粒载体p p i c 9 k 酶切后片段通过t 4 连接酶连 接， 反应体系： t a k a r at 4d n al i g a s e ( 3 5 0 u p1 ) t a k a r at 4l ig a s eb u f f e r 双酶切后p p i c 9 k 双酶切后r h t f p i 无菌去离子水 反应条件：1 6 ，过夜反应 2 5u1 1ul 2 5u1 0 3 p m o l 加至2 5u1 将反应液直接转化感受态大肠杆菌t b l ( 感受态大肠杆菌t b l 制备具体方法详 见附录) ，并将1 0 0l l1 转化后菌液直接涂布在l b 氨苄( 氨苄青霉素含量为1 0 0 ug m 1 ) 培养琼脂平板上，3 7 。c 培养1 2 小时。获得带有r h t f p i p p i c 9 k 的大 肠杆菌t b l ( t b l 一r h t f p i p p i c 9 k ) 。 4 挑取单个菌落至l o m ll b 氨苄( 氨苄青霉素含量为1 0 0ug m 1 ) 培养基，2 5 0 r p m 3 7 。c 培养1 2 小时，使用质粒小提试剂盒小量提取质粒r h t f p i - p p i c 9 k ( 具体 方法详见附录) ，质粒分别被限制性内切酶屁冰i ，x b oi ，b g li i 以及h i n di i i 1 4 北京协和医学院中国医掌科学院硕士学位论文 酶切， 反应体系： r h t f p i p p i c 9 k 2 0p1 1l jg t a k a r a 屁徕i ( 1 5 u | l1 ) x h oi ( i o u | l1 ) 脚i i ( 1 0 u i j1 ) h i n di i i ( i o u u1 ) 1 | l1 t a k a r a1 0 h h h mb u f f e r2 | ll 无菌去离子水 7pl 反应条件：3 7 1 小时。将反应液上样琼脂糖凝胶电泳，结果见图2 。 5 将质粒送上海生工，以引物： 5 c g c c c t a g g g a a t t c a c a t a t t t t3 5 g a a g g a t c c a a a c g a t g a g a t t t c c t a g3 和 进行扩增测序。 1 5 j e 京协耳口医学院中国医掌科学院硕士学位论文 结果和讨论 煳j ：p c r 反应液琼脂糖凝胶电泳结果 m ：d n a 分子量标准，1 0 0 6 0 0 0w i d er a n g e d n am a r k e r ( t a h a h 曲 l ：p c r 产物 由图1 n 知，p c r 产物电泳条带分子量约1i k b ，符合预计p c r 产物( 1 ，1 2 5 b p ) 包括了表达质粒载体p p i c 9 r 1a f a c t o r 信号序列( 编码a 因子信引芋列的2 6 9 b p ， 用于毕赤酵母分泌表达) 以及t f p ic d n a ( 8 3 1 b p ) 。 2 i 1 3 。 4 日b 5 t 3 e l 搿 图2 ：r h t f p ip p i c 9 r 限制性内切酶分析图谱 m d r a 分r 标准量 h i n di i id n a m a r k e r ( t a k a r a ) l ： 来酶切质粒r h t f p i p p i c 9 k 2e c o ri 酶切质粒r h t f p i p p i c 9 k 3 ： b g li i 酶切质粒r h t f p ip p i c 9 k 4 ：x h oi 酶切质粒r h t f p 卜p p i c 9 k 5 ：h i n d 儿i 酶切质粒r h t f p ip p i c g k m 2 ：d n a 分子量标准，1 0 06 0 0 0y i d er a n g e d n hm b x k e r ( t a k a r a ) 备注：根据理论推算，酶切片段大小应符合下表 北京协和医学院中国医掌科掌院硕士掌位论文 由图2 可知，r h t f p i p p i c 9 k 经由e c o ri 酶切产物分子量大约为l o k b ；经由 b g li i 酶切产物分子量大约为7 k b 及2 2 k b ；经由x h oi 酶切产物分子量大约为5 3 k b 及4 7 k b ；经由h i n di i i 酶切产物分子量大约为5 o k b 、3 5 k b 、1 5 k b ( 由于1 2 b p 太小，不能在0 5 琼脂糖凝胶上观察到) ；上述结果符合r h t f p i p p i c 9 k 酶切分析 理论推算结果。 测序结果： g a a g g a t c c aa a c g a t g a g at t t c c t t c a at t a t t a c t g ca g t t t t a t t cg c a g c a t c c t6 0 c c g c a t t a g ct g c t c c a g t ca a c a a t a c a ac a g a a g a t g a a a c g g c a c a a a t t c c g g c t g1 2 0 a a g c t g t c a tc g g t t a c t c ag a t t t a g a a g g g g a t t t c g at g t t g c t g t tt t g c c a t t t t1 8 0 c c a a c a g c a c a a a t a a c g g gt t a t t g t t t at a a a t a c t a ct a t t g c c a g ca t t g c t g c t a2 4 0 a a g a a g a a g gg g t a t c t c t cg a g a a a a g a g a g g c t g a a g ct g a t t c t g a gg a a g a t g a a g3 0 0 a a c a c a c a a tt a t c a c a g a ta c g g a g t t g cc a c c a c t g a a a c t t a t g c a tt c a t t t t g t g3 6 0 c a t t c a a g g cg g a t g a t g g cc c a t g t a a a g c a a t c a t g a aa a g a t t t t t ct t c a a t a t t t4 2 0 t c a c t c g a c a g t g c g a a g a at t t a t a t a t g g g g g a t g t g aa g g a a a t c a ga a t c g a t t t g4 8 0 a a a g t c t g g aa g a g t g c a a aa a a a t g t g t a c a a g a g a t a at g c a a a c a g ga t t a t a a a g a5 4 0 c a a c a t t g c aa c a a g a a a a gc c a g a t t t c tg c t t t t t g g aa g a a g a t c c tg g a a t a t g t c6 0 0 g a g g t t a t a tt a c c a g g t a c t t c t a c a a c aa t c a g a c a a a a c a g t g t g a a c g t t t c a a g t6 6 0 a t g g t g g a t gc c t g g g c a a ta t g a a c a a t t t t g a g a c a c t g g a a g a a t g ca a g a a c a t t t7 2 0 g t g a a g a t g gt c c g a a t g g tt t c c a g g t g g a t a a t t a t g ga a c c c a g c t ca a t g c t g t g a7 8 0 a t a a c t c c c tg a c t c c g c a at c a a c c a a g gt t c c c a g c c t t t t t g a a t t t c a c g g t c c c t8 4 0 c a t g g t g t c tc a c t c c a g c ag a c a g a g g a t t g t g t c g t g c c a a t g a g a a ca g a t t c t a c t9 0 0 a c a a t t c a g t c a t t g g g a a a t g c c g c c c a tt t a a g t a c a gt g g a t g t g g gg g a a a t g a a a9 6 0 a c a a t t t t a ct t c c a a a c a ag a a t g t c t g a g g g c a t g t a aa a a a g g t t t ca t c c a a a g a a l 0 2 0 t a t c a a a a g ga g g c c t a a t t a a a a c c a a a a g a a a a a g a a a g a a g c a g a g ag t g a a a a t a 9 1 0 8 0 c a t a t g a a g aa a t t t t t g t ta a a a a t a t g t g a a t t c a c a ta t t t t 11 2 5 上述测序结果符合实验室构建的突变t f p ie d n a 碱基序列，从第8 2 至第1 1 1 2 共 8 3 1 碱基是t f p i 基因序列，其中6 0 6 至6 4 1 的碱基序列( t a ta t ta c ea g gt a ct t ct a c a a ca a tc a ga c aa a a ) 是经本实验室突变的碱基序列( 区别于原始的人t f p ic d n a 序列t a ta t ta c ca g gt a t t t tt a ta a ca a tc a ga c aa a a ，其中斜体标记的碱基 是被突变的碱基) 。突变的目的是防止巴斯德毕赤酵母对于外源基因的翻译不会因 外源基因c d n a 中胸腺嘧啶碱基的密集而提前终止h 引。 1 7 北京协和医掌院中国医掌科学院硕士学位论文 小结 巴斯德毕赤酵母表达质粒r h t f p i - p p i c 9 k 构建完成，通过酶切分析及测序鉴 定，该表达质粒可以用于转化巴斯德毕赤酵母菌株，并构建含有高拷贝t f p ie d n a 基因的转化子。 1 8 北京协和阪学院中豳医掌科学院硕士学位论文 第二部分巴斯德毕赤酵母的转化，高拷贝转化子的筛选及鉴定 试剂、耗材和仪器 1 试剂及耗材 d n a 纯化试剂盒( p c r 产物纯化试剂盒) ：天根生化科技( 北京) 有限公司 毕赤酵母原生质体转化试剂盒( p i c h i as p h e r o p l a s tk i t ) ：美国i n v i t r o g e n 公司 毕赤酵母菌株g s l l 5 ：美国i n v i t r o g e n 公司 细胞培养板( 9 6 孔) ：b i o - o n e ，f l a tb o t t o mp l a t e ，德国g r e i n e r 公司 实时定量试剂盒( e x s c r i p t t mr tr e a g e n tk it ) ：日本t a k a r a 公司 s y b r 。g r e e n ( s y b r g r e e np c rm a s t e rm i x ) ：美国a b i 公司 琼脂糖：北京索莱宝科技有限公司 d n a 分子量标准( 入h i n di i id n am a r k e r ) ：日本t a k a r a 公司 d n a 分子量标准( 1 0 0 6 ，0 0 0w i d er a n g ed n am a r k e r ) ：日本t a k a r a 公司 酵母提取物：英国o x o i d 公司 胰蛋白胨：英国o x o i d 公司 t f p i 定量试剂盒：a s s a y m a xh u m a nt f p ie l i s ak i t ，美国a s s a y p r o 公司 b c a 定量试剂盒：上海生工 4 s d s p a g e 上样缓冲液：北京索莱宝科技有限公司 小分子量蛋白分子标准量( 低分子量，非预染) ：日本t a k a r a 公司 小分子量蛋白分子标准量( 预染) ：美国n e b 公司 p v d f 膜：i m m o b i l o npt r a n s f e rm e m b r a n e ( o 4 5i im ) ，美国m i l l i p o r e 公司 滤纸：国产 一抗：小鼠抗人t f p ii g g ，美国a d i 公司 二抗：山羊抗鼠i g g ，辣根过氧化物酶( h r p ) 结合，美国i n v i t r o g e n 公司 e c l 发光试剂盒：北京全式金生物技术有限公司 胶片( 柯达x o m a tb t 医用x 射线胶片) ：美国k o d a k 公司 显影液及定影液：天津市亨达经济贸易公司感光材料厂 其他试剂均为市售分析纯试剂 2 仪器 电子天平：p l 6 0 2 - s ，瑞士m e t t l e rt o l e d o 公司 微量电子天平：a l l 0 4 ，瑞士m e t t l e rt o l e d o 公司 超净工作台：苏州净化 孵育箱：日本s a n y o 公司 恒温细菌摇床：h z q - f 16 0 ，哈尔滨h d l 1 9 北京协和医掌院中圈医掌科学院硕士掌位论文 涡旋混合仪：w h 2 ，上海沪西分析仪器厂有限公司 加样器( 0 5 - 1 0 i j1 ) ：德国b r a n d 公司 加样器( 2 2 0 u1 ) ：德国b r a n d 公司 加样器( 2 0 2 0 0 i j1 ) ：德国b r a n d 公司 加样器( 2 0 0 1 0 0 0l j1 ) ：法国g i l s o n 公司 立式微量离心机：h i m a cc f1 5 r ；t 1 5 a 2 2 ；同本h i t a c 眦公司 落地式高速离心机：a v a n t ij - 2 5 ；j - l i t er o t o r ；美国b e c k m a n 公司 4 - 2 0 冰箱：中国海尔 - 8 6 。c 冰箱：中科美菱 液氮罐：c r y o s y s t e m4 0 0 2 ，美国c b s 公司 p c r 仪：a t c 一2 0 1 ，美国a p o l l o 公司 电泳仪：p o w e r p a c2 0 0 ，美国b i o - r a d 公司 琼脂糖凝胶电泳槽：d v c p - 31b n ，北京六一仪器厂 s d s p a g e 垂直电泳槽：v e l 8 0 ，上海天能科技有限公司 凝胶成像仪：g i s 一2 0 2 6 ，上海天能科技有限公司 酶标仪：v a r i o s k a nf l a s h ，美国t h e r m o 公司 荧光定量p c r 仪( a b i7 3 0 0r e a lt i m ep c rs y s t e m ) ：美国a b i 公司 半干法电转仪( t r a n s - b l o ts e m i - d r ye 1 e c t r o p h o r e t i ct r a n s f e rc e l l ) ：美 国b i o - r a d 公司 p h 计：4 0 5 一d p a s s c k 8 s ，瑞士m e t t l e rt o l e d o 公司 凝胶成像仪：上海天能科技有限公司 北京协和医学院中国医掌科学院硕士学位论文 主要试剂的配制 1 培养基配制 1 ) y p d 培养基 酵母提取物y e a s t