BIO-RAD脉冲场电泳介绍课件.ppt

脉冲场电泳介绍（PFGE）,一、脉冲场电泳（PFGE）的原理二、脉冲场电泳（PFGE）的操作流程三、脉冲场电泳（PFGE）的应用,主要内容,脉冲场电泳（PFGE）的原理,核酸的凝胶电泳:核酸凝胶电泳是重组DNA技术的核心技术之一，它可以按分子量大小对DNA或RNA进行分离。因此，可用于分离、鉴定和纯化DNA或RNA片段，也是许多分子生物学研究方法，如DNA分型、DNA核苷酸序列分析、限制性内切酶片段分析、凝胶回收等等一系技术的技术基础。,常用的核酸凝胶电泳有琼脂糖(Agarose)凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）。可以在水平或垂直的电泳槽中进行。,脉冲场电泳（PFGE）的原理,脉冲场电泳（PFGE）的原理,琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为0.2-50kb之间。聚丙烯酰胺凝胶的分辨范围为1-1,000bp之间。凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。,不同类型琼脂糖分离DNA片段的范围,脉冲场电泳（PFGE）的原理,脉冲场电泳（PFGE）的原理,DNA在聚丙烯胺凝胶中的有效分离范围,脉冲场电泳（PFGE）的原理,在凝胶电泳中或后，加入溴化乙锭（Ethidiumbromide，EtBr）染料对核酸分子进行染色，然后放置在紫外光下观察，可灵敏而快捷地检测出凝胶介质中DNA的谱带部位，即使每条DNA带中仅含有0.05g的微量DNA，也可以被清晰地检测出来。,普通核酸电泳的应用：1、分子克隆-PCR产物特异性的确认2、RNA完整性的确认（定量PCR的验证环节）,脉冲场电泳（PFGE）的原理,脉冲场电泳（PFGE）的原理,脉冲场凝脉电泳(Pulsedfieldgelelectrophoresis,PFGE),是近年发展起来的一种重要的分离大分子量线性DNA分子的电泳技术。普通的琼脂糖凝胶电泳分离DNA分子的上限是50kb大于该极限的DNA分子,常规的琼脂糖凝胶便失去了其分子筛的作用,导致电泳带型无法分辨，PFGE的发明正好解决了这一问题。,脉冲场电泳（PFGE）的原理,1984年,Schwartz和Cantor首次用此技术成功分离得到酿酒酵母菌(Saccharomycescerevisiae)细胞的16条完整染色体DNA。此后,随着PFGE技术的不断改进,现已具有分辨出高达10Mb级DNA的能力。这一独具的高分辨力使PFGE的应用范围已涉及到几乎所有生物基因组结构的研究。,PFGE的基本原理是对琼脂糖凝胶外加交变的脉冲电场,其方向、时间和电流大小交替改变,每当电场方向发生改变时,大分子DNA便滞留在凝胶孔内,直至沿新的电场轴重新定向后,才能继续向前泳动,DNA分子越大,这种重新定向需要的时间就越长,当DNA分子改变方向的时间小于脉冲时间时,DNA就可以按照其分子量大小分开,经EB染色后在凝胶上出现按DNA大小排列的电泳带型。这种电泳技术促进了癌症研究、食品安全、公共健康、品质控制和基因组作图的进步。,脉冲场电泳（PFGE）的原理,PFGE的原理,PFGE,普通核酸电泳,脉冲场电泳（PFGE）的原理,BIO-RAD脉冲场电泳的型号选择,脉冲网实验室使用BIO-RAD的脉冲场电泳系统分离菌株DNA，电泳完毕后凝胶用EB染色，然后用BIO-RAD的分辨率更高的成像仪采集和处理图像，并制成TIFF格式，使用带数据共享工具的Fingerprinting软件或BioNumeric软件进行分析。该模式成功地应用于细菌性传染疾病的溯源及监控。,CHEF-DRIII,脉冲场电泳系统的配件,脉冲场电泳（PFGE）的实验流程,所有的培养细胞用琼脂糖包被，避免后续处理过程中DNA被剪切,琼脂糖和细胞的混合物注入制样模块中，(1.5mmx10mmx5mm)，凝固后，胶块可以从制样模块中取出。,胶块在细胞裂解液和蛋白酶K溶液中处理,制好的胶块，可以在1天内或4天中进行后续处理,脉冲场电泳（PFGE）的操作流程,胶块的制备:常规的DNA制备方法得不到完整的大分子量DNA,因为DNA大片段很脆弱,容易因提取过程中的机械作用如吸打、离心等而导致DNA的断裂。,脉冲场电泳（PFGE）的操作流程,为了得到完整的大量DNA大片段,目前主要是采用低熔点琼脂糖(Lowmeltingpointagarose)包埋样品,再进行原位裂解和去蛋白处理从而释放DNA。低熔点琼脂糖在这个过程中阻止了机械力对DNA大片段的剪切作用,因而细胞裂解所释放的DNA大片段包埋在胶块中。制作好的样品插块可以在电泳时直接插入加样孔中。,16hr,用不常用的限制性内切酶消化DNA，产生15-20条带，可以清楚的鉴别亚型,脉冲场电泳（PFGE）的操作流程,脉冲场电泳（PFGE）的操作流程,DNA用EB染色，在紫外下观察结果。,电泳条带被凝胶图象仪记录下来，可以和数据库的资料做比较。比较的结果可以在不同实验室之间共享。,脉冲场电泳（PFGE）的操作流程,影响PFGE结果的因素,影响PFGE实验结果的因素：脉冲角度（Pulse/ReorientationAngle）脉冲转化时间和转化速率（SwitchTimeandSwitchTimeRamping）电压梯度（VoltageGradient）缓冲液类型、浓度和温度（BufferType,Concentration,andTemperature）琼脂糖类型和浓度（AgaroseTypeandConcentration）运行时间（RunTime）,脉冲场电泳（PFGE）的操作流程,PFGE具有独特的分离大片段DNA的能力,是一种分析染色体DNA强有力的工具。目前PFGE主要应用于染色体DNA的分离、微生物基因分型、DNA辐射损伤修复、细胞凋亡、酵母人工染色体电泳分析及单向电场泳难以分辨的DNA图谱制作等研究中。,脉冲场电泳（PFGE）的应用,脉冲场电泳（PFGE）的应用分子分型,一、PFGE在分子分型方面的应用通过微生物分型可以鉴定菌株是否一致、比较它们的亲缘关系,对于细菌性传染病的监测、传染源追踪、传播途径的调查和识别有着非常重要的意义。传统的微生物分型技术主要是基于表型特性分类,如生化分型(biotyping)、血清学分型(serotyping)、耐药谱测定(antmiicrobialsusceptibilitytesting)、噬菌体分型(bacterialphagetyping)等。由于微生物易受环境的影响,很容易改变其表达性状,使得表型分类很不准确。近年来随着分子生物学技术的发展,基因分型技术日渐受到青睐。现代的分子分型技术主要有:基于限制性内切酶的分型技术:PFGE分型和RFLP分型;基于PCR的分型技术:RAPD分型、Rep-PCR分型、AFLP分型;基于核苷酸序列分析的分型技术:SLST分型和MLST分型。,2019/12/15,26,可编辑,微生物表型分型与分子分型的方法对比,1.表型和分子分型各有优缺点；对于罕见血清型菌株，表型可发挥重要作用2.分子分型的方法各有优缺点，各有适用性，联合使用是主流3.实验方法和结果的质量保证是任何分析网络的最关键部分,PFGE分型技术因其重复性好、分辩力强被誉为细菌分子分型技术的“金标准”,并推荐作为金黄色葡萄球菌等病原微生物分型的标准技术。PFGE分型技术的不足是:耗时,需要24d的样品制备时间;设备价格昂贵；对分析大小相似的片段分辨力不是很高。目前,美国PulseNet已创建病原菌PFGE图谱数据库,通过与数据库中病原菌PFGE图谱的比较,可以判断菌株间染色体DNA的相似程度。,脉冲场电泳（PFGE）的应用分子分型,脉冲场电泳（PFGE）的应用分子分型,Tenover等提出了有关PFGE图谱与测定菌株相关性的判别标准,根据电泳条带可分为:如PFGE图谱一致,说明为相同菌株;有13条带的差异说明菌株间有相近关系,且只有单基因的改变;46条带的差异说明菌株间可能有相近关系,表示出有2个独立基因的差异;如菌株间有6条或更多条带差异,说明有3个或更多的基因差异,视为无相关性。该标准有一定的局限性。因为细菌的高变异性,判断是否是同一菌株时允许一定的变异存在。Fred在解释PFGE图谱时提出85%以上条带相同的为相同菌株,50%以上条带不相同的为不同菌株。,脉冲场电泳（PFGE）的应用分子分型,PulseNet,大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、李斯特菌、弯曲杆菌,PulseNet,PulseNet,PulseNet,PulseNet,加强公共卫生实验室和流行病学合作（1）,建立参比实验室和流行病学之间的常规和快速信息共享如每周例会通过实验室支持针对暴发的流行病学调查检测流行病学调查假设的样本来自病人的样本高度怀疑的致病源，如食物、水病原体分子分型共同讨论，确定较好的分型方法血清分型抗生素耐药性分析分子分型，如脉冲场凝胶电泳（PFGE）,建立实验室质量控制体系如外部质量控制系统（EQAS）引入区域或WHO全球性的监测网络，如全球食源性疾病监测网络Regionalcenters区域中心EQASofWHOsGFNCountrydatabank国家数据库Electroniclistserve电子目录服务器,增强公共卫生实验室和流行病学合作（2）,基因组文库是将细胞的核DNA酶切或随机打断成一定大小的片段，然后将全部片段随机地连接到各种基因载体上，再转移至适当的宿主细胞中，通过宿主细胞的大量繁殖而形成的各个片段的无性繁殖系的总集。大片段基因组文库包括噬菌体、YAC、BAC、Cosmid和Fosmid等文库，主要根据他们插入片段大小和构建的载体不同而进行分类的。当前几乎所有的模式物种及许多重要濒危物种都已建立了基因组文库。构建基因组文库也是全基因组测序中的一项重要工作，建立不同长度插人片段的基因组文库，为全基因组序列的拼接组装及基因组物理图谱的绘制提供必要条件。一般在DeNovo全基因测序中应用最多的是插入片段为约100Kb的BAC文库和40Kb左右大小插入片段的Fosmid文库，已有大量文献报道。构建BAC或Fosmid文库时，其插人片段长度都已超过普通电泳分离阈值，而PFGE技术的应用有效地解决了这一难题。,脉冲场电泳的应用构建基因组文库中的应用,文库构建中主要有以下几个方面需要应用到PFGE技术：特定长度DNA插入片段的分离，已分离DNA插入片段的大小鉴定，建库质量鉴定(包括大小及稳定性的鉴定)。图1简要演示了两种文库的构建流程及PFGE在其中的应用。,脉冲场电泳的应用构建基因组文库中的应用,二、PFGE在DNA辐射损伤和修复研究中的应用在电离辐射的作用下,DNA分子将产生多种类型的损伤,包括碱基损伤、DNA单链断裂(SSB)和双链断裂(DSBs)、DNA-DNA交联以及DNA-蛋白质交联等。辐射生物效应分子模型的提出者Leenhouts和Chadwick认为,电离辐射诱发的许多细胞效应均与DNA的双链断裂有关,所以DSB及其修复一直是研究的热点。,脉冲场电泳的应用DNA辐射损伤和修复,早期研究DSB的方法主要有粘弹性测量法、速度沉降法、中性滤膜洗脱法,这些方法稳定性差,灵敏度低。随着PFGE的出现,辐射引起的DNA断裂过程才得到了详细的研究。利用PFGE可以测量DNA双链断裂后DSBs的分布，研究辐射引起的DNA断裂片段释放的比例(FAR)和DNA断裂片段平均长度随照射剂量的变化规律。,脉冲场电泳的应用DNA辐射损伤和修复,脉冲场电泳的应用DNA辐射损伤和修复,PFGE技术的优点在于灵敏度高,还能够提供DSB片段的大小信息,是检测电离辐射所致DNA双链断裂及修复的敏感方法。但是该方法只能对双链断裂与否作出判断,不能对DSBs进行量化,同时对检测低剂量辐射引起的双链断裂无能为力。,脉冲场电泳的应用DNA辐射损伤和修复,三、PFGE在细胞凋亡研究中的应用细胞凋亡(apopto-sis)又称细胞的程序性死亡(PCD),是在一定的生理或病理条件下,为了更好地适应生存环境而采取的一种由基因控制的、细胞主动的、有序的死亡过程。由于细胞的凋亡与胚胎发育、免疫耐受和许多疾病的产生等方面有着极为密切的关系,因此,细胞凋亡的机理研究已成为生物学领域研究的热点之一。因此,凋亡的检测技术也显得尤为重要。,脉冲场电泳的应用细胞凋亡研究,研究表明:凋亡细胞DNA的降解呈分步进行,首先是核小体之间裂解,产生50300kb大小的大片段(HMW),随后HMW片段进一步分解成规则的约180200bp整数倍的寡核苷酸片段。PFGE可以检测HMW。电泳时,凋亡细胞呈现出阶梯状的条带,而正常细胞为一条带,因此PFGE可作为一种细胞凋亡早期的检测技术。该方法的优势在于可分辨大于5000kb的DNA分子,检测的灵敏度较高,但费时,需大量细胞,易造成核素污染。,脉冲场电泳的应用细胞凋亡研究,四、PFGE在转基因方面的应用PFGE也可作为一种转基因技术。李振刚通过脉冲电泳技术成功地将天蚕丝素基因转入家蚕卵中。YangJS等以水稻细胞为受体,利用脉冲电泳进行转基因并获得了转基因株。董琼珠等利用脉冲电泳技术转化玉米获得转基因植株。一般认为该技术的原理是:在脉冲电场的作用下,置于电场中的转化受体的细胞壁和细胞膜出现了一些微孔,外源DNA大分子在电场的作用下通过上述微孔进入细胞从而达到转基因的目的。转基因时DNA片段越长,越能维持