（生物医学工程专业论文）小鸡视网膜神经节细胞的双峰反应.pdf

摘要的时间特性却始终保持着稳定。印防己毒素( p i e r o t o x i n ) 是一种非特异性的y 氨基丁酸( g a b a ) 受体拮抗剂。实验结果显示，在灌流液中加入印防己毒素可使具有普通瞬时发放特性的神经节细胞变为双峰发放。这提示我们在双峰发放过程中的两次峰值发放的来源可能有所不同，并且后一次发放过程有可能与丫氨基丁酸受体的活动有关。不仅如此，在实验中我们还进一步发现当施加特定颜色的光刺激时，某些经典分类理论认为是非颜色拮抗型的视网膜神经节细胞，其动作电位发放的时间特性会随着刺激光颜色的不同而改变。具体表现为：此类神经节细胞在某种颜色光刺激下可能表现出瞬时型或持续型的反应特征，而在另一种颜色光刺激下却可能表现出双峰反应的特征。我们对来自1 5 个视网膜的4 6 4 个神经节细胞进行了统计，发现其中大约3 7 5 的神经节细胞( n =17 4 ) 在某种特定颜色的光刺激下，其动作电位发放频率都会出现双峰反应特征。除此之外，我们也发现相邻神经节细胞之间放电活动的同步性也会随着颜色刺激的改变而变化。结合之前的实验结果，这提示我们特定颜色的光刺激有可能会影响g a b a 受体通路的活动，进而影响神经节细胞放电活动的时间特性。传统的单电极记录方法至多只能对少数几个( 通常少于5 个) 神经元进行同步记录，因此所对应的数据处理方法也较为简单。而在多电极记录实验中，我们可以同时对数十乃至上百个神经元的活动进行同时记录，所以如何对得到的海量实验数据进行合理有效的分析就成为了一个值得人们第1 i 页摘要思考的问题。结合所获得的视网膜神经节细胞实验数据，我们也尝试了数种方法对其进行分析。关键词：视网膜，神经节细胞，时空特性，多电极记录，适应性第1 i i 页a b s t r a c tt h ed u a l p e a kr e s p o n s ei nc hi c k e nr e t l n a lg a n g l i o nc e l l sa b s t r a c ti nt h ep r e s e n ts t u d y , w ei n v e s t i g a t e dt h es p a t i o t e m p o r a lc h a r a c t e r i s t i c so fg a n g l i o nc e l l s r e s p o n s ei nc h i c k e nr e t i n a t h i st h e s i sc o n s i s t st h r e ep a r t s ：1 t h ed u a l - p e a kr e s p o n s ea n di t si n t e r n a lt e m p o r a lc h a r a c t e r s ，a n dt h ep o s s i b l em e c h a n i s m s ；2 t h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nd u a l - p e a kr e s p o n s ea n dt h ec h a r a c t e r so fl i g h ts t i m u l a t i o n ；3 r e l a t e dd a t aa n a l y s i sf o rc h i c k e nr e t i n a lg a n g l i o nc e l l sb a s e do nm u l t i - c h a n n e lr e c o r d i n g i no u re x p e r i m e n tw i t hr e p e t i t i v el i g h ts t i m u l a t i o n ，i tw a sf o u n dt h a tt h et e m p o r a lc h a r a c t e r so fs o m eg a n g l i o nc e l l s r e s p o n s ew o u l dc h a n g eo b v i o u s l ya l o n gw i t hs t i m u l a t i o n t h e s ec e l l sw o u l dr e s p o n dl i k en o r m a lt r a n s i e n to rs u s t a i n e dc e l l sa tt h ev e r yb e g i n n i n g h o w e v e r , t h e i rr e s p o n s ew o u l db e c o m ed u a l - p e a k a f t e rs e v e r a lr e p e a t so fs t i m u l u s f o rt h e d u a l - p e a k r e s p o n s e ，t h e s en e u r o n sr e s p o n d e dt ol i g h ts t i m u l u sw i t ht w os u c c e s s i v ec o m p o n e n t s ：at r a n s i e n ti n c r e a s eo ff i r i n gr a t ew h i c hl a s t e df o rl e s st h a n10 0m sw i t has m a l ll a t e n c y ( a r o u n d5 0m s ) t ot h es t i m u l u s ，a n da n o t h e rp r o l o n g e dl i g h tr e s p o n s ea p p e a r e di na b o u t10 0m sa f t e rt h ef i r s tt r a n s i e n tr e s p o n s e m o r e o v e r , o u rd a t a第1 v 页a b s t r a c td e m o n s t r a t e dat e m p o r a la d a p t a t i o np r o c e s si nt h el a t e rp h a s eo ff i r i n ga c t i v i t i e sw h e nr e p e a t e df l a s h e sw e r ea p p l i e d m e a n w h i l e ，t h ee a r l i e rp h a s eh a dam o r es t a b l el a t e n c yi nr e s p o n s et ot h es t i m u l u s a p p l i c a t i o no fp i c r o t o x i nc o u l de v o k et h ed u a l p e a kr e s p o n s e si nt r a n s i e n tg a n g l i o nc e l l s t h e s er e s u l t ss u g g e s tt h a tt h eo r i g i n a t i o no ft h et w or e s p o n s ec o m p o n e n t sm i g h tb ed i s t i n c ta n dt h el a t e ro n ei sl i k e l yr e l a t e dt og a b a e r g i cp a t h w a y s b e s i d e so ft h a t 。i ti sa l s of o u n dt h a td i f f e r e n tk i n do fc o l o rs t i m u l a t i o nc o u l dl e a dg a n g l i o nc e l l s r e s p o n s et od i f f e r e n tt e m p o r a lp a t t e r n sa l t h o u g ht h e s ec e l l sc o u l db ec l a s s i f i e da sn o n c o l o r - o p p o n e n tg a n g l i o nc e l l si nc l a s s i c a lt h e o r y f o re x a m p l e ，o n ec e l lm i g h tr e s p o n dl i k es u s t a i n e dc e l l su n d e rr e ds t i m u l a t i o nb u t “d u a l p e a k c e l l su n d e rg r e e nl i g h t as t a t i s t i c a lr e s u l ts h o w e dt h a ta b o u t37 5 o ft h eg a n g l i o nc e l l s ( 4 6 4i nt o t a l ) c o u l ds h o wt h ed u a l p e a kr e s p o n s eu n d e rs p e c i f i cc o l o rs t i m u l a t i o n t h i sr e s u l ts u g g e s t e dt h a ti nc h i c kr e t i n a ，t h ec o l o ri n f o r m a t i o nm i g h tb ee n c o d e dn o to n l yb yt h ec o l o r - o p p o n e n tg a n g l i o nc e l l s ，b u ta l s ot h es p a t i a l t e m p o r a lp a t t e r n so fs o m eg a n g l i o nc e l l st h a ta r et r a d i t i o n a l l yc l a s s i f i e da sn o n - c o l o r - o p p o n e n ts u b t y p e c o n s i d e r i n ga b o u tt h ep r e v i o u sr e s u l ta b o u tg a b ar e c e p t o r s ，t h i sp h e n o m e n o na l s os u g g e s t e ds p e c i f i cc o l o rs t i m u l a t i o nm i g h ti n f l u e n c et h eg a b a e r g i cp a t h w a ya n dh e n c ea f f e c tt h es p a t i a l - t e m p o r a lc h a r a c t e r so fr e t i n a lg a n g l i o nc e l l s a c t i v i t y c o n v e n t i o n a ls i n g l ee l e c t r o d er e c o r d i n gc o u l dr e c o r dt h ea c t i v i t i e so f第v 页a b s t r a c tl i m i t e dn u m b e ro fn e u r o n ss i m u l t a n e o u s l y ( u s u a l l yl e s st h a n5 ) a n do n l yr e q u i r e ss i m p l em e t h o d sf o ra n a l y z i n g h o w e v e r , d a t af r o md o z e n st os e v e r a lh u n d r e dn e u r o n sc o u l db ea c h i e v e dw i t hm u l t i c h a n n e lr e c o r d i n ga tt h es a m et i m e i th a sb e c o m ea ni m p o r t a n tm a n n e rt of i n dp r o p e rm e t h o d st oa n a l y z et h eh u g ea m o u n to fd a t ae f f e c t i v e l y b a s e do nt h ee x p e r i m e n t a ld a t ar e c o r d e df r o mc h i c k e nr e t i n a lg a n g l i o nc e l l s ，w eu s e ds e v e r a lm e t h o d sf o ra n a l y s i sa n dc o m p a r i s o n k e y w o r d s ：r e t i n a ，g a n g l i o nc e l l s ，m u l t i - e l e c t r o d er e c o r d i n g ，s p a t i a l - t e m p o r a lc h a r a c t e r i s t i c s ，a d a p t a t i o n第v i 页符号说明缩写及符号本论文中所使用到的缩写以及符号说明如下：缩写全称a ca m a c r i n ec e l lb cb i p o l a rc e l lb i cb i c u c u l l i n eg cg a n g l i o nc e l lg c lg a n g l i o nc e l ll a y e rh ch o r i z o n t a lc e l li n li n n e rn u c l e a rl a y e ri p li n n e rp l e x i f o r ml a y e ri s ii n t e r s p i k ei n t e r v a lj p s t hj o i n tp e r i s t i m u l u st i m eh i s t o g r a ml g nl a t e r a lg e n i c u l a t en u c l e u sm e am u l t ie l e c t r o d ea r r a ym i nm i n u t em mm m o l lm lm i l l i l i t em sm i l l i s e c o n dn w c m 2o n lo u t e rn u c l e a rl a y e ro p lo u t e rp l e x i f o r ml a y e rp c ap r i n c i p l ec o m p o n e n ta n a l y s i sp s t hp e r i s t i m u l u st i m eh i s t o g r a mp t xp i c r o t o x i nss e c o n dmm o l lp mi _ t m o l l肛vl x v o l t第1 x 页中文名无长突细胞双极细胞荷包牡丹碱神经节细胞神经节细胞层水平细胞内核层内网状层动作电位间隔期联合刺激前后时间直方图外膝体多电极阵列分钟毫摩尔升毫升毫秒纳可平方厘米外核层外网状层主成分分析刺激前后时问直方图印防己毒素( 印防己苦味毒)秒摩尔升微摩尔升微伏上海交通大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：虱匀日期：6 7 年7 月台日上海交通大学学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权上海交通大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密口，在一年解密后适用本授权书。本学位论文属于不保密口。( 请在以上方框内打“4 )学位论文作者签名：f 憩乞指导教师虢事轵茗日期：刁年7 月日日期：潍刁乡e l第一章引言1 1 概述第一章引言视觉信息的初级处理发生在视网膜。视网膜因其解剖结构和功能特性研究得比较透彻，且刺激输入相对容易定义而相应的神经元反应也比较容易记录，一直备受神经科学家的青睐【1 ；2 】。在神经系统中，神经元把外界刺激转换成动作电位序列时不仅仅是发生了能量形式的转换，更重要的是把刺激所包涵的外界信息也转移到了新的信号即动作电位序列之中。随之而来的是神经科学研究中的一个基本问题：如何将与行为相关的信息同神经元活动相对应 3 ；4 】?本论文工作以离体灌流状态下的小鸡视网膜组织为研究对象，利用胞外多电极记录技术对视网膜神经节细胞的对光反应进行同步记录。通过分析和比较不同刺激、给药条件下的实验结果，我们对小鸡视网膜中神经节细胞的某些特定放电模式进行了研究，并对其可能的机制与功能进行了分析和讨论。1 2 视网膜从眼球的剖面图( 图1 1 ) 上可以清楚地看到，眼球主要由眼球壁和眼球内容物两大部分构成的。对哺乳动物而言，眼球壁从外到罩的三层结构依次为纤维膜、血管膜和视网膜。如果将人眼比作照相机，则视网膜好比是涂有感光材料的胶片：外界光线依次经由角膜、瞳孑l 、晶状体、玻璃体以及眼房水之后，最终成像于视网膜上。视网膜从解剖上可以清晰地分为三层：外核层( o u t e rn u c l e a rl a y e r ，简称o n l ) ，内核层( i n n e rn u c l e a rl a y e r ，简称i n l ) 和神经节细胞层( g a n g l i o nc e l ll a y e r ，简称g c l ) 。此外，在三个细胞层之间有两个突触连接层，分别被称为外网状层( o u t e rp l e x i f o r ml a y e r ，简称o p l ) 和内网状层( i n n e rp l e x i f o r ml a y e r ，简称i p l ) 。图1 2 给出了视网膜中各类神经元细胞及其所形成的分层结构示意图。第l 页姒围1 ，1 人类眼球结构简囤f i gl - 1s a g i n a s c c t i o no it h ea d u l th u m a ne y e眼球住于眼眶内，后端有视神经( o p t i c e ) 与脑相连。艰球的构造分眼球壁和内容物两部分眼球壁分3 层，由外向内依次为纤维膜( 角膜( c o r n e a i 和巩膜( s c l e r a ) ) ，血管腱和视网膜( r e t i n a ) 。血管膜由后向前分为脉络膜( c h o r o l d ) 眭状体( c i l i a r yb o d y ) 和虹膜( i r l s ) 。眼球内容物包括晶状体( l e n s ) 、跟屠水扣玻璃体( v i t r e o u sb o d y ) 。( 图引自h t t p ：w e b v i s i o nm e du t a he d u )视嘲膜。”j 一要存在有6 大类神经元细胞：光感受器细胞( p h o t o r e c e p t o rc e i l ，简称p r ) 、水平剞胞( h o r i z o n t 出c e l l ，简称h c ) 、敬极细胞( b i p o l a rc e i l ，简称b c ) 、兀长突细胞( a m a c r i n ec e l l ，简称a c ) 、神经市细肥( g a n g l i o nc e l l ，简称g c ) 以及刚叫细胞( i n t e r p l e x i f o r mc e l l ) 。外核层丰要i j l 视锥型以及视杆型光感受嚣细胞组成。内核层主耍由取极细胞、水平细胞、无长定绁胞和嘲叫细胞组成。埘神经节细胞层则上监山神经节细胞构成。内、外核层神经元细胞之问的突触连接形成了外网状层，内桉层神经兀细胞与神经节细胞层之a 的突触连接构成内州状层。在视觉信息的传递中，光感受器通过中间神经兀一般极细胞将光刺激信息传给输出神经元一神经节细胞，并f 其进一步向t ，枢传递。来自靠近外刚状层的水平细胞和靠近内刚状层的无长突细胞的例向信号对径向通路起着横l a l 调节作用l ，5 。神经竹细胞的轴突7 i 集形成视神经束。视觉信息经山视网膜初步加工之后通过视神经柬传入后绒视觉系统( 外膝体、视皮层等) ( 图1 3 ) 。般认为，所有的视觉信号都第一章引jo oo o oooo o0oo o0o= | o p lh i m 几l0 n b c 札儿 “器l 1u_ r 弋囤1 - 2 视网膜组织结构示意图“if i g1 - 2s t r i | c e l r eo f r e t i n a ha 图为视网膜组织染色切片。b 囤为视网膜中各类细胞连接模式图光感受器细胞层( p r ) 位于b图的顿部。外耘层( o n l ) 主要包括视轩及视锥光感爱器细胞。内核层( i n l ) 主要包括鼠极细胞( b c ) 、水平细胞( h c ) 、无长突细胞( a c ) 。其中双极细胞通常可分为给光型视锥双极细胞( o nc b c ) 、撤光型枧锥双极细胞( o f f c b c ) 以及视杆型双极细胞神经节细胞层( g c l ) 中包含各类神经节细胞给光中心型( o n ) 神经节细胞、撤光中心型( o f f ) 神经节细胞以厦给光撤光型( o n 4 d f f ) 神经节细胞。图c 剧反映了各级细胞的电活动特性：其中光感受器细胞双扳细胞、水平细胞和大部分的无长突细胞均为分级型神经元而神经节细胞和少量的无长突细胞为发放型神经元 7 1 来自经视神经纤维上所传导的动作电位。在人体中，连接视网膜和视觉中枢的视神经包含约1 1 0 万根纤维。由于视网膜神经节细胞和视神经纤维的一一对应关系，这个数字也可以反映人体视网膜中神经节细胞的数目。在整个视觉通路中，光感受器细胞的数日是神经节细胞的近百倍，外膝体中的神经节细胞数目也多于视网膜中神经节细胞，而视皮层中相应神经元细胞( v i 区第层及后级) 的数量则数百倍于视网膜神经节细胞8 。这样的解剖结构从某种程度上决定了视网膜的功能之一就是将外界初级视觉形象进行第3 页一k 。藤鞯一乖，j i j高度压 i 处理，产生一个与视神经柯限释姑州匹配的映射( 表l 1 ) 。结构j 的瓶颈结构使得视网膜在向后绂神经死传递信息时，神经甘细胞必然采m 高教精简j 式束对视觉信息进暂编码和传递。传统上认为神经系统中的编码和传递丰要通过神经元动作电位的发放米苴；现，以动作电位序州的形式将信息通过突触传递给f 一缴神经儿。举例来说：在许多感觉系统单，加人刺激的强度会使感觉神经元放电频率增加。除此之外，已有研究结粜也表明，神经元活动的其它类型特征包括动作f 乜位发放的起始口jn i j ( t i m eo f f i r i n g ) ，粒放的时间模式( t e m p o r a lp a t t e m ) f 9 以及爆发持续的时州( d u r a t i o no fb u r s t ) 1 0 等等，均能编码特定的信息。以视觉系统为例，从刺激施加开始到高绒视应层中神经元产生干h 应反应的时删只柯1 0 0m s 左右。与此i o jb f ，视觉信息从光感受器细胞传递到高级枞皮层中的神经元必须经过至少】o 层五有的突触传递，这就意味着饵个阶段的处理时问都不应超过1 0m s 。而歧层神经元的坡r u 频率很少超过1 0 0h z ，也就是随单个皮层神纾元存这一反应过程中只能发放0 或1 个动作f 乜位f 1 1 lo 在这种情况f 如果神经几仪仪利j n 动作电位的发放频率米传递视觉信息的西难免会显得捉襟见肘。 一：c 1 “0v p 一q d1 j - ，一0：一l 、1 5h c d 【c ，e图i - 3 视觉通路f i gi - 3p a t h w a y o f v l s i o n 神经节细胞的轴竞形成视神经。采自双跟的鄙分视神经纤维汇聚形成视交叉。视交叉向后到外膝体问的视神经纤堆称为视束每一视束包括来自同侧视网膜的不交叉纤维和对侧视网膜的趸又纤维。第4 州第一章引言在我们的实验中，相当数量视网膜神经节细胞在重复性白光刺激下，其动作电位发放会出现一种特定的双峰放电模式。这种双峰放电模式与通常观察到的瞬时型发放和持续型发放均有所不同。具体表现为：在重复性白光刺激下，此类神经元所发放的动作电位的p s t h 会出现两个峰值。第一个峰值通常出现在刺激施加后5 0m s 左右，并随后迅速下降至一个很低的水平。在第一次发放高峰之后1 0 0m s 左右，此类神经元会经历一次新的高发放过程 1 2 】。在本论文结果和讨论部分，我们对这种特殊发放模式的时间特性进行了分析和讨论，研究结果提示这种双峰放电模式有可能编码了某种特定的视觉信息。表1 - 1 猴视网膜外膝体一皮层通路中的细胞数目( 单位：百万) 1 3 1其它视觉1视网膜外膝体背核视皮层相关区域光感受器神经节细v 1 区第1 vv 1 区其它其它视皮层视视胞层层区杆锥1 0 02 61 11 1 - - 2 35 0 8 48 9 - 1 5 15 184 8 11 3 多电极记录多年以来，人们对于视网膜中信号处理加工机制的了解主要来自于单细胞记录实验。由于这项技术本身的局限性，研究者通常只能对单个或少量数个神经元的活动进行记录。因此在早期，人们往往将单个神经元假设为一个功能单位，认为其活动可以独立地反映某种特定的过程( 刺激) 。然而近来有越来越多的实验证据提示人们：大脑的信息处理在很大程度上依赖于相关神经元的相互合作与信息整合。m e i s t e r 等人的一系列研究表明，视觉刺激的编码有可能依赖于视网膜神经节细胞的群体放电活动 1 4 ；1 5 】，而另外一些实验则发现神经节细胞的相关性放电对神经元在发育过程中找到j 下确的靶细胞从而形成高度有序的结构，起着至关重要的作用 1 6 】。而且，神经元问活动的相关性在信息处理过程中具有快速变化的特性，其相关性活动的确切时间特性可能对视觉信息的编码起着至关重要的作用 1 7 】。在视网膜和外膝体中均发现，神经元在不同的刺激条件下能迅速形成不同的功能群体【1 8 】。在神经系统的其它部分也存在类似的同步化放电第5 页第一章弓i 言【1 9 。因而，为了理解大脑中的编码、解码及信息处理等机制，神经科学研究者的兴趣正越来越多地由早期对单个神经元活动的研究逐渐转向对群体中多个神经元活动的研究。在初期的神经群体研究中，由于技术和操作上的困难，往往只能对若干个神经元逐个进行记录，然后根据实验数据对这些细胞的活动进行离线分析再研究其群体特性。这种方式虽然能够帮助人们了解神经元群体的特性，但由于缺乏对各个神经元同步活动的记录所以也丢失了很多有意义的信息。因此，如果要对多神经元的群体特性进行考察，就必须对群体中的神经元进行同步记录。这种需求随即导致了相关技术的迅速发展，即多电极记录技术。早期的多电极记录实验，往往是通过对两个或多个独立微电极的同时操作来实现的。这种方法必须借助于多个传统电极的组合使用才能实现。然而在这种系统中，由于各个电极之间的相对独立性而导致在操作上存在较大的难度，同时记录的细胞数量也不能得到有效的提高( 通常少于5 个) 。其后随着相关制造技术的发展，多电极阵列技术得到了全面的发展。目前流行的多电极记录装置可以根据其形状特点分为两大类：插入式多电极阵列和平面多电极阵列( 图1 4 ) 。前者可以通过手术植入实验动物体内，多用于大脑皮层的在体长期记录 2 0 】。后者多用于离体组织的研究，例如视网膜 2 1 ；2 2 】、海马组织切片 2 3 】、培养的神经元组织 2 4 等。从记录系统的角度而言，胞内单电极记录技术虽然有着记录数量少的缺点，但较之胞外多电极记录却有着更好信噪比。通常情况下，在胞内单电极记录实验中，神经元细胞膜电位的幅值范围在数十毫伏级别。而胞外记录实验中，细胞膜电位的电压变化仅有数十至上百微伏。另外，在胞外多电极记录中，电极的形状会在一定程度上影响到检测结果。电极尖端面积越大，其可能记录到的信号就越多。但如果电极尖端面积过大，就难以从其所记录到的信号中分离出单个神经元的放电活动；而如果电极尖端面积过小，则不能有效地对神经元活动进行检测。除此之外，电极阵列中各电极之间的相互距离也是实验测量中的一个重要因素。当电极问距足够大时，每个电极的作用就像一个独立微电极一样。在这种情况下，对电极信号的检测就变得较为简单，可以独立地对各个电极上的信号进行分析，以分离出单个神经元的放电活动。如果有m 个记录电极，从各个电极的记录信号上可以分离到，2 ，( f = 1 , 2 ，3 ，聊) 个神经元的活动，则系统所记录到的神经元的总数为从各个电极分离得到的神经元个数综合，即。但与此同时由于电极之间，距离较远，因此只能记录到相距较远的神经元反应，从而很难对相邻神经元之间的协同第6 页放电进行分析。若电极间距比较小( 例如在四管微电极中，微电极之州两两紧密排列) ，则单个神经元的活动有可能被附近的多个微电极同时记录到，从而产生重复检测。通常认为，来自同一个神经元的信号在经历不同的传递距离被多个电极记录之后，其波形的幅度有可能发生较大的改变，但其波形形状和时矧特征应该保持一致 2 5 ；2 6 。因此，可以根据邻近电极上波形的比例关系对单个神经元的活动进行判断。图1 4 三种多电极阵列1 2 1f i g1 4 t h r e e t y p e so f m u l t i - e l e c t r o d ea r r a y 目a 为四管微电极( t e t r o d e ) 是一种结构较为简单的插八式电极。图b 为薄片式微电极阵列，葬记录电极为贴片状。在大脑皮层的相关研究中，可根据需要同时使用一个或多个这样的阵列图c为平面多电极阵列，上万电极是记录用电极，下方电极则可以根据需要给出特定模式的电刺激。1 4 多电极记录实验数据处理随着多电极记录技术的发展，传统上用来处理和分析单电极实验数据的方法已经显得力不从心。如何对多电极记录实验产生的海量数据进行合理有效的分析业已成为神经科学方法研究的一个热点 2 8 3 1 1 。在本论文工作中，我们也尝试着结合视网膜多电极记录数据的特点，对相关数据处理和分析方法进行了研究和比较。现有用来研究神经元之间协同活动的方法大多源自单电极记录实验。其中互相关分析法t 3 2 3 4 1 足其中最经典的方法之一。互相关分析可以有效地估计两个特定神经元之间协同放电的程度，以及放电活动之间可能存在的延迟。但与此同时，它却无法得知两者第7 面第一章引言同步放电的具体时间细节。举例来说，从互相关分析的结果中也许可以得知在刺激施加后，神经元b 通常在神经元a 之后5m s 发放；但是却无从得知这种延迟发生时细胞通常是出现在刺激后的哪一个时刻，或者这种延迟是否会随着时间改变。事实上，越来越多的实验证据显示：神经元之间协同放电的动态特性会受到多种因素的影响( 例如刺激模式或者强度改变) ，并且在神经元的信息处理中起到至关重要的作用【3 5 ；3 6 。为此，人们尝试利用联合刺激前后时间直方图( j o i n tp e r i s t i m u l u st i m eh i s t o g r a m ，简称j p s t h ) 3 7 ；3 8 来对神经元对之间协同放电的时间特性进行分析。j p s t h 是基于刺激前后时间直方图( p e f i s t i m u l u st i m eh i s t o g r a m ) 【3 9 】的一种分析方法，通过将一对神经元放电活动随时间的变化特性进行联合分析，构建起对神经元之间协同放电的描述。因此j p s t h 可以较好展现神经元对之间的同步放电特性。除了缺乏对神经元之间相关性的动态描述之外，互相关算法在多电极记录数据应用中的另外一个问题在于其产生的互相关结果的数量会随着神经元个数的增加而迅速增 ， 一1 、大。当需要计算总数为n 的神经元两两之间的互相关时会产生3 掣组结果。举例来2说，当计算5 个神经元之间的互相关时会得到l o 组可能的结果；当神经元数量增加到1 0 个时，其互相关分析结果总数可能会达到4 5 个。事实上，现代多电极记录实验中通常可以获得数十乃至数百个神经元的数据 2 5 ；2 6 ，由此利用互相关方法所产生的结果数量会非常巨大。如果要进一步获取相关性变化的时间特征，则需要对原始数据加窗后分段计算互相关。但这样一来所产生的互相关结果的数目会更多，后续分析工作也将变得难以入手。因此如何对多电极记录所产生的大量神经元数据之间的相关活动进行简单而高效的分析就成为了神经科学方法中的一个新问题。为此，我们尝试了一种称为引力变换法( g r a v i t yt r a n s f o r m ) 4 0 ；4 1 1 的分析方法。这种方法不仅可以像j p s t h 一样对神经元对之问同步性的动态变化进行描述，还可以将大量神经元之间的这种动态特性在一个图中给出。但通过对模拟数据和实验数据的应用，我们发现引力变换法在对实验数据的实际分析中仍存在着一些问题。在本论文的方法部分我们对这种引力变换法进行了介绍，并且在结果部分展示了运用这种分析方法所得到的结果。1 5 色党系统色觉是视觉系统的基本机能之一，对于图像和物体的检测具有重要意义 4 2 ；4 3 】。通第8 页第一章引苦常认为视觉系统中色觉信息的处理主要由特定的颜色信息处理通道来完成：在视网膜光感受器细胞中，颜色信息即已被三种光谱敏感性不同的视锥细胞( 红敏、绿敏、蓝敏)所分别处理。经过侏儒型( m i d g e t ) 双极细胞处理的颜色信息，被传递至色拮抗神经节细胞( 在猴中是b 型神经节细胞) ，然后平行投射至l g n 的小细胞层 4 2 】。经l g n 小细胞层细胞所处理的颜色信息，被在v 1 区的细胞色素氧化酶染色斑块区域细胞进一步加工处理。通常，神经节细胞对色觉刺激的反应表现为颜色拮抗反应和亮度反应 4 3 ；4 4 】。传统观念认为神经节细胞的色觉编码是由色拮抗细胞来进行的，这些神经元可能被某种波长的光激活而被另外一种波长的光刺激压抑，因而产生颜色拮抗反应。通常人们已知的是两种色拮抗途径：一种是红绿拮抗，另外一种是蓝黄拮抗。通常认为神经节细胞的蓝黄拮抗主要基于接受红敏和绿敏视锥输入的o f f 型的双极细胞与接受蓝敏视锥输入的o n 型双极细胞的联合输入 4 3 ；4 5 】。红绿拮抗的机制尚不清楚，通常认为这个过程跟某些对红绿输入响应有着相反极性的双极细胞有关 4 6 。有趣的是，我们发现在不同颜色光刺激下的实验结果还显示出双峰发放与刺激光的颜色可能存在某种联系：在某种颜色光刺激下表现为持续型发放的神经节细胞，在另一种颜色光刺激下却可能表现出双峰特性。这一结果提示我们神经节细胞发放模式的变化有可能在颜色信息传递过程中发挥某种作用。1 6 本章小结本章对视网膜和多电极记录技术以及相关研究内容做了简要介绍。因为视觉信息本身具有空间特性，所以利用平面多电极记录技术可以很方便地对神经节细胞的对光反应特性进行研究。本论文的主要研究工作即是在多电极记录实验基础上，对一小块视网膜上的部分神经节细胞的电活动进行同步记录。通过对不同给光刺激条件下的细胞反应进行记录和细胞之间的协同放电进行分析，我们在某些视网膜神经节细胞上发现了一种特殊的发放模式：双峰反应。这种反应与传统的瞬时型反应以及持续型反应均存在着明显的差异。在本论文的结果和讨论部分，我们将对这种反应模式的时问特性、可能产生机制以及功能进行较为详细的分析。第9 页2 1 多电极记录2 1 1 标本的制备第二章材料与方法实验动物选用山生后3 8 呋的新生小鸡，并在模拟昼夜光照变化的动物房山饲养。为了提商视网膜神经肯细胞对光反应的敏感性，实验前先将实验动物置于暗盒中暗适应3 0 分针左右，晴适应完成之后，在赔红光下对动物进行断头处死。然后迅速摘除眼球，并用刀片仵角麒硐】巩膜交界处切开限球将其分丌。由丁小鸡的玻璃体呈清澈粘液状，故叮咀将眼杯倒扣在滤纸片j ：，片| m g 纸将玻璃体吸出。在驶璃体清理完毕之后，再用胀科手术剪将眼杯剪成4i i t mx4m r f t 见方左右的小块。每次实验中标本剪取的具体位置可以囤2 i 鸟类视网膜简囝f i g2la v i a nr e t i n a鸟类的视网膜与哺乳动物的一个明显不同乏处在于鸟类的视网膜中没有血管一般认为鸟类视网膜的营养主要由梳膜( p e c t e n ) 来完成【4 7 。d 鸟类所特有的梳艇( p e c t e n ，图2 - 1 ) 进行判断并选取 4 7 。最后，将标本小心移下多电撇阵列上( m u l t ic h a r m e ls y s t e m sm c sg m b t t ，g e r m a n y ) ，并使视删膜神经节细廿包层与电极紧密接触。为了提高两者之m 接触的紧密柙度，平而微 n 极r 可以预先滴加3 l导电的硝酸纤维素溶液( 浓度为每1 0 m l 甲醇巾溶打0 1g 硝酸纤维索) ，并茂于空气中第1 0 贝第= 章材料与方法晾干。当完成视网膜的固定之后，再用眼科镊子小心地将视网膜从巩膜上分离开，井尽可能保留色索上皮细胞层。实验结果表明，当色素上皮细胞保留较好时，细胞的反应一般能在较长时间内保持稳定。标本制各完成后，用标准灌流液( 配方详见213 节) 进行灌流。以上实验操作均在暗红光条件下进行。2 1 2 多电极阵列本实验中所用的多电板阵列，其底板是一块4 9m a nx4 9t u f a 见方的透明石英玻璃( 图2 - 2 ) ，内嵌有6 0 条彼此绝缘的导线( t i ) 。这些导线与透明的记录电极尖端( 1 谢)相连，电阻值为4 0 0k n ，电极直径大约为1 0 m n ，并排列成8 8 的平面矩阵( 四个角上空缺) 。电极阵列区域大约为0 7 8i n i n o 7 8g a i n 。整个电极阵列表面铺敷有一层氮化硅( s i n ) 作为绝缘材料。在石英玻璃平板上，微电极阵列用一个玻璃杯塑封住( 内径为2 0r a m ，外径为2 4 f n m ，高度为6m m ) ，形成灌流小室。w 9 晒嫂雠委缁豳 滴毒图2 - 2 多电极阵列实物j ! 曼片f i g2 - 2p h o t o o f m u l t i - e l e c t r o d e a r r a y左图为多电极阵列的实物照片：6 0 路电极信号通过极细的导线引出到玻璃平板的四周，并形成接触点中间的玻璃小环配合特静l 的灌流槽即可形成灌流小室右图为电极阵列排布图毗厦平面电极表面放大图2 1 3 灌流系统为了确保视网膜组织能得到充分的灌流从而保持良好的活性，我们特制了个由有机玻璃制成的灌流槽。如图2 3 所示灌流液由蠕动泵( 4 道) ( i s m a t e cs a ，u s a ) 平稳地从灌流槽的一侧小孔泵至灌流小室，并流过置于灌流小室内的视网膜表面。当灌流液液面高过灌流小室顶部时可被出水管吸出。用于抽取废液的出水管较之入水管略粗，第1 l 页第二章材料与方法以保证废液能够被及时地吸出。整个灌流系统的设计主要是为了保证灌流液能平稳地流经视网膜，以尽可能减少由于灌流液的流动所产生的机械震动对实验记录的影响。扣除视网膜体积后，灌流槽与电极底板所形成的灌流小室体积约为0 5 2m l 。通常情况下，灌流液的灌流速度设定为o 。8m l m i n 。因此，小室内的溶液可以在3 9s 内得到更换。灌流液的切换由自制多通道开关给药系统进行控制。标准灌流液( r i n g e r 液) 组成如下( 单位：m m o l l ) ：1 0 0 0n a c l ，5 0k c l ，3 0m g c l 2 ，1 8c a c l 2 ，2 5 0n a h c 0 3 ，2 5 0 葡萄糖，并通有含9 5 0 2 和5 c 0 2 的混合气体，同时维持p h 值7 5 0 2 。离体组织用控温仪( t h e r m o s t a th c x ，m u l t ic h a n n e ls y s t e m sm c sg m b h ，g e r m a n y ) 维持在3 7 0 c ，同时将a g a g c l 细丝浸入灌流液作为参考电极。在没有持续强光照射的情况下，这样的灌流条件能使视网膜维持良好状态达6 小时之久。当实验刺激中包含长时间高强度光刺激时，由于视色素被逐渐漂白，细胞反应的稳定性会受到一定的影响。h a m b e r 。g l a s sp l a t e图2 3 灌流槽示意图f i g 2 - 3p e r f u s i o nc h a m b e r通过对塑料灌流槽进行特殊设计，一方面使得灌流小室内的灌流液始终能得到及时更新，另一方面也确保废液能被及时排除，不会对附近的设备及显微镜系统造成泄漏危险。2 1 4 光刺激系统包括光刺激系统在内的整体实验装置如图2 4 所示。光刺激图形由计算机程序控制并在专业显示器( i i y a m a ，g 4 5 0 ) 上产生。通过光学聚焦系统，光刺激投射于离体视网膜上形成特定的刺激模式。本论文工作中通常使用的刺激模式是全域型光刺激。通过计算机程序调整显示器中不同颜色电子枪的强度来控制每一点光刺激的颜色和亮度。表2 - 1 给出了几种电子枪强度下对应光刺激的强度。光强数值由美国i n t e r n a t i o n a ll i g h tt e c h n o l o g i e s 公司生产的i l l 4 0 0 型光强计测出并多次平均后