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儿茶素的吸附层析最佳条件及在膨胀床上的应用研究 摘要 本论文在组建柱层析和膨胀床吸附层析系统的基础上，研究了p a ，h 1 0 3 和x a d 一4 三种吸附剂分离儿茶素的吸附特性，热力学及动力学特性，结合静 态解吸法及动态柱层析法研究了不同洗脱剂对儿茶素的洗脱性能，最终建立了 儿茶素柱层析的优化分离条件，并将该条件用于膨胀床上分离酯型儿茶素。 l 吸附剂的吸附性能研究结果表明，p a ，h 1 0 3 和x a d 4 三种吸附剂的吸 附性能较佳，平衡吸附量分别为4 0 5 ，0 6 m g g ，3 9 4 9 7m g g ，2 0 8 7 7m g g 。它们 的吸于等温线都可以用l a n g m i u r 方程来描述，都属于优惠型的吸附等温线， 吸附等温线方程亦都与l a n g m i u r 方程高度相关。p a 和h 1 0 3 树脂为中速吸附 型的吸附剂，x a d 4 为慢速吸附型的吸附剂。p a 、h 1 0 3 及x a d 一4 树脂的吸 附平衡速率常数依次为k v a = i 4 6 1 h ，k h l0 3 = 1 1 9 8 h ，k x a d _ 4 = o 4 9 8 h ，吸附 速率依次降低。x a d 4 的吸酣传质区最长，p a 和h 1 0 3 的传质区较短，p a 和 h 1 0 3 树脂的利用率较高。y 洗脱剂的洗脱性能研究结果表明，适于p a ，h 1 0 3 和x a d 4 三种吸附剂 分离儿茶素所需的洗脱剂分别为8 5 乙醇，6 4 甲醇3 0 8 乙腈5 3 四氢呋 喃，5 7 5 水的混合溶剂，乙醇乙酸乙酯水体积比为1 ：3 ：1 的混合溶剂。在 这三者中，以p a 为吸附剂。以8 5 e 醇为洗脱剂的试验体系对酯型儿茶素的 分离效果较好。经层析条件优化试验，最终选择p a 为层析介质，以4 5 , 醇 和8 5 7 , 醇为洗脱剂，按0 8 m l m i n 的流速进行梯次洗脱为较好的柱层析方案。 对膨胀床技术在儿茶素吸附分离方面的初步研究表明，利用膨胀床一吸附 层析法分离酯型儿茶素，可以省略茶多酚的提取过程，大大缩减工作量，提高 分离效率，而且对酯型儿茶素具有良好的分离效果。 关键词：儿案多7 吸疗薪7 洗脱扩碚藤蒹 s e p a r a t i o nc o n d i t i o n so fc a t e c h i n sw i t ha d s o r p t i o nc h r o m a t o g r a p h y a n di t sa p p l i c a t i o nt oe x p a n d e db e d a b s t r a c t t h r e ea d s o r b e n t so fp a ，h 1 0 3a n dx a d 一4w e f eu s e dt oi s o l a t ec a t e c h i n sf r o mg r e e nt e a w i t hc o l u m n c h r o m a t o g r a p h ys y s t e m a n dt h e e x p a n d e d b e d a d s o r p t i o n c h r o m a t o g r a p h ys y s t e m t h r o u g h t h e s y s t e m a t i ci n v e s t i g a t i o n s o f a d s o i 。p t i v e p e r f o r m a n c e ，t h e r m o d y n a m i ca n dk i n e t i cc h a r a c t e r i s t i c so fv a r i o u sa d s o r b e n t s ，a n d t l l e e l u t i o n p e r f o r l r l a n e e o fv a r i o u se l u a n t so nr e s o l u t i o n w ee s t a b l i s h e dt h e o p t i m u m c o n d i t i o n sw h i c hc o u l db e a p p l i e d t ot h e s e p a r a t i o n o fc a t e c h i n s e f f e c t i v e l yw i t he x p a n d e db e dt e c h n o l o g y t h er e s u l to f a d s o r p t i o np e r f o r m a n c ee x p e r i m e n ts h o w e dt h a t ，t h ea d s o r p t i o n p e r f o r m a n c eo fp a ，h 1 0 3a n dx a d 4w e r eb e t t e r t h e i re q u i l i b r i u ma d s o r p t i o n c a p a c i t y w e r e 4 0 5 0 6 m g m l ，3 9 4 9 7 m g m l a n d 2 0 8 7 7 m g m lr e s p e c t i v e l y t h e s t u d yo ft h e r m o d y n a m i cc h a r a c t e r i z a t i o ns h o w e dt h a tt h ea d s o r p t i o ni s o t h e r m so f t h e s et h r e ea d s o r b e n t sc o u l da 1 1b ed e s c r i b e db yt h el a n g m i u re q u a t i o n a n dt h e y a l l b e l o n g t ot h e p r e f e r e n t i a l i s o t h e r ma n da r e h i g h l y r e l a t e dt ot h el a n g m i u r e q u a t i o n b ys t u d y i n g t h ek i n e t i cc h a r a c t e r i z a t i o na n dd r a w i n gt h ea d s o r p t i o n k i n e t i ci s o t h e r m s ，w ek n o wt h a t ，p aa n dh 10 3a r e m i d d l i n gs p e e da d s o r b e n t s ， w h i l ex a d 一4i sl o ws p e e da d s o r b e n t t h ec o n s t a n t so fe q u i l i b r i u mr a t eo fp a ， h 1 0 3a n dx a d 一4a r e k p a = 1 4 6 1 h ，k h l 0 3 = 1 1 9 8 h ，k x a d 4 = 0 4 9 8 h 。i no r d e r t h e yb e c o m el o w e ri ns u c c e s s i o n t h ea n a l y s i so fp e n e t r a t i o nc u r v es h o w e dt h a t ， t h em a t t e rt r a n s f e rz o n eo fx a d - 4i sl o n g e s t ，w h i l et h em a t t e rt r a n s f e rz o n e so fp a a n dh 1 0 3a r es h o r t e r , w h i c hp u tg o o du s eo f p aa n dh 1 0 3 t h es t u d yo ft h ee l u t i o np e r f o r m a n c eo fv a r i o u se l u a n t ss h o w e dt h a t ，t h e a p p r o p r i a t ee l u a n t sf o rp a ，h 1 0 3a n dx a d 一4t oi s o l a t ec a t e c h i n sw e r e8 5 e t h a n o l ， m i x t u r eo f6 4 m e t h a n 0 1 3 0 8 a c e t o n i t r i l e 一5 _ 3 t e t r a h y d r o f u r a m - 5 7 5 w a t e r , m i x t u r eo fe t h a n o l e t h y l a c e t a t e w a t e r ( 1 ：3 ：】，v j v ：v ) r e s p e c t i v e l y b ym a k i n g c o n t r a s t i v ea n a l y s i s ，w ek n o wt h a tt h eb e s ts e p a r a t i o ne f f e c tc a nb ea c q u i r e db y u s i n gp aa s a d s o r b e n ta n d8 5 e t h a n o la se l u a n t a t i e rt a k i n gt h ec o n d i t i o n o p t i m i z e de x p e r i m e n t ，w ee v e n t u a l l y c h o s et h eb e s tm e t h o d f o rc o l u m n c h r o m a t o g r a p h y a sb e l o w ：u s ep aa sa d s o r b e n t ，u s e4 5 a n d8 5 e t h a n o la se l u a n t ， e l u a t ei nt w os t e p sw i t ht h ev e l o c i t yo f0 8 m l m i n t h ec o s ti sl o wb yu s i n gt h i s m e t h o d ，i ti sa p p r o p r i a t ef o rt h ei n d u s t r i a lp r o d u c t i o n a n dt h et o x i c i t yo f m a t t e r s d u r i n gt h ep r o c e s si sv e r ys m a l l ，s ot h i sm e t h o dc a n b ew i l d l yu s e di nm e d i c a la n d f o o da r e a s a f t e rp i l o ts t u d y ，i ti sf o u n dt h a ta p p l y i n gt h ee x p a n d e db e dt e c h n o l o g yt ot h e s e d a r a t i o np r o c e s so ft e ac a t h e c h i n s ，u s i n ge x p a n d e db e d 。c o l u m nc h r o m a t o g 阻p h y m e t h o dt os e d a r a t ee s t e rc a t e c h i n s ，t h ee x t a c t i o n o ft e ap o l y p h e n o l sc a nb eo m i t t e d s ot h ew o r k l o a di s r e d u c e dg r e a t l ya n dt h ew o r ke f f i c i e n c y i si n c r e a s e d t h 。 s e p a r a t i o ne f f e c tf o r e s t e rc a t e c h i n si sa l s ob e t t e rb yu s m g t h i sm e t h o d k e y w o r d s ：c a t e c h i n a d s o r b e n te l u a n t e x p a n d e d b e d 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已 经发表或撰写过的研究成果也不包含为获得盒蟹王些盔生或其他教育机 构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均 己在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解盒罡王些盍堂有关保留、使用学位论文的规定 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和 借阅。本人授权金蟹王些盔堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据 库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名 尊铂吁 签字日期：- 胛孑年珀6 日 导师签名： 豸每舀盈袋舀l 签字日啊甘 、j 一 工作单位：闺桃尧询杯穆i 矗乒舢叶d 帅龇：蚴j 辱忸驹杵系谚1 带 电话：矿，矿2 ，6 5 j z 邮编：，口p p g 吕 致谢 本论文是在我的导师姜绍通教授的悉心指导下完成的，从论文的选 题到完稿，都得到了姜老师无微不至的关怀和帮助，姜老师严谨求实 的工作作风、深厚的专业理论和丰富的实践经验，使我受益非浅。在 此，向姜老师表示衷心的感谢和崇高的敬意! 在试验过程中，潘丽军老师，马道荣老师，黄静老师，周先汉老师， 余顺火老师，方红美老师给了我许多指导和帮助，有了他们，我的论 文才得以顺利完成。此外，郑志老师在论文审阅过程中给予的指导， 周建芹老师、潘丽华老师、赵妍嫣老师、陈从贵老师、王武老师在学 习和生活上给我的关心都令我十分感激! 最后，我还要向我的父母、兄弟及其他亲朋好友表示感谢，他们用 亲情给了我莫大的支持和帮助。 总之，我要向所有帮助过我的老师和同学，向周围关心和支持我的 每一个人，表示最衷心的感谢! 第一章绪论 1 1 儿茶素简介 1 1 1 儿茶素的分子结构及其类别 茶叶中的儿茶素属于黄烷醇类化合物，在茶叶中含有1 2 2 4 ( 干量) ，是 茶多酚的重要组成部分。它们的结构至少包括有a 、b 、c 三个环核，是2 苯 基苯并吡喃的衍生物，具体结构见图1 1 。 图1 - 1 儿茶素结构图 当r = r4 = h 时b 环是儿茶酚基。分子式即为儿茶素。 当r = o h ，r - h 时，b 环是焦没食酸基，分子式即为没食子基儿茶素。 当r 。= 一e 一 3 ( 没食子酰基) 时，是上述两种儿茶索没食子酸 酯。这时，出现了第四个环核( d 环) 。发生了儿茶素与没食子酸的酯化作用， 故有时称其为酯型儿茶素或复杂儿茶素。前二种类型被称为非酯型儿茶素或简 单儿茶素或游离儿茶素【l l 。 茶叶中的儿茶素主要包括表儿茶素( e c ) ，表儿茶素没食子酸酯( e c g ) ， 表没食子儿茶素( e g c ) ，表没食子儿茶素没食子酸酯( e g c g ) 及儿茶素( c ) 等，它们的结构式及在茶叶干物中的百分含量具体见表1 1 1 ”。 1 1 2 儿茶素的用途 儿茶素是一种天然高效抗氧化剂。国内外学者对茶多酚的抗氧化作用进行 了大量研究，确认儿茶素对食用油脂的抗氧化性超过b h a ( 丁羟基茴香醚) ， b h t ( 二丁羟基甲苯) 等人工合成的抗氧化剂1 。 儿茶素具有很强的清除自由基的能力1 9 - 1 1 】。其防止脂类氧化作用的机理是 儿茶素具有2 苯基苯并毗喃环的基本结构，其b 环和c 环上的酚性羟基有很 第1 页 国 表卜1 茶叶中的儿茶素类主要组分 百分含量 名称 结构式 ( 干物) 0 耳 表儿茶素( e c ) 夥姐 1 3 6 r “ i z r 墙 r i = r 2 = h 表儿茶素没食子酸酯( e c g )r l = 没食子酰基 r 2 = h 3 6 n h 表没食子儿茶素( e g c ) 牧1 3 6 d 融 h r 氨3 西 r i = r 2 = h 表没食子儿茶素没食子酸酯( e g c g )r 1 = r 2 = 没食子酰基 9 1 3 0 h l 儿荼素( c ) 酶炒 1 2 k o ” ( z r 3 s 强的供氢活性，把氢原子供给不饱和脂肪酸过氧化游离基形成新的游离基促 使链锁过程中断。 即：儿茶素+ r h r h + 醌 或：r o o - + 儿茶素类一r o o h + 酚性自由基( 较稳定) 近年来，国内外越来越多的研究表明，儿茶素具有防癌、抗癌、抑制突变、 肿瘤忙6 1 ，降血脂，预防心血管硬化【1 8 】，增强肌体免疫力，抗衰老，抗辐 射1 1 9 - 2 1 1 ，抑菌f 2 22 引，抗病毒m2 甜，健齿防龋，消除口臭2 6 等多种药理功能， 因此儿茶素是一种很有前途的药用原料。此外，儿茶素还使人益思少睡，有助 第2 页 消化【2 ”，并可作为食品中的除臭剂、功能食品添加剂和香烟添加剂之用1 2 8 。 不同的儿茶素其生理活性有一定的差异，有资料表明，酯型儿茶素比非酯型儿 茶素清除氧自由基的能力更强，其生理活性具有较高优势2 9 1 ，因此分离酯型儿 茶素具有重大的意义。 1 i 3 儿茶素分离的研究进展 提取分离儿茶素的方法一般分为两步：首先从茶末中提取含儿茶素的茶多 酚粗品( t p ) ；其次从粗提取物中纯化分离儿茶素。 目前，茶多酚的提取方法主要有以下几种：沉淀法，萃取法和树脂法【3 0 _ 3 2 】。 ( 1 ) 沉淀法：茶多酚能与z n 2 + 、c a 2 斗、a 1 3 + 等金属离子产生络合沉淀。由于 z n h 、c a 2 + 、a 1 3 + 毒性较小，故可用于茶多酚的生产【3 引。 ( 2 ) 萃取法：利用多酚及其它成分在溶剂和水中的分配系数的差异，分别利 用不同溶剂抽提，回收溶剂后干燥，可得到不同含量的多酚产品 3 4 5 l 。 ( 3 ) 树脂法：某些树脂对茶多酚有一定的吸附作用，利用其选择吸附性，可 将茶多酚吸附到树脂上，然后用溶剂洗脱，浓缩干燥，从而获得不同含量的茶 多酚产品【3 6 4 0 1 。 由于儿茶素由多种单体组成，而各种单体性质相差不大，因而分离较困难。 儿茶素生产中目前较多使用两种方法，一为吸附型树脂及亲脂性凝胶层析法， 另一为逆流色谱法。 ( ”吸附型树脂及亲脂性凝胶层析法 吸附儿茶素的吸附剂有多种，如a m b e r l i t ex a d 2 ，x a d 一4 ，x a d 7 ， x a d 8 ，x a d 一1 6 ，d u o l i t es - 5 8 7 ，s - 7 6 1 ，s - 8 6 2 ，t o y p e a r lh w 4 0 ，s e p h a d e x l h 2 0 等等。其中，以t o y p e a r lh w - 4 0 或s e p h a d e xl h 一2 0 效果较好。但上述 吸附剂价格都比较高。 ( 2 ) 逆流色谱法 利用液液之间运动萃取，并在外力作用下逆向流动，可以将儿茶素的各种 单体分离。这种分离方法是在两相之间进行，克服了使用固体吸附材料造成的 样品不可逆吸附或降解的缺点，样品可最大限度得以回收。但是，该分离方法 难以同时得到大量的多种高纯度儿茶素，而且柱子总负载量较大，实际有效负 载量较小，制备效率不高，色谱柱容易污染，寿命短 4 。4 4 1 。 1 2 膨胀床技术简介 第3 页 1 2 1 膨胀床特点 膨胀床吸附是近年来首先由c h a s eh a 等人在研究流化床吸附的基础上发 展起来的 45 1 ，能在床层膨松状态下实现平推流的扩张床吸附技术。 膨胀床吸附与固定床吸附不同。众所周知，固定床吸附的料液是从柱上部 的液体分布器流经层析介质层从柱子的下部流出并分部收集，流体在介质层 中基本上呈平推流，返混小，柱效率高，但固定床无法处理含颗粒的料液，因 为它会堵塞床层，造成压力降增大而最终使操作无法进行，所以在固定床吸附 前需先进行培养液的预处理和固液分离，流化床虽能直接吸附含颗粒的料液， 但是存在较严重的返混，使床层理论塔板数降低，引起分离效率的下降；膨胀 床吸附综合了固定床和流化床吸附的优点，它使介质颗粒按自身的物理性质相 对稳定的处在床层中的一定层次上实现稳定分级，而流体保持以平推流的形式 流过床层，同时介质颗粒间有较大的空隙，使料液中的固体颗粒能顺利通过床 层。 1 2 2 膨胀床吸附的操作步骤 图1 2 膨胀床操作乐意图 膨胀床吸附首先要使床层稳定地扩张开，然后经过进料，洗涤，洗脱，再 生与清洗，最终转入下个循环，见图i 2 。 ( 1 ) 床层的稳定膨胀和介质的平衡 首先确定适宜的膨胀度，使介质颗粒在流动的液体中分级。 ( 2 ) 进料吸附 利用多通道恒流泵，将平衡液切换成原料液，根据流量计中转子的位置和 床层高度的关系调节流速，保持恒定的膨胀度，并进行吸附，通过对流出液中 第4 页 申|l甸姗 甲| ! _ 引瓣 目标产物的检测分析，确定吸附终点。 ( 3 ) 洗涤 在膨胀床中，用具有一定粘度的缓冲液冲洗吸附介质，直至流出液中看不 见固体杂质。 ( 4 ) 洗脱 采用固定床操作，将配制好的洗脱剂用恒流泵从柱上部导入，下部流出， 分段收集，并分析检测目标物。 ( 5 ) 再生和清洗 一般在使膨胀床膨胀到堆积高度5 倍左右时的清洗液的流速下，经过3 小 时的清洗，可以达到再生的目的。 1 2 3 膨胀床技术的应用现状 膨胀床作为近年来迅速发展起来的一种高新生化分离下游技术，现已在以 下几个方面得到了成功应用。 重组人体自介素8 的提纯【4 7 l ，葡萄糖6 磷酸脱氢酶的纯化1 4 8 。单细胞外 毒素a 的提纯f 4 9 】，重组人体白介素l 受体拮抗体( i l 1 r a ) 的提取1 5 们，单克隆 抗体的提取，重组人血清蛋白的提取 5 1 ，生物活性物质抗生素的提取1 5 2 1 ，等 等。 膨胀床吸附技术能直接处理含颗粒的料液，是因为除去的颗粒物质的物理 性质( 粒径、密度等) 与吸附剂有明显的差异。虽然这项技术还有待于完善， 但是它具有的集成优势已显示出了巨大的应用潜力5 3 - 6 7 。 1 3 本课题的主要研究内容及研究意义 该课题来源于国家教育部“高等学校骨干教师资助计划项目弦，属生化分离 高新技术领域。在参考了大量关于儿茶素分离的研究成果结合相关学科的发 展趋势，工业化需求，以及本单位的科研条件，最后选题为“儿茶素的吸附层 析最佳条件及在膨胀床上的应用研究”。 1 3 1 主要研究内容 ( 1 ) 实验系统的设计与组建：根据实验需要，设计工艺流程，选择相关 仪器，自行设计组建膨胀床吸附系统，并确定实验过程中所需的检 测方法，探索检测条件。 ( 2 ) 分离制备茶多酚粗品：为吸附层析实验提供茶多酚原料，并探索膨 胀床吸附所需茶汁原料的最佳配比。 第5 页 ( 3 ) 关于吸附剂的研究：研究十种吸附剂的基本吸附性能，优选出适于 儿茶素分离的吸附剂，并研究其吸附热力学性质及吸附动力学性质。 ( 4 ) 关于洗脱剂的研究：研究不同洗脱剂对儿茶素分离效果的影响，优 选出最佳的吸附剂与洗脱剂搭配组合，优化分离条件。 ( 5 ) 在膨胀床上的应用研究：将膨胀床技术应用到儿茶素分离工艺中， 并与普通层析分离作对比。 1 3 2 研究意义 儿茶素是茶叶中的一类多酚类物质，具有诸多生理活性和药理作用，国内 外对它的分离提取日趋重视。但是，其分离技术难度大，对多学科的技术集成 要求高。目前，虽然用s e p h a d e xl h 一2 0 等凝胶层析，大7 l 吸附树脂层析及逆 流色谱法可以获得酯型儿茶素与非酯型儿茶素的分离，但是关于利用大孔吸附 树腊进行酯型儿茶素与非酯型儿茶素的分离研究还不太深入。本文通过实验寻 优，选择出了一组价格低廉的吸附剂及洗脱剂，并对其吸附分离效果进行了系 统的研究。 在吸附剂与洗脱剂的选择过程中，本文结合大量实验结果，较为深入地从 理论角度对各种吸附剂的吸附性能及不同洗脱剂的洗脱性能进行了评析，从而 使得吸附剂与洗脱剂的选择具有一定的可信度。 膨胀床是近年来迅速发展起来的一项生化分离技术，但是，迄今为止尚未 发现将膨胀床技术应用于儿茶素分离方面的研究。因此，本文将儿茶素的分离 工艺与膨胀床技术的结合具有一定的创新性，对膨胀床技术应用范围的拓展有 着积极的作用。 本文的研究结果不仅为儿茶素制备的高技术产业形成提供必要的技术准 备和理论支持，对农业生物材料的高效分离纯化也是一次有益的尝试a 第6 页 第二章试验系统的设计与构成 在本章中，主要完成层析系统及膨胀床吸附系统的设计与组建，选择或自 行设计出所需仪器设备，为试验的开展提供硬件支持。另外，选择或探索适于 检测儿茶素含量及分离效果的检测方法，完善试验分析系统。 2 1 吸附层析系统 2 1 1 吸附层析的分离原理 吸附层析是色层分离法的一种，它具有高度的选择t 陛，通常比经典的单元 操作，如多级蒸馏，多级萃取，结晶等，具有较高的分辨率。这是因为在流动 相前缘沿柱展开时，溶质在流动相与分离介质( 吸附剂) 之间有多次重新平衡 的机会，因而大大提高了分离的程度。 吸附分离的机理与样品混合液在流经吸附荆时溶质相对于溶剂前缘的阻 滞现象有关。当流动相流过固定相时，由于易与固定相相结合的物质移动速度 较慢，而易与流动相相结合的物质移动速度快，因而不同的物质受到了不同程 度的差别阻滞作用，混合物便得到分离。吸附分离中的吸附是指固体表面对气 体分子或液体分子的吸着现象其作用力可以是物理吸附力，也可以是化学吸 附力，如范德华力，静电力，共价结合力以及氢键作用力，等等【6 。 2 1 2 吸附层析装置 柱式层析系统的基本构成部分包括蠕动泵，层析柱及部分收集器等。本实 验中，根据实验的需要，选配装置如表2 1 所示，层析系统装置示意图见图2 - 1 a 图2 - 1 层析系统装置示意图 第7 页 表2 - 1 层斩系统设备清单 名称型号厂家数量 电脑恒流泵d h l a上海沪西分析仪器厂 1 梯度混合器t h 1 0 0 0 a上海沪西分析仪器厂 1 数控计滴自动部分收集器 s b s 1 0 0上海沪西分析仪器厂l 层析柱 1 6 5 0上海华美实验仪器厂l 2 2 膨胀床系统 2 2 1 膨胀床的工作原理 膨胀床是吸附剂处于稳定状态的流化床。与串通的填充床层析不同的是在 膨胀床吸附操作中吸附剂层在原料液的流动下可产生适当的膨胀，其膨胀度取 决于吸附剂的密度，流体速度。当吸附剂的沉降速度与流体向上的流速相等时， 膨胀床达到平衡。由于吸附剂的膨胀，吸附剂之间的空隙率增大，可以使原料 液中的固体颗粒杂质顺利通过膨胀床而被排除，同时原料液中的目标物质被吸 附在吸附剂上，这样就实现了从原料液中直接分离目标产物的目的。膨胀床的 操作可分为平衡，吸酣，冲洗，洗脱和再生清洗等五个步骤。它将料液的澄清， 浓缩和初步纯化集成于一个单元操作中，减少了操作步骤，降低了分离过程的 复杂程度，提高了分离效率和产品的收率拍“。 2 2 2 膨胀床设备 膨胀床的设备，包括填充介质的柱子，在线检测装置，收集器，转子流量 计，恒流泵和速率分布器。根据本论文的研究需要，在参考大量中外文资料， 经过充分调查研究的前提下，自行设计组建膨胀床系统如下。 ( 1 ) 膨胀床柱体 膨胀床柱体是膨胀床系统的主体部分，其结构应适于膨胀床操作的特点， 以便于调节稳定床层高度。由于本研究处于实验室规模，因此我们从上海华美 实验仪器厂订做了。2 6 6 0 0 r a m 的膨胀床柱，柱体顶部带有转换接头，通过螺 旋升降，可实现床层高度的调节。 ( 2 ) 流量分配器 第8 页 流量分配器是一个合适的筛网，它对床层内流体的流动影响较大，它应使 料液中固体颗粒顺利通过，又能有效地截留较小的介质颗粒，除此之外，上端 流量分配器还应易于调节位置，下端流量分配器要保证床层中实现平推流。 在本论文中，以自制孔径0 3 m m ，开孔率o 1 6 的速率分布器进行实验，可 实现上述目的。 ( 3 ) 恒流泵 恒流泵用于不同操作阶段不同方向上的进料。泵的流量，压力，通道数是 需要考虑的主要参数。 据调查研究，柱体膨胀到填充床状态的2 3 倍比较合适，这样既能保证固 体杂质颗粒通过，又能保持较高的塔板效率。为了实现这一点，一般将柱体内 液体的流速控制在5 c m m i n 。在这一速度下，床体可达到预期的膨胀效果，液 流亦基本符合平推流模型，无返混现象产生。 据此，可计算出工作状态时的泵体流量为1 5 9 3 m l 。 对于泵压而言，一般只要满足泵压 一2 k g c m 2 就可以顺利地泵八液体。 为了使实验过程中液体的入口速度与出口速度一致，需要在入口端与出口 端都施加压力，因此需选一台至少有两个通道的恒流泵。 综合考虑上述因素。最终选择b t 一6 0 0 恒流泵，3 通道，每通道的流量为 10 - 3 0 0 0 0 m l h ，压力 2 k g c m 2 。 ( 4 ) 转子流量计 转子流量计用来检测膨胀床运作时的流量大小通过控制流量来控制浑 浊液进料时床层上界面的位置，并调节操作过程中变化的床层蓬松程度，保证 捕集效率。本实验中所选转子流量计的量程为0 - 1 0 l h ，可满足本实验要求e ( 5 ) 在线检测装置 为了便于确定吸附终点控制操作步骤，在膨胀床系统中需设置在线检测装 置。由于儿茶素属黄烷醇类物质，在2 2 5 n m ，2 8 0 r i m 处有最大吸收峰值，因此 该实验选择2 5 4 n m ，2 8 0 n m 双波长核酸一蛋白检测仪，检测流出液中儿茶素的 浓度，并以3 0 5 7 型记录仪做记录。 ( 6 ) 收集器 在膨胀床操作过程中，需要大量的缓冲液和洗脱液，一般的试管型收集器 第9 页 不能满足要求，所以本实验选择漏斗型的收集器，其收集量可达无限。 现将组建膨胀床系统所需仪器及部件列于表2 2 中，系统装置示意图参见 图2 2 。 表2 - 2 膨胀床系统设备清单 名称型号厂家数量 膨胀床柱体0 2 6 6 0 0上海华美实验仪器厂 1 孔径0 3 m m 流量分配器本实验室自制 1 开孔率0 1 6 恒流泵 b t 6 0 0上海沪西分析仪器厂1 转子流量计l z b 4常州热工仪表总厂 1 核酸一蛋白检测仪 w x j 9 3 8 8上海琦特分析仪器有限公司 】 便携式记录仪 3 0 5 7上海琦特分析仪器有限公司 l 自动收集器 b s z 3 0上海沪西分析仪器厂l 图2 - 2 膨胀床系统装置示意图 2 3 检测方法 2 3 1 茶多酚测定方法 茶多酚含量测定按酒石酸亚铁比色法进行。 茶多酚测定方法有佛林顿尼斯试剂测定法6 9 1 ，高锰酸钾比色法，酒石酸亚 铁比色法，紫外分光光度法等。其中，酒石酸亚铁比色法简便快捷，容易掌握， 第1 0 页 重现性好，国家标准g b 8 3 1 3 8 7 茶一茶多酚检测标准规定采用此法，其测定原 理为：在定的p h 条件下，酒石酸亚铁可与茶多酚类物质形成紫蓝色络台物， 于波长5 4 0 n m 处出现最大吸收蜂，并在适当的浓度范围内，茶多酚的量与颜 色的深浅成正比，遵从朗伯一比尔定律【7 0 1 。 2 3 2 薄层色谱检测 该法用于定性分析儿茶素的分离隋况j 。 薄层色谱法的基本原理：薄层色谱是一种物理化学的分离技术，其吸附剂 一般是极陆的，组分的分离是基于吸附剂被分离物质，展开剂的性质不同而 产生的。当把涂布着极性吸附剂的干薄板放入展开剂时，由于毛细管效应度与 展开剂的表面张力、粘度阻及吸附剂性质相关。此时，点在薄板上的样品随着 展开剂的移动而移动。由于被分离组分的极性差异使它们与吸附剂和展开剂的 亲和力产生差别，致使展开时各组分在薄板上的移动速度不一样，从而导致展 开后各、组分移动距离不一样。被分离物质中与吸附剂亲和力强的组分流在接 近样品滴加点( 原点) 较近的地方而与吸附剂亲和力弱的组分则在离原点较 远的地方，从而使各组分分离开1 7 2 州】。 2 3 3 高效液相色谱法检测 该法用于定量分析儿茶素的分离情况( 7 5 - 8 1 1 。 ( 1 ) 高效液相色谱法的特点：高效液相色谱法是二十世纪七十年代迅速发展 起来的一项高效、快速的分离分析技术。液相色谱法是指流动相为液体的色谱 技术，在经典的液柱色谱法的基础上，引入了气相色谱法的理论，在技术上采 用了高压泵，高效固定相和高灵敏度检测器，实现了分析速度快，分离效率高 和操作自动化。它的应用非常广泛，并具有高压，高速，高效，高灵敏度的突 出特点【8 口。 ( 2 ) 分离原理：本实验中采用液一固色谱法，或称吸附色谱法。流动相为液体， 固定相为吸附剂。这是根据物质吸附作用的不同来进行分离的。其作用机制是 溶质分子( x ) 和溶剂分子( s ) 对吸附剂活性表面的竞争吸附，可用式2 - l 表示。 第1 l 页 + n s 营x + n s( 式2 2 ) maa 式中，x m 和x a 分别表示在流动相中和被吸附的溶质分子，s a 代表被吸 附在表面上的溶剂分子，s m 表示在流动相中的溶剂分子。n 是被吸附的溶剂 分子数。溶质分子被吸附，将取代固定相表面上的溶剂分子，这种竞争吸附达 到平衡时，可用式2 3 表示。 k ： x a j s m ”( 式2 - 3 ) 【x n l s a ” 式中，k 为吸附平衡系数，亦即分配系数。上式表明，如果溶剂分子吸附 性更强，则被吸附的溶质分子相应地减少。显然，分配系数大的组分，吸附剂 对它的吸附力强，保留值就大 8 3 , 8 4 】。 第1 2 页 第三章吸附剂的性质研究 在本章试验中，以吸附剂的性质研究为主要目的。首先提取出茶多酚粗品， 研究茶汁的最佳浸提条件，以便在膨胀床操作过程中对茶叶中的茶多酚充分利 用。然后，对所选的十种吸附剂展开对比试验，研究它们的基本吸附性能，并 对选出的吸附性能较好的三种吸附剂作更深一步的对比研究，分析其吸附热力 学特性及吸附动力学特性。 3 1 茶多酚的制备 本文采用溶剂摹取法制茶多酚。 由于后期在膨胀床上的试验要以茶汁原料进样，因此，有必要对茶汁的浸 提条件作一定的研究，以获得最高浓度的茶多酚浸提液，以保证在膨胀床操作 过程中对茶汁的充分利用。然后对浸提液进行萃取，制各出茶多酚粗品。 3 1 。l 茶多酚浓度标准曲线 称取0 1 2 5 9 茶多酚，用蒸馏水定容至5 0 m l ，再配成浓度分别为0 5 ，1 ，2 ， 3 ，4 ，5 r a g m 1 的茶多酚溶液，按酒石酸亚铁比色法测定其吸光度值。然后， 通过一元线性回归，得出浓度与吸光度值之间的线性表达式，即茶多酚浓度标 准曲线方程，计算结果如式3 - 1 ； c = 2 8 3 0 9 a 0 1 4 9 7 r = o 9 9 9 8( 式3 1 ) 其中，彳一吸光度值； c - 一茶多酚浓度，m g m l 。 0l2 3456 茶多酚浓度( m g m 1 ) 图3 - 1 茶多酚浓度标准曲线 3 1 2 茶汁的浸提条件试验 第1 3 页 5 2 5 l 5 0 2 l 0 培瑙芸昏 ( 1 ) 试验原理及试验方案 茶多酚含有多个酚羟基，具有一定的极性，根据相似相溶原则，它易溶于 水，亲水性强，故可用热水作提取剂来浸提。 影响茶汁浸提的主要因素有：a 浸提温度；b 茶水质量比；c 浸提时间； d 浸提次数a 各因素均取三水平，选取l 9 ( 3 4 ) 正交表展开试验，其因素水平表 圃表3 】。 表3 - 1 茶汁浸提因素水平表 ab cd 试验号 墁提温度( )茶水质量比浸提时间( m i n ) 浸提次数 1 8 5 1 ：92 0 1 29 0 1 ：1 21 6 2 3 9 5l ：1 51 2 3 ( 2 ) 试验方法 称量5 0 9 磨碎的茶叶，按l 9 ( 3 4 ) 正交表的安排加入一定比例的水，在相应 恒温水浴下浸提一定的时间，榨汁得提取液，合并提取液，用量筒量出提取液 的总体积，充分搅拌后，按酒石酸亚铁国标法测其吸光度值。 3 1 3 茶汁最佳浸提条件分析 ( 1 ) 记录每次试验的吸光度值，按浓度标准计算茶汁浸提液中的茶多酚浓度。 测量每份浸提液的体积，计算所提取的茶多酚质量，并将结果列于表3 2 中。 表3 - 2 茶汁浸提条件试验结果 试验号123 4 56789 吸光度值2 7 52 5 92 4 22 3 62 6 92 2 92 8 42 5 52 4 l 茶汁浓度( m g l m l ) 7 6 47 1 86 7 06 5 37 4 76 3 37 ，8 97 0 76 6 7 茶汁体积( r nj ) 3 4 24 8 56 4 04 8 l 6 4 83 4 63 4 5 4 8 26 4 9 茶多酚浸出质量( g ) 2 6 13 4 84 2 93 1 44 8 42 1 92 7 23 4 l4 3 3 ( 2 ) 以每次提取出来的茶多酚质量为指标，对茶汁浸提条件，进行正交试验 第1 4 页 条件分析。 表3 - 3 茶汁浸提条件正交试验方案及结果分析 abd 茶多酚质 试验号 浸提温度( )茶水质量比 浸提时间( m i n ) 浸提次数 量( g ) 1 1 ( 8 5 )1 ( 1 ：9 )l ( 2 0 )1 ( i ) 2 6 1 212 ( 1 ：1 2 )2 ( 1 6 )2 ( 2 )3 4 8 313 ( 1 ：1 5 )3 ( 1 2 )3 ( 3 )4 2 9 42 ( 9 0 )2233 1 4 523314 8 4 62ll22 1 9 73 ( 9 5 )1322 7 2 832l33 4 i 933214 3 3 k i l o 3 87 5 28 2 11 1 7 8 k 2 1 1 1 71 0 0 3l o 9 58 t 3 9 k 3 1 0 4 61 3 4 61 l _ 8 5j 0 8 4 _ _ 置l 3 4 62 5 l2 7 43 9 3 丘 3 7 23 3 43 6 52 8 0 k ， 3 4 94 4 93 9 5 3 6 1 r0 2 61 9 81 2 1 1 1 3 由表3 3 的计算结果可知，每个因素对茶多酚浸出质量的影响是不一样的。 为了便于分析，绘制因素水平图，见图3 - 2 。 结果分析：从极差分析的结果可以看出，各因素对茶多酚浸提的影响主次 顺序由主到次排列为：b c d a 。就温度而言，从8 0 。c 到9 0 c 茶多酚的提取 率上升，到9 5 反而下降，这可能是因为茶汁浸提时温度过高导致了茶多酚 的氧化。直观上，最佳因素水平搭配为a 2 8 3 c 3 d i ，这与极差分析的结果相一 第1 5 页 致，因此选择试验条件如下：以茶水比1 ：1 5 展开试验，在9 0 c 的恒温水浴 中一次浸提1 2 r a i n ，可获得较高茶多酚得率的茶汁浸提液。 号5 善4 3 萋z 慧 徭o a 1a 2h 31 3 ib 2b 3c lc 20 3d 1 d 2d 3 因素水平 图3 - 2 茶多酚浸提条件因索水平图 3 i 4 茶多酚的分离提取 茶多酚的分离提取工艺流程如下： 茶叶粉碎一浸提一离心一乙酸乙酯萃取浓缩反萃取一干燥一茶多酚 ( 1 ) 茶汁浸提：按最佳浸提条件，称取1 2 0 9 干茶末，用l 8 0 0 m l ，9 0 。c 水一 次浸提1 2 r a i n 。浸提过程中不断用玻璃棒搅拌，使茶多酚充分浸提出。 ( 2 ) 离一“将浸提液在室温，转速4 0 0 0 r m i n 的条件下离一d2 - 3 分钟，合并离 心液。 ( 3 ) 萃取：待离心液冷却至室温，按乙酸乙酯与茶汁体积比为1 ：l 的比率进 行萃取，匀速摇动混合液，每份茶汁萃取3 次，直至茶汁颜色较浅，合并萃取 液。 ( 4 ) 浓缩：将萃取液转入蒸发烧瓶，在水浴温度3 0 ，旋转蒸发仪转速为 3 0 5 0 r m i n ，真空度o 0 8 6 m p a 的条件下旋转蒸发。 ( 5 ) 反萃取：将浓缩液转入蒸发烧瓶，快速加入二氯甲烷并振摇，待产生白 色沉淀后，放入冰箱中静置数小时，使之充分反萃取。 ( 6 ) 干燥：将提纯物用砂芯漏斗抽滤，然后置于真空干燥箱中，4 0 。c 温度下 干燥3 0 小时取出，即得茶多酚成品。 3 2 吸附剂简介 吸附是指固体表面或液体表面对气体或溶质的吸着现象，也就是在流动相 与固定相界面处产生溶质组分的浓缩现象。作为固定相的称为吸附剂，而在固 定相上产生浓缩的组分则称为吸附质。吸附实际上就是确定吸附剂对吸附质的 吸着现象i s 5 l 。因此，选择性能优良的吸附剂是确定吸附分离过程成败的首要问 题。表3 - 4 给出了试验中所选取的十种不同类型的吸附剂的基本物理性质。 第1 6 页 表3