（遗传学专业论文）利用免疫学技术对三种赤潮藻的定性和定量研究.pdf

对三种赤潮藻的免疫学定性和定量技术研究 摘要 及时、精确预报赤潮的发生和快速、准确地对赤潮藻进行定性、定量分析成为 当今赤潮研究的主要方向之一，但是通过现有的检测手段还不能完全准确的预报赤 潮的发生，特别是快速、准确的定性、定量检测赤潮藻。 本研究选取我国近海三种不同粒径的赤潮藻一赤潮异弯藻、共生甲藻、链状亚 历山大藻为研究对象，通过免疫家兔制各了它们的多克隆抗体，对多克隆抗体进行 效价测定，以反映抗血清中抗海藻i g g 分子数目的多少和它们与相应海藻细胞结合 能力的大小，同时对比不同形态大小的藻细胞抗体效价的差异和规律。对所获得抗 血清的特异性进行了鉴定，并采用吸附封闭处理的方法提高抗体的特异性。结果表 明未经吸附处理的赤潮异弯藻、共生甲藻效价分别达到1 ：4 10 0 0 、1 ：1 80 0 0 以上，显 示是高亲合力的抗体；链状亚历山大藻抗体效价达到1 ：35 0 0 ，相比另两种藻的效价 较低；吸附处理后的三种多克隆抗体的特异性明显提高，而效价有所下降。三种多 克隆抗体与各自藻细胞均有很强的结合力。竞争酶联免疫法对藻细胞的检测表明制 备的多克隆抗体与其他种类藻细胞交叉反应较弱，特异性较好。 采用间接荧光免疫显微检测技术对赤潮藻细胞表面抗原分布，以及多克隆抗体 的特异性进行了更加直观的研究，结合流式细胞仪分析，快速定性、定量地检测样 品中的藻细胞。结果表明三种多克隆抗体与各自藻细胞均有很强的结合力，赤潮异 弯藻和共生甲藻的荧光信号均匀分布于细胞表面，链状亚历山大藻细胞的荧光信号 在细胞表面分布不均匀，主要集中在腹部横沟内。制各的多克隆抗体只与自身藻细 胞结合，与另外两种藻细胞无交叉反应。链状亚历山大藻抗体只与自身藻细胞结合， 与塔马亚历山大藻无交叉反应，可作为同属内不同种的鉴别。利用流式细胞术检测 表明该方法通过激发荧光光谱范围的不同可以区分荧光标记的藻细胞，在定量方面 与显微镜观察计数存在定差异，赤潮异弯藻镜检结果同流式检测结果的差异为+ 5 1 6 ，共生甲藻镜检结果同流式检测结果的差异为+ 4 6 5 ，链状亚历山大藻镜检 结果同流式检测结果的差异为+ 1 1 7 6 ，可能是多克隆抗体与藻细胞结合率以及荧 光标记二抗与多克隆抗体的结合率的影响有关，造成显微计数结果偏大。该方法具 有检测快、灵敏度高、结果稳定，不需要大量的形态分类学知识就可对某一特定的 赤潮藻进行定性、定量分析；利用免疫流式细胞术的检测过程中，藻细胞的固定、 标记、洗脱容易导致细胞丢失，如果通过多次回收、富集的方法可以尽量的减少细 胞的丢失。 采用r p r o t e i ng 亲和纯化多克隆抗体，采用n h s 标记法将抗体标记到羧基化磁 珠表面，获得免疫磁珠。免疫磁珠与细胞表面相应分子特异性结合，或者已包被二 抗( 羊抗小鼠或羊抗大鼠) 的磁珠与预先已与细胞表面分子特异结合的一抗结合。磁珠 携带与之结合的细胞吸附于分离柱，试管上，实现阳性细胞分离或阴性细胞的分离， 利用免疫磁珠分选方法对赤潮异弯藻进行定性、定量研究，结果表明免疫磁珠分离 赤潮异弯藻细胞纯度可达8 5 * 0 - - 9 5 ，得率在6 0 0 0 - - 9 0 左右，可进行特定藻细胞的 分离和富集，还可进行活细胞的分选，方法简便、操作灵活。实验过程中洗脱的时 间、强度会影响到研究的结果，造成存在交叉反应的假象，因此需要试验条件进行 优化。此外，过低的浓度会影响结果的准确率。 本文还探索了利用噬菌体表面展示肽库技术筛选针对赤潮异弯藻的特异多肽。 通过筛选特异结合的多肽，研究赤潮异弯藻细胞表面抗原位点，用于分离检测赤潮 异弯藻，为赤潮爆发的前期检测提供有效的手段。实验结果表明，筛选得到的针对 赤潮异弯藻细胞的特异性多肽与其他藻细胞存在一定的交叉反应。造成结果的原因 一方面可能是藻细胞中存在细菌等微生物，不能获得只针对藻细胞表面抗原的外源 多肽。另一方面可能是噬菌体多肽的长度太短，不能与藻细胞表面抗原发生特异性 结合，导致交叉反应存在。因此，在今后的研究中一方面需要获得纯化藻细胞，去 除细菌等微生物的影响，另一方面采用更长的噬菌体展示肽库进行筛选，从而获得 特异性更高的外源性多肽。 关键词：赤潮异弯藻；共生甲藻；链状亚历山大藻；多克隆抗体；酶联免疫检测； 间接荧光免疫显微检测；流式细胞术：免疫磁珠分选方法；噬菌体表面展示肽库 t h es e l e c t i v ei s o l a t i o na n dq u a n t i t a t i v es t u d yo ft h r e es p e c i e sr i dt i d e a l g a e sb yi m m u n o l o g yt e c h n o l o g y a b s t r a c t r a p i d l ya n da c c u r a t e l yd e t e c ta n de n u m e r a t et h er e df i d ea l g a e ss p e c i e sw a so n e o fr e s e a r c hd i r e c t i o ni nh a r m f u la l g a lb l o o m s h o w e v e r , t h ep r e s e n td e t e c t i n ga n d m o n i t o r i n gt e c h n i q u e sa r en o ta d e q u a t e l yp r e p a r e dt op r e d i c th a r m f u la l g a lb l o o m s ， a sac o n s e q u e n c e ，ag r e a td e a lo fe f f o r th a sb e e nm a d et oi n c r e a s et h es e n s i t i v i t yo f t h ed i a g n o s t i cp r o c e s sa n dt or e d u c et h et i n l es p e n tt oo b t a i nar e s u l t p o l y c l o n a l a n t i b o d i e s a g a i n s t t h r e er e dt i d e a l g a e w i t hd i f f e r e n ts i z e ， h e t e r o s i g m aa k a s h i w o ，g y m n o d i n i u ms pa n da l e x a n d r i u mc a t e n e l l aw e r er a i s e di n t h i s s t u d y b l o c ka f f i n i t yt r e a t m e n tw a sd o n et oe n h a n c et h es p e c i f i c i t yo ft h e a n t i b o d i e s t h ef i t e ro ft h r e ep o l y c l o n a la n t i b o d i e sw i l l sd e t e r m i n e db yi n d i r e c t e n z y l i l e l i n k e di m m t m o s o r b e n ta s s a y , a n dt h es p e c i f i c i t ya g a i n s tp o l y c l o n a la n t i b o d y w a s d e t e r m i n e d b y i n d i r e c t c o m p e t i t i v ee n z y m e l i n k e d i m m t m o s o r b e n t a s s y ( i c e l i s a ) t h er e s u l ts h o w e dt h a th e t e r o s i g m aa k a s h i w oa n dg y m n o d i n i u ms p a n t i b o d i e sw i t h o u tb l o c kt r e a t m e n tg o tt i t e rh i g h e rt h a n1 ：4 10 0 0a n d1 ：180 0 0 ， r e s p e c t i v e l y , a l li n d i c a t i n g o fh i 曲a f f i n i t ya n t i b o d i e s t h et i t e ro fa l e x a n d r i u m c a t e n e l l aa n t i b o d yr e a c h e d1 ：35 0 0 ，r e l a t i v e l yl o w e rt h a nt h ep r e v i o u st w o t h e s p e c i f i c i t y o ft h r e e p o l y c l o n a l a n t i b o d i e sa f t e r a f f a f i t y t r e a t m e n tw a sr a i s e d r e m a r k a b l y h o w e v e r , t h et i t e rd e c l i n e d a l lt h ep o l y c l o n a la n t i b o d i e ss h o w e dah i 曲 a f f m i t yw i t ht h e i ro w nc e u s p o l y c l o n a la n t i b o d i e sw e r en o tr e m a r k a b l ec r o s sr e a c t e d w i t ho t h e ra l g a ei nt h ei e e l i s a d i s t r i b u t i n go fa n t i g e no nt h eo u t e ra l g a ec e l l ss u r f a c ea n dt h es p e c i f i c i t yo f t h r e ep o l y c l o n a la n t i b o d i e sw a sr e s e a r c h e db yi n d i r e c tf l u o r o i m m u n o a s s a y , r a p i d l y a n da c c u r a t e l yd e t e c ta n de n u m e r a t et h e r e dt i d ea l g a e sc e u sb yf l o wc y t o m e t r y m e t h o d t h er e s u l t ss u g g e s tt h a tt h ef l u o r e s c e n ts i g n a lo fh e t e r o s i g m aa k a s h i w oa n d g y m n o d i n i u ms pa n t i b o d i e sw a sc o n f e r r e dt ot h eo u t e rc e l ls 1 k r f a c e ，w h i l et h o s eo f a l e x a n d r i u mc a t e n e l l aw a sp a t c h yd i s t r i b u t e dm a i n l ya r o u n dt h ee x c a v a t e dc i n g u l u m p o l y c l o n a la n t i b o d i e sw e r eo n l yr e a c t e dw i t ht h e i ro w na l g a e n oc r o s sa c t i v i t yw i t h o t h e rt w oa l g a ew a sd e t e c t e d t h ea n t i b o d yo fa l e x a n d r i u mc a t e n e l l ar e a c t e dt oi t s o w nc e l l s ，n oc r o s sa 嘶v i t yw a sf o u n d 晰也a l e x a n d r i u mt a m a r e n s e , w h i c hw i l lb e a p p l i c a b l ei nd i s t i n g u i s h i n gs p e c i e sw i t h i nt h eg e n u s t h er e s u l t so ff l o wc y t o m e t r y m e t h o ds u g g e s tt h a tt h eo t h e r n e s sb e t w e e nt h ec e l lc o u n t sb yl i g h tm i c r o s c o p ya n d t h ec e l lc o u n t sb yf l o wc y t o m e t r ym e t h o d t h eo t h e m c s si nh e t e r o s i g m aa k a s h i w oi s + 5 16 ，t h eo t h e m e s si ns y m b i o d i n i u ms pi s + 4 6 5 ，t h eo t h e r n e s s i n a l e x a n d r i u mc a t e n e l l ai s + 11 7 6 t h i sm e t h o dw a sr a p i d s e n s i t i v e 、s t e a d ya n d s e l e c t i v ei s o l a t i o n 、q u a n t i t a t i v es t u d yo fr i dt i d ea l g a e s ，e v e n 讧n ot a x o l o g y k n o w l e d g e t h es e l e c t i v ei s o l a t i o na n d q u a n t i t a t i v e o fh e t c r o s i g m aa k a s h i w o b y i m m u n o m a g n e t i c b e a d s e p a r a t i o n ( i m b s ) m e t h o d , t h e r e s u l t s u g g e s t t h a t h e t e r o s i g m aa k a s h i w ow a ss e p a r a t e db yi m m u n o - m a g n e t i cb e a d , t h eh a l l m a r ki s 8 5 * - 一9 5 ，t h ep e r c e n to fw e r ec a p t u r ei s6 0 0 缶一9 0 ，t h i sm e t h o dc a nb eu s e dt ot h e s e l e c t i v ei s o l a t i o na n dq u a n t i t a t i v eo fa l g a ec e l l sa n ds e l e c t i v ei s o l a t i o nf i v ec e l l s ，t h i s m e t h o d w a sc o n v e n i e n ta n da l t e r a b l e p h a g ed i s p l a yp c p t i d el i b r a r yw a su s e dt o s e l e c t i v ea n di s o l a t es p e c i f i c i t y p e p t i d e s p e c i f i c i t yp e p t i d ew a sr e s e a r c h e dt o a n t i g e no nt h eo u t e ra l g a ec e l l s s t t r f a c ea n ds e l e c t i v ei s o l a t i o no fh e t e r o s i g m aa k a s h i w ob yt h i st e c h n o l o g y au s f u l t e c h n o l o g yw a sp r o v i d e dt od e t e c tr e dt i d ea l g a k e yw o r d s ：h e t e r o s i g m aa k a s h i w o ；s y m b i o d i n i u ms p ；a l e x a n d r i u mc a t e n e l l a ； p o l y c l o n a l a n t i b o d y ；e n z y m e - l i n k e d i m m u n o s o r b e n t a s s a y ； i n d i r c c t f l u o r o i m m u n o a s s a y ；f l o wc y t o m e t r ym e t h o d ；i m m u n o - m a g n e t i cb e a ds e p a r a t i o n ( i m b s ) m e t h o d ；p h a g ed i s p l a yp e p t i d el i b r a r y 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果或其他教育机构的学位或证书使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并 表示谢意。 学位论文作者签名：签字日期：年月日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人 授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用 影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密后 适用本授权书) 学位论文作者签名：磊) 、宁政 导师签字隋矿 签字日期：矽口8 年占月j 7 日签字日期：柳3 年易月，7 日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 电话： 邮编 利用免疫学技术对三种赤潮的定性和定量研究 u 刖舌 0 1赤潮的成因及危害 赤潮是水中一些浮游生物( 如腰鞭毛藻、裸甲藻等) 爆发性增殖引起水色异常的 现象，赤潮发生后常造成大量的水生生物死亡。( 孙儒泳等，2 0 0 0 ) 。因为一般称藻类 大量繁殖的现象为藻华，所以赤潮也被称作有害藻华( h a r m f u la l g a lb l o o m s ，h a b ) 。赤 潮形成的原因比较复杂，但有一个共识，即赤潮生物的存在和水体污染( 富营养化) 是形成赤潮的主要原因。海区的地理位置、地形特征、水文、气象、海流、海况等， 是形成赤潮的自然因子。在海水交换较差的内湾，较封闭海湾的交汇面、峰面及排污 口附近沿岸，海水有上升流的海域等，均可成为赤潮形成的条件。 赤潮是一种自然生态现象，也是一种人为因素引起的有害生态现象。赤潮一般分 为有害赤潮与无毒赤潮两类。有毒赤潮是赤潮生物体内含有某种毒素或能分泌出毒素 的生物为主形成赤潮。有毒赤潮一旦形成，可对赤潮区生态系统、海洋渔业、海洋环 境以及人体健康造成不同程度的毒害。无毒赤潮是指赤潮生物体内不含毒素，又不分 泌毒素的生物为主形成的赤潮。无毒赤潮对海洋生态、海洋环境、海洋渔业也会产生 不同程度的毒害，但基本不产生毒害作用。赤潮的爆发具有区域性、单一性、时间性 的特点。引发赤潮的生物除少数属于细菌和原生动物外，绝大部分属于浮游微藻类， 分别隶属于细菌纲、蓝藻纲、裸藻纲、硅藻纲、甲藻纲、隐藻纲、针胞藻纲、定鞭金 藻纲、硅鞭藻纲和原生动物等1 0 纲类。其中甲藻( d i n o f l a g e l l a t e ) 和硅藻( d i a t o m ) 是 引起赤潮的主要生物( 苏纪兰，2 0 0 1 ) 。 o 2 中国赤潮概述 中国是全球受赤潮危害较为严重的国家之一( a n d e r a n 等，1 9 9 6 ) 。伴随着中国近 海富营养化问题的加剧，有害赤潮发生的频率和规模也呈现明显增加趋势。随着沿海 社会经济的持续发展，赤潮在我国沿海地区已成为仅次于风暴潮的第二大海洋灾害， 伴随着赤潮灾害发生的频率、单次赤潮面积、持续时间的不断增加，赤潮灾害的发生 范围己遍及我国沿海的所有省市，每年的年初由南部海域开始爆发，持续向北推进， 直到1 0 月才在渤海止步，影响的时间近1 0 个月。2 0 0 7 年，我国共发生8 2 次赤潮， 总面积1 16 1 0 万平方公里，比2 0 0 6 年发生的次数及面积均有下降( 表o 1 ) 。 利用免疫学技术对三种赤潮的定性和定量研究 表0 - 12 0 0 6 2 0 0 7 年全国各海区赤潮发生情况对比( 中国赤潮报告) t a b 0 1c o m p a r i s o no fm a r i n er e dt i d ee v e n t si nc h i n e s ec o a s t a lw a t e r si n2 0 0 6 - 2 0 0 7 ( n a t i o n a lr e p o r to nh a n s i nc h i n a ) 从2 0 0 0 年以后全国赤潮发生次数及发生面积增加显著，近两年有所下降。一方面 是由于海水富营养化得到控制，另一方面我国建立了完善的赤潮监测网，对赤潮的重 视程度提高，采取一定的措施减少了赤潮的发生( 图o 一1 ) 。 碍乏匿2 1 1 u i 蠲陀z 啊3z 目乳z 四5 蕊阢撕和霜呵ji j h 匪删la 弧醒z l l t i ；jz 弧z u 驰硎z 删i _ _ - _ _ _ _ _ _ _ _ _ - - _ _ _ - _ - _ - _ _ l _ - _ l _ - - _ _ - _ l - _ - _ _ _ _ - - - _ o _ _ _ - - - _ 1 一 一一 图0 - 12 0 0 1 2 0 0 7 年全国赤潮发生次数及发生面积( 2 0 0 7 年中国海洋灾害公报) f i g 0 - 1c h i n ar e dt i d ee v e n t sa n da r e a sf r o m2 0 0 1 t o2 0 0 7 ( 2 0 0 7n a t i o n a lr e p o r to n h a n si nc h i n a ) 在赤潮频发的同时，有毒有害赤潮所占的比例也在不断上升。近年来，中国近海 已经多次发生较大规模的有毒甲藻赤潮，如2 0 0 2 年5 月在东海舟山海域发生1 0 0 0 k m 2 的亚历山大藻赤潮；2 0 0 4 年6 月天津市附近海域发生32 0 0k m 2 的米氏凯伦藻赤潮； 利用免疫学技术对三种赤潮的定性和定量研究 2 0 0 5 年6 月渤海湾发生30 0 0k m 2 的裸甲藻赤潮；2 0 0 5 年5 月6 月在东海浙江海 域发生上万平方公里的米氏凯伦藻赤潮；2 0 0 6 年5 月在东海长江口海域发生数百平方 公里的链状亚历山大藻赤潮；2 0 0 6 年9 月在黄海连云港临近海域发生裸甲藻赤潮等。 有毒有害赤潮的发生对中国社会发展和自然生态安全构成了严重威胁。1 9 9 8 年米氏凯 伦藻赤潮导致广东、香港两地养殖鱼类的大量死亡，造成了数亿元的直接经济损失。 2 0 0 0 2 0 0 5 年，中国沿海每年因赤潮造成的直接经济损失都有数千万元，2 0 0 5 年东 海米氏凯伦藻赤潮对南麂岛的养殖鱼类造成了毁灭性的打击，仅此一地直接经济损失 就达2 0 0 0 万元。( 周名江等，2 0 0 7 ) 。 与南方海域的赤潮相比，渤海2 0 0 7 年共发生赤潮7 次，累计面积6 7 2 平方公里， 发生次数较2 0 0 6 年减少4 次，累计面积减少23 0 8 平方公里，未发生5 0 0 平方公里以 上的赤潮( 图o 2 ) 。黄海2 0 0 7 年共发生赤潮5 次，累计面积6 5 5 平方公里，发生次 数与累计面积较上年分别增加3 次和2 3 5 平方公里( 图0 - 3 ) 。黄海、渤海海域主要赤 潮藻种有1 2 种( 表0 2 ) 。 月储 12sd5678 9101 11 2 图o 22 0 0 3 2 0 0 7 年各月份渤海赤潮次数( 2 0 0 7 年中国海洋灾害公报) f i g 0 2m o n t h bf r e q u e n c yo f r e df i d eo c c u r r e n c e si nb o h a is e a ( 2 0 0 3 2 0 0 7 ) ( 2 0 0 7r e p o r to nm a r i n ed i s a s t e r so fc h i n a ) 9 8 卜一6 5 寸s 2 1 0 籁始饕 利用免疫学技术对三种赤潮的定性和定量研究 月侪l 23455了89101 112 图0 32 0 0 3 2 0 0 7 年个月份黄海赤潮次数( 2 0 0 7 年中国海洋灾害公报) f i g 0 3m o n t h l yf r e q u e n c yo f r e dt i d eo c c u r r e n c e si ny e l l o ws e a ( 2 0 0 3 - 2 0 0 7 ) ( 2 0 0 7r e p o r to nm a r i n ed i s a s t e r so fc h i n a ) 表0 - 2 黄海、渤海海域主要赤潮藻种 t a b l e0 - 2r e dt i d ec a u s a t i v es p e c i e si ny e l l o ws e aa n db o h a iw a t e r s g e n u s ： s p e c i e s d i n o f l a g e l l a t e s ：a l e x a n d r i u mc a t e n e u a 、g y m n o d i n i u ms a n g u i n e u m 、g y m n o d i n i u ms a n g u i n e u m r a p h i d o p h y t e s ：c h a t t o n e l l aa n t i q u a 、c h a n o n e l l am a r i n a 、h e t e r o s i g m a a k a s h i w o h a p t o p h y t e s ：p h a e o c y s t i ss p d i a t o m s ：c h a e t o c e r u ss o c i a l i s ，c o s c i n o d i s c u sa s t e r o m p h a l u s ，e u c a m p mz o o d i a c u s ，l e p t o c y l i n d r u sd a n i c u 5 c i l i a r e s ：m e s o d i n i u m 6 崩卅 因此，如何及时、精确预报赤潮的发生和快速、准确地对赤潮藻进行定性、定量 分析，减少赤潮对海洋渔业及海洋养殖业造成的巨大损失，成为当今赤潮研究的主要 方向之一，但是通过现有的检测手段还不能完全准确的预报赤潮的发生，特别是快速、 准确的定性、定量检测赤潮藻方面还需要进一步研究。 0 3 定性及定量检测赤潮藻的主要技术和方法 6 5 4 3 2 1 0 壤鬟崎 利用免疫学技术对三种赤潮的定性和定量研究 o 3 1 基于形态学特征的检测方法 0 3 1 1 传统形态学分析方法 在获得海水样品后，借助光学显微镜依据藻细胞的形态学特征对其中的浮游微藻 进行分析是当前鉴别和计量赤潮藻最直接和有效的方法，在浮游微藻检测方面一直发 挥着很重要色作用，是浮游植物分类鉴定的基础( h a l l e g r a e f f 等，1 9 9 5 ) 。即使在光镜 下某些种类形态类似难以区分，也可以有富有经验的分类学专家借助电子显微镜对其 进一步分析，找出它们之间的差异，根据这些差异的大小来判断它们是否属于相同的 种类。优点是：操作简便，设备简单。缺点是：对检测人员要求高，易误判人为因素 影响大，定量误差较大。 0 3 1 2 自动影像分析 在传统形态学分类的基础上，采用流式细胞仪使藻细胞逐个通过显微镜镜头，以 c c d 捕获照片，然后结合专家系统，利用计算机对捕获的照片进行识别分类( s i e r a c 虹 等，1 9 9 5 ) 。这一技术加快了分析的速度，但是存在形态相似的种类及个体较小的种类 无法区分的缺点。同时由于技术的限制，该技术获得的图像分辨率有时会比较差，也 7 在一定程度上影响了识别的准确度。优点是：分析速度快。缺点是：形态相似的种类 及个体较小的种类无法区分。 o 3 2 基于核酸探针的检测技术 所谓核酸探针是指能识别特异核苷酸序列的、带标记的一段单链d n a 或r n a 分 子。它是能与被检测的特定核苷酸序列互补结合，而不与其他序列结合的带标记的单 链核苷酸片段( 沈萍，2 0 0 0 ) 。根据核酸探针的来源与性质，核酸探针可以分为三种形 式：基因组d n a 探针、r n a 探针和寡核苷酸探针。目前使用较多的主要是寡核苷酸 探针，具有组织穿透性强、使用方便，而且与目的片段杂交所需时间短等许多优点。 寡核苷酸探针技术己广泛的应用于临床检测、生物分类研究等领域( s e h o e n h u b e r 等， 1 9 9 9 ；d u e y m e s 等，2 0 0 2 ) 。当前，寡核苷酸探针技术主要以两种形式应用于浮游微藻检 测：全细胞形式和细胞匀浆形式。 0 3 2 1 全细胞形式 需要首先将细胞进行化学固定以保持细胞结构的完整性，然后将标记好的探针以 特异性结合的方式固定在细胞表面或细胞内部，通过荧光显微镜或流式细胞仪检测标 记探针发出的信号以显示细胞形态，从而达到识别和定量的目的。 利用免疫学技术对三种赤潮的定性和定量研究 采用该方法，被标记的细胞在野外样品中很容易被识别出来，当然这种方法也存 在着一些缺陷，例如：对以链状形式聚生的细胞( 如拟尖刺菱形藻属，n i t z s c h i a ) 和在保 存过程中聚集成簇的细胞( 如异弯藻属，h e t e r o s i g m a ) ，要准确地记数就比较困难，一些 易碎的藻细胞种类( 如金藻门的r a p h i d o p h y t e s 属) 则很难保存计数等( 米铁柱等，2 0 0 3 ) 。 0 3 2 2 细胞匀浆形式 首先利用化学溶剂破裂细胞以释放细胞内容物，然后将特异性分子探针和这些释 放出来的物质进行结合。由于探针进行了标记，所以通过检测标记信号就可以识别和 定量与探针结合的分子物质。再通过建立藻细胞数目和细胞内容物之间的数学关系模 型，就可以对该物种的生物量进行估算。 目前对细胞匀浆的检测方法主要有两种：将核酸探针直接与细胞匀浆杂交检验； 先将特异性片段扩增，然后再进行杂交并检测标记信号。前者可以采用斑点印迹法 和双探针杂交等技术实现，后者除了p c r 扩增后再采用上述两种手段外，还可使用定 量p c r ( q u a n t i t a t i v ep c r ) 和等温扩增( i s o t h e r m a la m p l i f i c a t i o n ) 等技术实现。细胞匀浆形 式的优点是能迅速的对样品进行检测，并且可以对藻类的孢子直接进行检测，而且检 测的时间较短，能提供很高的检测通量，易于实现自动控制。但这一方法不能同时提 供传统的形态学特征作为验证，而且检测信号与细胞数量的关系模型较难建立。 核酸探针的检测技术的优点是：能迅速的对样品进行检测，并且可以对藻类的孢 子直接进行检测，能提供很高的检测通量，易于实现自动控制。缺点是：由于不同藻 类型的基因文库资源尚十分有限，准确性值得怀疑。很难定量进行研究，无法现场检 测。 o 3 3 荧光图像检测法 荧光图像检测法：细胞受到连续的激发光照射会发出荧光和散射光，不同的细胞 会出现特有的峰值变化。这种荧光信号和散射光信号被接收放大后转换为电信号，经 过计算机分析，实现细胞的定量检测。目前，该技术己广泛应用于生物医学基础和临 床研究领域，在免疫学、血液学、肿瘤学等学科中得到广泛应用。在藻类检测方面， 王学民等( 2 0 0 6 ) 利用藻细胞自身发射的荧光对赤潮图像进行分析，可以排除现场检 测中杂质等对计数准确度带来的影响，具有一定的定性和定量的准确度。荧光图像检 测法的优点是：自动化程度高，样品无需处理操作简便。缺点是单纯以自发荧光检测 进行检测在区分不同种的细胞时可用数据太少，仅能作为鉴别的辅助工具。荧光图像 的采集和处理还存在一定的技术需要问题。 0 3 4 赤潮甲星遥感探测技术 卫星遥感探测技术的原理是运用现代光学、电子学探测仪器，在高空把目标物的 电磁波、红外辐射等特性记录下来，通过分析、揭示出目标物本身的特征、性质及其 变化规律。卫星遥感是2 0 世纪6 0 年代发展起来的门对地观测综合性技术。主要采 用了两类卫星数据用丁赤潮遥感监测，一是气象卫星类，使用其主要的海表温度数据， t h j 于探测赤潮的环境温度，可见光波段用于辅助分析；一：是水色卫星数据，主要用其 可见光数据，以建立叶绿素模型，进而探测海表浮游生物。卫星遥感探测技术特点： 探测范围广、采集数掘快，能动态反映地面事物的变化。获取的数据具有综合性( 图 0 - 4 ) 。由于浮游生物种类的多样性、生理特性及生态习性的显著差异，赤潮水体的光学 特性复杂，对赤潮的探测存在着很多不确定性( 丛j ! 福等，2 0 0 1 ) 。 图0 - 4 浙江近海赤潮卫星遥感影像图 f i g 0 - 4 h a b si nc o a s t a lz h e j i a n gp r o v i n c er e v e a l e db ys a t e l l i t er e m o t es e n s i n g o 3 5 基_ r 免疫学方法检测 在浮游微藻的研究中，免疫学方法( ( i m m u n o l o g i c a lm e t h o d ) t 要足以特异性的抗体 为基础构建的系列的藻细胞或藻毒素的检测方法。在藻类的研究中，免疫学检测 要足以特异性的抗体为基础构建的一系列的藻细胞或藻毒素的检测方法。其主要过程 利用免疫学技术对三种赤潮的定性和定量研究 包括：制备多克隆抗体或者进一步细胞融合制备单克隆抗体、抗体特异性检测及抗体 标记、样品检测和结果分析。这其中涉及到的检测方法和技术主要有荧光免疫测定、 免疫磁性微粒、免疫传感技术、酶免疫测定、流式细胞术、单克隆抗体制备及封闭抗 体技术等，这些方法和技术在生命科学其他领域已有应用，其中某些方法的优势在于 不需要对样品进行特别的预处理，流程较简单，结论可靠，数据重复性较好，易于实 现较大规模的样品分析，能够同时检测大批的样品，甚至可用于海洋环境中浮游植物 的实时监测。 0 4 免疫学方法在有害藻检测中的应用 0 4 1 酶联免疫分析技术 酶联免疫分析技术( e n z y m e 1 i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y , e l i s a ) ) 的基础是抗原或 抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免 疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。检测时，待 测样本( 含有抗体或抗原) 与固相载体表面的抗原或抗体起反应，用洗涤的方法使固相载 体上形成的抗原抗体复合物与溶液中的其他物质分开，再加入酶标记的抗体或抗原， 与抗原抗体复合物反应从而也结合在固相载体上，此时固相上的酶量与样本中受检物 质的量呈一定的比例。加入酶的底物后，底物被酶催化成为有色物质，产物的量与样 本中受检物质的量相关，故可根据显色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效 率很高，放大了免疫反应的结果，使测定方法具有很高的灵敏度。 e l i s a 可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有三个必要的试 剂：固相的抗原或抗体；酶标记的抗体或抗原；酶反应的底物。根据试剂的来 源和样本的情况以及检测的具体条件，可设计出各种不同类型的检测方法，比较常见 的有间接法、竞争法、夹心法等。 0 4 1 1 间接法 间接e l i s a ( i n d i r e c te l i s a ，i e l i s a ) 是测定抗体最常用的方法。如图o 5 ，主要操 作步骤如下：用已知抗原包被固相载体；加含有待测抗体的样本，经过温育( 3 7 。c 1 - 2 h ) ，使抗体与固相抗原结合。洗涤，除去非特异性结合的抗体；加酶标抗抗体， 再次温育( 3 7 。c1 - 2 h ) ，使二抗与固相载体上抗原抗体复合物结合：洗涤，除去非特异性 结合酶标抗抗体；加底物显色一段时间，终止反应后，目测定性分析或用酶标仪测 利用免疫学技术对三种赤潮的定性和定量研究 吸光值进行定量分析。 样本c 含抗 图o 5 间接e l i s a 原理示意图 f i g 0 - 5i d i r e e te l i s a f l o wc h a r t 0 4 1 2 竞争法 竞争e l i s a ( c o m p e t i t i v ee l i s a , c e l i s a ) ，可用于抗原和半抗原的定量测定，也可 用于测定抗体。以测定小分子抗原为例，如图0 - 6 ，主要操作步骤如下：用特异性抗 体包被固相载体；向对照管中加入一定量的酶标抗原；向待测管中加入含有待测抗 原的样品，温育一段时间后再加入一定量的酶标抗原；经过温育，分别洗涤，除去非特 异性结合的抗原物质：加入底物显色，对照管中只有酶标抗原，并且每一个吸光值 都与一个确定的抗原量相对应；待测管的显色程度则随待测抗原和酶标抗原与固相抗 体竞争结合的结果而异。如待测抗原量多，竞争性地抑制酶标抗原与固相抗体结合， 使固相上结合的酶标抗原量减少会使加入底物后显色反应较弱。根据两管的吸光值， 可以推算样本中待测抗原的含量。 八占 利用免疫学技术对三种赤潮的定性和定量研究 图0 - 6 竞争e l i s a 原理示意图 f i g 0 - 6c o m p e t i t i v ee l i s a f l o wc h a r t o 4 1 3 夹心法 适用于多价大分子抗原的检测，而不能用于测定半抗原等小分子物质。如图o 7 ， 主要操作步骤如下：用特异性抗体包被固相载体；加入含有待测抗原的样品，经过 温育使相应抗原与固相抗体结合；洗涤，除去非特异性结合的抗原；加入酶标特异 性抗体，与已结合在固相抗体上的抗原反应；洗涤，除去非特异性结合的酶标抗体； 加入底物显色，终止反应后，目测定性分析或用酶标仪测量吸光值进行定量分析。 瓣一懿一 和骂黝 警丫蕊掣丫圈 一 汛皂 ，墨0 。、，婚鼯u悖捞 、，蕊 晟，娶墓 巡一 厶a 一一 矗厶 l 一垒 甲圈甲醯 m 一 掣v 岑旦 |铲 v，图陬v ，蕊麟攀 利用免疫学技术对三种赤潮的定性和定量研究 y yy 土趟 髓圆c _ 二乌隧鼹圆 圄燃 图o - 7 夹心e l i s a 原理示意图 f 逗0 7 s a n d w i c he l i s af l o wc h a r t 酶联免疫吸附试验目前在医学和生命科学其他领域中已经得到了极其广泛的应 用，亦有针对多种藻毒素的检测方法得以建立( g a r c i ac t a l ，1 9 9 i ；渤fe t a l ，2 0 0 2 ； i m a i e t a l ，2 0 0 3 ) 。最近几年，也有将该方法应用于浮游微藻研究的报道。 c a r o n 等( 2 0 0 3 ) 制备了a u r e o c o c c u sa n o p h a g e f f e r e n 的特异性单克隆抗体，建立了 一种快速检测这种藻的e l i s a 方法。由于借助于预先封闭好的9 6 微孔过滤板定量收集 天然海水样品中的藻类，使得检测时间缩短为3 _ 4 小时，检测范围在1 0 0 0 - 6 0 0 0 0 0 个细 胞，与直接计数基本吻合。每一块微孔板可以检测2 0 多份样品，大大降低了鉴定和计 数过程的工作量，对于赤潮的预报意义重大。 x i n 等( 2 0 0 5 ) , u 各了一种裸甲藻g y m n o d i n i u ms p 的高特异性多克隆抗体，建立了 检测该种海藻的竞争型e l i s a 方法，检测范围达到了2 4 6 2 5 0 0 0 0 个细胞，检测极限达 到1 2 个藻细胞，方法的批内和批间变异系数分别