（生物化学与分子生物学专业论文）甲醛对小鼠肝的dna损伤.pdf

硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 甲醛在低浓度时，不能诱导d p c 的形成或者不能显著诱导d p c 的形成，在较高浓 度时能够显著诱导d p c 的形成，且具有明显的量效关系。修复结果显示，经过 7 5 z m o l l 液态甲醛染毒h e p g 2 细胞，染毒结束6 h 后，h e p g 2 细胞d p c 水平较染 毒结束时没有发生显著变化，当继续培养至1 8 h 和2 4 h 后，细胞内的d p c 水平较 染毒结束时发生了非常显著的下降( p o 0 5 ) ，说明没有显著产生 d p c 效应。1 2 h 或1 8 h 组肝细胞内d p c 含量明显增加( p o 0 5 、p 0 0 1 ) ，说明经 过液态甲醛作用1 2 h 或1 8 h 后，显著的产生d p c 效应。2 4 h 组肝细胞内d p c 与空 白组比较没有显著差异，说明在1 8 h n 2 4 h 之间发生了修复。 4 甲醛吸入对小鼠肝细胞的d n a 断裂作用 本研究以昆明雄性小鼠作为实验材料，经浓度为o 5 m e g m 3 、1 0 m g m 3 和 3 0 m g m 3 的气态甲醛染毒后，用彗星实验的方法检测小鼠的肝细胞的d n a 断裂情 况。结果显示：当甲醛浓度为o 5 m g m 3 和1 0 m g m 时，1 萄ld n a 和t a i lm o m e n t 数值都比各自的空白对照组高，差异均具有高度显著性( p 0 0 5 ) ，而t a i l m o m e n t 显著下降且低于空自对照组，差异有统计学意义( p 0 0 1 ) 。说明在3 0 m g m 3 时甲醛诱导了核内d n a 交联物的形成，使d n a 在电泳中泳动受阻，迁移率降低， 参数值下降。 关键词：甲醛；遗传毒性；彗星实验；k c i - - s d s 沉淀法；d p c ；d n a 断裂 u f o 瑚a l d e h y d ea t7 5 m o l ，lc a nb er e m o v e ds i g l l i n c a n t l ya f t e r l 8a n d2 4h o u r s ，b u in o t l h ec a s ea f i e r6a n d1 2h o u r s 3 t h ee 仃e c to fi i q u i de a - t n d u c e dd p ca n di t sr e p a i rp r o c e s st nm i c el i v e r s p f - c l a s sk l m m i n gm a l em i c ew e r cj n j e c t c db yl i q u i df 0 珊a l d e h y d ea td i 旋r e n t c o n c e n t r a t i o n s ( o 2 m 肚g 、2 m k ga l l d2 0 m g ，l 【g ) a i l dd p c c o n t e n tw a sd e t e c t e db y k a - s d sa s s a ya td i f f c r e n tt i n l e 皿er e s u l t ss h o w e dd p cj n d u c e db y l i q u i d f o 硼a j d e h y d e 啪b e 埘n o v e ds i 驴访啪l ya 矗e r1 8a n d2 4 五o u 稻 4 。】飞ee f f e c to fl 王6 l 1 n d u c e dd s s bi m i c eh v e r s p f - d a s sk u n m j n gm a l em i c e 靴f ce x p o s e dt og a s e o u sf o 朋a l d e h y d ea td i 触r c n c o n c c n t r a t j 咖s ( 0 5 m g m 、1 o i n g m a i l d3 m g m ) a l l df a i i n d u c e dd s s bi nm i c el i v e r c e l l sw a sd e t e c t e d b ys c g e 1 1 1 er e s u l ts h o w e dt h a tf ac o u l d 叫u c ed s s bs i g l l i f i c a i l t l y i nm i i i v e ra f t e re x p o s u r et o0 5a n d1 o m g ，m 3g 鹤c o t l se 八( 0 5m g ，m 。，p 室外，此外，家具内甲醛浓 度最高l l o l 。 1 3 室内甲醛的污染特征 室内空气甲醛污染的主要特征有： 污染范围广：在绝大多数新装修家庭和办公室都存在，其主要原因是使用了 含有脲醛树脂的木质人造板材，而脲醛树脂是由甲醛与尿素聚合反应生成的一种粘 合剂，其中所含的游离甲醛和降解时产生的甲醛都可以释放出来，污染室内空气i l ”； 污染时间长，呈季节性波动：甲醛污染可以持续数年之久，这是因为聚合脲 醛树脂的降解是一个长期的不间断的过程，且甲醛释放量可随夏季环境温度和湿度 的升高而大幅度增加； 污染水平相对较高；尽管居室内空气甲醛与职业性空气甲醛的污染水平相 比，还属于低浓度水平，但是在所有因室内装修引起的有机类空气污染物中，甲醛 的污染水平常可以高达o 1 4 m g m 3 ，这样的浓度水平不但远远高于其它单个污染 2 物的水平，有时甚至高于其它挥发性有机化合物( v o c ) 的总量f 1 2 】，所占比重也是 其它污染物难以相比； 生物毒性大：2 0 0 4 年6 月1 5 曰，世界卫生组织下属机构一国际癌症研究中心 领导的工作小组评估了甲醛致癌效应的相关研究报告后，将甲醛确定为1 a 类物质 ( 人类致癌物) 【1 3 1 ，目前美国甲醛的职业阈限值为o 3 7 m m 3 ，我国职业卫生标准 也于2 0 0 2 年将我国车间空气甲醛的职业阙限值从3 o m g ，m 3 降低到0 5 m g m 3 【1 4 】，同时 根据、h o 文件，非职业性环境空气甲醛阚限值仅为o 1 m g ，m 3 1 1 5 】，这些数据均说明 气态甲醛有较大的生物毒性。 2 甲醛的遗传毒性 甲醛的毒作用种类繁多，机制不清。甲醛暴露有关的症状有：眼炎、嗓子发干、 流鼻涕、咳嗽、窦感染、头痛、乏力、压抑、失眠、出疹鼻血、恶心、腹泻、胸痛 和腹痛等。甲醛对动物是强有力的致癌物，1 9 8 0 年美国化学工业毒理研究所首次报 道了动物吸入甲醛气体引起鼻腔鳞形细胞癌，但当时对人体还存在争议。随着对甲 醛毒性的深入研究，2 0 0 4 年6 月1 5 日，世界卫生组织的国际癌症研究中心( l a i t c ) 发表的报告称高浓度的甲醛能导致耳、鼻和喉癌，同时还提到也可能导致白血病删。 甲醛除了遗传毒性和致癌作用外，具有免疫毒性、神经毒性、细胞毒性和生殖毒性 【婚矧。本文主要研究甲醛的遗传毒性。 研究证实，甲醛的遗传毒性涉及到细胞的三个不同层次。第一个层次为基因水 平，在这一水平上甲醛可引起基因突变( g c n cm u t a t i 咖) 。第二个层次为d n a 水平， 在这一水平上甲醛可以引起d 队单链断裂( d n as i n 昏es t r a n db f e a l 【，d s s b ) 、 d n a d n a 交联( d n a _ d n ac r o s s l i n k s ，d d c ) 以及d n a 蛋白质交联( d n a p r o t e i n c r o s s l i i l i 【s ，d p c ) ：第三个层次为染色体水平，在该水平甲醛可以导致染色体异常 ( c h r o m o s o m a la b e 啪t i o n s ，c a ) 和姐妹染色单体的交换( s i s t e fc h r o m a i i de x c h a l l g c ， s c e ) 。以下就甲醛所致遗传毒性的第二层次d n a 损伤及其修复机制的研究做一 综述。 2 1 甲醛导致d n a 断裂作用 2 1 1 甲醛导致d n a 断裂 甲醛能否导致d n a 分子断裂，学术界一直没能达成共识。o l i v c tm e t k 等对甲 醛的遗传毒性作了多次研究，但却没能发现甲醛具有断裂作用【2 4 】，国内学者对此也 进行过多项研究，多数研究者也认为甲醛没有断裂作用：但是唐国慧利用h l 6 0 人 硕士学位论文 m a s t e r l st h e s s 白血病细胞和杨丹风利用大白鼠肝细胞分别进行研究，却发现甲醛在5 u m o l l 和 1 0 u m o l l 时都能引起d n a 链的断裂；袭著革等利用甲醛对健康雌性昆明小鼠脾淋 巴细胞进行染毒，也发现低浓度的甲醛能够引起d n a 断裂；本实验室经长期研究， 也发现分别经5 u m 0 1 l ，7 5 u m o l 几和1 0 u m o 】l 甲醛染毒，人体口腔颊黏膜细胞d n a 也有断裂作用发生，且甲醛导致瑚吒a 断裂的峰值浓度位于7 5 啪o l l 左右。 2 1 2 甲醛导致【 n a 断裂可能机理 应用单细胞凝胶电泳技术对d n a 断裂进行研究，发现加入自由基清除剂可以 显著地抑制甲醛所致的d n a 断裂，提示甲醛主要是通过活性氧自由基，特别是羟 自由基来介导d n a 断裂。甲醛可以通过以下三种途径产生活性氧自由基，引起氧 化压力的增加：( 1 ) 甲醛可以损害生物或细胞内的抗氧化系统，如引起超氧化物歧化 酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶等抗氧化酶活性的降低，以及抗氧化物质如 还原型g s h 的耗竭等【2 5 2 6 j ：( 2 ) 甲醛作为一种亲电子剂，作为一种自由基及弱氧化 剂，进入机体或细胞后可发生类似f e n t o n 反应的化学过程，作用类似于过氧化氢， 产生羟自由基等强氧化剂，进而导致氧化应激对生物大分子造成损伤1 2 7 j ；邝) 甲醛进 入细胞后可以打开线粒体上的线粒体渗透性转运通道，降低线粒体膜电位，抑制线 粒体的呼吸作用，产生更多的活性氧自由基( r o s ) ，使得细胞或机体内的氧化压 力增加【2 6 1 。即甲醛可以通过多种途径破坏机体的氧化平衡状态，使得机体内的r 0 s 水平增加，进而对核苷酸进行攻击产生峪断裂1 2 8 l 。 2 1 3d n a 断裂的修复 d n a 断裂如果不能及时修复，就会导致突变，更关键的是，它还会阻碍细胞分 裂所必需的d n a 复制过程，从而导致细胞死亡。在生物体长期进化过程中，正常 细胞形成了一套十分有效的d n a 修复系统，从而可使受损伤的d n a 分子迅速恢复 正常，使细胞的遗传稳定性和正常功能得以保持而不致发生恶变。 d n a 分子单链断裂( s s b s ) 的修复较为容易和迅速，一般采取切除修复。 切除修复即将d n a 分子中受损伤部分切除掉，并以完整的那一条为模板，合成切 除的部分，然后使d n a 恢复正常结构。 d n a 双链断裂( d s b s ) 的修复主要通过重组修复进行的。该修复主要依靠 一种d n a 依赖的蛋白激酶( d n a - p k ) ，d n a p k 主要由两个蛋白质组成：含有催 化亚基的p 3 5 0 和与双链d n a 作用的k u 自身抗原，后者是一个分子量为7 0 8 0 k u ( k d ) 的二聚体。具体修复机制是：7 0 8 0 k u 二聚体结合d s b s 的断端，然后由催 化亚单位p 3 5 0 作用，使必需蛋白质磷酸化，将断端重新接起来1 2 9 j 。 4 2 2 甲醛导致d n a d n a 交联 从代谢生理的角度上看，d n a d n a 的交联是甲醛正常代谢的一种方式，因此， 正常的细胞中存在着微量的d n a d n a 交联产物。当有外来物理，化学因素如：射 线、烷化剂、甲醛以及一些金属化合物如镍等直接或间接的作用时，则可诱导出过 量的d n a - d n a 交联。这些d n a - d n a 交联必将对d n a 的构象和功能( 复制与转 录) 产生严重的影响，并在其复制过程中造成某些重要基因( 如抑癌基因) 的丢失， 从而对生物体造成严重的危害。由于d n a d n a 交联对生物体的危害较大，所以也 引起了不少学者的重视。 2 2 1 甲醛导致d n 砧d n a 交联 许多研究都发现一定浓度的甲醛可以诱导d n a d n a 的交联。m c f koc o n a w a v c c p 捌等在不同的实验中都发现一定浓度的甲醛都可以导致d n a d n a 交联；袭著 革等在使用不同浓度甲醛对人外周血淋巴细胞作用时，也发现当甲醛浓度达到 0 3 5 8 4 m m o l l 时可以引起d n a - d n a 的交联：本实验室研究也发现甲醛在较低浓度 ( 1 5 0 1 l ) 时可以导致d n a d n a 交联剐。 2 2 2 甲醛导致d n a d n a 交联的机理 国内外专家学者虽然针对甲醛导致d n d n a 交联进行了很多研究，但确切机 理还不是很清楚。甲醛所致的d n a d n a 交联，分为链内交联和链间交联( 如图1 ) ， 主要发生在a 、g 、c 碱基自身或三者之间，但不形成c c 交联。其大致机理可能 是：( 1 ) 甲醛主要通过活性氧自由基，特别是羟自由基来介导d i 蛆d n l a 的交联【3 2 】。 ( 2 ) 甲醛是一种简单的小分子。其毒性效应的一个重要方面是源于它的羰基亲电 性和较小的空间位阻，使其易于与核酸发生交联。在体内或体外甲醛先与核酸上的 自由的氨基反应生成不稳定的羟甲基加合物，然后再进一步与其他核酸反应形成稳 定的交联物，其主要形式是：d n a n h c h 2 一n h d n a 【3 j o 2 2 3 甲醛导致d n a d n a 交联的修复 d n a d n a 交联的修复可能是由几种修复系统共同完成，主要的修复系统是切 除修复和重组修复。重组修复的主要机制是：受损伤的d n a 链复制时，产生的 子代d n a 在损伤的对应部位出现缺口。另一条母链d n a 与有缺口的子链d n a 进行重组交换，将母链d n a 上相应的片段填补子链缺口处，而母链d n a 出现缺口。 以另一条子链d n a 为模板，经d n a 聚合酶催化合成一新d n a 片段填补母链 d n a 的缺口，最后由d n a 连接酶连接，完成修补刚。 5 图1 甲醛所致d n a 交联的几种情况 f i g l l r e ld n a 啪s s l i n k si l l d u c e db yf o r m a l d e h y d e 2 3 甲醛导致d n a 蛋白质交联 在正常细胞中存在着一定量的d n a 蛋白质交联( d n a p r o t e i nc r o s s l i n l 【， d p c ) ，见图1 。这是d n a 与核蛋白的正常联系或其代谢的结果p 4 】，对维持细胞的 正常活动具有重要作用，当有外来物理，化学因素作用时，则可诱导出过量的d p c 。 d p c 与其他d n a 损伤相比，较难修复【矧，且d p c 仅可发生在单链d n a 上，这表 明这种交联只能发生在d n a 复制和转录期间，因此d p c 的形成，必将对d n a 的 构象和功能( 复制与转录) 产生严熏的影响f 州，并在其复制过程中容易造成某些重 要基因( 如抑癌基因) 的丢失，导致肿瘤或某些严重疾病的发生。可见d p c 过度 增加是一种病理现象，是d n a 分子的一种严重的遗传损伤。 2 3 1d p c 的生化特性 d p c 是一种稳定的共价化合物，难以被一般的分离剂如碱性溶液、去污剂、强 变性剂以及有机提取剂等分开。d p c 的生化特性有：在正常细胞中存在着一定量 的d p c ，这是d n a 与核蛋白的正常联系或代谢结果。当d n a 和蛋白质受到外来 理化因素如：u v ，y 射线、烷化剂、甲醛以及一些金属化合物如镍和铬等直接和间 接的作用，则可诱导出超量的交联产物【3 6 l 。和d n a 相联系的蛋白质：与d n a 交联的有正常联系的蛋白质，如核小体质粒组蛋白等，也有与d n a 无接触的蛋白 质，如白蛋白或溶菌酶等。紫外光可诱导小牛血清白蛋白、d n a 聚合酶、r n a 聚 合酶、氨基酰t r n a 合成酶以及核蛋白与核酸交联。d p c 的d n a 序列：通过核 酸探针杂交技术，可对d p c 的d n a 序列进行探讨。另外d p c 可在染色体结构松 散的基因组区域优先形成，而这些基因正是邻近于核基质结合位点并具有转录活性 硕士学位论文 m a s t e r s t h e s l s 的序列i 3 7 1 。 2 3 2 甲醛导致d p c 的形成 甲醛具有广泛的遗传毒性，可以导致d n a - 蛋白质交联，d n a d n a 交联，d n a 链断裂，染色体的畸变，姐妹染色体的交换等，其主要和直接的遗传毒性效应就是 形成d p c l 2 4 】。1 9 8 9 年c a s 越0 v c 等的实验表明，用气态【1 4 c 卜甲醛暴露6 h ，以放射 性“标记指数( 1 a b e l i n gi n d e x ，u ) ”为指标，检测f 3 4 4 大鼠鼻腔粘膜中d p c 的水 平，结果如下：经o 4 0 1 m 咖3 水平暴露，即可检出d p c 的形成；经0 9 3 5 ，2 6 7 8 ， 8 0 3 6 ，1 3 3 9 2 m g ，m 3 水平暴露，d p c 形成的数值分别增长为0 5 ，4 2 ，1 7 ，2 4u 。 另外本实验室也发现：在研究甲醛对人血淋巴细胞实验中，当甲醛浓度在 o 。0 0 5 m m o i 。和0 0 2 5 m r n o l l 时，d p c 的含量和对照组( 加入蒸馏水) 相比没有显 著性的差异( p 0 0 5 ) ，当甲醛浓度为0 1 2 5 m m o l ，l 和0 6 2 5 m i n o l ，l 时，d p c 的含 量和对照组相比有极显著性的差异( p o 0 1 ) ，结果反应：甲醛在低浓度时，d n a - 蛋白质的交联现象不明显或者不引起d n a 蛋白质的交联现象；在高浓度时，甲醛 能显著地诱导d p c 的产生州。 2 3 3 甲醛导致d p c 形成的机理 甲醛是醛类化合物中最简单的小分子，其毒性效应的一个重要方面是源予它的 羰基亲电性和较小的空间位阻，使其易于与核酸和蛋白质发生交联。在体内或体外 甲醛先与蛋白质或核酸上的自由的氨基反应生成不稳定的羟甲基加合物，然后再进 一步与核酸或蛋白质反应形成稳定的交联物。甲醛主要引起d n a 和组蛋白的交联， 该过程是甲醛先快速的和组蛋白反应，然后再和d n a 环外的氨基结合形成d p c ， 主要涉及到组蛋白赖氨酸的e 氨基和g 碱基的环外氨基，其主要结构为： h i s t o n e n h c h 2 n h d n “3 9 ，4 0 1 。甲醛损害生物体抗氧化系统或作为抗氧化酶的抑制 剂，间接导致d p c 的增加。例如甲醛可以引起还原性g s h 的耗竭，抑制谷胱甘肽 过氧化物酶和超氧化物歧化酶等抗氧化酶的活性，使羟自由基和氧自由基清除不 力，导致d p c 含量的增加1 4 1 j 。 2 3 4d p c 的修复 与其他生物体存在的各种d n a 损伤的修复机制相比，d p c 的修复存在两个特 点：修复困难；人类对d p c 的修复机制知之甚少。初步研究结果表明，d p c 的修复可能涉及“d p c 的水解”和“短肽d n a 的修复”两个基本过程：d p c 水 解的机制有：自发性水解( 慢) 和酶催化水解( 快) 。q u i e v r y ng 等认为蛋白酶复 合体p t o t e a s o m e 具有对d p c 酶催化水鳃的功能，2 0 0 0 年他们采用p m t e a s o m e 的特 异性抑制剂1 a c t a c v s 恤( 1 0 “m ) 作用d p c 模型细胞，使d p c 水解的速度降低3 硕士学证论文 m a s t e r st h e s i s 倍。短肽- d n a 修复机制：d p c 水解之后，还有短肽或氨基酸残基继续与d n a 相联，这时需要d p c 修复酶来切除这些成份。例如，一种新近命名为t c l p l 的磷酸 二酯酶就具有切除与d n a 相联的酪基酸残基或短肽的功能，这是目前唯一被报道 的d p c 修复酶，但是该酶仅能切除与d n a 相联的酪氨酸残基或短肽。由于甲醛主 要引起d n a 和组蛋白交联而形成的d p c ，所以我们要寻找的是能切除与d n a 相 联的赖氨酸残基或短肽的d p c 修复酶，或称之为“赖氨酸d p c 修复酶”【4 ”。 3 选题意义 甲醛对机体具有遗传和致癌作用。甲醛对机体的健康效应不容忽视，寻求甲醛 暴露的早期效应生物标志物具有现实意义。为了进一步研究甲醛的遗传毒性，本实 验真接选用小鼠肝和人肝癌细胞系h e p g 2 为实验材料，同时通过体内和体外实验， 可以证明甲醛分别在体内和体外都对d n a 有损伤作用。同时，采用气态灌流活体 染毒的染毒方式，能够更好的评价气态甲醛对d n a 的损伤作用。为制定安全的环 境和职业甲醛浓度标准，维护从业工人的身体健康提供较为科学的依据。 硕士学位论文 m a s t e r st h e s l s 1 实验材料 二、材料与方法 1 1 实验受试动物 s p f 级昆明种雄性小鼠，年龄为5 周，体重分别为1 8 2 2 9 左右，由湖北省医学 实验动物中心提供。 1 2 实验受试细胞 人肝癌细胞系h e p g 2 由新加坡南洋理工大学生命科学学院提供。 1 3 主要化学试剂 1 0 的福尔马林溶液购自s i g m a 公司、十二烷基硫酸钠、蛋白酶k 购自m e r k 公司、 h o e c h s t 3 2 5 8 荧光染料购自s i g m a 公司，d m e m 培养基和小牛血清购自g i b c o ，小牛 胸腺d n f 蝴自s i 鲫a 公司，吖啶橙( a o ) ，十二烷基肌氨酸钠购自a m r e s c o 公司，正 常熔点琼脂糖( m 队) 和低熔点琼脂糖( u 从) 购自p r o m e g a 公司，n a 2 e d t a 购 自b m 公司，n i t o n x 1 0 0 购自觚c o 公司，c e l lc o 岫t i n 9 8 虹购自d o j i n d o 公司，其 他试剂均为分析纯。 1 4 主要实验仪器 超净工作台，苏州净化科学仪器厂；三用电热恒温水箱，北京市长源实验设备 厂；c 0 2 培养箱( 日本岛津) ；倒置显微镜；尼康荧光显微镜( e 6 0 0 型) ；冷冻离心 机( e p p e n d o 5 4 1 5 r ) ；d y y _ 1 1 b 型三恒电泳仪( 北京市六一仪器厂) ；d y y - i i i 型 电泳槽( 北京市六一仪器厂) ；荧光分光光度计( f 。4 5 0 0 型，日本日立) 。4 1 6 0 2 型 甲醛测定仪( 美国i n r e r s o n 公司) ；w h 2 型小型智能环境气候舱( 武汉市宇信科 技开发有限公司) 。 1 5 主要实验溶液的配制 1 5 1 细胞培养相关溶液的配制 ( 1 1p b s 的配铕0 k c l 0 2 9 9 淼篇。 k h 2 p 0 4 o 2 9 n a c l 8 0 9 n a 2 h p 0 4 1 2 h 2 02 0 8 4 9 分别溶于三蒸水中，混合均匀，定容至1 0 0 0 m l 。分装于2 5 0 m l 葡萄糖瓶中，高 压蒸汽灭菌消毒( 1 0 磅、1 0 m i n ) ，4 冰箱保存。 ( 2 ) r p m i - 1 6 4 0 培养液( 1 l ) r p m l l 6 4 01 瓶( 袋) l g l u t 锄i n e o 1 1 9 丙酮酸钠 o 1 1 9 水 8 0 0 m l 磁力搅拌2 。3 h n a h c 0 3 2 0 9 水2 0 0 l n l 磁力搅拌1 h + ，调p h7 0 7 2 ，过滤除菌。 1 5 2k c l s d s 沉淀实验相关溶液的配制 ( 1 ) s d s 溶液：2 s d s ( 埘内) 。准确称取s d s ( 分析纯) 1 9 ，放入试剂瓶，再加入 适量双蒸水，水浴加热溶解，最后定容至5 0 i i l l ，4 冰箱保存备用。 ( 2 ) t ￥i s h c l k c l 液：1 o m o l l 的k c l 溶于2 0 m m o l 乙1 m s h c l 。p h = 7 5 。 ( 3 ) 清洗缓冲液：清洗缓冲液中各试剂的浓度分别为o 1m o l lk c l ， o 1m l o l ，l e d l a ，2 0 n l m o l u y i s h c l ，p h = 7 5 。 ( 4 ) 蛋白酶k 消化液：称取适量的蛋白酶k 溶于清洗缓冲液中配制成终浓度为 0 4 l ，现用现配。 ( 5 ) h o e c h s t 3 3 2 5 8 染液：准确称取1 m g 的h o e c h s t 3 3 2 5 8 染料，溶于2 5 m l 的 2 0 m m o m 胁i s h a 中，使用时再稀释1 0 0 0 倍，使其终浓度为4 0 0 n m l 。 1 5 3 单细胞凝胶电泳试验相关溶液的配制 ( 1 1 细胞裂解液：准确称量所需量的n a a 、n a 2 e d l a 、t r i s 、十二烷基肌氨酸钠试剂， 加入适量的双蒸水，加热溶解，定容至所需体积，使其终浓度分别为 n a a 2 5 m o l l ，n a 2 e d t a l 0 0 m m o l l ，t r i s l o m m o l l ，十二烷基肌氨酸钠1 ( m v ) ，再用n a 0 h 调节p h 至1 0 ，4 冰箱保存备用。使用时加入n i t o n x 一1 0 0 和 d m s o ，终浓度分别为1 和1 0 ( m ，v ) 。 ( 2 ) 电泳缓冲液：1 m m o l l ，n a 2 e d t a ，3 0 0 m m o l l n a o h ，p h = 1 3 。 硕士学位论文 m a s t b r st h e s i s ( 3 ) 中和液：o 4m o l ，珀r i s 缓冲液，p h = 7 5 。 ( 4 ) 吖啶橙染色液：2 0 u l 。 2 实验方法 2 1 气态甲醛致小鼠肝d p c 实验方案 2 1 1 气态甲醛染毒方案 实验采用仿真式暴露染毒，即通过吸入法进行染毒。这是机体暴露于室内空气 甲醛的仿真模式，使得这种染毒方案更接近于真实情况。将2 4 只昆明纯系雄性小 鼠随机分为4 组：1 个对照组和3 个甲醛染毒组，每组6 只小鼠。染毒期间每天定 时喂食、饮水两次。染毒组置于用8 ，4 l 通气式干燥器改装成的玻璃染毒缸中连续动 态染毒7 2 h ，进气口甲醛浓度分别设定为o 5 m g m 3 、1 o m g m 3 和3 m g 佃3 ：根据我 国职业卫生标准，目前甲醛在工作场所的最高容许浓度为o 5 m g m 3 ，而在2 0 0 2 年 之前的规定是3 m g m 3 。实验中的2 种浓度就是依据这2 种标准而设定的。对照组 也在同样的染毒缸中吸入经过滤的新鲜空气( 甲醛浓度 o 0 l m g m 3 ) 。 用于染毒的甲醛气体采用仿真式方案制备，即将4 的甲醛溶液，配制成不同 的浓度，置于w h 2 小型智能型环境气候舱通气湿度发生装置中，通过环境气候舱 设定的恒定湿度参数，使之能稳定连续地输出实验所需浓度的气态甲醛。舱内气温 为( 2 3 o 5 ) ，舱内湿度为( 4 5 5 ) ，过舱气流量为1 l 抽i n 。气体的甲醛浓度由美 国产4 1 6 0 2 型甲醛测定仪( 图2 ) 测定，灵敏度为o 0 1 2 m 咖3 ，准确度为 o 0 2 4 m m 3 ，数字显示。气态甲醛染毒装置如图2 所示； 图2 气态甲醛染毒装置 f i g u r e 2i n h a l a i i o 印p a r a i u so fg a s e o u sf o r m a l d e h y d e 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 2 1 2 肝细胞悬液制各 颈椎脱臼处死小鼠后，取出肝脏，用p b s ( p h = 7 5 ) 缓冲液洗去表面血迹，再 用眼科剪剪成糜状( 约1 m m 3 的组织块) ，4 层纱布过滤；将细胞滤液在1 5 0 蛳n i n 下离心5 m i n ，去掉上清液，用o 5 m l 的p b s ( p h = 7 5 ) 缓冲液重悬浮细胞并调整细 胞密度，苔盼蓝排斥法检测细胞活力，细胞存活率大于9 5 ，细胞密度为1 0 5 1 0 6 个m l 得到的肝细胞悬液待用。 2 1 3k c l s d s 沉淀法4 2 ，4 3 】实验步骤 ( 1 ) 细胞的裂解：将染毒好的细胞在6 0 0 0r d m 的条件下离心3m i n 收集细胞，去 掉上清液。接着向每支离心管中加入o 5m l p b s ( p h - 7 5 ) 缓冲液重悬浮细胞，再 分别加入0 5m l 2 的s d s 溶液并轻微振荡，然后将混合液6 5 水浴加热l om i n ， 裂解细胞。 ( 2 ) 游离d n a 的分离：从水浴中取出加入1 0 0ul 溶于2 0m mt r i s h a 的1 o m o l l 的k c l ( p h - 7 5 ) ，将混合液六次穿过l m l 的聚丙烯枪头，从而使d n a 长度 统一( 由于d n a 片段的长度可影响该方法的准确性) 。由于s d s 可以和游离的蛋 白质及d p c 结合而沉淀下来，而游离的d n a 留在悬液中，从而将游离的d n a 分 离出来。在冰上冷冻样品5 m 血后，s d s k + 沉淀( 包括蛋白质和d p c ) 可以形成， 然后1 0 0 0 0r p m4 离心5 m 缸收集沉淀，并将上清转入另一离心管( 5 m l ) 中。再 加入1 m l 的清洗缓冲液( o 1 m o l ik a ，0 1 m m o l ，l e d l 茂2 0 m m o l l 1 i d s h a ，p h = 7 5 ) 重悬浮沉淀，6 5 水浴加热1 0 m i n ，冰上骤冷5 m h ，如前述离心，如此清洗3 次， 每次都将上清转入上述离心管中。 ( 3 ) d p c 中结合d n a 的分离：最终的沉淀重悬浮于o 5 m l 的清洗缓冲液中，然 后加入o 5m l 的蛋白酶k ( 0 4 啦，溶于清洗缓冲液中配制) ，5 0 消化3 h ，从水 浴中取出冰上骤冷5 m j n ，1 2 0 0 0r p m4 离心1 0 m i n 收集上清液( 其中包括d p c 中 的d n a ) 。 ( 4 ) d p c 的定量：先制作d n a 浓度的标准曲线：用清洗缓冲液配制终浓度分别 为0 n g m l 1 0 0 n g m l 2 0 0 n g m l ，3 0 0 n g m k4 0 0 n 咖l5 0 0 n m k7 5 0 1 l m l 1 0 0 0 n 咖l ，2 0 0 0 n 咖l ，3 0 0 0 n g ，m l 5 0 0 0 n 咖l 的小牛胸腺d n a 标准液，紧接着 加入1 m l 新鲜配制的4 0 0 n 咖l 的荧光染料h o e c h s t 3 3 2 5 8 ，使终浓度为2 0 0 n g m l ， 置于暗处3 0 m i n ，用f 4 5 0 0 型荧光分光光度仪在3 5 0 n m 激发光和4 5 0 n m 发射光下 测得各浓度的荧光值，制备好标准曲线( 见图3 ) 。将染色后的样品用f - 4 5 0 0 型荧 光分光光度计测定其荧光值，根据标准曲线来定量交联和自由d n a ，再计算d p c 系数： 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s ( 1 ) 。p c 系数= 歪蕻丢焉。实验数据用。r i g i n 6 1 统计分析软件分析。 2 2 气态甲醛致小鼠肝d p c 修复的实验 2 - 2 1 气态甲醛染毒方案 将3 0 只昆明纯系雄性小鼠随机分为5 组，每组6 只，全部采用浓度为3 o m g ，m 3 的气态甲醛连续7 2 h 染毒，分别在染毒完后o 、6 、1 2 、1 8 、2 4 h 脱颈处死。对照组 6 只昆明纯系雄性小鼠也在同样的染毒缸中吸入经过滤的新鲜空气( 甲醛浓度 o 0 1 m g m 3 ) 。染毒期间每天定时喂食、饮水两次。染毒装置如2 1 1 。 2 2 2 肝细胞悬液制备( 同2 1 2 操作) 2 _ 2 3 d p c 含量的测定( 同2 1 3 操作) 2 3 液态甲醛致人肝癌细胞系h e p g2 d p c 的实验 2 _ 3 1 液态甲醛染毒方案 将细胞悬液分装于1 5m l 的离心管中，加入相同体积不同浓度的液态甲醛，使 染毒的甲醛浓度分别为o 、2 5 、5 0 、7 5 、1 0 0 um o l l ，同时设一阴性对照组，阴性 对照组为相同体积的生理盐水。离心管均置于3 7 恒温水浴锅孵育1 h 。染毒期间， 不定时地混匀细胞，染毒结束后，以1 0 0 0 帅m 的转速离心5 m i i l ，去上清，重新调 整细胞密度为1 0 6 10 | 7 个m l ，用苔盼蓝排斥法检测细胞活力。 2 3 2d p c 含量的测定( 同2 1 3 操作) 2 4 液态甲醛致人肝癌细胞系h e p g2 d p c 修复的实验 2 4 1 液态甲醛染毒方案 将细胞悬液分装于1 5 m l 的离心管中，加入液态甲醛，使染毒的甲醛终浓度为 7 跏m o l l ，同时设一阴性对照组，阴性对照组为相同体积的生理盐水。离心管均置 于3 7 恒温水浴锅孵育1 h 。染毒期间，不定时地混匀细胞，染毒结束后，取出细 胞在1 5 0 0 r p m 下离心5 m i n 去掉甲醛，并用p b s 清洗2 次，再用新鲜的培养基重悬 浮细胞并分成5 份，放入培养箱3 7 孵育o 、6 、1 2 、1 8 、2 4 h ，然后对各组分别进 行d p c 检测，观察d p c 的修复情况。 2 4 2 d p c 含量的测定( 同2 1 3 操作) 2 5 液态甲醛在不同时间段致小鼠肝d p c 效应 2 5 1 液态甲醛活体染毒方案 将3 0 只昆明纯系雄性小鼠随机分为5 组，1 个空白对照组和4 个甲醛染毒组， 每组6 只，采用腹腔注射的方法进行染毒，染毒组注射浓度为2 0 o m 眺g ( 根据液 态甲醛致小鼠d p c 效应实验选定) 的甲醛，对照组注射生理盐水，每天注射1 次， 剂量为l m l 次，连续5 天注射，染毒组分别在最后一次注射完后6 、1 2 、1 8 、2 4 h 脱颈处死。染毒期间动物自由进食和饮水。 将3 0 只昆明纯系雄性小鼠随机分为5 组，1 个空白对照组和4 个甲醛染毒组， 每组6 只，采用腹腔注射的方法进行染毒，染毒组注射浓度为2 o m g ，l ( g ( 根据液态 甲醛致小鼠d p c 效应实验选定) 的甲醛，对照组注射生理盐水，每天注射1 次， 剂量为l m l 次，连续5 天注射，染毒组分别在最后一次注射完后6 、1 2 、1 8 、2 4 h 脱颈处死。染毒期间动物自由进食和饮水。 将3 0 只昆明纯系雄性小鼠随机分为5 组，1 个空白对照组和4 个甲醛染毒组， 每组6 只，采用腹腔注射的方法进行染毒，染毒组注射浓度为o 2 m g 詹g ( 根据液态 甲醛致小鼠d p c 效应实验选定) 的甲醛，对照组注射生理盐水，每天注射1 次， 剂量为1 m l 次，连续5 天注射，染毒组分别在最后一次注射完后6 、1 2 、1 8 、2 4 h 脱颈处死。染毒期间动物自由进食和饮水。 2 5 2 肝细胞悬液制备( 同2 1 2 操作) 2 。5 3d p c 含量的测定( 同2 。1 。3 操作) 2 6 气态甲醛致小鼠肝d n a 损伤效应 2 6 1 气态甲醛染毒方案 将2 4 只昆明纯系雄性小鼠随机分为4 组：1 个对照组和3 个甲醛染毒组，每组 6 只小鼠。染毒组置于用8 4l 通气式干燥器改装成的玻璃染毒缸中连续动态染毒 7 2 h ，进气口甲醛浓度分别设定为0 5 m 咖3 、1 o m g m 3 和3 m g 细3 。染毒期间每天定 时喂食、饮水两次。染毒装置如2 1 1 。 2 6 2 肝细胞悬液制备( 同2 1 2 操作) 2 6 3 单细胞凝胶电泳4 4 l 实验步骤 ( 1 ) 制片：在完全磨毛的载玻片( 7 5m m 2 5m m ) 上铺第i 层1 8 0ul ( 质量分数 为l ) 的正常熔点琼脂糖( n m a ) ，待其固化后铺第2 层6 0 pl ( 质量分数为 o 8 ) 的低熔点琼脂糖( u 讧a ) 和4 0ul 细胞悬液的混合液，待其固化后铺第 3 层1 0 0 l ( 质量分数为0 5 ) 的l m a ，固化条件均为4 ，1 0 m i n 。 1 4 硕士学侄论文 m a s t e r s 下h e s i s ( 2 ) 裂解：将制好的凝胶玻片放入冷的裂解液( 2 5 m o l l n a c l ，o 1 m o l l n a 2 e d l 九 o 0 1 m o l ，l 1 y i s ，1 十二烷基肌氨酸钠，l t r i n x 1 0 0 ，1 0 d m s o ) 中，4 裂解 2 h 。 ( 3 ) 解旋：从裂解液中取出载玻片用蒸馏水漂洗3 m i n ，去掉表面盐分。然后将其放 入电泳稽中，再将新配制的电泳缓冲液( 1 m m o l l n a 2 e d l 氆o 3 m o l ，u n a o h ) 力h 入 电泳槽，约覆盖过载玻片o 2 5 锄，静置解旋2 0 m i l l 。 ( 4 ) 电泳：室温下调节液面高低，置2 5 v ，3 0 0 m a 下电泳2 0 m i i l 。 ( 5 ) 中和：将凝胶玻片取出后浸入o 4 m o l u h s 缓冲液( p h = 7 5 ) 中，浸洗3 0 m i i l 。 ( 6 ) 镜检和拍照：用2 0 l n 酊。的吖啶橙染色5 m i n ，双蒸水洗掉表面染料，2 铀内在 尼康荧光显微镜( e 6 0 0 型) 下观察并拍照。 ( 7 ) 读片：将由c c d 拍摄的细胞，在电脑上用c a s p 彗星图象分析软件( 从 幽丛盟单：q p ! 免费下载) 自动分析。分析指标为国际公认的尾部d n a 百分率 ( t a i ld n a ) 和尾距( 1 m lm o m 印t ) 。实验数据用o r i g i n6 1 统计分析软件分 析。 硕士举位论文 m a s t e r st h e s j s 三、实验结果 1 染毒装置中气态甲醛释放规律 表1 、2 和3 分别为舱输出气管( 即染毒缸进气口) 的甲醛浓度测量值。从表1 和2 可见，实际染毒剂量的平均水平0 5 1 m g ，m 3 和0 4 7m g m 3 ，3 0 m g ，m 3 和3 + 0 l m g ，m 3 ) 和设定值( o 5m g m 3 和3 om 咖3 ) 非常吻合，而且在释放过程中浓度非 常稳定，变异系数分别为8 1 9 和8 1 6 ，4 5 7 和2 0 9 ，说明用环境气候舱提供 用于染毒的气体甲醛是可靠、可行的。表3 所示的甲醛浓度的平均水平为o 6 8m 咖3 和2 9 7m 咖3 ，其中o 6 8m g ，m 3 比设定的0 5m g ，m 3 高，变异系数为1 5 2 ，这与 环境气候舱在提供低浓度的气态甲醛时较难控制有关。这组甲醛浓度染毒后的小鼠 是用来研究甲醛对小鼠蛋白质氧化损伤作用。对照组染毒缸进气口的甲醛浓度为 o m g m 3 ，即由空气净化装鼍产生的空气。 表1 动态染毒缸进气口气体甲醛浓度的测量值 0 0 0 7 0 0 1 2 0 0 2 3 0 0 2 7 0 0 3 3 0 0 4 8 0 0 5 2 0 0 5 7 0 0 7 2 0 0 平均值( 亍) 标准差( s d ) 变异系数( c v ，) o 0 0 5 0 0 1 1 0 0 2 0 0 0 2 6 0 0 3 0 0 0 4 9 0 0 5 4 o o 6 1 0 0 7 2 0 0 平